Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione
Summary
Utilizzando il DNA marcato con punti quantici e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale, possiamo studiare il meccanismo di reazione delle endonucleasi di restrizione utilizzando proteine non marcate. Questa tecnica a singola molecola consente l’osservazione massicciamente multiplexata delle singole interazioni proteina-DNA e i dati possono essere raggruppati per generare distribuzioni del tempo di permanenza ben popolate.
Abstract
Questo nuovo test basato sulla microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale facilita la misurazione simultanea della lunghezza del ciclo catalitico per centinaia di singole molecole di endonucleasi di restrizione (REasi) in un unico esperimento. Questo test non richiede la marcatura delle proteine e può essere eseguito con un singolo canale di imaging. Inoltre, i risultati di più esperimenti individuali possono essere raggruppati per generare distribuzioni del tempo di permanenza ben popolate. L’analisi delle distribuzioni del tempo di permanenza risultanti può aiutare a chiarire il meccanismo di scissione del DNA rivelando la presenza di passaggi cinetici che non possono essere osservati direttamente. I dati di esempio raccolti utilizzando questo test con la ben studiata REasi, EcoRV – un’endonucleasi dimerica di restrizione di tipo IIP che slega la sequenza palindromica GAT↓ATC (dove ↓ è il sito di taglio) – sono in accordo con studi precedenti. Questi risultati suggeriscono che ci sono almeno tre passaggi nel percorso di scissione del DNA che viene avviato introducendo il magnesio dopo che EcoRV si lega al DNA in sua assenza, con un tasso medio di 0,17 s-1 per ogni passaggio.
Introduction
Le endonucleasi di restrizione (REasi) sono enzimi che effettuano rotture del doppio filamento sequenzia-specifiche nel DNA. La scoperta delle REasi negli anni ’70 ha portato allo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante, e questi enzimi sono ora strumenti di laboratorio indispensabili per la modificazione e la manipolazione genetica1. Le REasi di tipo II sono gli enzimi più utilizzati in questa classe in quanto scindono il DNA in una posizione fissa all’interno o vicino alla loro sequenza di riconoscimento. Tuttavia, c’è una grande quantità di variazioni tra le REasi di Tipo II, e sono divise in diversi sottotipi in base a particolari proprietà enzimatiche piuttosto che essere classificate in base alle loro relazioni evolutive. Tra ogni sottotipo, ci sono frequenti eccezioni allo schema di classificazione e molti enzimi appartengono a più sottotipi2. Sono state identificate migliaia di REasi di Tipo II e centinaia di esse sono disponibili in commercio.
Tuttavia, nonostante la diversità tra le SI di Tipo II, pochissime SI sono studiate in dettaglio. Secondo REBASE, il database degli enzimi di restrizione istituito da Sir Richard Roberts nel 19753, i dati cinetici pubblicati sono disponibili per meno di 20 di questi enzimi. Inoltre, mentre alcune REasi sono state osservate direttamente a livello di singola molecola mentre si diffondevano lungo il DNA prima di incontrare e legarsi alla loro sequenza di riconoscimento 4,5,6,7, ci sono pochissimi studi su singole molecole della loro cinetica di reazione di scissione. Gli studi esistenti non riportano statistiche adeguate per intraprendere un’analisi dettagliata della variazione dei tempi in cui si verificano singoli eventi di scissione 8,9,10 o non sono in grado di catturare l’intera distribuzione dei tempi di scissione11. Questo tipo di analisi può rivelare la presenza di intermedi cinetici relativamente longevi e potrebbe portare a una migliore comprensione dei meccanismi di scissione del DNA mediata da REasi.
A livello di singola molecola, i processi biochimici sono stocastici: il tempo di attesa per il verificarsi di una singola istanza del processo, τ, è variabile. Tuttavia, ci si può aspettare che molte misure di τ obbediscano a una distribuzione di probabilità, p(τ), che è indicativa del tipo di processo in corso. Ad esempio, un processo a passo singolo, come il rilascio di una molecola di prodotto da un enzima, obbedirà alla statistica di Poisson e p(τ) assumerà la forma di una distribuzione esponenziale negativa:
dove β è il tempo medio di attesa. Si noti che la velocità del processo, k, sarà pari a 1/β, l’inverso del tempo medio di attesa. Per i processi che richiedono più di un passo, p(τ) sarà la convoluzione delle distribuzioni a singolo esponenziale per ciascuno dei singoli passaggi. Una soluzione generale per la convoluzione di N funzioni di decadimento a singolo esponenziale con identico tempo medio di attesa, β, è la distribuzione di probabilità gamma:
dove Γ(N) è la funzione gamma, che descrive l’interpolazione del fattoriale di N-1 a valori non interi di N. Sebbene questa soluzione generale possa essere utilizzata come approssimazione quando i tempi medi di attesa dei singoli passaggi sono simili, si deve comprendere che la presenza di passaggi relativamente veloci sarà mascherata da passaggi con tempi di attesa significativamente più lunghi. In altre parole, il valore di N rappresenta un limite inferiore al numero di passi12. Con un numero adeguato di misurazioni del tempo di attesa, i parametri β e N possono essere stimati raggruppando gli eventi e adattando la distribuzione gamma all’istogramma risultante o utilizzando un approccio di stima della massima verosimiglianza. Questo tipo di analisi può quindi rivelare la presenza di passaggi cinetici che non possono essere facilmente risolti nei saggi d’insieme e richiede un gran numero di osservazioni per stimare accuratamente i parametri12,13.
Questo articolo descrive un metodo per utilizzare il DNA marcato con punti quantici e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per osservare centinaia di singoli eventi di scissione del DNA mediati da REasi in parallelo. La progettazione del test consente di riunire i risultati di diversi esperimenti e può creare distribuzioni del tempo di permanenza contenenti migliaia di eventi. L’elevata fotostabilità e luminosità dei punti quantici consente una risoluzione temporale di 10 Hz senza sacrificare la capacità di osservare gli eventi di clivaggio che si verificano anche molti minuti dopo l’inizio dell’esperimento. Una buona risoluzione temporale e un ampio intervallo dinamico, combinati con la capacità di raccogliere un ampio set di dati, consentono una caratterizzazione accurata delle distribuzioni del tempo di permanenza per scoprire la presenza di più passaggi cinetici nelle vie di scissione delle REasi, che hanno tassi di turnover nell’intervallo 1 min-1 . Nel caso di EcoRV, è possibile risolvere tre passaggi cinetici, tutti identificati con altri mezzi, confermando che il test è sensibile alla presenza di tali passaggi.
I substrati di DNA duplex contenenti la sequenza di riconoscimento di interesse sono prodotti mediante ricottura di un oligonucleotide biotinilato in un filamento complementare marcato con un singolo punto quantico di nanocristalli semiconduttori attaccato covalentemente. Questi substrati vengono introdotti in un canale di flusso costruito sopra un vetrino coprioggetti con un prato di molecole di polietilenglicole (PEG) ad alto peso molecolare attaccate in modo covalente alla sua superficie. I substrati del DNA vengono catturati tramite un legame biotina-streptavidina-biotina da una frazione delle molecole PEG che hanno una biotina all’estremità libera. Nella microscopia TIRF, un’onda evanescente che decade esponenzialmente con la distanza dall’interfaccia vetro-liquido fornisce illuminazione; La profondità di penetrazione è dell’ordine della lunghezza d’onda della luce utilizzata. In queste condizioni, saranno eccitati solo i punti quantici che sono legati alla superficie da una molecola di DNA che è stata catturata sulla superficie di vetro funzionalizzato. I punti quantici che sono liberi in soluzione non saranno vincolati all’interno della regione illuminata e quindi non si illumineranno. Se il DNA che lega un punto quantico alla superficie viene tagliato, quel punto quantico sarà libero di diffondersi lontano dalla superficie e scomparirà dall’immagine a fluorescenza.
Sebbene molte RACESI di Tipo II siano note per legare il DNA in assenza di magnesio14, tutte richiedono magnesio per mediare la scissione del DNA15. Queste REasi possono legare il DNA immobilizzato in superficie in assenza di magnesio. Quando il tampone contenente magnesio viene fatto scorrere attraverso un canale con REasi prelegata al DNA, la scissione inizia immediatamente, come indicato dalla scomparsa dei punti quantici. La sincronizzazione ottenuta prelegando le molecole di REasi e quindi avviando la scissione del DNA introducendo il magnesio, facilita la misurazione del tempo di ritardo al completamento della scissione del DNA indipendentemente per ciascuna molecola nella popolazione di enzimi osservata in un esperimento. La fluoresceina è inclusa come colorante tracciante nel tampone contenente magnesio per indicare l’arrivo del magnesio nel campo visivo. Poiché nessun enzima è incluso nel tampone contenente magnesio, il tempo di ritardo dall’arrivo del tampone contenente magnesio alla scomparsa di ciascun punto quantico indica il tempo necessario a una REasi che è già legata al DNA per scindere il DNA e rilasciare il punto quantico dalla superficie di vetro. La scomparsa dei punti quantici avviene rapidamente e si traduce in una forte diminuzione della traiettoria di intensità, fornendo una chiara indicazione del tempo in cui una data molecola di DNA viene scissa. La determinazione dei tempi degli eventi viene effettuata mediante analisi matematica delle traiettorie di intensità e un tipico esperimento produce centinaia di eventi di scissione identificabili. I risultati di più esperimenti possono essere raggruppati per fornire statistiche adeguate per consentire la stima dei parametri, N e β, mediante analisi dei minimi quadrati non lineari o di massima verosimiglianza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il substrato di DNA per questo saggio è marcato con un punto quantico utilizzando uno schema di reazione in due fasi utilizzando sulfo-SMCC. Questo reticolante bifunzionale è costituito da una porzione estere NHS che può reagire con un’ammina primaria e da una porzione maleimmidica che può reagire con un gruppo sulfidrilico20. Gli oligonucleotidi tiolati utilizzati per preparare il substrato vengono spediti nella loro forma ossidata. È importante ridurli e purificarli, come descritto, prima d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal premio numero K12GM074869 all’ECM dall’Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell’Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali o del National Institutes of Health.
Materials
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | Store in dessicator box |
| 5 Minute Epoxy | Devcon | 20845 | use for sealing the microfluidic device |
| acetone | Pharmco | 329000ACS | use for cleaning coverslips |
| bath sonicator | Fisher Scientific | CPXH Model 2800 | catalog number 15-337-410 |
| Beaker, glass, 100 mL | |||
| Benchtop centrifuge | |||
| Biotin-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000) | Laysan Bio | BIO-SVA-5K | Succinimidyl valerate has a longer half-life than succinimidyl carbonate |
| biotinylated oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | custom – see protocol for design considerations | Request 5' Biotin modification and HPLC purification |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0903-5G | prepare a 10 mg/mL solution (aq) and heat to 95 °C before using |
| Centri-Spin-10 Size Exclusion Spin Columns | Princeton Separations | CS-100 or CS-101 | used to purify thiolated oligonucleotides after reducing the disulfide bond |
| Centrifuge tubes 1.5. mL | |||
| Coverslips, 1-inch square glass | |||
| coverslip holders | |||
| diamond point wheel | Dremel | 7134 | use for drilling holes in quartz flow cell topper |
| dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | A39255 | No-Weigh Format, 7.7 mg/vial |
| drill press rotary tool workstation stand | Dremel | 220-01 | facilitates quartz drilling |
| EcoRV (REase used to generate example data) | New England Biolabs | R0195T or R0195M | Use 100,000 units/mL stock to avoid adding excess glycerol Check REBASE for suppliers of other REases |
| ethanol | various | CAS 64-17-5 | denatured or 95% are acceptable, use for cleaning coverslips |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | EDS | BioUltra, anhydrous, store in dessicator box |
| Flea Micro Spinbar | Fisherbrand | 14-513-65 | 3 mm x 10 mm size to fit beneath coverslip rack |
| fluorescein | Acros Organics | 17324 | use to make experimental buffers |
| gravity convection oven | Binder | 9010-0131 | |
| handheld rotary multitool | Dremel | 8220 | use for drilling holes in quartz flow cell topper |
| ImagEM X2 EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-23B | air cooling is adequate for this experiment, use HCImage software or similar to control |
| Imaging spacer, double-sided, adhesive | |||
| Jar, glass with screw cap, (approximately 50 mm diameter by 50 mm high) | |||
| magnesium chloride hexahydrate | Fisher Bioreagents | BP214-500 | use to make experimental buffer with magnesium |
| MATLAB software | Data analysis | ||
| metal tweezers | Fisher Brand | 16-100-110 | |
| methoxy-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000) | Laysan Bio | M-SVA-5K | Both PEGs should have the same NHS ester so that the rate of reaction is consistent |
| microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| multiposition magnetic stirrer | VWR | 12621-022 | |
| N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES) | Acros Organics | AC20818 | CAS 103-47-9, use to make CHES buffer |
| orbital shaker and heater for microcentrifuge tubes | Q Instruments | 1808-0506 | with 1808-1061 adaptor for 24 x 2.0 mL or 15 x 0.5 mL tubes |
| Parafilm | |||
| PE60 Polyethylene tubing (inner diameter 0.76 mm, outer diameter 1.22 mm) | Intramedic | 6258917 | 22 G blunt needles are a good fit for this tubing size |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10x | Sigma Aldrich | P7059 | Use at 1x strength |
| potassium hydroxide | VWR Chemicals BDH | BDH9262 | use a 1 M solution to clean coverslips |
| Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Invitrogen | Q21521MP | |
| Quartz Slide, 1 inch square, 1 mm thick | Electron Microscopy Sciences | 72250-10 | holes must be drilled in the corners for inlet and outlet tubing insertion |
| reinforced plastic tweezers | Rubis | K35a | use for handling coverslips and building microfluidic device |
| SecureSeal Adhesive Sheets | Grace Biolabs | SA-S-1L | cut to form spacer for microfluidic device |
| Single channel syringe pump for microfluidics | New Era Pump Systems | NE-1002X-US | fitted with a 50 mL syringe and a 22 G blunt needle |
| Slide-a-Lyzer MINI Dialysis Devices, 10 kDa MWCO, 0.1 mL | Thermo Scientific | 69570 or 69572 | used for buffer exchange during quantum dot coupling to DNA |
| sodium bicarbonate | EMD Millipore | SX0320 | use to make buffer for surface functionalization; 100 mM, pH 8 |
| sodium chloride | Macron | 7581-12 | use to make experimental buffers |
| Sodium phosphate dibasic solution (BioUltra, 0.5 M in water) | Sigma Aldrich | 94046 | use to make 100 mM sodium phosphate buffer |
| Sodium phosphate monobasic solution (BioUltra, 5M in water) | Sigma Aldrich | 74092 | use to adjust pH of 100 mM sodium phosphate buffer |
| Streptavidin from Streptomyces avidinii | Sigma Aldrich | S4762 | dissolve at 1 mg/mL and store 25 mL aliqouts at -20 ℃ |
| Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) | Thermo Scientific | A39268 | No-Weigh Format, 2 mg/vial |
| Syringe fitted with blunt 21 G needle | |||
| Syringe pump | |||
| thiolated oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | custom – see protocol for design considerations | Request 5' Thiol Modifier C6 S-S and HPLC purificaiton |
| TIRF imaging system with 488 nm laser illumination | various | custom built | |
| Tris -HCl | Research Products International | T60050 | use to make experimental buffers |
| Tris base | JT Baker | 4101 | use to make experimental buffers |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | use to make blocking buffer |
| Ultrapure water | |||
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| Wash-N-Dry Coverslip Rack | Electron Microscopy Sciences | 70366-16 | used for surface functionalization of coverslips |
References
- Roberts, R. J. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5905-5908 (2005).
- Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 42 (1), 3-19 (2014).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE–a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, 298-299 (2015).
- Bonnet, I., et al. Sliding and jumping of single EcoRV restriction enzymes on non-cognate DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 4118-4127 (2008).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophysical Journal. 96 (8), 50-52 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
- Huang, C. -. F., et al. Direct visualization of DNA recognition by restriction endonuclease EcoRI. Journal of Experimental & Clinical Medicine. 5 (1), 25-29 (2013).
- Palma, M., et al. Selective biomolecular nanoarrays for parallel single-molecule investigations. Journal of American Chemical Society. 133 (20), 7656-7659 (2011).
- Reinhard, B. M., Sheikholeslami, S., Mastroianni, A., Alivisatos, A. P., Liphardt, J. Use of plasmon coupling to reveal the dynamics of DNA bending and cleavage by single EcoRV restriction enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2667-2672 (2007).
- van den Broek, B., Noom, M. C., Wuite, G. J. DNA-tension dependence of restriction enzyme activity reveals mechanochemical properties of the reaction pathway. Nucleic Acids Research. 33 (8), 2676-2684 (2005).
- Gambino, S., et al. A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage. Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).
- Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
- Loparo, J. J., van Oijen, A., Hinterdorfer, P., Oijen, A. Single-molecule enzymology. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 165-182 (2009).
- Taylor, J. D., Badcoe, I. G., Clarke, A. R., Halford, S. E. EcoRV restriction endonuclease binds all DNA sequences with equal affinity. Biochemistry. 30 (36), 8743-8753 (1991).
- Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Research. 29 (18), 3705-3727 (2001).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1529 (2009).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1689 (2010).
- Baldwin, G. S., Vipond, I. B., Halford, S. E. Rapid reaction analysis of the catalytic cycle of the EcoRV restriction endonuclease. Biochemistry. 34 (2), 705-714 (1995).
- Winkler, F. K., et al. The crystal-structure of Ecorv endonuclease and of Its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments. EMBO Journal. 12 (5), 1781-1795 (1993).
- Sioss, J. A., Stoermer, R. L., Sha, M. Y., Keating, C. D. Silica-coated, Au/Ag striped nanowires for bioanalysis. Langmuir. 23 (22), 11334-11341 (2007).
