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Biology

वाइड-फील्ड, अरबीडोप्सिस में स्थानीय और प्रणालीगत घाव संकेतों की वास्तविक समय इमेजिंग

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Summary

पौधों में यांत्रिक घायल और शाकाहारी हमले के लिए पौधों की रक्षा प्रतिक्रियाओं को शामिल करने के लिए अतिरिक्त ग्लूटामेट-ट्रिगर प्रणालीगत कैल्शियम सिग्नलिंग महत्वपूर्ण है। यह लेख इन दोनों कारकों की स्थानिक और लौकिक गतिशीलता की कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है जिसमें कैल्शियम और ग्लूटामेट-सेंसेंट बायोसेंसर व्यक्त किए गए अरबीडोप्सिस थैलियाना पौधों का उपयोग किया जाता है।

Abstract

पौधे क्षतिग्रस्त और डिस्टल अक्षतिग्रस्त हिस्सों में रक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करके घायल और शाकाहारी जैसे यांत्रिक तनावों का जवाब देते हैं। एक पत्ती के घायल होने पर, घाव स्थल पर साइटोसॉलिक कैल्शियम आयन एकाग्रता (सीए2 + सिग्नल) में वृद्धि होती है। यह संकेत तेजी से अक्षतिग्रस्त पत्तियों को प्रेषित किया जाता है, जहां रक्षा प्रतिक्रियाएं सक्रिय होती हैं। हमारे हाल के शोध से पता चला है कि उनके चारों ओर एपोप्लास्ट में पत्ती की घायल कोशिकाओं से लीक ग्लूटामेट एक घाव संकेत के रूप में कार्य करता है । यह ग्लूटामेट ग्लूटामेट रिसेप्टर जैसे सीए2 + पारमेबल चैनलों को सक्रिय करता है, जो तब पूरे संयंत्र में लंबी दूरी की सीए2 + सिग्नल प्रचार की ओर जाता है। इन घटनाओं की स्थानिक और लौकिक विशेषताओं को आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट बायोसेंसर व्यक्त करने वाले जीवित पौधों के वास्तविक समय इमेजिंग के साथ कैप्चर किया जा सकता है। यहां हम सीए2 + संकेतों और घायल होने के जवाब में होने वाले एपोप्लास्टिक ग्लूटामेट में परिवर्तन दोनों की गतिशीलता की निगरानी के लिए एक संयंत्र-चौड़ा, वास्तविक समय इमेजिंग विधि पेश करते हैं। यह दृष्टिकोण ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) आधारित सीए2 + और ग्लूटामेट बायोसेंसर को व्यक्त करने वाले व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और ट्रांसजेनिक अरबीडोप्सिस पौधों का उपयोग करता है। इसके अलावा, हम आसानी से घाव से प्रेरित, ग्लूटामेट-ट्रिगर रैपिड और लंबी दूरी के सीए2 + सिग्नल प्रचार को प्रकाश में लाने के लिए कार्यप्रणाली पेश करते हैं। इस प्रोटोकॉल को अन्य संयंत्र तनावों पर अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है ताकि यह जांच करने में मदद मिल सके कि संयंत्र प्रणालीगत सिग्नलिंग उनके सिग्नलिंग और प्रतिक्रिया नेटवर्क में कैसे शामिल हो सकती है।

Introduction

पौधे बायोटिक तनावों से बच नहीं सकते हैं, उदाहरण के लिए, कीड़े उन पर भोजन करते हैं, इसलिए उन्होंने जड़ी-बूटी1जैसी चुनौतियों से खुद को बचाने के लिए परिष्कृत तनाव संवेदन और सिग्नल ट्रांसडक्शन सिस्टम विकसित किया है। घायल या शाकाहारी हमले पर, पौधे न केवल घायल स्थल पर बल्कि अक्षतिग्रस्त डिस्टलअंगोंमें भी फाइटोहोरमोन जैस्मोनिक एसिड (जा) के संचय सहित तेजी से रक्षा प्रतिक्रियाएं शुरू करते हैं। यह जा तो दोनों सीधे क्षतिग्रस्त ऊतकों में रक्षा प्रतिक्रियाओं से चलाता है और पहले से संयंत्र के अक्षतिग्रस्त भागों में सुरक्षा लाती है । अरेबिडोप्सिसमें, घायल होने से प्रेरित जा के संचय का पता तब चला, पौधे में कहीं और नुकसान के कुछ ही मिनटों के भीतर बरकरार पत्तियां यह सुझाव देती हैं कि घायल पत्ती3से तेजी से और लंबी दूरी का संकेत प्रेषित किया जा रहा है । सीए2 +,प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और विद्युत संकेतों जैसे कई उम्मीदवारों को पौधों4, 5में लंबी दूरी के घाव संकेतों के रूप में सेवा करने का प्रस्ताव किया गया है।

Ca2 + यूकेरियोटिक जीवों में सबसे बहुमुखी और सर्वव्यापी दूसरे दूत तत्वों में से एक है। पौधों में, कैटरपिलर चबाने और यांत्रिक रूप से घायल होने से साइटोसोलिक सीए2 + एकाग्रता ([सीए2 +]साइट)दोनों घायल पत्ती में और बिना घाव वाली दूर की पत्तियों में कठोर वृद्धि होती है6,7। यह प्रणालीगत Ca2 + सिग्नलइंट्रासेलुलर सीए2 +-सेंसिंग प्रोटीन द्वारा प्राप्त होता है, जो एनएए बायोसिंथेसिस8,9सहित डाउनस्ट्रीम डिफेंस सिग्नलिंग रास्तों को सक्रिय करता है। संयंत्र घाव प्रतिक्रियाओं में सीए2 + संकेतों के महत्व का समर्थन करने वाली कई ऐसी रिपोर्टों के बावजूद, घायल होने से प्रेरित सीए2 + संकेतों की स्थानिक और लौकिक विशेषताओं के बारे में जानकारी सीमित है।

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतकों का उपयोग करके वास्तविक समय इमेजिंग सीए 2+ संकेतों की स्थानिक और लौकिक गतिशीलता की निगरानी और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। आज तक, ऐसे सेंसरों के संस्करण विकसित किए गए हैं जो एक कोशिका के स्तर पर सीए2 + संकेतों के दृश्य को ऊतकों, अंगों और यहां तक कि पूरे पौधोंको 10तक सक्षम करते हैं। पौधों में उपयोग किया जाने वाला सीए2 + के लिए पहला आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर जेलीफिश एक्यूरिया विक्टोरिया11से प्राप्त बायोल्यूमिनसेंट प्रोटीन एइकोरिन था। यद्यपि इस रसायनीय प्रोटीन का उपयोग12, 13, 14, 15, 16, 17,18में विभिन्न तनावों के जवाब में सीए2+ परिवर्तनों का पता लगाने के लिए किया गया है, लेकिन यह बेहद कम ल्यूमिनेसेंट सिग्नल के कारण वास्तविक समय की इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है। 19,20, 21, 22, 23, 24 में सीए2 + सिग्नलिंग घटनाओं की एक श्रृंखला की घटनाओं की जांच करने के लिए फैस्टर रेकॉन्स एनर्जी ट्रांसफर (FRET) आधारित सीए2+ संकेतकों का भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। ये सेंसर इमेजिंग दृष्टिकोणों के साथ संगत होते हैं और आमतौर पर सीए2 + बाध्यकारी प्रोटीन कैलमोडुलिन (सीएएम) और एक मायोसिन लाइट चेन किनेज़ से सीएएम-बाइंडिंग पेप्टाइड (एम13) से बने होते हैं, सभी दो फ्लोरोफोर प्रोटीन के बीच जुड़े होते हैं, आम तौर पर एक सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (CFP) और एक पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण (वाईएफपी)10। Ca2 + CaM के लिए बाध्यकारी CaM और M13 के बीच बातचीत को बढ़ावा देता है जिससे सेंसर का एक अनुरूप परिवर्तन होता है। यह बदलाव सीएफपी और वाईएफपी के बीच ऊर्जा हस्तांतरण को बढ़ावा देता है, जो सीएफपी से फ्लोरेसेंस उत्सर्जन को कम करते हुए वाईएफपी की फ्लोरेसेंस तीव्रता को बढ़ाता है । सीएफपी से वाईएफपी फ्लोरेसेंस तक इस बदलाव की निगरानी करना सीए2 + स्तर में वृद्धि का एक उपाय प्रदान करता है। इन FRET सेंसरों के अलावा, एकल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) आधारित सीए2 + बायोसेंसर, जैसे कि जीसीएएमपी और आर-जीईसीओ, पौधों के इमेजिंग दृष्टिकोणों के साथ भी संगत हैं और उनकी उच्च संवेदनशीलता और उपयोग में आसानी के कारण [सीए2 +]साइट परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है25,26,27, 28,29,30। GCaMPs में एक गोलाकार रूप से क्रमबद्ध (सीपी) जीएफपी होता है, जो फिर से सीएएम और एम13 पेप्टाइड से जुड़ा होता है। Ca2+-CaM और M13 के बीच निर्भर बातचीत सेंसर में एक अनुरूप परिवर्तन का कारण बनता है कि cpGFP के प्रोटोनेशन राज्य में बदलाव को बढ़ावा देता है, अपने फ्लोरोसेंट संकेत को बढ़ाने । इस प्रकार, सीए2 + स्तर बढ़ने के साथ, सीपीजीएफपी सिग्नल बढ़ जाता है।

यांत्रिक घायल या शाकाहारी भोजन के जवाब में उत्पन्न सीए2 + संकेतों की गतिशीलता की जांच करने के लिए, हमने ट्रांसजेनिक अरबीडोप्सिस थैलियाना पौधों का उपयोग किया है जो जीसीएएमपी संस्करण, जीसीएएमपी 3 और एक व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप6व्यक्त करते हैं। यह दृष्टिकोण घाव स्थल से पूरे पौधे तक एक लंबी दूरी के सीए2 + सिग्नल के तेजी से संचरण की कल्पना करने में सफल रहा है। इस प्रकार, घाव स्थल पर [सीए2 +]साइट में वृद्धि का तुरंत पता चला लेकिन इस सीए2 + सिग्नल को घायल होने के कुछ मिनटों के भीतर वेक्यूलेचर के माध्यम से पड़ोसी पत्तियों में प्रचारित किया गया। इसके अलावा, हमने पाया कि इस तेजी से प्रणालीगत घाव संकेत का संचरण अरबीडोप्सिस पौधों में समाप्त हो जाता है, जिसमें दो ग्लूटामेट रिसेप्टर जैसे जीन, ग्लूटामेट रिसेप्टर जैसे (जीएलआर), जीएलआर 3.3 और जीएलआर 3.6 6में म्यूटेशन होते हैं। जीएलआर विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल अमीनो-एसिड गेटेड सीए2 + चैनलों के रूप में कार्य करता दिखाई देता है, जिसमें घाव प्रतिक्रिया3,पराग ट्यूब विकास31,रूट विकास32,कोल्ड रिस्पांस33और जन्मजात प्रतिरक्षा34शामिल हैं। जीएलआर के इस अच्छी तरह से समझे जाने वाले, व्यापक शारीरिक कार्य के बावजूद, उनके कार्यात्मक गुणों के बारे में जानकारी, जैसे कि उनकी लिगांड विशिष्टता, आयन चयनशीलता, और उपकोशिकीय स्थानीयकरण,सीमित 35हैं। हालांकि, हाल के अध्ययनों ने बताया कि GLR3.3 और GLR3.6 क्रमशः phloem और दारू में स्थानीयकृत हैं । पौधे जीएलआर में स्तनधारियों में आयनोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (आईजीएलआर)36 में समानताएं हैं, जो स्तनधारी तंत्रिका तंत्र37में ग्लूटामेट, ग्लाइसिन और डी-सेरीन जैसे अमीनो एसिड द्वारा सक्रिय होती हैं। दरअसल, हमने दिखा दिया कि घाव स्थल पर 100 mM ग्लूटामेट का आवेदन, लेकिन अन्य अमीनो एसिड नहीं, अरबीडोप्सिसमें तेजी से, लंबी दूरी की सीए2 + सिग्नल को प्रेरित करता है, यह दर्शाता है कि बाह्राश ग्लूटामेट की संभावना पौधों में घाव संकेत के रूप में कार्य करती है6। इस प्रतिक्रिया को glr3.3/glr3.6उत्परिवर्ती में समाप्त कर दिया गया है, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि ग्लूटामेट इन रिसेप्टर जैसे चैनलों में से एक या दोनों के माध्यम से कार्य कर सकता है और वास्तव में, ATGLR3.6 को हाल ही में ग्लूटामेट३८के इन स्तरों से गेट किया जाना दिखाया गया था ।

पौधों में, एक संरचनात्मक अमीनो एसिड के रूप में अपनी भूमिका के अलावा, ग्लूटामेट को एक प्रमुख विकास नियामक39के रूप में भी प्रस्तावित किया गया है; हालांकि, इसकी स्थानिक और लौकिक गतिशीलता खराब समझ में आती है। सीए2 +के लिए, जीवित कोशिकाओं में इस अमीनो एसिड की गतिशीलता की निगरानी के लिए ग्लूटामेट के लिए कई आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड संकेतक विकसित किए गएहैं। iGluSnFR एक जीएफपी आधारित एकल-एफपी ग्लूटामेट बायोसेंसर है जो सीपीजीएफपी से बना है और एस्चेरिचिया कोलाई42, 43से ग्लूटामेट बाइंडिंग प्रोटीन (ग्लटीआई) है। IGluSnFR का अनुरूप परिवर्तन, जो ग्लूटामेट द्वारा जीएलटीआई के लिए बाध्यकारी द्वारा प्रेरित होता है, जिसके परिणामस्वरूप जीएफपी फ्लोरेसेंस उत्सर्जन में वृद्धि होती है। यह जांचने के लिए कि क्या एक्सासेलुलर ग्लूटामेट पौधे के घाव की प्रतिक्रिया में एक सिग्नलिंग अणु के रूप में कार्य करता है, हमने एपोप्लास्टिक स्पेस6में इस बायोसेंसर को स्थानीयकृत करने के लिए बुनियादी चिटनेस सिग्नल पेप्टाइड स्राव अनुक्रम (CHIB-iGluSnFR) के साथ iGluSnFR अनुक्रम को जोड़ा। इस दृष्टिकोण ने इस सेंसर को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक अरबीडोप्सिस पौधों का उपयोग करके एपोप्लास्टिक ग्लूटामेट एकाग्रता ([ग्लू]एपीओ)में किसी भी परिवर्तन की इमेजिंग को सक्षम किया। हमने घायल स्थल पर iGluSnFR सिग्नल में तेजी से वृद्धि का पता लगाया। यह डेटा इस विचार का समर्थन करता है कि ग्लूटामेट क्षतिग्रस्त कोशिकाओं/ऊतकों से घायल होने पर एपोप्लास्ट में लीक हो जाता है और जीएलआर को सक्रिय करने के लिए क्षति संकेत के रूप में कार्य करता है और पौधों में लंबी दूरी की सीए2 + सिग्नल के लिए अग्रणी6।

यहां, हम6घायल होने के जवाब में लंबी दूरी की सीए2 + और बाह्राशील ग्लूटामेट संकेतों की गतिशीलता की निगरानी और विश्लेषण करने के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर का उपयोग करके एक संयंत्र-व्यापी वास्तविक समय इमेजिंग विधि का वर्णन करते हैं। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर व्यक्त करने वाले व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और ट्रांसजेनिक पौधों की उपलब्धता सीए2 + तरंगों जैसे तेजी से संचारित लंबी दूरी के संकेतों का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली, अभी तक आसानी से लागू दृष्टिकोण प्रदान करती है।

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Protocol

1. पौधे सामग्री तैयार करने

  1. एक 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में, सतह अरबीडोप्सिस थैलियाना (कर्नल-0 परिग्रहण) संयंत्र के बीजों को 3 मिनट के लिए 20% (v/v) NaClO के साथ मिलाते हुए GCaMP3 या CHIB-iGluSnFR व्यक्त करने और फिर बाँझ आसुत पानी के साथ 5 बार धोने के बीज को निष्फल करते हैं।
    नोट: GCaMP3 या CHIB-iGluSnFR व्यक्त अरबीडोप्सिस की ट्रांसजेनिक लाइनों को पहले6वर्णित किया गया है ।
  2. एक बाँझ हुड में, 30 एमएल बाँझ (ऑटोक्लेव) मुराशिगे और स्कूग (एमएस) माध्यम [1x एमएस साल्ट, से भरे 10 सेमी वर्ग प्लास्टिक पेट्री डिश पर 13 सतह-निष्फल बीज बोएं, 1% (w/v) सुक्रोज, ०.०१% (w/v) मायोइनोसिटोल, ०.०५% (w/v) एमईएस और ०.५% (w/v) जेललान गम; पीएच ५.७ 1N KOH के साथ समायोजित] । ढक्कन को बदलें और सर्जिकल टेप से लपेटें।
  3. 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेशन के बाद, प्लेटों को उपयोग से लगभग 2 सप्ताह पहले निरंतर प्रकाश (90-100 माइक्रोमोल मीटर -2 एस-1)के तहत एक विकास कक्ष में22 डिग्री सेल्सियस पर क्षैतिज रूप से रखें। 2 सप्ताह के बाद, सबसे पुराने से सबसे कम उम्र के44 (चित्रा 1)तक अरबीडोप्सिस पत्तियों की संख्या गिनें। घाव प्रतिक्रियाएं अधिमानतः क्षतिग्रस्त पत्ती (एन) से गिने गए एन ± 3 और एन ± 56पत्तियों में स्थानांतरित हो जाती हैं।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, पेट्री डिश को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत घाव और ग्लूटामेट प्रभावों की इमेजिंग के लिए खोला जाएगा। इसलिए, इस प्रयोग में बाद के कदम तापमान और आर्द्रता नियंत्रित कमरे की स्थिति के तहत आयोजित किए जाने चाहिए। इसका कारण यह है कि Ca2 + संकेतों को भी इन पर्यावरणीय स्थितियों में परिवर्तन से प्राप्त किया जाता है । यह भी ज्ञात है कि बायोसेंसर प्रोटीन के फ्लोरेसेंस की उमंग के लिए रिकॉर्डिंग के दौरान माइक्रोस्कोप से उत्सर्जित नीली रोशनी, साइटोसोलिक सीए2 + एकाग्रता45 की वृद्धि प्राप्त कर सकती है और इसलिए पौधे को प्रयोग शुरू करने से पहले कई मिनट के लिए नीली रोशनी विकिरण के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

2. रासायनिक तैयारी

  1. एल-ग्लूटामेट को तरल विकास माध्यम [1/2x एमएस साल्ट, 1% (w/v) सुक्रोज और ०.०५% (w/v) एमईएस; पीएच ५.१ 1N KOH के साथ समायोजित] में भंग करें ताकि १०० mM वर्किंग सॉल्यूशन बनाया जा सके ।
    नोट: सीए2 + गतिशीलता पर संभावित सेशन-संबंधित प्रभावों को रोकने के लिए सोडियम ग्लूटामेट जैसे ग्लूटामेट के लवण के उपयोग से बचें।

3. माइक्रोस्कोप की स्थापना और वास्तविक समय इमेजिंग का आयोजन

  1. 1x उद्देश्य लेंस (एनए = 0.156) और एक एसएमओ कैमरा(चित्रा 2)से लैस मोटराइज्ड फ्लोरेसेंस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप चालू करें और डिवाइस सेटिंग्स को 470/40 एनएम एक्सेक्टेशन लाइट के साथ विकिरणित करने के लिए कॉन्फ़िगर करें और 535/50 एनएम फिल्टर से गुजरने वाले उत्सर्जन प्रकाश को प्राप्त करें।
    नोट: किसी भी GFP के प्रति संवेदनशील फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग वास्तविक समय में GCaMP3 और iGluSnFR संकेतों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, लेकिन एक कम शक्ति उद्देश्य लेंस और एक विस्तृत SCMOS चिप के साथ अत्यधिक संवेदनशील कैमरा पूरे संयंत्र से संकेत प्राप्त करने की सिफारिश कर रहे हैं । कम शक्ति उद्देश्य एक पूरे अरबीडोप्सिस संयंत्र की प्रतिक्रिया की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है और एक अत्यधिक संवेदनशील कैमरे का उपयोग घाव-ट्रिगर सीए2 + लहर के तेजी से समय पाठ्यक्रम को कैप्चर करने के लिए आवश्यक तेजी से डेटा अधिग्रहण की अनुमति देता है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के लिए, दृश्य और लौकिक संकल्प के क्षेत्र के अधिकतम मूल्य क्रमशः 3 सेमी x 3 सेमी और 30 फ्रेम प्रति सेकंड (एफपीएस) हैं।
  2. ढक्कन निकालें और उद्देश्य लेंस के नीचे पकवान जगह है।
  3. पौधे से फ्लोरेसेंस सिग्नल की जांच करें और फिर अंधेरे में लगभग 30 मिनट की प्रतीक्षा करें जब तक कि पौधों को नए पर्यावरणीय स्थितियों के अनुकूल न बनाया जाए। इस अनुकूलन कदम की आवश्यकता है क्योंकि आर्द्रता में परिवर्तन पौधों में प्रकाश में लाना [Ca2 +]cyt ऊंचाई है कि किसी भी घाव से संबंधित घटनाओं के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ।
  4. देखने के क्षेत्र में पूरे संयंत्र को देखने के लिए ध्यान और आवर्धन समायोजित करें। वर्तमान प्रोटोकॉल में, 0.63x आवर्धन का उपयोग किया गया था।
  5. रियल-टाइम इमेजिंग शुरू करने से पहले, माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फ्लोरेसेंस संकेतों का पता लगाने के लिए अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें। वर्तमान प्रोटोकॉल में इमेजिंग के लिए सेटिंग्स हैं: एक्सपोजर और इंटरवल समय क्रमशः 1.8 एस और 2 एस (यानी, 0.5 एफपीएस) तक सेट होता है। 11 मिनट के लिए रिकॉर्डिंग समय निर्धारित करें।
  6. माइक्रोस्कोप से नीली रोशनी विकिरण के लिए संयंत्र को अनुकूलित करने के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले 5 मिनट के लिए छवि, फिर रन नाउपर क्लिक करके रिकॉर्डिंग शुरू करें, या माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में समकक्ष कमांड का उपयोग किया जा रहा है। औसत बेसलाइन फ्लोरेसेंस निर्धारित करने के लिए, घायल या ग्लूटामेट एप्लिकेशन (धारा 4 देखें) से पहले कम से कम 10 फ्रेम (यानी, वर्तमान प्रोटोकॉल में कम से कम 20 एस) रिकॉर्ड करें।
    1. घाव-प्रेरित [सीए2 +]साइट और [ग्लू]एपो परिवर्तन के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए, पैर की कैंची के साथ पेटियोल या पत्ती L1 के मध्य क्षेत्र कोकाटें (चित्रा 3 और चित्रा 4)।
    2. ग्लूटामेट-ट्रिगर [सीए2 +]साइट परिवर्तनों के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए, कैंची के साथ मुख्य नस के पार पत्ती 1 के किनारे (टिप से लगभग 1 मिमी) काटें। कम से कम 20 मिनट की वसूली अवधि के बाद, पत्ती की कट सतह(चित्रा 5)पर 100 m m ग्लूटामेट के 10 माइक्रोन लागू करें।
      नोट: प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए पत्ती एपोप्लास्ट तक ग्लूटामेट एक्सेस की अनुमति देने के लिए यह प्री-कटिंग आवश्यक थी। इसके अलावा, पत्ती L1 की कट सतह पर आसुत पानी की एक बूंद लगाने के लिए ग्लूटामेट लगाने से पहले वसूली के दौरान गाद से नमूनों को रोकने के लिए महत्वपूर्ण पाया गया था ।
  7. 11 मिनट की रिकॉर्डिंग खत्म करने के बाद, डेटा को सेव करें।

4. डेटा विश्लेषण

  1. समय के साथ फ्लोरेसेंस तीव्रता विश्लेषण के लिए, उस स्थान पर ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) को परिभाषित करें जहां फ्लोरेसेंस तीव्रता का विश्लेषण किया जाना है(चित्र 6 और चित्रा 7)। सीए2 + तरंग की वेग गणना के लिए, विश्लेषण के लिए 2 आरओआई (ROI1 और ROI2) को परिभाषित करें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर में टाइम मेजरमेंट | पर क्लिक करें | को परिभाषित करें सर्किल। एनोटेशन और माप | पर क्लिक करके ROI1 और ROI2 के बीच की दूरी को मापें लंबाई | सरल रेखा (चित्र 6)।
  2. उपाय पर क्लिक करके समय के साथ प्रत्येक आरओआई में कच्चे फ्लोरेसेंस मूल्यों (एफ) को मापें। सभी पर क्लिक करके हर समय बिंदु पर फ्लोरेसेंस सिग्नल को संख्याओं में परिवर्तित करने के लिए स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में कच्चे डेटा का निर्यात करें | निर्यात।
  3. रिकॉर्ड किए गए डेटा में पहले10 फ्रेम (यानीउपचार से पहले) एफ के औसत की गणना करके बेसलाइन फ्लोरेसेंस मूल्य निर्धारित करें, जिसे एफ 0 के रूप में परिभाषित किया गया है।
  4. एफ डेटा को सामान्य करें (बीएफ/एफ की गणना करके) समीकरण का उपयोग करके ΤF/F = (एफ−एफ0)/F0,जहां फ्लूसेंस में समय पर निर्भर परिवर्तन है।
  5. सीए2 + तरंग तरंग विश्लेषण के लिए, सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एफ0 डेटा से गणना की जाने वाली मानक विचलन(2x एसडी) की वृद्धि के मापदंड का उपयोग करके प्रत्येक आरओआई(टी1 और टी2)में सीए× 2 + वृद्धि का प्रतिनिधित्व करने के रूप में पूर्व-उत्तेजित मूल्यों के ऊपर एक महत्वपूर्ण संकेत वृद्धि बिंदु को परिभाषित करें। एफ0 डेटा का 95% मतलब से 2x एसडी के भीतर आता है, यह दर्शाता है कि संयोग से इस स्तर से ऊपर संकेत में वृद्धि ≤5% है। ROI1 और ROI2 के बीच सीए2 + वृद्धि के समय अंतर की गणना करें [टी 2 - टी1 समय-अंतराल(ΤT)]और ROI1 और ROI2 के बीच की दूरी को मापने, तो किसी भी Ca2 + लहर के वेग का निर्धारण।

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Representative Results

घायल होने के जवाब में [सीए2+]साइट और [ग्लू]एपीओ का सिग्नल प्रचार चित्र 3, चित्रा 4, मूवी एस 1और मूवी एस 2में प्रस्तुत किया गया है । GCaMP3 (0 एस पर) व्यक्त पौधों में पत्ती 1 के पेटियोल को काटने से [सीए2 +]साइट में उल्लेखनीय वृद्धि हुई जो स्थानीय रूप से वैक्यूलेचर (40 एस पर)(चित्रा 3 और मूवी एस 1)के माध्यम से तेजी से प्रेरित थी। इसके बाद, संकेत तेजी से पड़ोसी पत्तियों (पत्ती 3 और 6) के लिए कुछ ही मिनटों के भीतर (८० एस पर)(चित्रा 3 और फिल्म S1)के लिए प्रचारित किया गया था ।

चिब-iGluSnFR व्यक्त पौधों में पत्ती 1 काटने पर, कटौती क्षेत्र (2 एस पर) के आसपास एक तेजी से [ग्लू]एपीओ वृद्धि देखी गई। इस संकेत को स्थानीय रूप से कुछ मिनटों के भीतर (160 एस पर) वैक्यूलेचर के माध्यम से प्रचारित किया गया था लेकिन प्रणालीगत पत्तियों(चित्र 4 और मूवी एस 2)में नहीं देखा गया था।

ग्लूटामेट के आवेदन से शुरू हुए सीए2 + सिग्नल प्रचार के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए, GCaMP3 व्यक्त करने वाले पौधों में पत्ती 1 के किनारे (टिप से लगभग 1 मिमी) को चित्र 5ए और मूवी एस 3में दिखाया गया था। पत्ती 1 के किनारे काटने के कारण एक स्थानीय [Ca2 +]साइट वृद्धि (40 एस पर) लेकिन यह संकेत कुछ ही मिनटों में गायब हो गया (124 एस पर)। संयंत्र को ठीक करने के लिए लगभग 10 मिनट के इंतजार के बाद, 100 mM ग्लूटामेट के 10 माइक्रोन को पत्ती 1 की कट सतह पर लागू किया गया था, जिसके कारण स्थानीय रूप से [सीए2 +]साइट (56 एस पर) की तेजी से, महत्वपूर्ण वृद्धि हुई और डिस्टल पत्तियों (104 एस पर)(चित्रा 5B और मूवी S4)के लिए संकेत प्रचार किया गया।

प्रणालीगत पत्ती में घायल होने से प्रेरित [सीए2 +]साइट में परिवर्तन को मापने के लिए, आधार क्षेत्र में दो आरओआई (ROI1 और ROI2) स्थापित किए गए थे और GCaMP3 को व्यक्त करने वाले पौधों में पत्ती 6 की नोक के रूप में चित्र 6 एमें दिखाया गया था। पत्ती 1 के पेटियोल को काटने पर ROI1 और ROI2 में GCaMP3 सिग्नल तीव्रता के समय पाठ्यक्रम परिवर्तन(चित्रा 6B)मापा गया था । ROI1 में [सीए2 +]साइट की एक महत्वपूर्ण वृद्धि आरओआई 2(चित्रा 6B)की तुलना में पहले पाई गई थी। [Ca2+] cyt घायल होने के बाद लगभग 100 एस पर नुकीला, 10 मिनट से अधिक के लिए चली, और दो चरणों(चित्रा 6B)का प्रदर्शन किया।

यांत्रिक घायल होने पर सीए2 + तरंग के वेग का निर्धारण करने के लिए, ROI1 और ROI2 में पूर्व-उत्तेजित मूल्यों से ऊपर एक महत्वपूर्ण संकेत वृद्धि का समय निर्धारित किया गया था (समय-अंतराल; धारा 4 देखें)(चित्रा 6C)। क्योंकि ROI1 और ROI2 के बीच की दूरी इस मामले में २.७ मिमी थी(चित्रा 6A),पत्ती 6 में सीए2 + सिग्नल वेग की गणना ०.१५ मिमी/s के रूप में की गई थी । यांत्रिक क्षति के जवाब में [ग्लू]एपीओ परिवर्तनों को मापने के लिए, ROI1 को चित्र 7 एमें दिखाए गए एल1 के रूप में चिह्नित पत्ती की साइट काटने के आसपास स्थापित किया गया था। [ग्लू] ROI1 पर एपीओ हस्ताक्षर घायल(चित्रा 7B)पर लगभग १०० एस पर एक ही चोटी का प्रदर्शन किया है ।

Figure 1
चित्र 1: अरबीडोप्सिस रोसेट पत्तियों की संख्या। अरबीडोप्सिस पत्तियों को सबसे पुराने से सबसे कम उम्र (बाएं पैनल) तक गिने जाते हैं। पत्तियों की स्थिति का एक योजनाबद्ध आरेख सही पैनल में इंगित किया जाता है। एल: पत्ती, सी: कोटिलेडन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वालाफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप। [सीए2+]साइट और [ग्लू]एपो गतिशीलता को व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया गया था। आर: रिमोट कंट्रोलर, ओ: 1x उद्देश्य लेंस, सी: SCMOS कैमरा, टी: Trinocular झुकाव ट्यूब, एस: चरण, पी: संयंत्र सामग्री । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:घाव प्रेरित लंबी दूरी की Ca2 + सिग्नल ट्रांसमिशन। GCaMP3 को व्यक्त करने वाले पौधे में पत्ती 1 (एल1) के पेटियोल (सफेद तीर, 0 एस) को काटने से एक स्थानीय [सीए2 +]साइट वृद्धि (लाल तीर, 40 एस) शुरू हो गई जो प्रणालीगत पत्तियों [पत्ती 3 (एल3) और पत्ती 6 (एल 6)] (नारंगी तीर, 80 एस) को प्रेषित किया गया था। स्केल बार, 5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:घाव-ट्रिगर [ग्लू]एपीओ ऊंचाई। चिब-iGluSnFR व्यक्त पौधों में पत्ती 1 (L1) (सफेद तीर, 0 एस) काटने के कारण [ग्लू]एपीओ (लाल तीर, 80 एस) की तेजी से ऊंचाई हुई जो वैक्यूलेचर (नारंगी तीर, 160 एस) के माध्यम से प्रचारित हुई। स्केल बार, 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:ग्लूटामेट-लंबी दूरी की Ca2 + सिग्नल ट्रांसमिशन शुरू हो गया । (A)GCaMP3 (सफेद तीर, 0 एस) व्यक्त पौधों में पत्ती 1 (L1) के किनारे काटने (टिप से लगभग 1 मिमी) एक [Ca2 +]साइट वृद्धि (लाल तीर, ४० एस) का कारण बना । (ख)L1 (सफेद तीर, 0 एस) की कट सतह के लिए 100 mM ग्लूटामेट के आवेदन के कारण एक स्थानीय [Ca2+]साइट वृद्धि (लाल तीर, 56 एस) जो तेजी से डिस्टल पत्तियों के लिए प्रचारित होती है [जैसे, पत्ती 3 (एल 3), पत्ती 4 (L4), और पत्ती 6 (एल6)] (नारंगी तीर, 104 एस)। स्केल बार, 5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:[Ca2+]यांत्रिक घायल होने के जवाब में प्रणालीगत पत्तियों मेंसाइट हस्ताक्षर। (A)GCaMP3 व्यक्त पौधों में पत्ती 6 (L6) की एक विस्तारित छवि चित्र 3में दिखाया गया है । ROI1 (ब्लू सर्कल) और ROI2 (गुलाबी सर्कल) क्रमशः आधार और टिप क्षेत्र में स्थापित किए गए थे । सफेद तीर पत्ती 1 के पेटियोल (एल 1) की कट साइट को इंगित करता है। इस मामले में, ROI1 और ROI2 के बीच की दूरी 2.7 मिमी थी।(बी)ROI1 और ROI2 में [सीए2 +]साइट हस्ताक्षरोंका क्वांटिफिकेशन। फ्लोरेसेंस तीव्रता परिवर्तन इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । (ग)0 और 80 एस के बीच (बी) में डेटा का विस्तारित ट्रेस । आरओआई1 और आरओआई2 में सीए2 + वृद्धि के डिटेक्शन पॉइंट्स को क्रमशः टी 1 और टी2के रूप में परिभाषित किया गया था, जो एक मापदंड के रूप में उपयोग करते हुए 2x के मानक विचलन (2x एसडी, बिंदीदार रेखा) का उपयोग करते हुए। टी 2 के मूल्य - टी1 वर्तमान प्रोटोकॉल में समय अंतराल(1t)के रूप में परिभाषित किया गया था। काला तीर कट समय को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:यांत्रिक घायल होने के जवाब में [ग्लू]एपीओ हस्ताक्षर। (ए)चिब-iGluSnFR व्यक्त पौधों में पत्ती 1 (L1) की एक विस्तारित छवि चित्र 4में दिखाया गया है । ROI1 कट साइट के आसपास के क्षेत्र में स्थापित किया गया था । सफेद तीर कट क्षेत्र को इंगित करता है। (ख)आरओआई1 में [ग्लू]एपीओ हस्ताक्षर की मात्रा इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निगरानी की जाती है । काला तीर कट समय को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म S1:यांत्रिक घायल होने के बाद लंबी दूरी की Ca2 + संचरण। पत्ती 1 (L1) के पेटियोल में यांत्रिक घायल होने के कारण डिस्टल पत्तियों [जैसे, पत्ती3(एल3) और पत्ती 6 (एल6)] में फैलने वालीसाइट वृद्धि हुई। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म S2: काटने के जवाब में एपोप्लास्टिक ग्लूटामेट स्तर की ऊंचाई। पत्ती 1 (एल 1) के यांत्रिक घायल होने के कारण [ग्लू]एपीओमें तत्काल वृद्धि हुई । कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म S3: काटने केजवाब में [Ca2 +]साइट के स्तर की ऊंचाई । पत्ती 1 (L1) के किनारे पर यांत्रिक घायल होने के कारण तत्काल, स्थानीय [सीए2+]साइट ऊंचाई हुई। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

मूवी S4: ग्लूटामेट का आवेदन प्रणालीगत [सीए2 +]साइट बढ़ जाती है। 100 mM ग्लूटामेट के आवेदन ने सीए2 + ट्रांसमिशन को प्रणालीगत पत्तियों के लिए ट्रिगर किया [उदाहरण के लिए, पत्ती 3 (एल 3), पत्ती 4 (एल4) और लीफ 6 (एल6 ))]। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

पौधों के लिए स्थानीयकृत बाहरी पर्यावरणीय उत्तेजनाओं का जवाब देने और फिर पूरे पौधे के स्तर पर अपने होमोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए प्रणालीगत संकेत महत्वपूर्ण है। यद्यपि वे जानवरों की तरह उन्नत तंत्रिका तंत्र से लैस नहीं हैं, वे मोबाइल इलेक्ट्रिकल (और संभवतः हाइड्रोलिक) संकेतों जैसे कारकों के आधार पर अंगों के भीतर और बीच में तेजी से संचार को नियोजित करते हैं और आरओएस और सीए2 +46,47की तरंगों का प्रचार करते हैं। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल घायल होने के जवाब में सीए2 + और एपोप्लास्टिक ग्लूटामेट की गतिशीलता की निगरानी के माध्यम से इस सिग्नलिंग सिस्टम की गतिविधि के पौधे-चौड़े, वास्तविक समय की इमेजिंग की अनुमति देता है। यह विधि उच्च स्थानिक संकल्प और उपयोग में आसानी के संयोजन वाले पौधों में तेजी से और लंबी दूरी के संकेतों को समझने के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करती है। यह प्रोटोकॉल लंबी दूरी के घाव के संकेत के माध्यम से अंतर्निहित आणविक तंत्र में नई शारीरिक अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता भी प्रदान करता है, उदाहरण के लिए, तेजी से सिग्नलिंग सिस्टम के ख्यात तत्वों में दोषपूर्ण म्यूटेंट का उपयोग करना या Ca2 + चैनल ब्लॉकर्स (जैसे, लासीएल3)या अन्य संभावित प्रमुख सिग्नलिंग गतिविधियों के अवरोधक6। 

वर्णित बायोसेंसर इमेजिंग विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ उच्च फ्लोरोसेंट उपज के साथ एकल-एफपी बायोसेंसर का उपयोग है, जो इन मापों और उनके प्लांटा उपयोग में बनाने के लिए आवश्यक उपकरणों दोनों को सरल बनाता है। इस प्रकार, फ्लोरेसेंस आधारित आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड संकेतकों को दो वर्गों में विभाजित किया गया है: 1) तीव्रता आधारित एकल-एफपी बायोसेंसर और 2) अनुपातमेट्रिक FRET-आधारित बायोसेंसर10। यद्यपि अनुपातमेट्रिक एफआरटी-आधारित सेंसर मात्रात्मक रूप से सटीक हैं, तीव्रता-आधारित सीए2 + संकेतक, जिनमें GCaMP3 और iGluSnFR शामिल हैं, उनके आम तौर पर उज्जवल सीए2 + -उत्तरदायीसंकेत और उनकी सरल माइक्रोस्कोप आवश्यकताओं के कारण उच्च अस्थायी संकल्प और उपयोग में आसानी प्रदान करता है10। उदाहरण के लिए, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित एकल-एफपी सीए2 + संकेतक आर-जीईओ1 को अनुपातमेट्रिक वाईसी 3.6 बायोसेंसर 27 की तुलना में एक्सट्रासेलुलर एटीपीऔर प्लांट डिफेंस एलिटर्स flg22 और चिटिन के जवाब में बहुत अधिक संकेत परिवर्तन दिखाने की सूचना दी गई थी । अनुपातमेट्रिक FRET आधारित सेंसरों के विश्लेषण के लिए, दो तरंगदैर्ध्य पर डेटा एकत्र करने के लिए कई फिल्टर के साथ एक विशेष माइक्रोस्कोप का उपयोग करना भी आवश्यक है, जबकि एकल-एफपी-आधारित बायोसेंसर को केवल एक तरंगदैर्ध्य पर डेटा एकत्र करने के लिए डिवाइस की आवश्यकता होती है, जो सभी मानक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप10में पाई जाने वाली क्षमता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सिंगल-एफपी बायोसेंसर का उपयोग करने के कुछ नुकसान हैं। इन तीव्रता आधारित, एकल एफपी बायोसेंसर को पूर्ण एकाग्रता परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करने या कई घंटों या दिनों में दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए पसंद नहीं किया जाता है। यह सीमा इसलिए है क्योंकि GCaMP3 के लिए सीए2 + स्तर के अलावा, इन एकल-एफपी बायोसेंसर से सिग्नल तीव्रता सेंसर अभिव्यक्ति स्तर या सेलुलर पीएच जैसे मापदंडों जैसे अन्य कारकों से प्रभावित माना जाता है जो समय के साथ बदल सकते हैं।

आज तक, इन आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड संकेतकों के कई नए वेरिएंट को सिग्नल टू शोर अनुपात, डायनेमिक रेंज, काइनेटिक्स और सेंसर स्थिरता में सुधार करने के लिए इंजीनियर किया गया है। उदाहरण के लिए, नाकाई एट अल26 के बाद पहला जीसीएएमपी विकसित किया गया, विभिन्न लगातार वेरिएंट, जैसे जीईसीओ म्यूटेनेसिस और सावधान लक्षण वर्णन48,49,50के संयोजन से उत्पन्न हुए हैं। जी-जीईसीओ (ग्रीन-जीईसीओ) की गतिशील रेंज को GCaMP328की तुलना में लगभग दो गुना बड़ा बताया गया था । इसके अलावा, इन संकेतकों में विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ प्रतिस्थापन ने विभिन्न उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ जीईको वेरिएंट की पीढ़ी का नेतृत्व किया, जैसे बी-जीईसीओ (ब्लू-जीईसीओ) और आर-जीईसीओ (रेड-जीईसीओ), जो मल्टी-कलर इमेजिंग अनुप्रयोगों28में अन्य जीएफपी स्पेक्ट्रल वेरिएंट के साथ इन संकेतकों के उपयोग को सक्षम बनाता है। इसी प्रकार, जीसीएएमपी को विकसित किया जाना जारी रखा गया है और उसमें सुधार किया गया है जिसमें प्रतिक्रिया की गति और सिग्नल के आयाम के लिए बढ़ाए गए सेंसरों की एक श्रृंखला के साथ अब50उपलब्ध हैं। ग्लूटामेट गतिशीलता की निगरानी के लिए, iGluSnFR के अलावा, FRET-आधारित ग्लूटामेट बायोसेंसर की एक श्रृंखला, ग्लूटामेट (फ्लिप) के लिए फ्लोटोसेंट इंडिकेटर प्रोटीन40विकसित किए गए हैं। फ्लिप सीएफपी और वाईएफपी से बना है जो ई कोलाईसे लिए गए ग्लूटामेट बाइंडिंग प्रोटीन वाईबीजे के माध्यम से जुड़ा हुआ है। ybeJ के लिए ग्लूटामेट बाध्यकारी होने पर, FRET दक्षता की एक ग्लूटामेट एकाग्रता-निर्भर कमी देखी जाती है। इसलिए, सीए2 + और ग्लूटामेट दोनों के लिए कई सिंगल-एफपी और रेशियोमेट्रिक सेंसर उपलब्ध हैं। शोधकर्ताओं को प्रयोगात्मक डिजाइन और उच्च संकेत के रूप में माप कारकों के लिए आवश्यकताओं के आधार पर संकेत गतिशीलता का पता लगाने के लिए उपयुक्त बायोसेंसर पर विचार करना चाहिए: शोर (एकल एफपी सेंसर) बनाम अत्यधिक सटीक मात्रा की आवश्यकता (जहां FRET सेंसर उत्कृष्टता) ।

घायल होने के लिए यहां वर्णित व्यापक क्षेत्र, एकल-एफपी इमेजिंग विधि भी उपयोगी होनी चाहिए जब अन्य तनाव प्रणालीगत सिग्नलिंग प्रक्रियाओं पर लागू हो। कई रिपोर्टों की उपस्थिति के बावजूद जो लंबी दूरी कीसीए2 + की महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव देते हैं, विभिन्न तनाव प्रतिक्रियाओं में संकेत देते हैं, जैसे कि शाकाहारी हमला6,51,52,नमक20,और सूखा53,केवल कुछ अध्ययनों ने इन तनाव प्रतिक्रियाओं6,7,20,52से प्रेरित तेजी से लंबी दूरी के सीए2 + संकेतों से संबंधित स्थानिक जानकारी प्रदान की है। इस प्रोटोकॉल में एक व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग न केवल पत्ती से पत्ती संचार में बल्कि रूट-टू-शूट संचार में मोबाइल सिग्नल गतिशीलता के वास्तविक समय अवलोकन की अनुमति देता है जैसा कि हाल ही में38दिखाया गया है। यद्यपि हमने अरबीडोप्सिसके लिए प्रोटोकॉल पर ध्यान केंद्रित किया है, यह पौधे-व्यापी वास्तविक समय इमेजिंग विधि तंबाकू30जैसे अन्य पौधों की प्रजातियों में बायोटिक और अजैविक तनाव प्रतिक्रियाओं दोनों में प्रणालीगत सीए2 + सिग्नलिंग की स्थानिक और लौकिक विशेषताओं को समझने के लिए एक मजबूत उपकरण भी प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (17H05007 और 18H05491) से एमटी, नेशनल साइंस फाउंडेशन (IOS1557899 और MCB2016177) और नेशनल एयरोनॉटिक्स एंड स्पेस एडमिनिस्ट्रेशन (एनएनएक्स14AT25G और 80NSSC19K0126) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

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जीव विज्ञान अंक 172 कैल्शियम GCaMP3 आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट बायोसेंसर ग्लूटामेट iGluSnFR लंबी दूरी के संकेत घायल
वाइड-फील्ड, <em>अरबीडोप्सिस</em> में स्थानीय और प्रणालीगत घाव संकेतों की वास्तविक समय इमेजिंग
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Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y.,… More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

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