制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析
Summary
量子ドット標識DNAと全反射蛍光顕微鏡を用いて、非標識タンパク質を用いた制限エンドヌクレアーゼの反応機構を調べることができます。この単一分子技術により、個々のタンパク質-DNA相互作用の大規模な多重化観察が可能になり、データをプールして、十分に蓄積された滞留時間分布を生成できます。
Abstract
この新しい全反射蛍光顕微鏡ベースのアッセイは、1回の実験で数百の個々の制限エンドヌクレアーゼ(REase)分子の触媒サイクルの長さを同時に測定することを容易にします。このアッセイはタンパク質の標識を必要とせず、単一のイメージングチャネルで実施できます。さらに、複数の個別の実験の結果をプールして、十分に入力された滞留時間分布を生成できます。その結果得られた滞留時間分布を解析することで、直接観察できない速度論的ステップの存在を明らかにすることで、DNA切断メカニズムの解明に役立てることができます。このアッセイとよく研究されているREaseを用いて収集されたデータの例、EcoRV(回文配列GAT↓ATC(↓は切断部位)を切断する二量体IIP型制限エンドヌクレアーゼ)は、先行研究と一致しています。これらの結果は、EcoRVがDNAに結合した後にマグネシウムを導入することによって開始されるDNA切断への経路には少なくとも3つのステップがあり、各ステップで平均0.17 s-1 の割合があることを示唆しています。
Introduction
制限エンドヌクレアーゼ(REase)は、DNAの配列特異的な二本鎖切断に影響を与える酵素です。1970年代のREasesの発見は、組換えDNA技術の開発につながり、現在では遺伝子組換えや遺伝子操作に欠かせない実験ツールとなっています1。II型REaseは、認識配列内または認識配列付近の固定位置でDNAを切断するため、このクラスで最も広く使用されている酵素です。しかし、タイプIIのREasesには大きなバリエーションがあり、進化的関係によって分類されるのではなく、特定の酵素特性に基づいていくつかのサブタイプに分類されます。各サブタイプの中には、分類スキームに例外が頻繁にあり、多くの酵素は複数のサブタイプ2に属しています。何千ものType II REaseが同定されており、そのうちの数百が市販されています。
しかし、Type II REasesの多様性にもかかわらず、詳細に研究されたREaseはほとんどありません。1975年にリチャード・ロバーツ卿によって設立された制限酵素データベースであるREBASEによると、これらの酵素のうち公開された動態データは20未満しか入手できません。さらに、一部のREaseは、その認識配列4,5,6,7に遭遇して結合する前にDNAに沿って拡散しながら、単一分子レベルで直接観察されていますが、その切断反応速度に関する単一分子の研究はほとんどありません。既存の研究は、単一の切断事象が発生する時間の変化を詳細に分析するための適切な統計を報告していないか8,9,10、または切断時間11の完全な分布を捕捉することができない。この種の解析により、比較的長寿命の運動学的中間体の存在が明らかになり、REaseを介したDNA切断のメカニズムの理解を深めることができる可能性があります。
単一分子レベルでは、生化学的プロセスは確率的であり、プロセスの単一のインスタンスが発生するまでの待ち時間τは変動します。ただし、τの多くの測定値は、発生しているプロセスの種類を示す確率分布p(τ)に従うことが期待できます。たとえば、酵素から生成物分子を放出するなどのシングルステッププロセスはポアソン統計に従い、p(τ)は負の指数分布の形を取ります。
ここで、 β は平均待ち時間です。プロセスの速度 k は、平均待機時間の逆数である 1/β に等しくなることに注意してください。複数のステップを必要とするプロセスの場合、 p(τ) は、個々のステップごとに 1 つの指数分布の畳み込みになります。平均待ち時間が同一の N 個の単一指数関数減衰関数の畳み込み ( β) の一般的な解は、ガンマ確率分布です。
ここで、Γ(N) はガンマ関数で、N-1 の階乗と N の非整数値への補間を表します。この一般的な解は、個々のステップの平均待ち時間が類似している場合の近似値として使用できますが、比較的速いステップの存在は、待ち時間が大幅に長いステップによって隠されることを理解する必要があります。つまり、N の値はステップ12 の数の下限を表します。待機時間測定の数が適切であれば、イベントをビン化してガンマ分布を結果のヒストグラムに適合させるか、最尤推定アプローチを使用して、パラメーター β と N を推定できます。したがって、このタイプの分析は、アンサンブルアッセイでは容易に解決できず、パラメータを正確に推定するために多数の観察を必要とする速度論的ステップの存在を明らかにすることができる12,13。
この論文では、量子ドット標識DNAと全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用して、REaseを介した数百の個々のDNA切断イベントを並行して観察する方法について説明します。このアッセイの設計により、複数の実験結果をプールすることが可能になり、数千のイベントを含む滞留時間分布を作成することができます。量子ドットの高い光安定性と輝度により、実験開始から数分後でも発生する切断イベントを観察する能力を犠牲にすることなく、10Hzの時間分解能が可能になります。優れた時間分解能と広いダイナミックレンジ、および大規模なデータセットを収集する能力を組み合わせることで、滞留時間分布の正確な特性評価が可能になり、ターンオーバー率が1分-1 の範囲にあるREaseの切断経路に複数の運動学的ステップが存在することが明らかになります。EcoRVの場合、3つの速度論的ステップを解決でき、そのすべてが他の手段によって特定されており、アッセイがそのようなステップの存在に対して敏感であることが確認されています。
目的の認識配列を含む二本鎖DNA基質は、ビオチン化オリゴヌクレオチドを、共有結合した単一の半導体ナノ結晶量子ドットで標識された相補鎖にアニーリングすることによって生成されます。これらの基板は、ガラスカバーガラスの上に構築された流路に導入され、その表面に高分子量ポリエチレングリコール(PEG)分子が共有結合して芝生に付着しています。DNA基質は、ビオチン-ストレプトアビジン-ビオチン結合を介して、自由末端にビオチンを持つPEG分子の一部によって捕捉されます。TIRF顕微鏡では、ガラスと液体の界面からの距離とともに指数関数的に減衰するエバネッセント波が照明を提供します。透過深度は、使用する光の波長のオーダーです。これらの条件下では、機能化されたガラス表面に捕捉されたDNA分子によって表面につながれた量子ドットのみが励起されます。溶液中で遊離している量子ドットは、照らされた領域内に制約されないため、発光しません。量子ドットを表面につなぎとめているDNAが切断されると、その量子ドットは表面から自由に拡散し、蛍光画像から消えます。
多くのII型REaseはマグネシウムの非存在下でDNAに結合することが知られているが14、すべてのREaseはDNA切断を媒介するためにマグネシウムを必要とする15。これらのREaseは、マグネシウムの非存在下で表面に固定化されたDNAに結合することができます。マグネシウム含有バッファーをDNAにプレバインディングしたREaseのチャネルに流すと、量子ドットの消失が示すように、すぐに切断が始まります。REase分子を事前に結合し、マグネシウムを導入してDNA切断を開始することで同期化を達成することで、実験で観察された酵素集団の各分子について、DNA切断が完了するまでのタイムラグを独立して測定することができます。フルオレセインは、マグネシウムが視野に到着することを示すために、マグネシウム含有緩衝液にトレーサー色素として含まれています。マグネシウム含有バッファーには酵素が含まれていないため、マグネシウム含有バッファーの到着から各量子ドットが消失するまでのタイムラグは、DNAにすでに結合しているREaseがDNAを切断し、ガラス表面から量子ドットを放出するのにかかる時間を示しています。量子ドットの消失は迅速に起こり、強度の軌跡が急激に減少するため、特定のDNA分子が切断される時間を明確に示します。イベント時間の決定は、強度軌道の数学的分析によって行われ、一般的な実験では、何百もの識別可能な切断イベントが得られます。複数の実験の結果をプールして、非線形最小二乗分析または最尤分析によってパラメーター N と β を推定できる適切な統計を提供できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このアッセイのDNA基質は、sulfo-SMCCを用いた2段階の反応スキームを用いて量子ドットで標識されています。この二官能性架橋剤は、第一級アミンと反応できるNHSエステル部分と、スルフヒドリル基と反応できるマレイミド部分で構成されています20。基質の調製に使用されるチオール化オリゴヌクレオチドは、酸化された形で出荷されます。カップリング手順を進める前に、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、National Institute of General Medical SciencesからCMEへのAward Number K12GM074869によって支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立総合医科学研究所または国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | Store in dessicator box |
| 5 Minute Epoxy | Devcon | 20845 | use for sealing the microfluidic device |
| acetone | Pharmco | 329000ACS | use for cleaning coverslips |
| bath sonicator | Fisher Scientific | CPXH Model 2800 | catalog number 15-337-410 |
| Beaker, glass, 100 mL | |||
| Benchtop centrifuge | |||
| Biotin-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000) | Laysan Bio | BIO-SVA-5K | Succinimidyl valerate has a longer half-life than succinimidyl carbonate |
| biotinylated oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | custom – see protocol for design considerations | Request 5' Biotin modification and HPLC purification |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0903-5G | prepare a 10 mg/mL solution (aq) and heat to 95 °C before using |
| Centri-Spin-10 Size Exclusion Spin Columns | Princeton Separations | CS-100 or CS-101 | used to purify thiolated oligonucleotides after reducing the disulfide bond |
| Centrifuge tubes 1.5. mL | |||
| Coverslips, 1-inch square glass | |||
| coverslip holders | |||
| diamond point wheel | Dremel | 7134 | use for drilling holes in quartz flow cell topper |
| dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | A39255 | No-Weigh Format, 7.7 mg/vial |
| drill press rotary tool workstation stand | Dremel | 220-01 | facilitates quartz drilling |
| EcoRV (REase used to generate example data) | New England Biolabs | R0195T or R0195M | Use 100,000 units/mL stock to avoid adding excess glycerol Check REBASE for suppliers of other REases |
| ethanol | various | CAS 64-17-5 | denatured or 95% are acceptable, use for cleaning coverslips |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | EDS | BioUltra, anhydrous, store in dessicator box |
| Flea Micro Spinbar | Fisherbrand | 14-513-65 | 3 mm x 10 mm size to fit beneath coverslip rack |
| fluorescein | Acros Organics | 17324 | use to make experimental buffers |
| gravity convection oven | Binder | 9010-0131 | |
| handheld rotary multitool | Dremel | 8220 | use for drilling holes in quartz flow cell topper |
| ImagEM X2 EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-23B | air cooling is adequate for this experiment, use HCImage software or similar to control |
| Imaging spacer, double-sided, adhesive | |||
| Jar, glass with screw cap, (approximately 50 mm diameter by 50 mm high) | |||
| magnesium chloride hexahydrate | Fisher Bioreagents | BP214-500 | use to make experimental buffer with magnesium |
| MATLAB software | Data analysis | ||
| metal tweezers | Fisher Brand | 16-100-110 | |
| methoxy-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000) | Laysan Bio | M-SVA-5K | Both PEGs should have the same NHS ester so that the rate of reaction is consistent |
| microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| multiposition magnetic stirrer | VWR | 12621-022 | |
| N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES) | Acros Organics | AC20818 | CAS 103-47-9, use to make CHES buffer |
| orbital shaker and heater for microcentrifuge tubes | Q Instruments | 1808-0506 | with 1808-1061 adaptor for 24 x 2.0 mL or 15 x 0.5 mL tubes |
| Parafilm | |||
| PE60 Polyethylene tubing (inner diameter 0.76 mm, outer diameter 1.22 mm) | Intramedic | 6258917 | 22 G blunt needles are a good fit for this tubing size |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10x | Sigma Aldrich | P7059 | Use at 1x strength |
| potassium hydroxide | VWR Chemicals BDH | BDH9262 | use a 1 M solution to clean coverslips |
| Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Invitrogen | Q21521MP | |
| Quartz Slide, 1 inch square, 1 mm thick | Electron Microscopy Sciences | 72250-10 | holes must be drilled in the corners for inlet and outlet tubing insertion |
| reinforced plastic tweezers | Rubis | K35a | use for handling coverslips and building microfluidic device |
| SecureSeal Adhesive Sheets | Grace Biolabs | SA-S-1L | cut to form spacer for microfluidic device |
| Single channel syringe pump for microfluidics | New Era Pump Systems | NE-1002X-US | fitted with a 50 mL syringe and a 22 G blunt needle |
| Slide-a-Lyzer MINI Dialysis Devices, 10 kDa MWCO, 0.1 mL | Thermo Scientific | 69570 or 69572 | used for buffer exchange during quantum dot coupling to DNA |
| sodium bicarbonate | EMD Millipore | SX0320 | use to make buffer for surface functionalization; 100 mM, pH 8 |
| sodium chloride | Macron | 7581-12 | use to make experimental buffers |
| Sodium phosphate dibasic solution (BioUltra, 0.5 M in water) | Sigma Aldrich | 94046 | use to make 100 mM sodium phosphate buffer |
| Sodium phosphate monobasic solution (BioUltra, 5M in water) | Sigma Aldrich | 74092 | use to adjust pH of 100 mM sodium phosphate buffer |
| Streptavidin from Streptomyces avidinii | Sigma Aldrich | S4762 | dissolve at 1 mg/mL and store 25 mL aliqouts at -20 ℃ |
| Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) | Thermo Scientific | A39268 | No-Weigh Format, 2 mg/vial |
| Syringe fitted with blunt 21 G needle | |||
| Syringe pump | |||
| thiolated oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | custom – see protocol for design considerations | Request 5' Thiol Modifier C6 S-S and HPLC purificaiton |
| TIRF imaging system with 488 nm laser illumination | various | custom built | |
| Tris -HCl | Research Products International | T60050 | use to make experimental buffers |
| Tris base | JT Baker | 4101 | use to make experimental buffers |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | use to make blocking buffer |
| Ultrapure water | |||
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| Wash-N-Dry Coverslip Rack | Electron Microscopy Sciences | 70366-16 | used for surface functionalization of coverslips |
References
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