Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים ב Arabidopsis

doi: 10.3791/62114 Published: June 4, 2021

Summary

איתות סידן מערכתי המופעל על ידי גלוטמט חוץ-תאי הוא קריטי לגיוס תגובות הגנת הצמח לפצעים מכניים ולתקפת אוכלי עשב בצמחים. מאמר זה מתאר שיטה לדמיין את הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של שני גורמים אלה באמצעות צמחי תאליאנה ערבידופסיס המבטאים ביוסנסורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן וגלוטמט.

Abstract

צמחים מגיבים ללחצים מכניים כגון פצעים ואוכלי עשב על ידי גרימת תגובות הגנה הן בחלקים הפגועים והן בחלקים הלא פגומים. עם פציעת עלה, מתרחשת עלייה בריכוז יון הסידן הציטוזולי (Ca2+ אות) באתר הפצע. אות זה מועבר במהירות לעלים לא פגומים, שם מופעלות תגובות ההגנה. המחקר האחרון שלנו גילה כי גלוטמט דולף מהתאים הפצועים של העלה לתוך apoplast סביבם משמש אות פצע. גלוטמט זה מפעיל ערוצים חדירים דמויי קולטן גלוטמט Ca2+ , מה שמוביל להפצת אותות Ca2+ למרחקים ארוכים ברחבי הצמח. המאפיינים המרחביים והטמפורליים של אירועים אלה ניתן ללכוד עם הדמיה בזמן אמת של צמחים חיים המבטאים biosensors פלואורסצנטי מקודד גנטית. כאן אנו מציגים שיטת הדמיה כלל-צמחית בזמן אמת כדי לנטר את הדינמיקה של אותות Ca2+ ושינויים בגלוטמט אפופלסטי המתרחשים בתגובה לפציעה. גישה זו משתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה ובצמחי Arabidopsis מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המבוסס על Ca2+ וביו-סנסורים גלוטמטים. בנוסף, אנו מציגים מתודולוגיה כדי לעורר בקלות פצע-induced, גלוטמט מופעלות מהירות למרחקים ארוכים Ca2 + התפשטות אות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על מחקרים על לחצים צמחיים אחרים כדי לעזור לחקור כיצד איתות מערכתי צמח עשוי להיות מעורב ברשתות האיתות והתגובה שלהם.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

צמחים אינם יכולים לברוח מלחצים ביוטיים, למשל, חרקים הניזונים מהם, ולכן הם פיתחו חישת מתח מתוחכמת ומערכות העברת אותות כדי לזהות ואז להגן על עצמם מפני אתגרים כגון אוכלי עשב1. עם פציעה או התקפת אוכלי עשב, צמחים ליזום תגובות הגנה מהירה כולל הצטברות של חומצה ג'אסמונית phytohormone (JA) לא רק באתר הפצוע, אלא גם באיברים דיסטליים ניזוק2. JA זה אז הן מפעילה תגובות הגנה ברקמות שנפגעו ישירות וגורם מראש הגנות בחלקים ניזוקו של הצמח. ב Arabidopsis, הצטברות של JA הנגרמת על ידי פציעה זוהתה עלים דיסטליים, שלמים בתוך דקות ספורות של נזק במקומות אחרים במפעל מציע כי אות מהיר למרחקים ארוכים מועבר מן העלה הפצוע3. מספר מועמדים, כגון Ca2 +, מינים חמצן תגובתי (ROS), ואותות חשמליים, הוצעו לשמש אותם פצע למרחקים ארוכים אלה בצמחים4,5.

Ca2+ הוא אחד האלמנטים המגוונים ביותר בכל מקום שליח שני באורגניזמים אוקריוטיים. בצמחים, לעיסת זחל ופציעה מכנית גורמים לעלייה דרסטית בריכוז ציטוזולי Ca2+ ([Ca2+]ציט)הן בעל הפצוע והן בעלים מרוחקים לא מבוססים6,7. אות Ca2+ מערכתי זה מתקבל על ידי חלבונים תאיים Ca2+חישה, אשר מובילים להפעלת מסלולי איתות הגנה במורד הזרם, כולל JA biosynthesis8,9. למרות דיווחים רבים כאלה התומכים בחשיבות של Ca2 + אותות בתגובות פצע הצמח, מידע על המאפיינים המרחביים והטמפורליים של Ca2 + אותות הנגרמים על ידי פציעה מוגבל.

הדמיה בזמן אמת באמצעות מחווני Ca2+ מקודדים גנטית היא כלי רב עוצמה לניטור וכימות הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של אותות Ca2+ . עד כה פותחו גרסאות של חיישנים כאלה המאפשרות הדמיה של אותות Ca2+ ברמה של תא יחיד, לרקמות, איברים ואפילו צמחים שלמים10. הביוסנסור הראשון המקודד גנטית עבור Ca2+ המשמש בצמחים היה אקוורין החלבון הביולומינסנטי המופק ממדוזה Aequorea victoria11. למרות חלבון chemiluminescent זה שימש כדי לזהות Ca2 + שינויים בתגובה לחצים שונים בצמחים12,13,14,15,16,17,18, זה לא מתאים היטב עבור הדמיה בזמן אמת בשל אות זוהר נמוך מאוד שהיא מייצרת. Förster תהודה העברת אנרגיה (FRET)מבוסס Ca2 + אינדיקטורים, כגון הגמלים הצהובים, שימשו גם בהצלחה כדי לחקור את הדינמיקה של מגוון של Ca2 + אירועי איתות במפעלים19,20,21,22,23,24. חיישנים אלה תואמים לגישות הדמיה ובדרך כלל מורכבים מ- Ca2 + חלבון מחייב calmodulin (CaM) ופפטיד מחייב CaM (M13) מתוך קינאז שרשרת אור מיוסין, כל התמזגו בין שני חלבוני פלואורופור, בדרך כלל חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) וגרסה חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP)10. Ca2+ מחייב CaM מקדם את האינטראקציה בין CaM ו M13 המוביל לשינוי קונפורמציה של החיישן. שינוי זה מקדם העברת אנרגיה בין CFP ו- YFP, אשר מגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות של YFP תוך הפחתת פליטת הפלואורסצנטיות מן CFP. ניטור מעבר זה מ- CFP לפלואורסצנטיות YFP מספק מדד לעלייה ברמת Ca2+ . בנוסף לחיישני FRET אלה, חלבון פלואורסצנטי יחיד (FP)מבוסס Ca2+ biosensors, כגון GCaMP ו- R-GECO, תואמים גם הם לגישות הדמיה צמחית ומשמשים באופן נרחב לחקר [Ca2+] שינוייםבציט בשל הרגישות הגבוהה שלהם וקלות השימוש25,26,27,28,29,30. GCaMPs מכילים GFP יחיד שעבר מוטציה מעגלית (cp), שוב התמזגו עם CaM ופפטיד M13. האינטראקציה התלויה ב- Ca2+בין CaM ל- M13 גורמת לשינוי קונפורמי בחיישן המקדם שינוי במצב הפרוטונציה של cpGFP, ומשפר את אות הפלואורסצנטי שלו. לכן, כמו Ca2 + רמות עלייה, אות cpGFP עולה.

כדי לחקור את הדינמיקה של Ca2 + אותות שנוצרו בתגובה לפצעים מכניים או האכלת אוכלי עשב, השתמשנו בצמחי תלתנא ערבידופסיס מהונדסים המבטאים גרסה GCaMP, GCaMP3, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב6. גישה זו הצליחה לדמיין העברה מהירה של אות Ca2+ למרחקים ארוכים מאתר הפצע על עלה לצמח כולו. לכן, עלייה [Ca2+]ציט זוהה מיד באתר הפצע אבל זה Ca2 + אות הופץ אז לעלים השכנים דרך כלי הדם בתוך כמה דקות של פציעה. יתר על כן, מצאנו כי העברת אות הפצע המערכתי המהיר הזה מבוטלת בצמחי Arabidopsis עם מוטציות בשני גנים דמויי קולטן גלוטמט, קולטן גלוטמט כמו (GLR), GLR3.3, ו GLR3.66. GLRs מופיעים לתפקד כמו חומצת אמינו מגודר Ca2 + ערוצי מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים מגוונים, כולל תגובת פצע3, צמיחת צינור אבקה31, פיתוח שורש32, תגובה קרה33, וחסינות מולדת34. למרות פונקציה פיזיולוגית רחבה ומובנה זו של GLRs, מידע על המאפיינים הפונקציונליים שלהם, כגון הספציפיות שלהם ליגנד, סלקטיביות היונים, לוקליזציה תת תאית, מוגבלים35. עם זאת, מחקרים אחרונים דיווחו כי GLR3.3 ו GLR3.6 הם מקומיים פלום ו xylem, בהתאמה. ל- GLRs של צמחים יש קווי דמיון לקולטני גלוטמט יונוטרופיים (iGluRs)36 ביונקים, המופעלים על ידי חומצות אמינו, כגון גלוטמט, גליצין ו- D-serine במערכת העצבים של היונקים37. אכן, הוכחנו כי היישום של גלוטמט 100 מ"מ, אבל לא חומצות אמינו אחרות, באתר הפצע גורם מהיר, למרחקים ארוכים Ca2 + אות Arabidopsis, המציין כי גלוטמט חוץ תאיים סביר פועל כאות פצע בצמחים6. תגובה זו מבוטלת glr3.3/glr3.6 מוטנט מציע כי גלוטמט עשוי לפעול דרך אחד או שניהם של ערוצים אלה דמויי קולטן ואכן, AtGLR3.6 הוכח לאחרונה להיות מגודר על ידי רמות אלה של גלוטמט38.

בצמחים, בנוסף לתפקידו כחומצת אמינו מבנית, גלוטמט הוצע גם כרגולטור התפתחותי מרכזי39; עם זאת, הדינמיקה המרחבית והטמפורלית שלו מובנת היטב. בדיוק כמו Ca2 +, מספר אינדיקטורים מקודדים גנטית גלוטמט פותחו כדי לפקח על הדינמיקה של חומצת אמינו זו בתאיםחיים 40,41. iGluSnFR הוא ביו-סנסור גלוטמט יחיד מבוסס GFP המורכב מ- cpGFP וחלבון מחייב גלוטמט (GltI) מ Escherichia coli42,43. השינוי הקונפורמי של iGluSnFR, המושרה על ידי גלוטמט מחייב GltI, תוצאות פליטת פלואורסצנטיות GFP משופרת. כדי לחקור אם גלוטמט חוץ-תאי פועל כמולקולה איתות בתגובת פצע הצמח, חיברנו את רצף iGluSnFR עם רצף הפרשת פפטיד אות chitinase בסיסי (CHIB-iGluSnFR) כדי להתאים את biosensor זה בחלל האפופלסטיק6. גישה זו אפשרה הדמיה של כל שינוי בריכוז הגלוטמט האפופלוסי ([Glu]apo) באמצעות צמחי Arabidopsis מהונדסים המבטאים חיישן זה. גילינו עליות מהירות באות iGluSnFR באתר הפציעה. נתונים אלה תומכים ברעיון כי גלוטמט דולף מתוך התאים הפגועים / רקמות כדי apoplast על הפציעה ופועל כאות נזק הפעלת GLRs ומוביל למרחקים ארוכים Ca2 + אות בצמחים6.

כאן, אנו מתארים שיטת הדמיה כלל-צמחית בזמן אמת באמצעות biosensors מקודדים גנטית כדי לפקח ולנתח את הדינמיקה של Ca2+ למרחקים ארוכים אותות גלוטמט חוץ תאיים בתגובה לפציעה6. הזמינות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה וצמחים מהונדסים המבטאים ביו-סנסורים מקודדים גנטית מספקת גישה רבת עוצמה אך מיושמת בקלות לזיהוי אותות למרחקים ארוכים המועברים במהירות, כגון גלי Ca2+ .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת חומר צמחי

  1. במיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל, פני השטח מעקרים את הזרעים של הצמח Arabidopsis thaliana (הצטרפות קול-0) המבטאים GCaMP3 או CHIB-iGluSnFR על ידי טלטול עם 20% (v /v) NaClO במשך 3 דקות ולאחר מכן לשטוף 5 פעמים עם מים מזוקקים סטריליים.
    הערה: הקווים המהונדסים של Arabidopsis המבטא GCaMP3 או CHIB-iGluSnFR תוארו בעבר6.
  2. במכסה המנוע סטרילי, לזרוע 13 משטח מעוקר זרעים על צלחת פטרי פלסטיק 10 ס"מ מרובע מלא 30 מ"ל סטרילי (autoclaved) Murashige ו Skoog (MS) בינוני [1x MS מלחים, 1% (w/v) סוכרוז, 0.01% (w/v) מיונוציטול, 0.05% (w/v) MES ו-0.5% (w/v) מסטיק גלן; pH 5.7 מותאם עם 1N KOH]. החלף את המכסה ולעטוף עם קלטת כירורגית.
  3. לאחר הדגירה בחושך ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 ימים, למקם את הצלחות אופקית ב 22 מעלות צלזיוס בתא צמיחה תחת אור רציף (90-100 מיקרומול m-2 s-1) במשך כ 2 שבועות לפני השימוש. לאחר שבועיים, לספור את מספר העלים Arabidopsis מן הבכור לצעיר44 (איור 1). תגובות הפצע מעדיפות לעבור מהעלה הפגום (n) לעלים ממוספרים n ± 3 ו- n ± 56.
    הערה: בפרוטוקול זה, צלחת פטרי תיפתח להדמיית הפצע ואפקטי גלוטמט תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכן, השלבים הבאים בניסוי זה צריכים להתבצע בתנאי חדר מבוקר טמפרטורה ולחות. הסיבה לכך היא כי Ca2 + אותות הם גם עוררו על ידי שינויים בתנאים סביבתיים אלה. ידוע גם כי האור הכחול, הנפלט מהמיקרוסקופ במהלך ההקלטה לצורך עירור הפלואורסצנטיות של חלבון הביוסנסור, עשוי לגרום לעלייה של ריכוז Ca2+ ציטוזולי45 ולכן יש להסתגל להקרנת האור הכחול במשך מספר דקות לפני תחילת הניסוי.

2. הכנה כימית

  1. המסת L-גלוטמט במדיום צמיחה נוזלי [1/2x MS מלחים, 1% (w / v) סוכרוז ו 0.05% (w / v) MES; pH 5.1 מותאם עם 1N KOH] כדי להפוך פתרון עבודה 100 מ"מ.
    הערה: יש להימנע משימוש במלחי גלוטמט כגון נתרן גלוטמט למניעת השפעות אפשריות הקשורות לקטיון על הדינמיקה של Ca2+ .

3. הגדרת מיקרוסקופ וביצוע הדמיה בזמן אמת

  1. הפעל את סטריאומיקרוסקופ הפלואורסצנטי הממונע המצויד בעדשה אובייקטיבית 1x (NA = 0.156) ומצלמת sCMOS (איור 2)וקבע את תצורת הגדרות ההתקן להקרין עם אור עירור של 470/40 ננומטר ולרכוש אור פליטה העובר דרך מסנן 535/50 ננומטר.
    הערה: כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיש ל- GFP יכול לשמש לגילוי אותות GCaMP3 ו- iGluSnFR בזמן אמת, אך עדשה אובייקטיבית בהספק נמוך ומצלמה רגישה מאוד עם שבב SCMOS רחב מומלץ לרכוש אותות מהמפעל כולו. מטרת ההספק הנמוך מאפשרת הדמיה של תגובת מפעל ערבידופסיס שלם ושימוש במצלמה רגישה ביותר מאפשר רכישת נתונים מהירה הדרושה כדי ללכוד את מהלך הזמן המהיר של גל Ca2+ המופעל על ידי פצעים. עבור מיקרוסקופ הפלואורסצנטי המשמש במחקר זה, הערכים המרביים של שדה הראייה והרזולוציה הזמנית הם 3 ס"מ x 3 ס"מ ו- 30 מסגרות לשנייה (fps), בהתאמה.
  2. מוציאים את המכסה ומניחים את המנה מתחת לעדשה האובייקטיבית.
  3. בדוק את אות הפלואורסצנטיות מהצמח ולאחר מכן המתן כ-30 דקות בחושך עד שהצמחים יתאימו את עצמם לתנאים הסביבתיים החדשים. שלב הסתגלות זה נדרש מכיוון ששינויים בלחות מעוררים [Ca2+] העלאתציט בצמחים שעלולים להפריע לכל אירוע הקשור לפצע.
  4. התאם את המיקוד וההגדלה כדי לראות את הצמח כולו בשדה הראייה. בפרוטוקול הנוכחי, נעשה שימוש בהגדלה של 0.63x.
  5. לפני שתתחיל בהדמיה בזמן אמת, הגדר את פרמטרי הרכישה כדי לזהות את אותות הפלואורסצנטיות באמצעות תוכנת הדמיה של מיקרוסקופ. ההגדרות עבור דימות בפרוטוקול הנוכחי הן: זמני חשיפה ומרווח מוגדרים ל- 1.8 שניות ו- 2 שניות (כלומר, 0.5 fps), בהתאמה. הגדר את זמן ההקלטה ל- 11 דקות.
  6. תמונה במשך 5 דקות לפני תחילת הניסוי כדי להסתגל הצמח להקרין אור כחול מן המיקרוסקופ, ואז להתחיל להקליט על ידי לחיצה על הפעל עכשיו, או הפקודה המקבילה בתוכנת מיקרוסקופ בשימוש. כדי לקבוע את הפלואורסצנטיות הבסיסית הממוצעת, רשום לפחות 10 מסגרות (כלומר, לפחות 20 שניות בפרוטוקול הנוכחי) לפני יישום פציעה או גלוטמט (ראה סעיף 4).
    1. להדמיה בזמן אמת של שינויים באפו [Ca2+ ]ו-[Glu],חתכו את הפטיולה או את האזור האמצעי של עלה L1 במספריים(איור 3 ואיור 4).
    2. להדמיה בזמן אמת של שינוייםבציט [Ca2+ ]המופעלים על-ידי גלוטמט, חותכים את הקצה (כ-1 מ"מ מקצה) של עלה 1 על פני הווריד הראשי עם מספריים. לאחר תקופת החלמה של 20 דקות לפחות, יש למרוח 10 μL של 100 מ"מ גלוטמט על פני השטח החתוכים של העלה (איור 5).
      הערה: חיתוך מראש זה היה הכרחי כדי לאפשר גישה גלוטמט apoplast העלה על מנת לעורר תגובות. בנוסף, החלת טיפת מים מזוקקים על פני השטח החתוכים של עלה L1 נמצאה קריטית כדי למנוע מהדגימות להתייבש במהלך ההתאוששות לפני החלת גלוטמט.
  7. לאחר סיום ההקלטה של 11 דקות, שמור את הנתונים.

4. ניתוח נתונים

  1. לניתוח עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן, הגדירו אזור עניין (ROI) במקום שבו יש לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות (איור 6 ואיור 7). לחישוב המהירות של גל Ca2+ , הגדר 2 החזרי ROIs (ROI1 ו- ROI2) לניתוח. בתוכנת ההדמיה, לחץ על מדידת זמן | הגדרת | מעגל , עיגול. למדוד את המרחק בין ROI1 ו ROI2 על ידי לחיצה על ביאורים ומדידה | | אורך קו פשוט (איור 6).
  2. מדוד את ערכי הפלואורסצנטיות הגולמיים (F) בכל החזר על ההשקעה לאורך זמן על-ידי לחיצה על מדידה. יצא נתונים גולמיים לתוכנת גיליון אלקטרוני כדי להמיר את אות הפלואורסצנטי למספרים בכל נקודת זמן על-ידי לחיצה על הכל ל- Excel | יצא.
  3. קבע את ערך הפלואורסצנטיות הבסיסי, המוגדר כ- F0, על-ידי חישוב הממוצע של F מעל 10 המסגרות הראשונות (כלומר, לפני הטיפול) בנתונים המוקלטים.
  4. נרמל את נתוני F (על-ידי חישוב ΔF/F) באמצעות המשוואה ΔF/F = (F-F0)/F0, כאשר ΔF הוא השינוי תלוי הזמן בפלואורסצנטיות.
  5. עבור ניתוח גל מהירות גל Ca2+ , הגדר נקודת עליית אות משמעותית מעל הערכים המעוררים מראש כמייצג זיהוי של עלייה של Ca2+ בכל החזר השקעה (t1 ו- t2) באמצעות הקריטריון של עלייה ל- 2× סטיית התקן (2x SD) המחושבת מנתוני F0 באמצעות תוכנה סטטיסטית. 95% מנתוניה-F 0 נופלים בטווח של 2x SD מהממוצע, מה שמצביע על כך שעליית האות מעל רמה זו במקרה היא ≤5%. חשב את הפרש הזמן של עליית Ca2+ בין החזר על ההשקעה ל- ROI2 [t2- t1 השהיית זמן (Δt)]ומדוד את המרחק בין החזר על ההשקעה ל- ROI2 ולאחר מכן קבע את המהירות של כל גל Ca2+ .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפצת אותות של [Ca2+]ct ו- [Glu]apo בתגובה לפציעה מוצגת באיור 3, איור 4, סרט S1וסרט S2. חיתוך פטיולה של העלה 1 בצמחים המבטאים GCaMP3 (ב 0 s) הוביל לעלייה משמעותית [Ca2+]ציט כי היה במהירות המושרה באופן מקומי דרך כלי הדם (ב 40 s)(איור 3 ו סרט S1). לאחר מכן, האות הופץ במהירות לעלים שכנים (דף 3 ו-6) תוך דקות ספורות (ב-80 שניות)(איור 3 וסרט S1).

עם חיתוך עלה 1 בצמחים המבטאים CHIB-iGluSnFR, עלייה מהירה [גלו]apo נצפתה סביב האזור לחתוך (ב 2 s). אות זה הופץ דרך כלי הדם באופן מקומי תוך דקות ספורות (ב-160 שניות), אך לא נצפה בעלים מערכתיים(איור 4 וסרט S2).

להדמיה בזמן אמת של הפצת אותות Ca2+ המופעלת על ידי יישום גלוטמט, הקצה (כ -1 מ"מ מקצה) של עלה 1 בצמחים המבטאים GCaMP3 נחתך כפי שמוצג באיור 5A ובסרט S3. חיתוך קצה של דף 1 גרם לעלייה מקומית [Ca2+]cyt (ב 40 s) אבל אות זה נעלם בתוך כמה דקות (ב 124 s). לאחר המתנה של כ 10 דקות עבור הצמח להתאושש, 10 μL של 100 מ"מ גלוטמט הוחל על משטח לחתוך של עלה 1, אשר גרם לעלייה מהירה, משמעותית של [Ca2 +]ציט מקומי (ב 56 s) ו התפשטות אות עלים דיסטליים (ב 104 s) (איור 5B וסרט S4).

כדי למדוד את השינויים ב-[Ca2+]cyt הנגרמים על ידי פציעה בעלה המערכתי, נקבעו שני ROIs (ROI1 ו- ROI2) באזור הבסיס ובקצה העלה 6 בצמחים המבטאים GCaMP3 כפי שמוצג באיור 6A. שינוי מסלול הזמן של עוצמת האות GCaMP3 ב-ROI1 וב-ROI2 עם חיתוך הפטיול של דף 1 נמדד (איור 6B). עלייה משמעותית של [Ca2+]cyt ב ROI1 זוהה מוקדם יותר מזה של ROI2 (איור 6B). [Ca2+] ה-cyt הגיע לשיא של כ-100 שניות לאחר פציעה, נמשך יותר מ-10 דקות והציג שני שלבים (איור 6B).

כדי לקבוע את המהירות של גל Ca2+ על פצעים מכניים, נקודת הזמן של עליית אות משמעותית מעל הערכים המעוררים מראש ב- ROI1 ו- ROI2 נקבעה (השהיית זמן; ראה סעיף 4) (איור 6C). מכיוון שהמרחק בין ROI1 ל-ROI2 היה 2.7 מ"מ במקרה זה (איור 6A),מהירות האות Ca2+ בעלה 6 חושבה כ- 0.15 מ"מ/s. כדי למדוד את שינוייהאפו [Glu] בתגובה לנזק המכני, ROI1 נקבע בקרבת אתר החיתוך של העלה המסומן כ- L1 כפי שמוצג באיור 7A. [גלו] חתימת אפו ב-ROI1 הציגה שיא בודד של כ-100 שניות עם פציעתה (איור 7B).

Figure 1
איור 1: מספור עלי רוזט ערבידופסיס. עלי Arabidopsis ממוספרים מהמבוגר לצעיר ביותר (פאנל שמאלי). דיאגרמה סכמטית של מיקום העלים מצוינת בלוח הימני. L: עלה, ג: קוטילדון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מיקרוסקופ פלואורסצנטי המשמש במחקר זה. [Ca2+]ציט ודינמיקתאפו [גלו] צולמו עם סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה. R: שלט רחוק, O: 1x עדשה אובייקטיבית, C: מצלמת sCMOS, T: צינור הטיה Trinocular, S: שלב, P: חומר צמחי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שידור אותות Ca2+ למרחקים ארוכים הנגרמים על-ידי פצעים. חיתוך פטיול (חץ לבן, 0 s) של עלה 1 (L1) במפעל המבטא GCaMP3 עורר עלייה מקומית [Ca2+]cyt (חץ אדום, 40 s) שהועבר עלים מערכתיים [עלה 3 (L3) ועלה 6 (L6)] (חצים כתומים, 80 s). סרגל קנה מידה, 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: העלאתאפו המופעלת על-ידי פצעים. חיתוך העלה 1 (L1) (חץ לבן, 0 s) בצמחים המבטאים CHIB-iGluSnFR גרם לעלייה מהירה שלאפו [גלו] (חץ אדום, 80 s) שהתפשט דרך כלי הדם (חץ כתום, 160 s). סרגל קנה מידה, 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שידור אותות Ca2+ למרחקים ארוכים המופעל על-ידי גלוטמט. (A) חיתוך הקצה (כ- 1 מ"מ מקצה) של עלה 1 (L1) בצמחים המבטאים GCaMP3 (חץ לבן, 0 ים) גרם לעלייה [Ca2+]ציט (חץ אדום, 40 שניות). (B)יישום של 100 מ"מ גלוטמט למשטח לחתוך של L1 (חץ לבן, 0 s) גרם מקומי [Ca2+] עלייתציט (חץ אדום, 56 s) כי הופץ במהירות עלים דיסטליים [למשל, עלה 3 (L3), עלה 4 (L4), ועלה 6 (L6)] (חצים כתומים, 104 s). סרגלי קנה מידה, 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: [Ca2+] חתימתציט בעלים מערכתיים בתגובה לפציעה מכנית. (A) תמונה מורחבת של דף 6 (L6) בצמחים המבטאים GCaMP3 מוצגת באיור 3. ROI1 (עיגול כחול) ו ROI2 (עיגול ורוד) נקבעו באזור הבסיס והקצה, בהתאמה. חץ לבן מציין את האתר החתוך של פטיולה של עלה 1 (L1). במקרה זה, המרחק בין ROI1 ו ROI2 היה 2.7 מ"מ. (B)כימות של [Ca2 +] חתימותcyt ב ROI1 ו ROI2. שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות נותחו באמצעות תוכנת הדמיה. (ג)מעקב מורחב אחר נתונים ב- (B) בין 0 s ל- 80 s. נקודות איתור של עלייה של Ca2+ ב- ROI1 ו- ROI2 הוגדרו כ- t1 ו- t2, בהתאמה, תוך שימוש כקריטריון עלייה עד פי 2 סטיית התקן של ערכי prestimulation (2x SD, קו מנוקד). הערך של t2 - t1 הוגדר כהשהיית זמן (Δt) בפרוטוקול הנוכחי. החץ השחור מציין את זמן החיתוך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: חתימתאפו [Glu] בתגובה לפציעה מכנית. (A) תמונה מורחבת של דף 1 (L1) בצמחים המבטאים CHIB-iGluSnFR מוצגת באיור 4. ROI1 נקבע בקרבת אתר הקיצוץ. חץ לבן מציין את האזור שנחתך. (B)כמות חתימתאפו [Glu] ב- ROI1 מנוטרת באמצעות תוכנת דימות. החץ השחור מציין את זמן החיתוך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט S1: למרחקים ארוכים Ca2 + שידור לאחר פציעה מכנית. פצעים מכניים בפטיולה של עלה 1 (L1) גרמו לעלייה [Ca2+]ציט המועברת לעלים דיסטליים [למשל, דף 3 (L3) ועלה 6 (L6)]. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט S2: העלאת רמות גלוטמט אפופלסטי בתגובה לחיתוך. פציעה מכנית של העלה 1 (L1) גרמה לעלייהמיידית באפו[גלו] . אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט S3: העלאת [Ca2+]רמותציט בתגובה לחיתוך. פציעה מכנית בקצה עלה 1 (L1) גרמה לגובהציט מיידי, מקומי [Ca2+]. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט S4: יישום של גלוטמט מפעיל מערכתית [Ca2+]ציט מגביר. יישום גלוטמט של 100 מ"מ הפעיל שידור Ca2+ לעלים מערכתיים [למשל, דף 3 (L3), עלה 4 (L4) ועלה 6 (L6)]. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איתות מערכתי חשוב לצמחים להגיב לגירויים סביבתיים חיצוניים מקומיים ולאחר מכן לשמור על הומאוסטזיס שלהם ברמת צמח שלמה. למרות שהם אינם מצוידים במערכת עצבים מתקדמת כמו בעלי חיים, הם משתמשים בתקשורת מהירה הן בתוך ובין איברים המבוססים על גורמים כגון אותות חשמליים ניידים (ואולי הידראוליים) וגלים מתפשטים של ROS ו- Ca2+ 46,47. הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר הדמיה כלל-צמחית בזמן אמת של פעילות מערכת איתות זו באמצעות ניטור הדינמיקה של Ca2+ וגלוטמט אפופלסטי בתגובה לפציעה. שיטה זו מספקת כלי חזק להבנת אותות מהירים ובינעירוניים בצמחים המשלבים רזולוציה מרחבית גבוהה וקלות שימוש. פרוטוקול זה מציע גם את הפוטנציאל לספק תובנות פיזיולוגיות חדשות על המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפצעים למרחקים ארוכים, למשל, באמצעות מוטנטים פגומים באלמנטים פואטיים של מערכת האיתות המהירה או חקר ההשפעות של ריאגנטים פרמקולוגיים כגון חוסמי ערוצי Ca2+ (למשל, LaCl3) או מעכבים של פעילויות איתות פוטנציאליות אחרות6.

אחד היתרונות החשובים של שיטת ההדמיה biosensor המתוארת הוא השימוש biosensors יחיד FP עם תשואה פלואורסצנטית גבוהה, מאוד לפשט הן את הציוד הנדרש כדי לבצע מדידות אלה שלהם בשימוש planta. לפיכך, אינדיקטורים מקודדים גנטית מבוססי פלואורסצנטיות מחולקים לשני סוגים: 1) ביו-חושים מבוססי אינטנסיביות של FP יחיד ו- 2) ביוסנסורים מבוססי FRET10. למרות חיישנים מבוססי FRET ratiometric הם מדויקים כמותית, מבוססי אינטנסיביות Ca2 + אינדיקטורים, כולל GCaMP3 ו iGluSnFR המשמשים כאן, לספק הן רזולוציה זמנית גבוהה יותר וקלות השימוש בשל שלהם בדרך כלל בהיר Ca2 +- אות מגיב ודרישות מיקרוסקופ פשוט שלהם10. לדוגמה, דווח כימחוון R-GECO1 המבוסס על חלבון אדום-פלואורסצנטי, R-GECO1, הראה שינוי אות גדול בהרבה בתגובה ל- ATP חוץ-תאי ולגורמים להגנת הצמח flg22 וצ'יטין, בהשוואה ליחס בין YC3.6 biosensor27. לצורך ניתוח חיישנים מבוססי RATIOMETRIC FRET, יש צורך גם להשתמש במיקרוסקופ מיוחד עם מסננים מרובים כדי לאסוף נתונים בשני אורכי גל, ואילו biosensors מבוססי FP יחיד דורשים מהמכשיר לאסוף את הנתונים באורך גל אחד בלבד, יכולת שנמצאת בכל מיקרוסקופי הפלואורסצנטיות הסטנדרטיים10. עם זאת, חשוב לציין כי ישנם כמה חסרונות של שימוש biosensors יחיד FP. ביוסנסורים מבוססי אינטנסיביות אלה, חד-תכליתיים, אינם מועדפים לכימות שינויי ריכוז מוחלטים או להדמיה ארוכת טווח על פני שעות או ימים רבים. מגבלה זו נובעת מכך שבנוסף לרמת Ca2+ עבור GCaMP3, עוצמת האות מביו-סנסורים חד-תכליתיים אלה נחשבת מושפעת מגורמים אחרים כגון רמת ביטוי החיישן או פרמטרים כגון pH סלולרי שעשוי להשתנות עם הזמן.

עד כה, גרסאות חדשות רבות של אינדיקטורים מקודדים גנטית אלה תוכננו כדי לשפר את יחס האות לרעש, טווח דינמי, קינטיקה ויציבות חיישן. לדוגמה, לאחר Nakai et al.26 פיתח את GCaMP הראשון, גרסאות רצופות שונות, כגון GECOs נוצרו על ידי שילוב של mutagenesis ואפיון זהיר48,49,50. הטווח הדינמי של G-GECO (גרין-GECO) דווח להיות גדול בערך פי שניים מזה של GCaMP328. יתר על כן, ההחלפה בחלבונים פלואורסצנטיים שונים באינדיקטורים אלה הובילה ליצירת גרסאות GECO עם ספקטרום פליטה שונה, כגון B-GECO (Blue-GECO) ו- R-GECO (Red-GECO), המאפשר שימוש באינדיקטורים אלה לצד גרסאות ספקטרליות אחרות של GFP ביישומי הדמיה צבעוניים28. באופן דומה, GCaMP המשיך להיות מפותח ומשופר עם סדרה של חיישנים משופרים למהירות התגובה משרעת של האות עכשיו להיות זמין50. לניטור דינמיקת גלוטמט, מלבד iGluSnFR, סדרה של ביו-סנסורים גלוטמט מבוססי FRET, פותחו40חלבוני מחוון FLuorescent עבור גלוטמט (FLIPE). FLIPE מורכב CFP ו YFP המקושרים באמצעות חלבון מחייב גלוטמט ybeJ נלקח E. coli. על גלוטמט מחייב ybeJ, ירידה תלוית ריכוז גלוטמט של יעילות FRET נצפתה. לכן, הן עבור Ca2+ והן עבור גלוטמט ישנם חיישנים מרובים של FP יחיד ו- ratiometric זמינים. החוקרים צריכים לשקול את biosensor המתאים כדי לזהות דינמיקה אות בהתאם לתכנון הניסוי ודרישות עבור גורמי מדידה כגון אות גבוה:רעש (חיישני FP יחיד) לעומת צורך כמויות מדויקת מאוד (שם חיישני FRET מצטיינים).

שיטת ההדמיה החד-תכליתית הרחבה המתוארת כאן לפציעה צריכה להיות שימושית גם כאשר היא מוחלת על תהליכי איתות מערכתיים אחרים של מתח. למרות נוכחותם של דיווחים רבים המציעים תפקיד מכריע של Ca2+ למרחקים ארוכים איתות בתגובות מתח שונות, כגון התקפת אוכלי עשב6,51,52, מלח20, ובצורת53, רק כמה מחקרים סיפקו את המידע spatiotemporal הקשורים מהיר למרחקים ארוכים Ca2 + אותות הנגרמים על ידי תגובות מתח אלה6,7,20,52. השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה בפרוטוקול זה מאפשר גם תצפית בזמן אמת על דינמיקת האותות הניידים לא רק בתקשורת עלה עלה, אלא גם בתקשורת שורש לירות כפי שהוצג לאחרונה38. למרות שהתמקדנו בפרוטוקולים עבור Arabidopsis, שיטת הדמיה זו בזמן אמת ברחבי הצמח מספקת גם כלי חזק להבנת המאפיינים המרחביים והטמפורליים של Ca2+ מערכתית איתות הן בתגובות מתח ביוטיות ואביוטיות במיני צמחים אחרים כגון טבק30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של האגודה היפנית לקידום המדע (17H05007 ו 18H05491) ל MT, הקרן הלאומית למדע (IOS1557899 ו MCB2016177) ומינהל האווירונאוטיקה והחלל הלאומי (NNX14AT25G ו 80NSSC19K0126) ל SG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32, (9), 1161-1174 (2009).
  2. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, (1), 387-415 (2018).
  3. Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500, (7463), 422-426 (2013).
  4. Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171, (3), 1606-1615 (2016).
  5. Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67, (1), 287-307 (2016).
  6. Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361, (6407), 1112-1115 (2018).
  7. Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (40), 10178-10183 (2018).
  8. Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171, (2), 249-269 (2006).
  9. Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227, (4), 1037-1050 (2020).
  10. Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29, (3), 144-152 (2011).
  11. Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, (2), 229-234 (1967).
  12. Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23, (2), 267-278 (2000).
  13. Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6, (2), 444-455 (2013).
  14. Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440, (3), 355-373 (2011).
  15. Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93, (12), 2095-2101 (2011).
  16. Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163, (2), 543-554 (2013).
  17. Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
  18. Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (35), 5242-5249 (2016).
  19. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (29), 10554-10559 (2004).
  20. Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (17), 6497-6502 (2014).
  21. Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171, (3), 1771-1784 (2016).
  22. Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, (31), 18849-18857 (2020).
  23. Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216, (4), 1161-1169 (2017).
  24. Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70, (1), 118-128 (2012).
  25. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (6), 3197-3202 (2001).
  26. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, (2), 137-141 (2001).
  27. Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8, (8), 1188-1200 (2015).
  28. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333, (6051), 1888-1891 (2011).
  29. Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142 (2017).
  30. DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58, (7), 1173-1184 (2017).
  31. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332, (6028), 434-437 (2011).
  32. Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67, (6), 1853-1869 (2016).
  33. Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42, (12), 3326-3339 (2019).
  34. Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162, (3), 1497-1509 (2013).
  35. Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69, (17), 4151-4163 (2018).
  36. De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
  37. Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2, (1), 232 (2011).
  38. Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13, (640), (2020).
  39. Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58, (9), 2339-2358 (2007).
  40. Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (24), 8740-8745 (2005).
  41. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (11), 4411-4416 (2008).
  42. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, (2), 162-170 (2013).
  43. Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15, (11), 936-939 (2018).
  44. Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. (2013).
  45. Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83, (1), 102-111 (2007).
  46. Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67, (7), 2063-2079 (2016).
  47. Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90, (4), 698-707 (2017).
  48. Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (12), 4753-4758 (2006).
  49. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, (12), 875-881 (2009).
  50. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, (7458), 295-300 (2013).
  51. Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29, (6), 1460-1479 (2017).
  52. Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31, (7), 1539-1562 (2019).
  53. Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15, (8), 1833-1845 (2003).
שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים <em>ב Arabidopsis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter