Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Imagerie en temps réel à large champ des signaux de plaies locales et systémiques chez Arabidopsis

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Summary

La signalisation systémique glutamate-déclenchée extracellulaire de calcium est critique pour l’induction des réponses de défense des plantes à la blessure mécanique et à l’attaque herbivore dans les plantes. Cet article décrit une méthode pour visualiser la dynamique spatiale et temporelle de ces deux facteurs utilisant des plantes de thaliana d’Arabidopsis exprimant des biocapteurs fluorescents calcium et glutamate-sensibles.

Abstract

Les plantes réagissent aux contraintes mécaniques telles que la blessure et l’herbivorie en induisant des réponses de défense à la fois dans les parties endommagées et dans les parties distales non endommagées. Lors du enroulement d’une feuille, une augmentation de la concentration cytosolique d’ions calcium (signal Ca2+) se produit sur le site de la plaie. Ce signal est rapidement transmis aux feuilles intactes, où les réponses de défense sont activées. Nos recherches récentes ont révélé que le glutamate qui fuit des cellules blessées de la feuille dans l’apoplaste qui les entoure sert de signal de plaie. Ce glutamate active les canaux perméables Ca2+ de type récepteur du glutamate, ce qui conduit ensuite à la propagation du signal Ca2+ à longue distance dans toute la plante. Les caractéristiques spatiales et temporelles de ces événements peuvent être capturées avec l’imagerie en temps réel de plantes vivantes exprimant des biocapteurs fluorescents génétiquement codés. Ici, nous introduisons une méthode d’imagerie en temps réel à l’échelle de la plante pour surveiller la dynamique des signaux Ca2 + et des changements dans le glutamate apoplasique qui se produisent en réponse à la blessure. Cette approche utilise un microscope à fluorescence à large champ et des plantes arabidopsis transgéniques exprimant des biocapteurs Ca2+ et glutamate à base de protéines fluorescentes vertes (GFP). En outre, nous présentons la méthodologie pour obtenir facilement la propagation rapide et à longue distance causée par la blessure et glutamate-déclenchée de signal de Ca2+. Ce protocole peut également être appliqué à des études sur d’autres contraintes de la plante pour aider à étudier comment la signalisation systémique de la plante pourrait être impliquée dans leurs réseaux de signalisation et de réponse.

Introduction

Les plantes ne peuvent pas échapper aux stress biotiques, par exemple les insectes qui s’en nourrissent, elles ont donc développé des systèmes sophistiqués de détection du stress et de transduction des signaux pour détecter et ensuite se protéger contre des défis tels que l’herbivorie1. Lors d’une blessure ou d’une attaque herbivore, les plantes déclenchent des réponses de défense rapides, y compris l’accumulation de l’acide jasmonique phytohormone (JA) non seulement sur le site blessé, mais également dans les organes distaux intacts2. Ce JA déclenche alors à la fois des réponses de défense dans les tissus directement endommagés et induit préventivement des défenses dans les parties intactes de la plante. Chez Arabidopsis,l’accumulation de JA induite par la blessure a été détectée dans des feuilles distales et intactes en quelques minutes seulement après avoir été endommagées ailleurs dans la plante, ce qui suggère qu’un signal rapide et à longue distance est transmis à partir de la feuille blessée3. Plusieurs candidats, tels queCa2+,les espèces réactives de l’oxygène (ROS), et les signaux électriques, ont été proposés pour servir de signaux enroulés à longue distance dans les plantes4,5.

Ca2+ est l’un des éléments messagers deuxièmes les plus polyvalents et les plus omniprésents dans les organismes eucaryotes. Chez les plantes, la mastication des chenilles et les blessures mécaniques provoquent des augmentations drastiques de la concentration cytosolique deCa2+ ([Ca2+]cyt)à la fois dans la feuille blessée et dans les feuilles éloignées non enroulées6,7. Ce signal systémiqueCa2+ est reçu par des protéines de détectionca2+intracellulaires, qui conduisent à l’activation des voies de signalisation de défense en aval, y compris la biosynthèse JA8,9. En dépit de nombreux tels rapports soutenant l’importance des signaux de Ca2+ dans des réponses de blessure d’usine, l’information sur les caractéristiques spatiales et temporelles des signaux de Ca2+ induits par blessure est limitée.

L’imagerie en temps réel à l’aide d’indicateurs Ca2+ génétiquement codés est un outil puissant pour surveiller et quantifier la dynamique spatiale et temporelle des signaux Ca2+. À ce jour, des versions de ces capteurs ont été développées qui permettent la visualisation des signaux Ca2+ au niveau d’une seule cellule, vers des tissus, des organes et même des plantes entières10. Le premier biocapteur génétiquement codé pour Ca2+ utilisé dans les plantes était la protéine bioluminescente aequorine dérivée de la méduse Aequorea victoria11. Bien que cette protéine chimiluminescente ait été utilisée pour détecter les changements deCa2+ en réponse à diverses contraintes chez les plantes12,13,14,15,16,17,18,elle n’est pas bien adaptée à l’imagerie en temps réel en raison du signal luminescent extrêmement faible qu’elle produit. Les indicateurs Ca2+ basés sur le transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET), tels que les caméléons jaunes, ont également été utilisés avec succès pour étudier la dynamique d’une gamme d’événements de signalisation Ca2 + dans les plantes19,20,21,22,23,24. Ces capteurs sont compatibles avec les approches d’imagerie et sont le plus souvent composés de la protéine de liaison Ca2+ calmoduline (CaM) et d’un peptide de liaison au CaM (M13) à partir d’une kinase à chaîne légère de myosine, toutes fusionnées entre deux protéines fluorophores, généralement une protéine fluorescente cyan (CFP) et une variante de protéine fluorescente jaune (YFP)10. Ca2+ se liant au CaM favorise l’interaction entre le CaM et le M13 conduisant à un changement conformationnel du capteur. Ce changement favorise le transfert d’énergie entre le CFP et le YFP, ce qui augmente l’intensité de fluorescence du YFP tout en diminuant l’émission de fluorescence du CFP. La surveillance de ce passage de la CFP à la fluorescence YFP fournit ensuite une mesure de l’augmentation du niveau de Ca2 +. En plus de ces capteurs FRET, les biocapteurs Ca2+ à base de protéines fluorescentes uniques (FP), tels que GCaMP et R-GECO, sont également compatibles avec les approches d’imagerie végétale et sont largement utilisés pour étudier les changementsde cytaires [Ca2+ ] en raison de leur sensibilité élevée et de leur facilité d’utilisation25,26,27,28,29,30. Les GCaMPs contiennent un seul GFP permuté circulairement (cp), à nouveau fusionné au CaM et au peptide M13. L’interaction dépendante du Ca2+entre le CaM et le M13 provoque un changement conformationnel dans le capteur qui favorise un changement dans l’état de protonation du cpGFP, améliorant ainsi son signal fluorescent. Ainsi, à mesure que les niveaux de Ca2+ augmentent, le signal cpGFP augmente.

Pour étudier la dynamique des signaux Ca2+ générés en réponse à une blessure mécanique ou à une alimentation herbivore, nous avons utilisé des plantes transgéniques Arabidopsis thaliana exprimant une variante GCaMP, GCaMP3, et un microscope à fluorescence à large champ6. Cette approche a réussi à visualiser la transmission rapide d’un signal Ca2+ longue distance du site de la plaie sur une feuille à la plante entière. Ainsi, une augmentation de [Ca2+]cyt a été immédiatement détectée à l’emplacement de blessure mais ce signal de Ca2+ a été alors propagé aux feuilles voisines par la vascularisation dans quelques minutes de blessure. En outre, nous avons constaté que la transmission de ce signal de plaie systémique rapide est abolie dans les plantes Arabidopsis avec des mutations dans deux gènes récepteur-comme de glutamate, glutamate récepteur comme (GLR), GLR3.3, et GLR3.66. Les GLR semblent fonctionner comme des canaux Ca2+ à capté d’acides aminés impliqués dans divers processus physiologiques, y compris la réponse de la plaie3,la croissance du tubepollinique 31,le développement des racines32,la réponse au froid33et l’immunité innée34. Malgré cette fonction physiologique large et bien comprise des GLRs, les informations sur leurs propriétés fonctionnelles, telles que leur spécificité de ligand, leur sélectivité ionique et leur localisation subcellulaire, sont limitéesà 35. Cependant, des études récentes ont rapporté que GLR3.3 et GLR3.6 sont localisés dans le phloème et le xylème, respectivement. Les GLR végétaux présentent des similitudes avec les récepteurs ionotropes du glutamate (iGluRs)36 chez les mammifères, qui sont activés par des acides aminés, tels que le glutamate, la glycine et la D-sérine dans le système nerveux des mammifères37. En effet, nous avons démontré que l’application de glutamate de 100 mM, mais pas d’autres acides aminés, sur le site de la plaie induit un signalCa2+ rapide et à longue distance chez Arabidopsis,indiquant que le glutamate extracellulaire agit probablement comme un signal de plaie dans les plantes6. Cette réponse est supprimée dans le mutant glr3.3/glr3.6 suggérant que le glutamate peut agir par l’un ou les deux canaux de type récepteur et en effet, AtGLR3.6 s’est récemment avéré être fermée par ces niveaux de glutamate38.

Dans les plantes, en plus de son rôle d’acide aminé structurel, le glutamate a également été proposé comme régulateur clé du développement39; cependant, sa dynamique spatiale et temporelle est mal comprise. Tout comme pour leCa2+,plusieurs indicateurs génétiquement codés pour le glutamate ont été développés pour surveiller la dynamique de cet acide aminé dans les cellules vivantes40,41. iGluSnFR est un biocapteur de glutamate mono-FP à base de GFP composé de cpGFP et d’une protéine de liaison au glutamate (GltI) d’Escherichia coli42,43. Le changement conformationnel d’iGluSnFR, qui est induit par la liaison de glutamate à GltI, a comme conséquence une émission augmentée de fluorescence de GFP. Pour étudier si le glutamate extracellulaire agit comme une molécule de signalisation dans la réponse de la plaie végétale, nous avons connecté la séquence iGluSnFR avec la séquence de sécrétion peptidique signal de chitinase de base (CHIB-iGluSnFR) pour localiser ce biocapteur dans l’espace apoplasique6. Cette approche a permis l’imagerie de tout changement dans la concentration de glutamate apoplasique ([Glu]apo)en utilisant des plantes transgéniques d’Arabidopsis exprimant ce capteur. Nous avons détecté des augmentations rapides du signal d’iGluSnFR à l’emplacement de blessure. Ces données soutiennent l’idée que le glutamate s’échappe des cellules / tissus endommagés vers l’apoplaste lors de la blessure et agit comme un signal de dommage activant les GLRs et conduisant au signal Ca2 + à longue distance dans les plantes6.

Ici, nous décrivons une méthode d’imagerie en temps réel à l’échelle de la plante utilisant des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller et analyser la dynamique des signaux Ca2+ à longue distance et extracellulaires du glutamate en réponse à la blessure6. La disponibilité de la microscopie à fluorescence à large champ et de plantes transgéniques exprimant des biocapteurs génétiquement codés fournit une approche puissante, mais facile à mettre en œuvre pour détecter les signaux à longue distance transmis rapidement, tels que les ondes Ca2 +.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Préparation du matériel végétal

  1. Dans un microtube de 1,5 mL, stériliser en surface les graines de la plante Arabidopsis thaliana (Col-0 accession) exprimant soit GCaMP3, soit CHIB-iGluSnFR en secouant avec 20% (v/v) de NaClO pendant 3 min, puis laver 5 fois avec de l’eau distillée stérile.
    NOTE: Les lignées transgéniques d’Arabidopsis exprimant GCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR ont été décrites précédemment6.
  2. Dans une hotte stérile, semez 13 graines stérilisées en surface sur une boîte de Petri en plastique carré de 10 cm remplie de 30 mL de murashige stérile (autoclavé) et de milieu Skoog (MS) [1x sels MS, 1% (p/v) de saccharose, 0,01% (p/v) de myoinositol, 0,05% (p/v) MES et 0,5% (p/v) de gomme gellan; pH 5,7 ajusté avec 1N KOH]. Remplacez le couvercle et enveloppez-le par du ruban chirurgical.
  3. Après incubation dans l’obscurité à 4 °C pendant 2 jours, placer les plaques horizontalement à 22 °C dans une chambre de croissance sous lumière continue (90-100 μmol m-2 s-1)pendant environ 2 semaines avant utilisation. Après 2 semaines, comptez le nombre de feuilles d’Arabidopsis du plus ancien au plus jeune44 (Figure 1). Les réponses des plaies se déplacent préférentiellement de la feuille endommagée (n) vers les feuilles numérotées n ± 3 et n ± 56.
    REMARQUE: Dans ce protocole, la boîte de Petri sera ouverte pour l’imagerie des effets de la plaie et du glutamate sous un microscope à fluorescence. Par conséquent, les étapes suivantes de cette expérience devraient être effectuées dans des conditions ambiantes à température et humidité contrôlées. En effet, les signaux Ca2+ sont également obtenus par les changements dans ces conditions environnementales. On sait également que la lumière bleue, émise par le microscope lors de l’enregistrement pour l’excitation de la fluorescence de la protéine biocapteur, peut provoquer une augmentation de la concentration cytosolique de Ca2+ 45 et donc la plante doit être acclimatée à l’irradiation de la lumière bleue pendant plusieurs minutes avant de commencer l’expérience.

2. Préparation chimique

  1. Dissoudre le L-glutamate dans un milieu de croissance liquide [1/2x sels ms, 1% (p/v) de saccharose et 0,05% (p/v) MES; pH 5,1 ajusté avec 1N KOH] pour obtenir une solution de travail de 100 mM.
    REMARQUE: Évitez d’utiliser des sels de glutamate tels que le glutamate de sodium pour prévenir les effets cationiques potentiels sur la dynamique du Ca2 +.

3. Réglage au microscope et réalisation d’images en temps réel

  1. Allumez le stéréomicroscope à fluorescence motorisé équipé d’une lentille d’objectif 1x (NA = 0,156) et d’une caméra sCMOS(Figure 2)et configurez les réglages de l’appareil pour irradier avec une lumière d’excitation de 470/40 nm et acquérir une lumière d’émission passant à travers un filtre de 535/50 nm.
    REMARQUE: Tout microscope à fluorescence sensible au GFP peut être utilisé pour détecter les signaux GCaMP3 et iGluSnFR en temps réel, mais un objectif de faible puissance et une caméra hautement sensible avec une large puce sCMOS sont recommandés pour acquérir des signaux de l’ensemble de l’usine. L’objectif de faible puissance permet l’imagerie de la réponse d’une usine Arabidopsis entière et l’utilisation d’une caméra hautement sensible permet l’acquisition rapide de données nécessaires pour capturer le cours rapide du temps de l’onde Ca2 + déclenchée par la plaie. Pour le microscope à fluorescence utilisé dans cette étude, les valeurs maximales du champ de vision et de la résolution temporelle sont respectivement de 3 cm x 3 cm et 30 images par seconde (fps).
  2. Retirez le couvercle et placez le plat sous la lentille de l’objectif.
  3. Vérifiez le signal de fluorescence de la plante, puis attendez environ 30 minutes dans l’obscurité jusqu’à ce que les plantes soient adaptées aux nouvelles conditions environnementales. Cette étape d’adaptation est nécessaire parce que les changements d’humidité provoquent une élévationdes cytaires [Ca2+ ] chez les plantes qui peuvent interférer avec tout événement lié à la plaie.
  4. Ajustez la mise au point et le grossissement pour voir la plante entière dans le champ de vision. Dans le protocole actuel, un grossissement de 0,63x a été utilisé.
  5. Avant de commencer l’imagerie en temps réel, configurez les paramètres d’acquisition pour détecter les signaux de fluorescence à l’aide d’un logiciel d’imagerie au microscope. Les paramètres d’imagerie dans le protocole actuel sont les suivants : exposition et intervalles réglés sur 1,8 s et 2 s (c.-à-d. 0,5 ips), respectivement. Réglez la durée d’enregistrement sur 11 min.
  6. Image pendant 5 min avant de commencer l’expérience pour acclimater la plante à l’irradiation de la lumière bleue du microscope, puis commencez l’enregistrement en cliquant sur Exécuter maintenant, ou la commande équivalente dans le logiciel de microscope utilisé. Pour déterminer la fluorescence de base moyenne, enregistrer au moins 10 images (c.-à-d. au moins 20 s dans le protocole actuel) avant de blesser ou d’appliquer du glutamate (voir la section 4).
    1. Pour l’imagerie en temps réel des changements decyte [Ca2+] etd’apo [Glu] induits par la plaie, coupez le pétiole ou la région médiane de la feuille L1 avec des ciseaux(figure 3 et figure 4).
    2. Pour l’imagerie en temps réel des changements decytocytes déclenchés par le glutamate [Ca2+],coupez le bord (environ 1 mm de la pointe) de la feuille 1 à travers la veine principale avec des ciseaux. Après une période de récupération d’au moins 20 minutes, appliquer 10 μL de glutamate de 100 mM sur la surface coupée de la feuille (figure 5).
      REMARQUE: Cette prédécoupe était nécessaire pour permettre au glutamate d’accéder à l’apoplaste foliaire afin de déclencher des réponses. De plus, l’application d’une goutte d’eau distillée sur la surface coupée de la feuille L1 s’est avérée essentielle pour empêcher les échantillons de se dessécher pendant la récupération avant l’application du glutamate.
  7. Après avoir terminé l’enregistrement de 11 minutes, enregistrez les données.

4. Analyse des données

  1. Pour l’analyse de l’intensité de la fluorescence au fil du temps, définissez une région d’intérêt (ROI) à l’endroit où l’intensité de la fluorescence doit être analysée(Figure 6 et Figure 7). Pour le calcul de la vitesse de l’onde Ca2+, définissez 2 ROIs (ROI1 et ROI2) pour l’analyse. Dans le logiciel d’imagerie, cliquez sur Mesure du temps | Définir | Cercle. Mesurez la distance entre ROI1 et ROI2 en cliquant sur Annotations et mesures | Longueur | Ligne simple (Figure 6).
  2. Mesurez les valeurs de fluorescence brutes (F) dans chaque roi au fil du temps en cliquant sur Mesurer. Exportez des données brutes vers un tableur pour convertir le signal de fluorescence en nombres à chaque point de temps en cliquant sur Tous vers Excel | Exporter.
  3. Déterminer la valeur de fluorescence de base, qui est définie comme F0, en calculant la moyenne de F sur les 10 premières trames (c’est-à-dire avant le traitement) dans les données enregistrées.
  4. Normaliser les données F (en calculant ΔF/F) en utilisant l’équation ΔF/F= (F−F0 )/F0 , où ΔF est le changement de fluorescence dépendant du temps.
  5. Pourl’analyse d’onde de vitesse d’onde Ca 2+, définissez un point de montée de signal significatif au-dessus des valeurs pré-stimulées comme représentant la détection d’une augmentation Ca2+ de chaque ROI (t1 et t2) en utilisant le critère d’une élévation à 2× l’écart type (2x SD) qui est calculé à partir des données F0 à l’aide d’un logiciel statistique. 95% des données F0 se situent à moins de 2x SD de la moyenne, ce qui indique qu’une augmentation du signal au-dessus de ce niveau par hasard est ≤5%. Calculez la différence de temps de l’augmentation ca2+ entre ROI1 et ROI2 [t2- t1 décalage temporel (Δt)] et mesurez la distance entre ROI1 et ROI2, puis déterminez les vitesses de toute onde Ca2+.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La propagation du signal de[Ca2+]cyt et [Glu]apo en réponse à la blessure est présentée à la figure 3, à la figure 4, au film S1et au film S2. La coupe du pétiole de la feuille 1 chez les plantes exprimant GCaMP3 (à 0 s) a conduit à une augmentation significative ducyte [Ca2+]qui a été rapidement induite localement par la vascularisation (à 40 s)(figure 3 et film S1). Par la suite, le signal a été rapidement propagé aux feuilles voisines (feuilles 3 et 6) en quelques minutes (à 80 s)(Figure 3 et Film S1).

Lors de la coupe de la feuille 1 chez les plantes exprimant CHIB-iGluSnFR, une augmentation rapide de [Glu]apo a été observée autour de la région coupée (à 2 s). Ce signal s’est propagé localement à travers la vascularisation en quelques minutes (à 160 s) mais n’a pas été observé dans les feuilles systémiques(figure 4 et film S2).

Pour l’imagerie en temps réel de la propagation du signalCa2+ déclenchée par l’application de glutamate, le bord (à environ 1 mm de la pointe) de la feuille 1 chez les plantes exprimant GCaMP3 a été coupé comme le montrent la figure 5A et le film S3. Couper le bord de la feuille 1 a provoqué une augmentation locale descytaires [Ca2+] (à 40 s) mais ce signal a disparu en quelques minutes (à 124 s). Après avoir attendu environ 10 min pour que la plante récupère, 10 μL de glutamate de 100 mM ont été appliqués sur la surface coupée de la feuille 1, ce qui a provoqué une augmentation rapide et significative ducyte [Ca2+] localement (à 56 s) et une propagation du signal aux feuilles distales (à 104 s)(Figure 5B et film S4).

Pour mesurer les changements dans lecyte [Ca2+] induits par la blessure dans la feuille systémique, deux ROIs (ROI1 et ROI2) ont été fixés à la région de base et à l’extrémité de la feuille 6 chez les plantes exprimant GCaMP3 comme le montre la figure 6A. Le changement de temps de l’intensité du signal GCaMP3 en ROI1 et ROI2 lors de la coupe du pétiole de la feuille 1 a été mesuré(Figure 6B). Une augmentation significative de[Ca2+]cyt à ROI1 a été détectée plus tôt que celle de ROI2(Figure 6B). [Ca2+] le cyt a culminé à environ 100 s après blessure, a duré plus de 10 minutes, et a montré deux phases(figure 6B).

Pour déterminer les vitesses de l’onde Ca2+ lors d’un enroulage mécanique, le point de temps d’une élévation significative du signal au-dessus des valeurs pré-stimulées en ROI1 et ROI2 a été déterminé (décalage dans le temps; voir section 4) (Figure 6C). Étant donné que la distance entre roi1 et roi2 était de 2,7 mm dans ce cas(figure 6A),la vitesse du signal Ca2+ dans la feuille 6 a été calculée comme étant de 0,15 mm/s. Pour mesurer les changementsd’apo [Glu] en réponse aux dommages mécaniques, roi1 a été placé à proximité du site de coupe de la feuille marquée comme L1 comme le montre la figure 7A. [Glu] apo signature à ROI1 a montré un seul pic à environ 100 s lors du blessure (Figure 7B).

Figure 1
Figure 1: Numérotation des feuilles de rosette Arabidopsis. Les feuilles d’Arabidopsis sont numérotées du plus ancien au plus jeune (panneau gauche). Un diagramme schématique de la position des feuilles est indiqué dans le panneau de droite. L: feuille, C: cotylédons. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Un microscope à fluorescence utilisé dans cette étude. [Ca2+ ]cyt et [Glu]apo dynamique ont été itopés avec un stéréomicroscope à fluorescence à large champ. R: Télécommande, O: objectif 1x, C: caméra sCMOS, T: Tube inclinable trinoculaire, S: Scène, P: Matériel végétal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Transmission du signal Ca2+ à longue distance induite par la plaie. La coupe du pétiole (flèche blanche, 0 s) de la feuille 1 (L1) dans la plante exprimant GCaMP3 a déclenché une augmentation locale descytaires [Ca2+] (flèche rouge, 40 s) qui a été transmise aux feuilles systémiques [feuille 3 (L3) et feuille 6 (L6)] (flèches orange, 80 s). Barre d’échelle, 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Élévation del’apo déclenchée par la plaie [Glu]. Couper la feuille 1 (L1) (flèche blanche, 0 s) chez les plantes exprimant CHIB-iGluSnFR a provoqué une élévation rapide de [Glu]apo (flèche rouge, 80 s) qui s’est propagée à travers la vascularisation (flèche orange, 160 s). Barre d’échelle, 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Transmission du signal Ca2+ longue distance déclenché par le glutamate. (A)La coupure du bord (environ 1 mm de la pointe) de la feuille 1 (L1) chez les plantes exprimant GCaMP3 (flèche blanche, 0 s) a provoqué une augmentationdes cytaires [Ca2+ ] (flèche rouge, 40 s). (B) L’application de glutamate de 100 mM sur la surface coupée de L1 (flèche blanche, 0 s) a provoqué une augmentation locale descytocytes [Ca2+ ] (flèche rouge, 56 s) qui s’est rapidement propagée aux feuilles distales [p. ex. feuille 3 (L3), feuille 4 (L4) et feuille 6 (L6)] (flèches orange, 104 s). Barres d’échelle, 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Signature descytaires [Ca2+] dans les feuilles systémiques en réponse à un enroulement mécanique. (A)Une image élargie de la feuille 6 (L6) chez les plantes exprimant le GCaMP3 est représentée à la figure 3. ROI1 (cercle bleu) et ROI2 (cercle rose) ont été définis à la région de base et de pointe, respectivement. La flèche blanche indique le site de coupe du pétiole de la feuille 1 (L1). Dans ce cas, la distance entre ROI1 et ROI2 était de 2,7 mm. (B) Quantification des signaturesde cyt [Ca2+ ] en ROI1 et ROI2. Des changements d’intensité de fluorescence ont été analysés utilisant le logiciel d’imagerie. (C) Une trace étendue des données en (B) entre 0 s et 80 s. Les points de détection d’une augmentationCa2+ du ROI1 et du ROI2 ont été définis comme t1 et t2,respectivement, en utilisant comme critère une élévation à 2x l’écart type des valeurs de préstimulation (2x SD, ligne pointillée). La valeur de t2 -t1 a été définie comme un décalage temporel (Δt) dans le protocole actuel. La flèche noire indique le temps de coupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7: [Glu]apo signature en réponse à un enroulement mécanique. (A)Une image élargie de la feuille 1 (L1) chez les plantes exprimant chib-iGluSnFR est représentée à la figure 4. Roi1 a été fixé à proximité du site de coupe. La flèche blanche indique la région coupée. (B) La quantification de la signature [Glu]apo dans ROI1 est surveillée à l’aide d’un logiciel d’imagerie. La flèche noire indique le temps de coupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Film S1: Transmission Ca2 + longue distance après blessure mécanique. La blessure mécanique au pétiole de la feuille 1 (L1) a causé une augmentationdes cytos [Ca2+ ] transmise aux feuilles distales [par exemple, feuille 3 (L3) et feuille 6 (L6)]. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film S2: Élévation des niveaux apoplasiques de glutamate en réponse à la coupe. La blessure mécanique de la feuille 1 (L1) a provoqué une augmentation immédiate de [Glu]apo. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film S3: Élévation desniveaux decyt [Ca2 +]en réponse à la coupe. La blessure mécanique au bord de la feuille 1 (L1) a causé une altitude immédiate et locale decyt de [Ca2+]. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film S4: L’application de glutamate déclenche des augmentations systémiques [Ca2 +]des cyt. L’application de glutamate de 100 mM a déclenché la transmission du Ca2+ aux feuilles systémiques [p. ex. feuille 3 (L3), feuille 4 (L4) et feuille 6 (L6)]. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La signalisation systémique est importante pour que les plantes réagissent à des stimuli environnementaux externes localisés, puis maintiennent leur homéostasie à un niveau de plante entière. Bien qu’ils ne soient pas équipés d’un système nerveux avancé comme les animaux, ils emploient une communication rapideà la fois à l’intérieur et entre les organes en fonction de facteurs tels que les signaux électriques mobiles (et éventuellement hydrauliques) et les ondes de propagation de ROS etCa2+ 46,47. Le protocole décrit ci-dessus permet une imagerie en temps réel de l’activité de ce système de signalisation à l’échelle de l’usine grâce à la surveillance de la dynamique du Ca2+ et du glutamate apoplasique en réponse à la blessure. Cette méthode fournit un outil robuste pour comprendre les signaux rapides et à longue distance dans les plantes combinant une résolution spatio-temporelle élevée et une facilité d’utilisation. Ce protocole offre également le potentiel de fournir de nouvelles informations physiologiques sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la signalisation des plaies à longue distance par, par exemple, en utilisant des mutants défectueux dans les éléments putatifs du système de signalisation rapide ou en explorant les effets des réactifs pharmacologiques tels que les bloqueurs de canalCa2 + (par exemple, LaCl3) ou les inhibiteurs d’autres activités de signalisation potentiellement clés6. 

Un avantage important de la méthode d’imagerie du biocapteur décrite est l’utilisation de biocapteurs à fp unique à haut rendement fluorescent, simplifiant grandement à la fois l’équipement requis pour effectuer ces mesures et leur utilisation dans les plantes. Ainsi, les indicateurs génétiquement codés basés sur la fluorescence sont divisés en deux classes: 1) les biocapteurs mono-FP basés sur l’intensité et 2) les biocapteurs ratiométriques à base de FRET10. Bien que les capteurs ratiométriques à base de FRET soient quantitativement précis, les indicateurs Ca2+ basés sur l’intensité, y compris le GCaMP3 et l’iGluSnFR utilisés ici, offrent à la fois une résolution temporelle plus élevée et une facilité d’utilisation en raison de leur signal sensible au Ca2 +généralement plus lumineux et de leurs exigences de microscope plus simples10. Par exemple, l’indicateur R-GECO1 à base de protéines fluorescentes rouges à base de protéines mono-FP A été signalé comme présentant un changement de signal beaucoup plus important en réponse à l’ATP extracellulaire et aux élicitateurs de défense des plantes flg22 et à la chitine, par rapport au biocapteur ratiométrique YC3.627. Pour l’analyse de capteurs ratiométriques à base de FRET, il est également nécessaire d’utiliser un microscope spécialisé avec plusieurs filtres pour collecter des données à deux longueurs d’onde, tandis que les biocapteurs à base d’un seul FP nécessitent que l’appareil collecte les données à une seule longueur d’onde, une capacité que l’on trouve dans tous les microscopes à fluorescence standard10. Cependant, il est important de noter que l’utilisation de biocapteurs à FP unique présente certains inconvénients. Ces biocapteurs à FP unique basés sur l’intensité ne sont pas préférés pour quantifier les changements de concentration absolue ou pour l’imagerie à long terme sur de nombreuses heures ou jours. Cette limitation est parce qu’en plus, par exemple, du niveau de Ca2 + pour GCaMP3, l’intensité du signal de ces biocapteurs à FP unique est considérée comme affectée par d’autres facteurs tels que le niveau d’expression du capteur ou des paramètres tels que le pH cellulaire qui peuvent changer au fil du temps.

À ce jour, de nombreuses nouvelles variantes de ces indicateurs génétiquement codés ont été conçues pour améliorer le rapport signal/bruit, la plage dynamique, la cinétique et la stabilité des capteurs. Par exemple, après que Nakai et al.26 ont développé le premier GCaMP, diverses variantes successives, telles que les GECO ont été générées par une combinaison de mutagenèse et de caractérisation minutieuse48,49,50. La plage dynamique de G-GECO (Green-GECO) serait environ deux fois plus grande que celle de GCaMP328. En outre, le remplacement par différentes protéines fluorescentes dans ces indicateurs a conduit à la génération de variantes GECO avec différents spectres d’émission, tels que B-GECO (Blue-GECO) et R-GECO (Red-GECO), ce qui permet l’utilisation de ces indicateurs aux côtés d’autres variantes spectrales GFP dans des applications d’imagerie multicolore28. De même, GCaMP a continué à être développé et amélioré avec une série de capteurs améliorés pour la vitesse de réponse et l’amplitude du signal étant maintenant disponible50. Pour la surveillance de la dynamique du glutamate, autre que iGluSnFR, une série de biocapteurs de glutamate à base de FRET, les protéines indicatrices FLuorescent pour le glutamate (FLIPE) ont été développées40. FLIPE est composé de CFP et YFP qui sont liés via la protéine de liaison au glutamate ybeJ prélevée sur E. coli. Lors de la liaison du glutamate à ybeJ, on observe une diminution dépendante de la concentration de glutamate de l’efficacité de la FRETTE. Par conséquent, pour le Ca2+ et le glutamate, il existe plusieurs capteurs mono-FP et ratiométriques disponibles. Les chercheurs devraient envisager le biocapteur approprié pour détecter la dynamique du signal en fonction de la conception expérimentale et des exigences pour les facteurs de mesure tels que le signal élevé: bruit (capteurs à FP unique) par rapport à un besoin de quantification très précise (où les capteurs FRET excellent).

La méthode d’imagerie à champ large et à FP unique décrite ici pour le cisrage devrait également être utile lorsqu’elle est appliquée à d’autres processus de signalisation systémique de stress. Malgré la présence de nombreux rapports qui suggèrent un rôle crucial de la signalisation Ca2+ longue distance dans diverses réponses de stress, telles que l’attaque herbivore6,51,52,le sel20et la sécheresse53,seules quelques études ont fourni les informations spatio-temporelles liées aux signaux rapides à longue distance Ca2+ induits par ces réponses de stress6,7,20,52. L’utilisation d’un microscope à fluorescence à large champ dans ce protocole permet également l’observation en temps réel de la dynamique du signal mobile non seulement dans la communication feuille à feuille, mais aussi dans la communication racine à pousse comme récemment montré38. Bien que nous nous s’ayons concentré sur les protocoles pour Arabidopsis,cette méthode d’imagerie en temps réel à l’échelle de la plante fournit également un outil robuste pour comprendre les caractéristiques spatiales et temporelles de la signalisation systémique Ca2 + dans les réponses au stress biotique et abiotique chez d’autres espèces végétales telles que le tabac30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Société japonaise pour la promotion de la science (17H05007 et 18H05491) à MT, à la National Science Foundation (IOS1557899 et MCB2016177) et à la National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G et 80NSSC19K0126) à SG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32 (9), 1161-1174 (2009).
  2. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 387-415 (2018).
  3. Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
  4. Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
  5. Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 287-307 (2016).
  6. Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361 (6407), 1112-1115 (2018).
  7. Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10178-10183 (2018).
  8. Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171 (2), 249-269 (2006).
  9. Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227 (4), 1037-1050 (2020).
  10. Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
  11. Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29 (2), 229-234 (1967).
  12. Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23 (2), 267-278 (2000).
  13. Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  14. Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440 (3), 355-373 (2011).
  15. Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93 (12), 2095-2101 (2011).
  16. Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163 (2), 543-554 (2013).
  17. Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
  18. Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5242-5249 (2016).
  19. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  20. Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (17), 6497-6502 (2014).
  21. Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171 (3), 1771-1784 (2016).
  22. Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18849-18857 (2020).
  23. Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216 (4), 1161-1169 (2017).
  24. Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  25. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  26. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  27. Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
  28. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  29. Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142 (2017).
  30. DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58 (7), 1173-1184 (2017).
  31. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
  32. Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67 (6), 1853-1869 (2016).
  33. Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42 (12), 3326-3339 (2019).
  34. Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1497-1509 (2013).
  35. Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69 (17), 4151-4163 (2018).
  36. De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
  37. Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2 (1), 232 (2011).
  38. Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13 (640), (2020).
  39. Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58 (9), 2339-2358 (2007).
  40. Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  41. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4411-4416 (2008).
  42. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  43. Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
  44. Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. , (2013).
  45. Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83 (1), 102-111 (2007).
  46. Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67 (7), 2063-2079 (2016).
  47. Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90 (4), 698-707 (2017).
  48. Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (12), 4753-4758 (2006).
  49. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  50. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  51. Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29 (6), 1460-1479 (2017).
  52. Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31 (7), 1539-1562 (2019).
  53. Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15 (8), 1833-1845 (2003).

Tags

Biologie Numéro 172 calcium GCaMP3 biocapteurs fluorescents génétiquement codés glutamate iGluSnFR signal longue distance blessure
Imagerie en temps réel à large champ des signaux de plaies locales et systémiques chez <em>Arabidopsis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y.,… More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter