Automatically Generated

Summary

Met behulp van kwantum-dot-gelabeld DNA en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie kunnen we het reactiemechanisme van restrictie-endonucleasen onderzoeken met behulp van niet-gelabeld eiwit. Deze techniek met één molecuul maakt massaal gemultiplexte observatie van individuele eiwit-DNA-interacties mogelijk, en gegevens kunnen worden samengevoegd om goed bevolkte verblijftijdverdelingen te genereren.

Abstract

Deze nieuwe op fluorescentie gebaseerde test op basis van totale interne reflectie vergemakkelijkt de gelijktijdige meting van de lengte van de katalytische cyclus voor honderden individuele restrictie-endonuclease (REase) -moleculen in één experiment. Deze test vereist geen eiwitetikettering en kan worden uitgevoerd met een enkel beeldvormingskanaal. Bovendien kunnen de resultaten van meerdere individuele experimenten worden samengevoegd om goed bevolkte verblijftijdverdelingen te genereren. Analyse van de resulterende verblijftijdverdelingen kan helpen het DNA-splitsingsmechanisme op te helderen door de aanwezigheid van kinetische stappen te onthullen die niet direct kunnen worden waargenomen. Voorbeeldgegevens verzameld met behulp van deze test met het goed bestudeerde REase, EcoRV – een dimeer Type IIP-restrictie-endonuclease dat de palindroomsequentie GAT↓ATC splitst (waarbij ↓ de snijplaats is) – komen overeen met eerdere studies. Deze resultaten suggereren dat er ten minste drie stappen zijn in de weg naar DNA-splitsing die wordt geïnitieerd door magnesium te introduceren nadat EcoRV DNA bindt in zijn afwezigheid, met een gemiddelde snelheid van 0,17 ^s-1 voor elke stap.

Introduction

Restrictie-endonucleasen (REases) zijn enzymen die sequentiespecifieke dubbelstrengsbreuken in DNA veroorzaken. De ontdekking van REases in de jaren 1970 leidde tot de ontwikkeling van recombinant-DNA-technologie, en deze enzymen zijn nu onmisbare laboratoriuminstrumenten voor genetische modificatie en manipulatie. Type II REases zijn de meest gebruikte enzymen in deze klasse, omdat ze DNA op een vaste locatie splitsen, hetzij binnen of in de buurt van hun herkenningssequentie. Er is echter veel variatie tussen de Type II REases, en ze zijn onderverdeeld in verschillende subtypen op basis van bepaalde enzymatische eigenschappen in plaats van te worden geclassificeerd op basis van hun evolutionaire relaties. Onder elk subtype zijn er frequente uitzonderingen op het classificatieschema en veel enzymen behoren tot meerdere subtypen². Er zijn duizenden Type II-REases geïdentificeerd en honderden daarvan zijn in de handel verkrijgbaar.

Ondanks de diversiteit onder de Type II REases zijn er echter maar heel weinig REases in detail bestudeerd. Volgens REBASE, de restrictie-enzymendatabase die in 1975 door Sir Richard Roberts werd opgericht³, zijn gepubliceerde kinetische gegevens beschikbaar voor minder dan 20 van deze enzymen. Bovendien, hoewel sommige REases direct zijn waargenomen op het niveau van één molecuul terwijl ze langs het DNA diffundeerden voordat ze hun herkenningssequentie 4,5,6,7 tegenkwamen en eraan bonden, zijn er zeer weinig studies met één molecuul naar hun kinetiek van de splitsingsreactie. De bestaande studies rapporteren ofwel geen adequate statistieken om een gedetailleerde analyse uit te voeren van de variatie in de tijdstippen waarop enkelvoudige splitsingen plaatsvinden ^8,9,10 of zijn niet in staat om de volledige verdeling van splijtingstijden¹¹ vast te leggen. Dit type analyse kan de aanwezigheid van relatief langlevende kinetische tussenproducten aan het licht brengen en kan leiden tot een beter begrip van de mechanismen van REase-gemedieerde DNA-splitsing.

Op het niveau van één molecuul zijn biochemische processen stochastisch – de wachttijd voor een enkel exemplaar van het proces, τ, is variabel. Van veel metingen van τ kan echter worden verwacht dat ze gehoorzamen aan een kansverdeling, p(τ), die een indicatie geeft van het soort proces dat plaatsvindt. Bijvoorbeeld, een proces in één stap, zoals de afgifte van een productmolecuul uit een enzym, zal gehoorzamen aan de Poisson-statistieken, en p(τ) zal de vorm aannemen van een negatieve exponentiële verdeling:

waarbij β de gemiddelde wachttijd is. Merk op dat de snelheid van het proces, k, gelijk zal zijn aan 1/β, het omgekeerde van de gemiddelde wachttijd. Voor processen die meer dan één stap vereisen, zal p(τ) de convolutie zijn van de enkelvoudige exponentiële verdelingen voor elk van de afzonderlijke stappen. Een algemene oplossing voor de convolutie van N enkelvoudige exponentiële vervalfuncties met identieke gemiddelde wachttijden, β, is de gamma-kansverdeling:

waarin Γ(N) de gammafunctie is, die de interpolatie van de faculteit van N-1 naar niet-gehele waarden van N beschrijft. Hoewel deze algemene oplossing bij benadering kan worden gebruikt wanneer de gemiddelde wachttijden van individuele stappen vergelijkbaar zijn, moet worden begrepen dat de aanwezigheid van relatief snelle stappen zal worden gemaskeerd door stappen met aanzienlijk langere wachttijden. Met andere woorden, de waarde van N vertegenwoordigt een ondergrens voor het aantal stappen¹². Met een adequaat aantal wachttijdmetingen kunnen de parameters β en N worden geschat door de gebeurtenissen samen te voegen en de gammaverdeling aan te passen aan het resulterende histogram of door gebruik te maken van een benadering op basis van maximale waarschijnlijkheid. Dit type analyse kan daarom de aanwezigheid van kinetische stappen aan het licht brengen die niet gemakkelijk kunnen worden opgelost in ensemble-assays en vereist een groot aantal observaties om parameters nauwkeurig te schatten^12,13.

Dit artikel beschrijft een methode om quantum-dot-gelabeld DNA en totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie te gebruiken om honderden individuele REase-gemedieerde DNA-splitsingsgebeurtenissen parallel te observeren. Het ontwerp van de test maakt het mogelijk om de resultaten van verschillende experimenten samen te voegen en kan dwell-time-verdelingen maken die duizenden gebeurtenissen bevatten. De hoge fotostabiliteit en helderheid van kwantumdots maken een tijdresolutie van 10 Hz mogelijk zonder dat dit ten koste gaat van het vermogen om splitsingen waar te nemen die zelfs vele minuten na het begin van het experiment plaatsvinden. Goede temporele resolutie en een breed dynamisch bereik, gecombineerd met de mogelijkheid om een grote dataset te verzamelen, maken een nauwkeurige karakterisering van de verblijftijdverdelingen mogelijk om de aanwezigheid van meerdere kinetische stappen in de splitsingspaden van REases aan het licht te brengen, die omloopsnelheden hebben in het bereik van 1 ^min-1 . In het geval van EcoRV kunnen drie kinetische stappen worden opgelost, die allemaal op een andere manier zijn geïdentificeerd, wat bevestigt dat de test gevoelig is voor de aanwezigheid van dergelijke stappen.

Duplex-DNA-substraten die de herkenningssequentie van belang bevatten, worden geproduceerd door een gebiotinyleerd oligonucleotide te gloeien aan een complementaire streng die is gelabeld met een enkele, covalent gehechte halfgeleider nanokristal kwantumpunt. Deze substraten worden ingebracht in een stroomkanaal dat is gebouwd op een glazen dekglaasje met een gazon van polyethyleenglycol (PEG)-moleculen met een hoog moleculair gewicht die covalent aan het oppervlak zijn bevestigd. De DNA-substraten worden gevangen via een biotine-streptavidine-biotine-binding door een fractie van de PEG-moleculen die een biotine aan hun vrije uiteinde hebben. In TIRF-microscopie zorgt een vluchtige golf die exponentieel vervalt met de afstand tot de glas-vloeistofinterface voor verlichting; De penetratiediepte is in de orde van grootte van de golflengte van het gebruikte licht. Onder deze omstandigheden zullen alleen kwantumdots die aan het oppervlak zijn vastgemaakt door een DNA-molecuul dat op het gefunctionaliseerde glazen oppervlak is vastgelegd, worden opgewonden. Quantum dots die vrij in oplossing zijn, worden niet beperkt binnen het verlichte gebied en zullen daarom niet oplichten. Als het DNA dat een kwantumdot aan het oppervlak bindt, wordt gesplitst, zal die kwantumdot vrij zijn om weg te diffunderen van het oppervlak en zal het uit het fluorescentiebeeld verdwijnen.

Hoewel van veel Type II REases bekend is dat ze DNA binden in afwezigheid van magnesium¹⁴, hebben ze allemaal magnesium nodig om DNA-splitsing te mediëren¹⁵. Deze REases kunnen het aan het oppervlak geïmmobiliseerde DNA binden in afwezigheid van magnesium. Wanneer magnesiumhoudende buffer door een kanaal wordt gestroomd met REase vooraf gebonden aan het DNA, begint de splitsing onmiddellijk, zoals aangegeven door het verdwijnen van kwantumdots. De synchronisatie die wordt bereikt door de REase-moleculen voor te binden en vervolgens de DNA-splitsing te initiëren door magnesium te introduceren, vergemakkelijkt het meten van de vertragingstijd tot de voltooiing van de DNA-splitsing onafhankelijk voor elk molecuul in de populatie enzymen die in een experiment zijn waargenomen. Fluoresceïne wordt als tracerkleurstof opgenomen in de magnesiumhoudende buffer om de aankomst van magnesium in het gezichtsveld aan te geven. Aangezien er geen enzym is opgenomen in de magnesiumhoudende buffer, geeft de vertragingstijd vanaf de aankomst van de magnesiumhoudende buffer tot het verdwijnen van elke kwantumpunt de tijd aan die nodig is voor een REase die al aan het DNA is gebonden om het DNA te splitsen en de kwantumpunt van het glasoppervlak los te laten. Het verdwijnen van de kwantumdot gebeurt snel en resulteert in een scherpe afname van het intensiteitstraject, wat een duidelijke indicatie geeft van het tijdstip waarop een bepaald DNA-molecuul wordt gesplitst. De bepaling van gebeurtenistijden wordt bereikt door wiskundige analyse van intensiteitstrajecten, en een typisch experiment resulteert in honderden identificeerbare splitsingsgebeurtenissen. De resultaten van meerdere experimenten kunnen worden samengevoegd om adequate statistieken te verschaffen om een schatting van de parameters, N en β, mogelijk te maken door middel van niet-lineaire kleinste kwadraten of maximale waarschijnlijkheidsanalyse.

Protocol

1. Algemene informatie Oligonucleotide ontwerpOPMERKING: Het 60 basenparen (bp) lange DNA-substraat wordt gevormd uit een paar complementaire oligonucleotiden met een duplexsmelttemperatuur van 75 °C in 100 mM NaCl.Bestel een oligonucleotide gesynthetiseerd met een enkele 5′ biotinemodificatie en de andere met een 5′-thiolmodificatie (met een spacer met zes koolstofatomen). Plaats de herkenningsplaats in het midden van het duplexgebied.OPMERKING: De oligonucleotidesequenties voor gebruik met Ec…

Representative Results

De flowcel is direct gekoppeld aan een olie-immersieobjectief met een hoge numerieke apertuur en een vergroting van 60x op een omgekeerde microscoop die is uitgerust met laserverlichting voor TIRF-beeldvorming door middel van objectieven (Figuur 5A). Na het introduceren van het DNA-substraat en het wegspoelen van overtollig DNA en kwantumdots, zijn er doorgaans duizenden individuele kwantumdots in een gezichtsveld (Figuur 5B). Deze kwantumdots zijn stabiel beves…

Discussion

Het DNA-substraat voor deze test is gelabeld met een kwantumdot met behulp van een tweestapsreactieschema met behulp van sulfo-SMCC. Deze bifunctionele crosslinker bestaat uit een NHS-estergroep die kan reageren met een primair amine en een maleimidegroep die kan reageren met een sulfhydrylgroep²⁰. De gethioleerde oligonucleotiden die worden gebruikt om het substraat voor te bereiden, worden in geoxideerde vorm verzonden. Het is belangrijk om ze te verkleinen en te zuiveren, zoals beschreven, voor…

Materials

3-aminopropyltriethoxysilane (APTS)	Sigma Aldrich	440140-100ML	Store in dessicator box
5 Minute Epoxy	Devcon	20845	use for sealing the microfluidic device
acetone	Pharmco	329000ACS	use for cleaning coverslips
bath sonicator	Fisher Scientific	CPXH Model 2800	catalog number 15-337-410
Beaker, glass, 100 mL
Benchtop centrifuge
Biotin-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)	Laysan Bio	BIO-SVA-5K	Succinimidyl valerate has a longer half-life than succinimidyl carbonate
biotinylated oligonucleotide	Integrated DNA Technologies	custom – see protocol for design considerations	Request 5' Biotin modification and HPLC purification
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	0903-5G	prepare a 10 mg/mL solution (aq) and heat to 95 °C before using
Centri-Spin-10 Size Exclusion Spin Columns	Princeton Separations	CS-100 or CS-101	used to purify thiolated oligonucleotides after reducing the disulfide bond
Centrifuge tubes 1.5. mL
Coverslips, 1-inch square glass
coverslip holders
diamond point wheel	Dremel	7134	use for drilling holes in quartz flow cell topper
dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	A39255	No-Weigh Format, 7.7 mg/vial
drill press rotary tool workstation stand	Dremel	220-01	facilitates quartz drilling
EcoRV (REase used to generate example data)	New England Biolabs	R0195T or R0195M	Use 100,000 units/mL stock to avoid adding excess glycerol Check REBASE for suppliers of other REases
ethanol	various	CAS 64-17-5	denatured or 95% are acceptable, use for cleaning coverslips
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	EDS	BioUltra, anhydrous, store in dessicator box
Flea Micro Spinbar	Fisherbrand	14-513-65	3 mm x 10 mm size to fit beneath coverslip rack
fluorescein	Acros Organics	17324	use to make experimental buffers
gravity convection oven	Binder	9010-0131
handheld rotary multitool	Dremel	8220	use for drilling holes in quartz flow cell topper
ImagEM X2 EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-23B	air cooling is adequate for this experiment, use HCImage software or similar to control
Imaging spacer, double-sided, adhesive
Jar, glass with screw cap, (approximately 50 mm diameter by 50 mm high)
magnesium chloride hexahydrate	Fisher Bioreagents	BP214-500	use to make experimental buffer with magnesium
MATLAB software			Data analysis
metal tweezers	Fisher Brand	16-100-110
methoxy-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)	Laysan Bio	M-SVA-5K	Both PEGs should have the same NHS ester so that the rate of reaction is consistent
microcentrifuge	Eppendorf	5424
multiposition magnetic stirrer	VWR	12621-022
N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES)	Acros Organics	AC20818	CAS 103-47-9, use to make CHES buffer
orbital shaker and heater for microcentrifuge tubes	Q Instruments	1808-0506	with 1808-1061 adaptor for 24 x 2.0 mL or 15 x 0.5 mL tubes
Parafilm
PE60 Polyethylene tubing (inner diameter 0.76 mm, outer diameter 1.22 mm)	Intramedic	6258917	22 G blunt needles are a good fit for this tubing size
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10x	Sigma Aldrich	P7059	Use at 1x strength
potassium hydroxide	VWR Chemicals BDH	BDH9262	use a 1 M solution to clean coverslips
Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Invitrogen	Q21521MP
Quartz Slide, 1 inch square, 1 mm thick	Electron Microscopy Sciences	72250-10	holes must be drilled in the corners for inlet and outlet tubing insertion
reinforced plastic tweezers	Rubis	K35a	use for handling coverslips and building microfluidic device
SecureSeal Adhesive Sheets	Grace Biolabs	SA-S-1L	cut to form spacer for microfluidic device
Single channel syringe pump for microfluidics	New Era Pump Systems	NE-1002X-US	fitted with a 50 mL syringe and a 22 G blunt needle
Slide-a-Lyzer MINI Dialysis Devices, 10 kDa MWCO, 0.1 mL	Thermo Scientific	69570 or 69572	used for buffer exchange during quantum dot coupling to DNA
sodium bicarbonate	EMD Millipore	SX0320	use to make buffer for surface functionalization; 100 mM, pH 8
sodium chloride	Macron	7581-12	use to make experimental buffers
Sodium phosphate dibasic solution (BioUltra, 0.5 M in water)	Sigma Aldrich	94046	use to make 100 mM sodium phosphate buffer
Sodium phosphate monobasic solution (BioUltra, 5M in water)	Sigma Aldrich	74092	use to adjust pH of 100 mM sodium phosphate buffer
Streptavidin from Streptomyces avidinii	Sigma Aldrich	S4762	dissolve at 1 mg/mL and store 25 mL aliqouts at -20 ℃
Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC)	Thermo Scientific	A39268	No-Weigh Format, 2 mg/vial
Syringe fitted with blunt 21 G needle
Syringe pump
thiolated oligonucleotide	Integrated DNA Technologies	custom – see protocol for design considerations	Request 5' Thiol Modifier C6 S-S and HPLC purificaiton
TIRF imaging system with 488 nm laser illumination	various		custom built
Tris -HCl	Research Products International	T60050	use to make experimental buffers
Tris base	JT Baker	4101	use to make experimental buffers
Tween-20	Sigma	P7949	use to make blocking buffer
Ultrapure water
vortex mixer	VWR	10153-842
Wash-N-Dry Coverslip Rack	Electron Microscopy Sciences	70366-16	used for surface functionalization of coverslips