Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij Arabidopsis

doi: 10.3791/62114 Published: June 4, 2021

Summary

Extracellulaire glutamaat-geactiveerde systemische calcium signalering is van cruciaal belang voor de inductie van plantenverdedigingsreacties op mechanische wond- en herbivore-aanval in planten. Dit artikel beschrijft een methode om de ruimtelijke en temporele dynamiek van beide factoren te visualiseren met behulp van Arabidopsis thaliana-planten die calcium- en glutamaatgevoelige fluorescerende biosensoren uitdrukken.

Abstract

Planten reageren op mechanische spanningen zoals wond- en herbivoren door afweerreacties op te wekken, zowel in de beschadigde als in de distale onbeschadigde delen. Bij het verwonden van een blad treedt een toename van de cytosolische calciumionconcentratie (Ca2+ signaal) op de wondplaats op. Dit signaal wordt snel doorgegeven aan onbeschadigde bladeren, waar verdedigingsreacties worden geactiveerd. Ons recente onderzoek onthulde dat glutamaat dat uit de gewonde cellen van het blad lekt in de apoplast om hen heen dient als wondsignaal. Dit glutamaat activeert glutamaatreceptor-achtige Ca 2+ doorlaatbare kanalen, wat vervolgens leidt tot lange afstand Ca2+ signaal propagatie door de hele plant. De ruimtelijke en temporele kenmerken van deze gebeurtenissen kunnen worden vastgelegd met real-time beeldvorming van levende planten die genetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren uitdrukken. Hier introduceren we een plantbrede, real-time beeldvormingsmethode om de dynamiek van zowel de Ca2+ signalen als veranderingen in apoplastisch glutamaat die optreden als reactie op wondvorming te monitoren. Deze aanpak maakt gebruik van een breedveldfluorescentiemicroscoop en transgene Arabidopsis-planten die op groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerde Ca2+ en glutamaatbiosensoren uitdrukken. Daarnaast presenteren we methodologie om gemakkelijk wondgeïnduceerde, glutamaat-geactiveerde snelle en lange afstand Ca2 + signaalvoortplanting uit te lokken. Dit protocol kan ook worden toegepast op studies over andere plantenspanningen om te helpen onderzoeken hoe systemische signalering van planten betrokken kan zijn bij hun signalerings- en responsnetwerken.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Planten kunnen niet ontsnappen aan biotische spanningen, bijvoorbeeld insecten die zich ermee voeden, dus hebben ze geavanceerde stressdetectie- en signaaltransductiesystemen ontwikkeld om te detecteren en zichzelf vervolgens te beschermen tegen uitdagingen zoals herbivoren1. Bij een wond- of herbivore aanval initiëren planten snelle afweerreacties, waaronder accumulatie van het fytohormoon jasmonzuur (JA), niet alleen op de gewonde plaats, maar ook in onbeschadigde distale organen2. Deze JA activeert vervolgens beide afweerreacties in de direct beschadigde weefsels en induceert preventief afweer in de onbeschadigde delen van de plant. Bij Arabidopsiswerd de accumulatie van JA veroorzaakt door verwonding gedetecteerd in distale, intacte bladeren binnen slechts een paar minuten na schade elders in de plant, wat suggereert dat een snel en langeafstandssignaal wordt overgedragen van het gewonde blad3. Verschillende kandidaten, zoals Ca2+,reactieve zuurstofsoorten (ROS) en elektrische signalen, zijn voorgesteld om te dienen als deze langeafstandswondsignalen in planten4,5.

Ca2+ is een van de meest veelzijdige en alomtegenwoordige tweede boodschapperelementen in eukaryotische organismen. In planten veroorzaken het kauwen van rupsen en mechanische wond drastische verhogingen van de cytosolische Ca2+ concentratie ([Ca2+]cyt) zowel in het gewonde blad als in ongewikkelde verre bladeren6,7. Dit systemische Ca2+ signaal wordt ontvangen door intracellulaire Ca2+-sensing eiwitten, die leiden tot de activering van downstream verdedigingssignaleringsroutes, waaronder JA-biosynthese8,9. Ondanks talrijke dergelijke rapporten die het belang van Ca2+ signalen in de reacties op plantenwonden ondersteunen, is de informatie over de ruimtelijke en temporele kenmerken van Ca2+ signalen veroorzaakt door verwonding beperkt.

Real-time beeldvorming met behulp van genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren is een krachtig instrument om de ruimtelijke en temporele dynamiek van Ca2+ signalen te monitoren en te kwantificeren. Tot op heden zijn versies van dergelijke sensoren ontwikkeld die de visualisatie van Ca2+ signalen op het niveau van een enkele cel, naar weefsels, organen en zelfs hele planten mogelijk maken10. De eerste genetisch gecodeerde biosensor voor Ca2+ gebruikt in planten was het bioluminescente eiwit aequorin afgeleid van de kwal Aequorea victoria11. Hoewel dit chemiluminescente eiwit is gebruikt om Ca2 + veranderingen te detecteren in reactie op verschillende spanningen in planten12,13,14,15,16,17,18, is het niet goed geschikt voor real-time beeldvorming vanwege het extreem lage luminescente signaal dat het produceert. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-gebaseerde Ca2+ indicatoren, zoals de Gele cameleons, zijn ook met succes gebruikt om de dynamiek van een reeks Ca2+ signaleringsgebeurtenissen in planten19,20,21,22,23,24te onderzoeken . Deze sensoren zijn compatibel met beeldvormingsbenaderingen en bestaan meestal uit het Ca2+ bindende eiwit calmodulin (CaM) en een CaM-bindend peptide (M13) uit een myosine lichtketenkinase, allemaal versmolten tussen twee fluorofooreiwitten, over het algemeen een Cyaan Fluorescerend Eiwit (CFP) en een Gele Fluorescerende Eiwit variant (YFP)10. Ca2+ binding aan CaM bevordert de interactie tussen CaM en M13, wat leidt tot een conformationele verandering van de sensor. Deze verandering bevordert de energieoverdracht tussen het GVB en het GVB, waardoor de fluorescentie-intensiteit van het GVB toeneemt en tegelijkertijd de fluorescentie-emissie van het GVB afneemt. Het monitoren van deze verschuiving van GVB naar YFP fluorescentie geeft dan een maat voor de toename van ca2+ niveau. Naast deze FRET-sensoren zijn single fluorescent protein (FP)-gebaseerde Ca2+ biosensoren, zoals GCaMP en R-GECO, ook compatibel met plant imaging benaderingen en worden ze veel gebruikt om [Ca2+]cytveranderingen te bestuderen vanwege hun hoge gevoeligheid en gebruiksgemak25,26,27,28,29,30. GCaMP's bevatten een enkele circulair gepermuteerde (cp) GFP, opnieuw gefuseerd met CaM en het M13-peptide. De Ca2+-afhankelijke interactie tussen CaM en M13 veroorzaakt een conformationele verandering in de sensor die een verschuiving in de protonatietoestand van de cpGFP bevordert, waardoor het fluorescerende signaal wordt verbeterd. Dus naarmate ca2+ niveaus stijgen, neemt het cpGFP-signaal toe.

Om de dynamiek van Ca2+ signalen te onderzoeken die worden gegenereerd als reactie op mechanische wond- of herbivore voeding, hebben we transgene Arabidopsis thaliana-planten gebruikt die een GCaMP-variant, GCaMP3 en een fluorescentiemicroscoop in het breed veld uitdrukken6. Deze aanpak is erin geslaagd om een snelle overdracht van een ca2+ signaal over lange afstand van de wondplaats op een blad naar de hele plant te visualiseren. Zo werd een toename van [Ca2+]cyt onmiddellijk gedetecteerd op de wondplaats, maar dit Ca2 + signaal werd vervolgens binnen een paar minuten na het verwonden doorgegeven aan de naburige bladeren door de vasculatuur. Bovendien ontdekten we dat de overdracht van dit snelle systemische wondsignaal wordt afgeschaft in Arabidopsis-planten met mutaties in twee glutamaatreceptorachtige genen, Glutamaatreceptor Zoals (GLR), GLR3.3 en GLR3.66. De GLR's lijken te functioneren als aminozuur gated Ca2+ kanalen die betrokken zijn bij diverse fysiologische processen, waaronder wondrespons3, pollenbuisgroei31, wortelontwikkeling32, koude respons33, en aangeboren immuniteit34. Ondanks deze goed begrepen, brede fysiologische functie van de GLR's, is informatie over hun functionele eigenschappen, zoals hun ligand specificiteit, ion selectiviteit en subcellulaire lokalisatie, beperkt35. Recente studies meldden echter dat GLR3.3 en GLR3.6 gelokaliseerd zijn in respectievelijk het floëem en xyleem. Planten-GLR's vertonen overeenkomsten met ionotrope glutamaatreceptoren (iGluRs)36 bij zoogdieren, die worden geactiveerd door aminozuren, zoals glutamaat, glycine en D-serine in het zenuwstelsel van zoogdieren37. We hebben inderdaad aangetoond dat de toepassing van 100 mM glutamaat, maar niet van andere aminozuren, op de wondplaats een snel Ca2+ signaal op lange afstand induceert in Arabidopsis, wat aangeeft dat extracellulair glutamaat waarschijnlijk fungeert als een wondsignaal in planten6. Deze reactie wordt afgeschaft in de glr3.3/glr3.6 mutant wat suggereert dat glutamaat kan werken via een of beide van deze receptor-achtige kanalen en inderdaad, AtGLR3.6 werd onlangs aangetoond te worden gated door deze niveaus van glutamaat38.

In planten is, naast zijn rol als structureel aminozuur, ook glutamaat voorgesteld als een belangrijke ontwikkelingsregulator39; de ruimtelijke en temporele dynamiek worden echter slecht begrepen. Net als voor Ca2+zijn er verschillende genetisch gecodeerde indicatoren voor glutamaat ontwikkeld om de dynamiek van dit aminozuur in levende cellen40,41te monitoren . iGluSnFR is een GFP-gebaseerde single-FP glutamaat biosensor bestaande uit cpGFP en een glutamaatbindend eiwit (GltI) uit Escherichia coli42,43. De conformationele verandering van iGluSnFR, die wordt veroorzaakt door glutamaatbinding aan GltI, resulteert in een verbeterde GFP-fluorescentie-emissie. Om te onderzoeken of extracellulair glutamaat fungeert als een signaalmolecuul in de reactie van plantenwonden, hebben we de iGluSnFR-sequentie verbonden met de basis chitinase signaalpeptide secretiesequentie (CHIB-iGluSnFR) om deze biosensor in de apoplastische ruimte te lokaliseren6. Deze aanpak maakte beeldvorming mogelijk van eventuele veranderingen in de apoplastische glutamaatconcentratie ([Glu]apo) met behulp van transgene Arabidopsis-planten die deze sensor uitdrukken. We ontdekten snelle toenames van het iGluSnFR-signaal op de wondplaats. Deze gegevens ondersteunen het idee dat glutamaat uit de beschadigde cellen / weefsels naar de apoplast lekt bij het verwonden en fungeert als een schadesignaal dat de GLR's activeert en leidt tot het ca2 + -signaal over lange afstand in planten6.

Hier beschrijven we een plantbrede real-time beeldvormingsmethode met behulp van genetisch gecodeerde biosensoren om de dynamiek van langeafstandssignalen ca2+ en extracellulair glutamaat te monitoren en te analyseren als reactie opwondvorming 6. De beschikbaarheid van breedveldfluorescentiemicroscopie en transgene planten die genetisch gecodeerde biosensoren uitdrukken, biedt een krachtige, maar gemakkelijk te implementeren aanpak om snel overgedragen langeafstandssignalen, zoals Ca2+ golven, te detecteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Voorbereiding van plantaardig materiaal

  1. Steriliseer in een microbuis van 1,5 ml de zaden van de Arabidopsis thaliana (Col-0 toetredings)plant, die GCaMP3 of CHIB-iGluSnFR uitdrukt door 3 minuten met 20% (v/v) NaClO te schudden en vervolgens 5 keer te wassen met steriel gedestilleerd water.
    OPMERKING: De transgene lijnen van Arabidopsis die GCaMP3 of CHIB-iGluSnFR uitdrukken, zijn eerder beschreven6.
  2. Zaai in een steriele kap 13 oppervlaktegesteriliseerde zaden op een vierkante plastic petrischaal van 10 cm gevuld met 30 ml steriel (autoclaaf) Murashige en Skoog (MS) medium [1x MS-zouten, 1% (w/v) sacharose, 0,01% (w/v) myoinositol, 0,05% (w/v) MES en 0,5% (w/v) Vervang het deksel en de wikkel met chirurgische tape.
  3. Na incubatie in het donker bij 4 °C gedurende 2 dagen, plaatst u de platen horizontaal op 22 °C in een groeikamer onder continu licht (90-100 μmol m-2 s-1) gedurende ongeveer 2 weken voor gebruik. Tel na 2 weken het aantal Arabidopsisbladeren van oudste naar jongste44 (figuur 1). Wondreacties gaan bij voorkeur van het beschadigde blad (n) naar bladeren met de ± 3 en n ± 56.
    OPMERKING: In dit protocol wordt de petrischaal geopend voor het in beeld brengen van de wond- en glutamaateffecten onder een fluorescentiemicroscoop. Daarom moeten de volgende stappen in dit experiment worden uitgevoerd onder temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerde ruimteomstandigheden. Dit komt omdat Ca2+ signalen ook worden opgewekt door veranderingen in deze omgevingsomstandigheden. Het is ook bekend dat het blauwe licht, dat tijdens de opname door de microscoop wordt uitgezonden voor excitatie van de fluorescentie van het biosensoreiwit, een toename van cytosolische Ca2 + concentratie45 kan opwekken en dus moet de plant enkele minuten aan de blauwe lichtbestraling worden geacclimateerd voordat met het experiment wordt begonnen.

2. Chemisch preparaat

  1. Los L-Glutamaat op in een vloeibaar groeimedium [1/2x MS-zouten, 1% (w/v) sacharose en 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 aangepast met 1N KOH] om een 100 mM werkoplossing te maken.
    OPMERKING: Vermijd het gebruik van zouten van glutamaat zoals natriumglutamaat om mogelijke kationgerelateerde effecten op ca2+ dynamiek te voorkomen.

3. Microscoop instellen en uitvoeren van real-time beeldvorming

  1. Schakel de gemotoriseerde fluorescentiesterioscoop in die is uitgerust met een 1x objectief (NA = 0,156) en een sCMOS-camera (figuur 2) en configureer de apparaatinstellingen om te bestralen met een excitatielicht van 470/40 nm en een emissielicht te verkrijgen dat door een filter van 535/50 nm gaat.
    OPMERKING: Elke GFP-gevoelige fluorescentiemicroscoop kan worden gebruikt om GCaMP3- en iGluSnFR-signalen in realtime te detecteren, maar een objectief met een laag vermogen en een zeer gevoelige camera met een brede sCMOS-chip worden aanbevolen om signalen van de hele fabriek te ontvangen. De doelstelling met een laag vermogen maakt het mogelijk om de reactie van een hele Arabidopsis-installatie in beeld te brengen en het gebruik van een zeer gevoelige camera maakt de snelle gegevensverzameling mogelijk die nodig is om het snelle tijdverloop van de door de wond getriggerde Ca2 + -golf vast te leggen. Voor de fluorescentiemicroscoop die in deze studie wordt gebruikt, zijn de maximale waarden van het gezichtsveld en de tijdresolutie respectievelijk 3 cm x 3 cm en 30 frames per seconde (fps).
  2. Verwijder het deksel en plaats de schotel onder de objectieve lens.
  3. Controleer het fluorescentiesignaal van de plant en wacht vervolgens ongeveer 30 minuten in het donker totdat de planten zijn aangepast aan de nieuwe omgevingsomstandigheden. Deze aanpassingsstap is vereist omdat veranderingen in vochtigheid [Ca2+]cytverhoging in planten oproepen die wondgerelateerde gebeurtenissen kunnen verstoren.
  4. Pas de focus en vergroting aan om de hele plant in het gezichtsveld te zien. In het huidige protocol werd een vergroting van 0,63x gebruikt.
  5. Voordat u met real-time beeldvorming begint, stelt u de acquisitieparameters in om de fluorescentiesignalen te detecteren met behulp van microscoopbeeldsoftware. De instellingen voor beeldvorming in het huidige protocol zijn: belichtings- en intervaltijden ingesteld op respectievelijk 1,8 s en 2 s (d.w.z. 0,5 fps). Stel de opnametijd in op 11 min.
  6. Afbeelding gedurende 5 minuten voorafgaand aan het starten van het experiment om de plant te acclimatiseren aan de blauwlichtbestraling van de microscoop en begin vervolgens met opnemen door op Nu uitvoerente klikken , of het equivalente commando in de microscoopsoftware die wordt gebruikt. Om de gemiddelde fluorescentie bij aanvang te bepalen, moet u ten minste 10 frames registreren (d.w.z. ten minste 20 s in het huidige protocol) voordat u de behandeling of het glutamaat aanbrengt (zie rubriek 4).
    1. Voor real-time beeldvorming van wondgeïnduceerde [Ca2+] cyt en [Glu]apoveranderingen, snijdt u de bladsteel of het middelste gebied van blad L1 met een schaar (figuur 3 en figuur 4).
    2. Voor real-time beeldvorming van glutamaat-geactiveerde [Ca2+]cytveranderingen, snijdt u de rand (ongeveer 1 mm van de punt) van blad 1 over de hoofdader met een schaar. Breng na ten minste 20 minuten herstelperiode 10 μL 100 mM glutamaat aan op het snijoppervlak van het blad (figuur 5).
      OPMERKING: Deze voorsnijding was nodig om glutamaat toegang te geven tot de bladapoplast om reacties te activeren. Bovendien bleek het aanbrengen van een druppel gedestilleerd water op het snijoppervlak van blad L1 van cruciaal belang om te voorkomen dat de monsters tijdens het herstel uitdroogden voordat glutamaat werd aangebracht.
  7. Sla na het voltooien van de 11 minuten opname de gegevens op.

4. Gegevensanalyse

  1. Definieer voor fluorescentie-intensiteitsanalyse in de loop van de tijd een interessegebied (ROI) op de plaats waar de fluorescentie-intensiteit moet worden geanalyseerd (figuur 6 en figuur 7). Definieer voor de snelheidsberekening van de Ca2+ golf 2 ROIs (ROI1 en ROI2) voor analyse. Klik in de beeldvormingssoftware op Tijdmeting | Definieer | Cirkel. Meet de afstand tussen ROI1 en ROI2 door te klikken op Annotaties en Meting | Lengte | Eenvoudige lijn (figuur 6).
  2. Meet de ruwe fluorescentiewaarden (F) in elke ROI in de loop van de tijd door op Metente klikken. Exporteer onbewerkte gegevens naar een spreadsheetsoftware om het fluorescentiesignaal op elk moment in getallen om te zetten door op Alles naar Excel te klikken | Exporteren.
  3. Bepaal de fluorescentiewaarde van de uitgangswaarde, gedefinieerd als F0, door het gemiddelde van F over de eerste 10 frames (d.w.z. voorafgaand aan de behandeling) in de geregistreerde gegevens te berekenen.
  4. Normaliseer de F-gegevens (door ΔF/F te berekenen) met behulp van de vergelijking ΔF/F = (F−F0)/F0, waarbij ΔF de tijdsafhankelijke verandering in fluorescentie is.
  5. Definieer voor Ca2+ golfsnelheidsgolfanalyse een significant signaalstijgingspunt boven de vooraf gestimuleerde waarden als een detectie van een Ca2+ toename van elke ROI (t1 en t2) met behulp van het criterium van een stijging tot 2× de standaardafwijking (2x SD) die wordt berekend op basis van de F0-gegevens met behulp van statistische software. 95% van de F0-gegevens valt binnen 2x SD ten opzichte van het gemiddelde, wat aangeeft dat een stijging van het signaal boven dit niveau bij toeval ≤5% is. Bereken het tijdsverschil van de Ca2+ toename tussen ROI1 en ROI2 [t2- t1 time-lag (Δt)] en meet de afstand tussen ROI1 en ROI2, en bepaal vervolgens de snelheden van elke Ca2+ golf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Signaalvoortplanting van [Ca2+]cyt en [Glu]apo als reactie op verwondingen wordt weergegeven in figuur 3, figuur 4, film S1en film S2. Het snijden van de bladsteel van blad 1 in planten die GCaMP3 uitdrukken (bij 0 s) leidde tot een significante toename van [Ca2+]cyt die lokaal snel werd geïnduceerd door de vasculatuur (bij 40 s) (Figuur 3 en Film S1). Vervolgens werd het signaal binnen enkele minuten (bij 80 s) snel doorgegeven aan naburige bladeren (blad 3 en 6) (figuur 3 en film S1).

Bij het snijden van blad 1 in planten die CHIB-iGluSnFR uitdrukken, werd een snelle [Glu]apo-toename waargenomen rond het snijgebied (bij 2 s). Dit signaal werd binnen enkele minuten (bij 160 s) lokaal door de vasculatuur gepropageerd, maar werd niet waargenomen in systemische bladeren (figuur 4 en film S2).

Voor de real-time beeldvorming van Ca2+ signaalvoortplanting veroorzaakt door de toepassing van glutamaat, werd de rand (ongeveer 1 mm van de punt) van blad 1 in planten die GCaMP3 uitdrukken gesneden zoals weergegeven in figuur 5A en film S3. Het doorsnijden van de rand van blad 1 veroorzaakte een lokale [Ca2+]cytverhoging (bij 40 s), maar dit signaal verdween binnen een paar minuten (bij 124 s). Na ongeveer 10 minuten te hebben gewacht tot de plant zich herstelde, werd 10 μL van 100 mM glutamaat aangebracht op het snijoppervlak van blad 1, wat een snelle, significante toename van [Ca2+]cyt lokaal veroorzaakte (bij 56 s) en signaalvoortplanting naar distale bladeren (bij 104 s) (Figuur 5B en Movie S4).

Om de veranderingen in [Ca2+]cyt te meten die werden veroorzaakt door verwondingen in het systemische blad, werden twee ROIs (ROI1 en ROI2) ingesteld op het basisgebied en de punt van blad 6 in planten die GCaMP3 uitdrukken, zoals weergegeven in figuur 6A. De tijdsverandering van de signaalintensiteit van GCaMP3 in ROI1 en ROI2 bij het snijden van de bladsteel van blad 1 werd gemeten (figuur 6B). Een significante toename van [Ca2+]cyt bij ROI1 werd eerder gedetecteerd dan die van ROI2 (Figuur 6B). [Ca2+] cyt piekte op ongeveer 100 s na het verwonden, duurde meer dan 10 min, en vertoonde twee fasen (Figuur 6B).

Om de snelheden van de Ca2+ golf bij mechanisch verwonden te bepalen, werd het tijdspunt van een significante signaalstijging boven de vooraf gestimuleerde waarden in ROI1 en ROI2 bepaald (tijdsvertraging; zie sectie 4) (Figuur 6C). Omdat de afstand tussen ROI1 en ROI2 in dit geval 2,7 mm was(figuur 6A),werd de Ca2+ signaalsnelheid in blad 6 berekend als 0,15 mm/s. Om de veranderingen in deapo [Glu] als reactie op de mechanische schade te meten, werd ROI1 ingesteld in de buurt van de snijplaats van het blad gemarkeerd als L1, zoals weergegeven in figuur 7A. [Glu] apo-signatuur op ROI1 heeft bij het verwonden een enkele piek van ongeveer 100 s vertoond (figuur 7B).

Figure 1
Figuur 1: Nummering van Arabidopsis rozetbladeren. Arabidopsis bladeren zijn genummerd van oudste tot jongste (linker paneel). In het rechterpaneel wordt een schematisch schema van de positie van de bladeren aangegeven. L: blad, C: cotyledons. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Een fluorescentiemicroscoop gebruikt in deze studie. [Ca2+]cyt en [Glu]apo dynamica werden afgebeeld met een breedveld fluorescentie stereomicroscoop. R: Afstandsbediening, O: 1x objectieve lens, C: sCMOS camera, T: Trinocular kantelbuis, S: Stage, P: Plant materiaal. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Wondgeïnduceerde langeafstands- Ca2+ signaaloverdracht. Het snijden van de bladsteel (witte pijl, 0 s) van blad 1 (L1) in plant die GCaMP3 uitdrukt, veroorzaakte een lokale [Ca2+]cytverhoging (rode pijl, 40 s) die werd overgedragen op systemische bladeren [blad 3 (L3) en blad 6 (L6)] (oranje pijlen, 80 s). Schaalbalk, 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Door wond getriggerde [Glu]apo-verhoging. Het snijden van blad 1 (L1) (witte pijl, 0 s) in planten die CHIB-iGluSnFR uitdrukken, veroorzaakte een snelle verhoging van [Glu]apo (rode pijl, 80 s) die zich door de vasculatuur voortplantte (oranje pijl, 160 s). Schaalbalk, 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Glutamaat-geactiveerde langeafstands- Ca2+ signaaloverdracht. (A) Het snijden van de rand (ongeveer 1 mm van de punt) van blad 1 (L1) in planten die GCaMP3 (witte pijl, 0 s) uitdrukken, veroorzaakte een [Ca2+]cytverhoging (rode pijl, 40 s). (B) Toepassing van 100 mM glutamaat op het snijoppervlak van L1 (witte pijl, 0 s) veroorzaakte een lokale [Ca2+]cytverhoging (rode pijl, 56 s) die zich snel voortplantte tot distale bladeren [bijv. blad 3 (L3), blad 4 (L4) en blad 6 (L6)] (oranje pijlen, 104 s). Schaalbalken, 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: [Ca2+]cyt signatuur in systemische bladeren als reactie op mechanische wond. (A) Een uitgebreid beeld van blad 6 (L6) in planten die GCaMP3 uitdrukken is weergegeven in Figuur 3. ROI1 (blauwe cirkel) en ROI2 (roze cirkel) werden respectievelijk ingesteld op het basis- en tipgebied. Witte pijl geeft de snijplaats van blad 1's bladsteel (L1) aan. In dit geval was de afstand tussen ROI1 en ROI2 2,7 mm. (B) Kwantificering van [Ca2+]cyt-handtekeningen in ROI1 en ROI2. Veranderingen in de fluorescentie-intensiteit werden geanalyseerd met behulp van beeldvormingssoftware. (C) Een uitgebreid spoor van gegevens in (B) tussen 0 s en 80 s. Detectiepunten van een Ca2+ toename van ROI1 en ROI2 werden gedefinieerd als respectievelijk t1 en t2,met als criterium een stijging tot 2x de standaardafwijking van de prestimulatiewaarden (2x SD, stippellijn). De waarde van t2 - t1 werd gedefinieerd als tijdsvertraging (Δt) in het huidige protocol. Zwarte pijl geeft de snijtijd aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: [Glu]apo signatuur als reactie op mechanisch verwonden. (A) Een uitgebreid beeld van blad 1 (L1) in planten die CHIB-iGluSnFR uitdrukken is weergegeven in figuur 4. ROI1 werd ingesteld in de buurt van de cut site. Witte pijl geeft het snijgebied aan. (B) Kwantificering van [Glu]apo-handtekening in ROI1 wordt gecontroleerd met behulp van beeldvormingssoftware. Zwarte pijl geeft de snijtijd aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Film S1: Lange afstand Ca2+ transmissie na mechanisch verwonden. Mechanische wonding aan de bladsteel van blad 1 (L1) veroorzaakte een [Ca2+]cytverhoging die werd overgedragen op distale bladeren [bijv. blad 3 (L3) en blad 6 (L6)]. Klik hier om deze film te downloaden.

Film S2: Verhoging van de apoplastische glutamaatniveaus als reactie op snijden. Mechanische wond van blad 1 (L1) veroorzaakte een onmiddellijke toename van [Glu]apoKlik hier om deze film te downloaden.

Film S3: Verhoging van [Ca2+]cytniveaus als reactie op snijden. Mechanische wond aan de rand van blad 1 (L1) veroorzaakte een onmiddellijke, lokale [Ca2+]cytverhoging. Klik hier om deze film te downloaden.

Film S4: Toepassing van glutamaat triggers systemische [Ca2+]cyt verhoogt. Toepassing van 100 mM glutamaat veroorzaakte Ca2+ transmissie op systemische bladeren [bijv. blad 3 (L3), blad 4 (L4) en blad 6 (L6)]. Klik hier om deze film te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Systemische signalering is belangrijk voor planten om te reageren op gelokaliseerde externe omgevingsprikkels en vervolgens hun homeostase op een heel plantniveau te behouden. Hoewel ze niet zijn uitgerust met een geavanceerd zenuwstelsel zoals dieren, maken ze gebruik van snelle communicatie zowel binnen als tussen organen op basis van factoren zoals mobiele elektrische (en mogelijk hydraulische) signalen en voortplantingsgolven van ROS en Ca2+ 46,47. Het hierboven beschreven protocol maakt plantbrede, real-time beeldvorming van de activiteit van dit signaleringssysteem mogelijk door de dynamiek van Ca2+ en apoplastisch glutamaat als reactie op verwondingen te monitoren. Deze methode biedt een robuust hulpmiddel om snelle en langeafstandssignalen in planten te begrijpen die een hoge spatiotemporale resolutie en gebruiksgemak combineren. Dit protocol biedt ook het potentieel om nieuwe fysiologische inzichten te verschaffen in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan wondsignalering over lange afstand door bijvoorbeeld mutanten die defect zijn in putatieve elementen van het snelle signaleringssysteem of exploratie van de effecten van farmacologische reagentia zoals Ca2+ kanaalblokkers (bijv. LaCl3) of remmers van andere potentieel belangrijke signaleringsactiviteiten6.

Een belangrijk voordeel van de beschreven biosensor imaging methode is het gebruik van single-FP biosensoren met een hoge fluorescerende opbrengst, waardoor zowel de benodigde apparatuur om deze metingen uit te voeren als hun in planta gebruik aanzienlijk wordt vereenvoudigd. Fluorescentiegebaseerde genetisch gecodeerde indicatoren zijn dus onderverdeeld in twee klassen: 1) op intensiteit gebaseerde single-FP biosensoren en 2) ratiometrische FRET-gebaseerde biosensoren10. Hoewel ratiometrische FRET-gebaseerde sensoren kwantitatief nauwkeurig zijn, bieden op intensiteit gebaseerde Ca2+ indicatoren, waaronder de GCaMP3 en iGluSnFR die hier worden gebruikt, zowel een hogere tijdsresolutie als gebruiksgemak vanwege hun over het algemeen helderdere Ca2 +-responsieve signaal en hun eenvoudigere microscoopvereisten10. Bijvoorbeeld, de rood-fluorescerende eiwit-gebaseerde single-FP Ca2+ indicator R-GECO1 werd gemeld om een veel grotere signaalverandering te tonen in reactie op extracellulaire ATP en de plantaardige verdediging elicitors flg22 en chitine, in vergelijking met de ratiometrische YC3.6 biosensor27. Voor de analyse van ratiometrische FRET-gebaseerde sensoren is het ook noodzakelijk om een gespecialiseerde microscoop met meerdere filters te gebruiken om gegevens op twee golflengten te verzamelen, terwijl biosensoren op basis van één KP vereisen dat het apparaat de gegevens op slechts één golflengte verzamelt, een mogelijkheid die in alle standaard fluorescentiemicroscopen wordt gevonden10. Het is echter belangrijk op te merken dat er enkele nadelen zijn aan het gebruik van single-FP biosensoren. Deze op intensiteit gebaseerde, single-FP biosensoren hebben niet de voorkeur voor het kwantificeren van absolute concentratieveranderingen of voor langetermijnbeeldvorming gedurende vele uren of dagen. Deze beperking komt omdat, naast bijvoorbeeld ca2+ niveau voor GCaMP3, de signaalintensiteit van deze single-FP biosensoren wordt verondersteld te worden beïnvloed door andere factoren zoals het sensorexpressieniveau of parameters zoals cellulaire pH die in de loop van de tijd kunnen veranderen.

Tot op heden zijn veel nieuwe varianten van deze genetisch gecodeerde indicatoren ontworpen om de signaal-ruisverhouding, dynamisch bereik, kinetiek en sensorstabiliteit te verbeteren. Nadat Nakai et al.26 bijvoorbeeld de eerste GCaMP hadden ontwikkeld, zijn verschillende opeenvolgende varianten, zoals de GECO 's, gegenereerd door een combinatie van mutagenese en zorgvuldige karakterisering48,49,50. Het dynamisch bereik van G-GECO (Green-GECO) was naar verluidt ongeveer twee keer groter dan dat van GCaMP328. Bovendien leidde de vervanging door verschillende fluorescerende eiwitten in deze indicatoren tot de generatie van GECO-varianten met verschillende emissiespectra, zoals B-GECO (Blue-GECO) en R-GECO (Red-GECO), waardoor deze indicatoren naast andere GFP-spectrale varianten in meerkleurige beeldvormingstoepassingen28kunnen worden gebruikt. Evenzo is GCaMP verder ontwikkeld en verbeterd met een reeks sensoren die zijn verbeterd voor de reactiesnelheid en amplitude van het signaal dat nu beschikbaar is50. Voor het monitoren van glutamaatdynamiek, met andere dan iGluSnFR, een reeks fret-gebaseerde glutamaatbiosensoren, zijn de FLuorescent Indicator Proteins for Glutamate (FLIPE) ontwikkeld40. FLIPE bestaat uit GVB en YFP die met elkaar verbonden zijn via het glutamaatbindende eiwit ybeJ afkomstig van E. coli. Bij glutamaatbinding aan ybeJ wordt een glutamaatconcentratieafhankelijke afname van fret-efficiëntie waargenomen. Daarom zijn er voor zowel Ca2+ als glutamaat meerdere single-FP en ratiometrische sensoren beschikbaar. Onderzoekers moeten de juiste biosensor overwegen om signaaldynamiek te detecteren, afhankelijk van het experimentele ontwerp en de vereisten voor meetfactoren zoals hoge signaal:ruis (single-FP-sensoren) versus een behoefte aan zeer nauwkeurige kwantificering (waar FRET-sensoren uitblinken).

De breedveldse, single-FP beeldvormingsmethode die hier wordt beschreven voor het verwonden, moet ook nuttig zijn wanneer deze wordt toegepast op andere stress systemische signaleringsprocessen. Ondanks de aanwezigheid van talrijke rapporten die wijzen op een cruciale rol van ca2+ signalering op lange afstand in verschillende stressreacties, zoals herbivore attack6,51,52, salt20en droogte53, hebben slechts enkele studies de spatiotemporale informatie verstrekt met betrekking tot snelle ca2+ langeafstandssignalen die door deze stressreacties worden geïnduceerd6,7,20,52. Het gebruik van een breedveldfluorescentiemicroscoop in dit protocol maakt het ook mogelijk om mobiele signaaldynamiek real-time te observeren, niet alleen in blad-tot-bladcommunicatie, maar ook root-to-shoot-communicatie zoals onlangs aangetoond38. Hoewel we ons hebben gericht op protocollen voor Arabidopsis, biedt deze plantbrede real-time beeldvormingsmethode ook een robuust hulpmiddel om de ruimtelijke en temporele kenmerken van systemische Ca2+ signalering te begrijpen in zowel biotische als abiotische stressreacties bij andere plantensoorten zoals tabak30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 en 18H05491) aan MT, de National Science Foundation (IOS1557899 en MCB2016177) en de National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G en 80NSSC19K0126) aan SG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32, (9), 1161-1174 (2009).
  2. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, (1), 387-415 (2018).
  3. Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500, (7463), 422-426 (2013).
  4. Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171, (3), 1606-1615 (2016).
  5. Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67, (1), 287-307 (2016).
  6. Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361, (6407), 1112-1115 (2018).
  7. Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (40), 10178-10183 (2018).
  8. Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171, (2), 249-269 (2006).
  9. Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227, (4), 1037-1050 (2020).
  10. Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29, (3), 144-152 (2011).
  11. Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, (2), 229-234 (1967).
  12. Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23, (2), 267-278 (2000).
  13. Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6, (2), 444-455 (2013).
  14. Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440, (3), 355-373 (2011).
  15. Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93, (12), 2095-2101 (2011).
  16. Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163, (2), 543-554 (2013).
  17. Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
  18. Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (35), 5242-5249 (2016).
  19. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (29), 10554-10559 (2004).
  20. Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (17), 6497-6502 (2014).
  21. Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171, (3), 1771-1784 (2016).
  22. Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, (31), 18849-18857 (2020).
  23. Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216, (4), 1161-1169 (2017).
  24. Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70, (1), 118-128 (2012).
  25. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (6), 3197-3202 (2001).
  26. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, (2), 137-141 (2001).
  27. Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8, (8), 1188-1200 (2015).
  28. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333, (6051), 1888-1891 (2011).
  29. Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142 (2017).
  30. DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58, (7), 1173-1184 (2017).
  31. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332, (6028), 434-437 (2011).
  32. Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67, (6), 1853-1869 (2016).
  33. Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42, (12), 3326-3339 (2019).
  34. Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162, (3), 1497-1509 (2013).
  35. Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69, (17), 4151-4163 (2018).
  36. De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
  37. Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2, (1), 232 (2011).
  38. Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13, (640), (2020).
  39. Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58, (9), 2339-2358 (2007).
  40. Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (24), 8740-8745 (2005).
  41. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (11), 4411-4416 (2008).
  42. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, (2), 162-170 (2013).
  43. Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15, (11), 936-939 (2018).
  44. Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. (2013).
  45. Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83, (1), 102-111 (2007).
  46. Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67, (7), 2063-2079 (2016).
  47. Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90, (4), 698-707 (2017).
  48. Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (12), 4753-4758 (2006).
  49. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, (12), 875-881 (2009).
  50. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, (7458), 295-300 (2013).
  51. Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29, (6), 1460-1479 (2017).
  52. Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31, (7), 1539-1562 (2019).
  53. Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15, (8), 1833-1845 (2003).
Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij <em>Arabidopsis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter