Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Широкоугольная визуализация в реальном времени локальных и системных сигналов раны при арабидопсисе

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Summary

Внеклеточная систематическая передача кальция, вызванная глутаматом, имеет решающее значение для индукции реакций защиты растений на механическое ранение и атаку травоядных животных у растений. В данной статье описан метод визуализации пространственной и временной динамики обоих этих факторов с использованием растений Arabidopsis thaliana, экспрессирующих чувствительные к кальцию и глутамату флуоресцентные биосенсоры.

Abstract

Растения реагируют на механические напряжения, такие как раны и травоядные, вызывая защитные реакции как в поврежденных, так и в дистальных неповрежденными частях. При ранении листа на месте раны происходит повышение концентрации цитозольного иона кальция (сигнал Ca2+). Этот сигнал быстро передается в неповрежденные листья, где активируются защитные реакции. Наше недавнее исследование показало, что глутамат, просачивающийся из раненых клеток листа в апопласт вокруг них, служит сигналом раны. Этот глутамат активирует глутамат-рецептороподобные каналы Ca2+, что затем приводит к распространению сигнала Ca2+ на большие расстояния по всему растению. Пространственные и временные характеристики этих событий могут быть получены с помощью визуализации в реальном времени живых растений, экспрессирующих генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры. Здесь мы представляем общезаводской метод визуализации в режиме реального времени для мониторинга динамики как сигналов Ca2+, так и изменений в апопластическом глутамате, которые происходят в ответ на ранение. Этот подход использует широкоугольный флуоресцентный микроскоп и трансгенные растения Arabidopsis, экспрессирующие биосенсоры Ca2+ и глутамата на основе зеленого флуоресцентного белка (GFP). Кроме того, мы представляем методологию, которая легко вызывает раневое, вызванное глутаматом быстрое и дальнее распространение сигнала Ca2+. Этот протокол также может быть применен к исследованиям других стрессов растений, чтобы помочь выяснить, как системная сигнализация растений может быть вовлечена в их сигнальные и ответные сети.

Introduction

Растения не могут избежать биотических стрессов, например, насекомые, питающиеся ими, поэтому они разработали сложные системы восприятия стресса и передачи сигналов, чтобы обнаружить, а затем защитить себя от таких проблем, как травоядные1. При ранении или травоядной атаке растения инициируют быстрые защитные реакции, включая накопление фитогормонной жасмоновой кислоты (JA) не только в раненом месте, но и в неповрежденные дистальные органы2. Затем эта JA вызывает защитные реакции в непосредственно поврежденных тканях и упреждающе индуцирует защиту в неповрежденных частях растения. У Arabidopsisнакопление JA, вызванное ранением, было обнаружено в дистальных, неповрежденных листьях всего за несколько минут после повреждения в другом месте растения, что говорит о том, что от раненого листа3передается быстрый и дальний сигнал. Несколько кандидатов, таких как Ca2+,активные формы кислорода (АФК) и электрические сигналы, были предложены для того, чтобы служить в качестве этих сигналов на большие расстояния в растениях4,5.

Ca2+ является одним из самых универсальных и вездесущих вторых мессенджеров в эукариотических организмах. У растений жевание гусениц и механическое ранение вызывают резкое повышение концентрации цитозоля Ca2+ ([Ca2+]cyt)как в раненом листе, так и в нераненых отдаленных листьях6,7. Этот системный сигнал Ca2+ принимается внутриклеточными Ca2+-чувствительными белками, которые приводят к активации нисходящих защитных сигнальных путей, включая биосинтез JA8,9. Несмотря на многочисленные такие сообщения, подтверждающие важность сигналов Ca2+ в реакциях на раны растений, информация о пространственных и временных характеристиках сигналов Ca2+, вызванных ранением, ограничена.

Визуализация в режиме реального времени с использованием генетически закодированных индикаторов Ca2+ является мощным инструментом для мониторинга и количественной оценки пространственной и временной динамики сигналов Ca2+. На сегодняшний день разработаны версии таких датчиков, позволяющие визуализировать сигналы Ca2+ на уровне одной клетки, к тканям, органам и даже целым растениям10. Первым генетически закодированным биосенсором для Ca2+, используемым в растениях, был биолюминесцентный белок экворин, полученный из медузы Aequorea victoria11. Хотя этот хемилюминесцентный белок использовался для обнаружения изменений Ca2+ в ответ на различные стрессы в растениях12,13,14,15,16,17,18,он не очень хорошо подходит для визуализации в режиме реального времени из-за чрезвычайно низкого люминесцентного сигнала, который он производит. Индикаторы Ca2+, основанные на резонансном переносе энергии Фёрстера (FRET), такие как желтые камелоны, также успешно используются для исследования динамики диапазона сигнальных событий Ca2+ в растениях19,20,21,22,23,24. Эти датчики совместимы с подходами к визуализации и чаще всего состоят из Ca2+, связывающего белка кальмодулина (CaM) и CaM-связывающего пептида (M13) из миозиновой киназы легкой цепи, все они слиты между двумя флуорофорными белками, как правило, синим флуоресцентным белком (CFP) и вариантом желтого флуоресцентного белка (YFP)10. Связывание Ca2+ с CaM способствует взаимодействию между CaM и M13, что приводит к конформационному изменению датчика. Это изменение способствует передаче энергии между CFP и YFP, что увеличивает интенсивность флуоресценции YFP при одновременном уменьшении флуоресцентного излучения от CFP. Мониторинг этого перехода от флуоресценции CFP к флуоресценции YFP затем обеспечивает измерение увеличения уровня Ca2+. В дополнение к этим датчикам FRET, биосенсоры Ca2+ на основе одного флуоресцентного белка (FP), такие как GCaMP и R-GECO, также совместимы с подходами к визуализации растений и широко используются для изучения измененийцит [Ca2+]из-за их высокой чувствительности и простоты использования25,26,27,28,29,30. GCaMP содержат один циркулярно перестановленный (cp) GFP, снова сплавленный с CaM и пептидом M13. Ca2+-зависимое взаимодействие между CaM и M13 вызывает конформационное изменение датчика, которое способствует сдвигу в протонационном состоянии cpGFP, усиливая его флуоресцентный сигнал. Таким образом, по мере повышения уровня Ca2+ сигнал cpGFP увеличивается.

Чтобы исследовать динамику сигналов Ca2+, генерируемых в ответ на механическое ранение или кормление травоядных, мы использовали трансгенные растения Arabidopsis thaliana, экспрессирующие вариант GCaMP, GCaMP3, и широкопольный флуоресцентный микроскоп6. Этот подход позволил визуализировать быструю передачу сигнала Ca2+ на большие расстояния от места раны на листе ко всему растению. Таким образом, увеличениециты [Ca2+]было немедленно обнаружено в месте раны, но этот сигнал Ca2 + затем распространялся на соседние листья через сосудистую азкулятуру в течение нескольких минут после ранения. Кроме того, мы обнаружили, что передача этого быстрого системного сигнала раны отменяется у растений Arabidopsis с мутациями в двух генах, подобных рецепторам глутамата, Glutamate Receptor Like (GLR), GLR3.3 и GLR3.66. GLR, по-видимому, функционируют как аминокислотные закрытые каналы Ca2+, участвующие в различных физиологических процессах, включая раневую реакцию3,рост пыльцевой трубки31,развитие корней32,холодный ответ33и врожденный иммунитет34. Несмотря на эту хорошо понятную, широкую физиологическую функцию GLR, информация об их функциональных свойствах, таких как их лигандная специфичность, селективность ионов и субклеточная локализация, ограничена35. Однако недавние исследования показали, что GLR3.3 и GLR3.6 локализованы во флоэме и ксилеме соответственно. Растительные GLR имеют сходство с ионотропными глутаматными рецепторами (iGluRs)36 у млекопитающих, которые активируются аминокислотами, такими как глутамат, глицин и D-серин в нервной системе млекопитающих37. Действительно, мы продемонстрировали, что применение глутамата 100 мМ, но не других аминокислот, в месте раны индуцирует быстрый, дальний сигнал Ca2+ у Arabidopsis,что указывает на то, что внеклеточный глутамат, вероятно, действует как раневой сигнал у растений6. Этот ответ отменяется у мутанта glr3.3/glr3.6, предполагая, что глутамат может действовать через один или оба из этих рецептороподобных каналов, и действительно, недавно было показано, что AtGLR3.6 ограничен этими уровнями глутамата38.

В растениях, в дополнение к своей роли в качестве структурной аминокислоты, глутамат также был предложен в качестве ключевого регулятора развития39; однако его пространственная и временная динамика плохо изучена. Так же, как и для Ca2+,было разработано несколько генетически закодированных индикаторов для глутамата для мониторинга динамики этой аминокислоты в живых клетках40,41. iGluSnFR представляет собой биосенсор глутамата на основе GFP, состоящий из cpGFP и глутаматсвязывающего белка (GltI) из Escherichia coli42,43. Конформационное изменение iGluSnFR, которое индуцируется связыванием глутамата с GltI, приводит к усиленному флуоресцентному излучению GFP. Чтобы исследовать, действует ли внеклеточный глутамат как сигнальная молекула в реакции раны растений, мы связали последовательность iGluSnFR с основной последовательностью секреции сигнального пептида хитиназы (CHIB-iGluSnFR) для локализации этого биосенсора в апопластическом пространстве6. Этот подход позволил визуализировать любые изменения концентрации апопластического глутамата ([Glu]apo)с использованием трансгенных растений Arabidopsis, экспрессирующих этот датчик. Мы обнаружили быстрое увеличение сигнала iGluSnFR в месте ранения. Эти данные подтверждают идею о том, что глутамат просачивается из поврежденных клеток / тканей в апопласт при ранении и действует как сигнал повреждения, активирующий GLR и приводящий к сигналу Ca2 + на большом расстоянии у растений6.

Здесь мы описываем общезаводской метод визуализации в режиме реального времени с использованием генетически закодированных биосенсоров для мониторинга и анализа динамики сигналов Ca2+ и внеклеточных сигналов глутамата на большие расстояния в ответ на ранение6. Наличие широкоугольной флуоресцентной микроскопии и трансгенных растений, экспрессирующих генетически закодированные биосенсоры, обеспечивает мощный, но легко реализуемый подход к обнаружению быстро передаваемых сигналов на большие расстояния, таких как волны Ca2+.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка растительного сырья

  1. В микротрубке 1,5 мл поверхностно стерилизуют семена растения Arabidopsis thaliana (присоединение Col-0), экспрессируя либо GCaMP3, либо CHIB-iGluSnFR путем встряхивания с 20% (v/v) NaClO в течение 3 мин, а затем промыть 5 раз стерильной дистиллированной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансгенные линии Арабидопсиса, экспрессирующие GCaMP3 или CHIB-iGluSnFR, были описаныранее 6.
  2. В стерильной вытяжке посейте 13 поверхностно-стерилизованных семян на пластиковую чашку Петри площадью 10 см, наполненную 30 мл стерильной (автоклавной) средой Мурашиге и Скуг (MS) [1x соли MS, 1% (мас./об.) сахарозы, 0,01% (мас./об.) миоинозитола, 0,05% (мас./об.) MES и 0,5% (мас./об.) геллановой камеди; рН 5,7, скорректированный с помощью 1N KOH]. Замените крышку и оберните хирургической лентой.
  3. После инкубации в темноте при 4 °C в течение 2 дней поместите пластины горизонтально при 22 °C в камеру роста при непрерывном свете (90-100 мкмольм-2 с-1)в течение примерно 2 недель перед использованием. Через 2 недели подсчитайте количество листьев арабидопсиса от самых старых до самых молодых44 (рисунок 1). Раневые реакции преимущественно перемещаются от поврежденного листа (n) к листьям, пронумерованным n ± 3 и n ± 56.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе чашка Петри будет открыта для визуализации воздействия раны и глутамата под флуоресцентным микроскопом. Поэтому последующие этапы этого эксперимента должны проводиться в комнатных условиях с контролируемой температурой и влажностью. Это связано с тем, что сигналы Ca2+ также вызваны изменениями в этих условиях окружающей среды. Также известно, что синий свет, излучаемый микроскопом во время записи для возбуждения флуоресценции биосенсорного белка, может вызвать увеличение цитозольной концентрации Ca2+ 45 и поэтому растение должно быть акклиматизироваться к облучению синим светом в течение нескольких минут до начала эксперимента.

2. Химическая подготовка

  1. Растворите L-глутамат в жидкой среде для роста [1/2x солей MS, 1% (мас./об.) сахарозы и 0,05% (мас./об.) MES; рН 5,1, скорректированный с помощью 1N KOH], чтобы получить рабочий раствор 100 мМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования солей глутамата, таких как глутамат натрия, для предотвращения потенциального катионного воздействия на динамику Ca2+.

3. Настройка микроскопа и проведение визуализации в режиме реального времени

  1. Включите моторизованный флуоресцентный стереомикроскоп, оснащенный объективом 1x (NA = 0,156) и камерой sCMOS(рисунок 2),и настройте параметры устройства для облучения светом возбуждения 470/40 нм и получения излучения света, проходящего через фильтр 535/50 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любой GFP-чувствительный флуоресцентный микроскоп может быть использован для обнаружения сигналов GCaMP3 и iGluSnFR в режиме реального времени, но для получения сигналов от всей установки рекомендуется объектив с низким энергопотреблением и высокочувствительная камера с широким чипом sCMOS. Маломощная цель позволяет визуалировать реакцию всей установки Arabidopsis, а использование высокочувствительной камеры позволяет быстро собирать данные, необходимые для захвата быстрого временного хода вызванной раной волны Ca2+. Для флуоресцентного микроскопа, используемого в этом исследовании, максимальные значения поля зрения и временного разрешения составляют 3 см х 3 см и 30 кадров в секунду (fps) соответственно.
  2. Снимите крышку и поместите блюдо под объектив.
  3. Проверьте сигнал флуоресценции от растения, а затем подождите примерно 30 минут в темноте, пока растения не адаптируются к новым условиям окружающей среды. Этот этап адаптации необходим, потому что изменения влажности вызывают [Ca2+] повышениецисты в растениях, которые могут мешать любым событиям, связанным с ранами.
  4. Отрегулируйте фокус и увеличение, чтобы увидеть все растение в поле зрения. В текущем протоколе использовалось увеличение в 0,63 раза.
  5. Перед началом визуализации в режиме реального времени настройте параметры сбора для обнаружения флуоресцентных сигналов с помощью программного обеспечения для визуализации микроскопа. Настройки для визуализации в текущем протоколе: экспозиция и интервал времени установлены на 1,8 с и 2 с (т.е. 0,5 кадра в секунду) соответственно. Установите время записи на 11 мин.
  6. Изображение за 5 минут до начала эксперимента, чтобы акклиматизировать растение к облучению синим светом из микроскопа, затем начать запись, нажав на Run Nowили эквивалентную команду в используемом программном обеспечении микроскопа. Чтобы определить среднюю базовую флуоресценцию, запишите не менее 10 кадров (т.е. не менее 20 с в текущем протоколе) перед нанесением ран или применением глутамата (см. Раздел 4).
    1. Для визуализации в реальном времени раневой индуцированной [Ca2+]циты и [Glu]апо изменяется, ножницами разрезайте черешек или среднюю область листа L1(рисунок 3 и рисунок 4).
    2. Для визуализации измененийкисты, вызванных глутаматом [Ca2+],в режиме реального времени, ножницами отрежьте край (примерно в 1 мм от кончика) листа 1 поперек основной вены. По истечении не менее 20 мин восстановительного периода нанесите 10 мкл глутамата 100 мМ на поверхность среза листа(рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта предварительная резка была необходима для обеспечения доступа глутамата к листовой апопласту, чтобы вызвать реакцию. Кроме того, было обнаружено, что нанесение капли дистиллированной воды на поверхность среза листа L1 имеет решающее значение для предотвращения высыхания образцов во время восстановления перед нанесением глутамата.
  7. После завершения 11-минутной записи сохраните данные.

4. Анализ данных

  1. Для анализа интенсивности флуоресценции с течением времени определите интересующей область (ROI) в месте, где должна быть проанализирована интенсивность флуоресценции(рисунок 6 и рисунок 7). Для расчета скорости волны Ca2+ определите 2 ROI (ROI1 и ROI2) для анализа. В программном обеспечении для обработки изображений щелкните Измерение времени | Определение | Круг. Измерьте расстояние между ROI1 и ROI2, щелкнув Аннотации и измерение | Длина | Простая линия (рисунок 6).
  2. Измерьте необработанные значения флуоресценции (F) в каждом ROI с течением времени, щелкнув Измерить. Экспортируйте необработанные данные в программное обеспечение для работы с электронными таблицами, чтобы преобразовать флуоресцентный сигнал в цифры в каждой точке времени, щелкнув Все в Excel | Экспорт.
  3. Определите базовое значение флуоресценции, которое определяется как F0,путем вычисления среднего значения F за первые 10 кадров (т.е. до обработки) в записанных данных.
  4. Нормализуйте данные F (путем вычисления ΔF/F) с помощью уравнения ΔF/F = (F−F0)/F0, где ΔF — зависящее от времени изменение флуоресценции.
  5. Для анализа волны скорости волны Ca2+ определите значимую точку подъема сигнала выше предварительно стимулированных значений как представляющую обнаружение увеличения Ca2+ в каждом ROI(t1 и t2),используя критерий повышения до 2× стандартного отклонения (2x SD), которое вычисляется из данных F0 с использованием статистического программного обеспечения. 95% данных F0 попадает в пределах 2x SD от среднего значения, что указывает на то, что повышение сигнала выше этого уровня случайно составляет ≤5%. Рассчитайте разницу во времени увеличения Ca2+ между ROI1 и ROI2 [t2- t1 time-lag(Δt)] и измерьте расстояние между ROI1 и ROI2, затем определите скорости любой волны Ca2+.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Распространение сигнала [Ca2+]cyt и [Glu]apo в ответ на ранение представлено на рисунке 3, рисунке 4, фильме S1и фильме S2. Обрезание черешка листа 1 у растений, экспрессировающих GCaMP3 (при 0 с), привело к значительному увеличению [Ca2+]циты, которая была быстро индуцирована локально через сосудистую (через 40 с)(Рисунок 3 и Фильм S1). Впоследствии сигнал быстро распространялся на соседние листья (листы 3 и 6) в течение нескольких минут (при 80 с)(рисунок 3 и ролик S1).

При срезке листа 1 у растений, экспрессирующих CHIB-iGluSnFR, вокруг области среза наблюдалось быстрое увеличение [Glu]апо (через 2 с). Этот сигнал распространялся через сосудистую систему локально в течение нескольких минут (при 160 с), но не наблюдался в системных листьях(рисунок 4 и фильм S2).

Для визуализации в реальном времени распространения сигнала Ca2+, вызванного применением глутамата, край (примерно 1 мм от кончика) листа 1 у растений, экспрессирующих GCaMP3, был разрезан, как показано на рисунке 5A и movie S3. Обрезание края листа 1 вызвало локальное [Ca2+]увеличениециты (на 40 с), но этот сигнал исчез в течение нескольких минут (при 124 с). После ожидания примерно 10 мин восстановления растения, 10 мкл 10 мМ глутамата наносили на поверхность среза листа 1, что вызывало быстрое, значительное увеличение [Ca2+]циты локально (при 56 с) и распространение сигнала на дистальные листья (при 104 с)(рисунок 5B и фильм S4).

Для измерения изменений в [Ca2+]ците, вызванной ранением в системном листе, два ROI (ROI1 и ROI2) были установлены в области основания и кончике листа 6 у растений, экспрессирующих GCaMP3, как показано на рисунке 6A. Измерено временное изменение интенсивности сигнала GCaMP3 в ROI1 и ROI2 при разрезании черешка листа 1(рисунок 6B). Значительное увеличение [Ca2+]cyt при ROI1 было обнаружено раньше, чем у ROI2(рисунок 6B). [Около2+] цит достиг пика примерно через 100 с после ранения, длился более 10 мин и проявлял две фазы(рисунок 6B).

Для определения скоростей волны Ca2+ при механическом ранении определяли временную точку подъема значительного сигнала выше предварительно стимулированных значений в ROI1 и ROI2 (time-lag; см. Раздел 4)(Рисунок 6C). Поскольку расстояние между ROI1 и ROI2 в данном случае составляло 2,7 мм(рисунок 6A),скорость сигнала Ca2+ в листе 6 была рассчитана как 0,15 мм/с. Для измерения изменений [Glu]apo в ответ на механическое повреждение ROI1 был установлен в непосредственной близости от места разреза листа, помеченного как L1, как показано на рисунке 7A. [Клей] Сигнатура apo при ROI1 продемонстрировала один пик примерно через 100 с после ранения(рисунок 7B).

Figure 1
Рисунок 1:Нумеровка розетчатых листьев арабидопсиса. Листья арабидопсиса пронумерованы от самого старого до самого молодого (левая панель). Принципиальная схема положения листьев указана на правой панели. L: лист, C: семяледоны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Флуоресцентный микроскоп, используемый в этом исследовании. [Ca2+] динамикацита и [Glu]апо были визуалированы с помощью широкопольного флуоресцентного стереомикроскопа. R: Пульт дистанционного управления, O: объектив 1x, C: камера sCMOS, T: Тринокулярная наклонная трубка, S: Сцена, P: Растительный материал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Раневая передача сигнала ca2+ на большие расстояния. Обрезание черешка (белая стрелка, 0 с) листа 1 (L1) в растении, экспрессирующее GCaMP3, вызвало локальное [Ca2+] увеличениециты (красная стрелка, 40 с), которое передавалось на системные листья [лист 3 (L3) и лист 6 (L6)] (оранжевые стрелки, 80 с). Шкала, 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Раневое [Glu]повышение апо. Разрезание листа 1 (L1) (белая стрелка, 0 с) у растений, экспрессирующих CHIB-iGluSnFR, вызвало быстрое возвышение [Glu]апо (красная стрелка, 80 с), которое распространялось через сосудистую азкулятуру (оранжевая стрелка, 160 с). Шкала, 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5:Глутамат-триггерная передача сигнала ca2+ на большие расстояния. (A) Обрезание края (приблизительно 1 мм от кончика) листа 1 (L1) у растений, экспрессирующих GCaMP3 (белая стрелка, 0 с), вызвало увеличениециты [Ca2+](красная стрелка, 40 с). (B)Нанесение 100 мМ глутамата на поверхность разреза L1 (белая стрелка, 0 с) вызвало локальное [Ca2+] увеличениециты (красная стрелка, 56 с), которая быстро распространилась на дистальные листья [например, лист 3 (L3), лист 4 (L4) и лист 6 (L6)] (оранжевые стрелки, 104 с). Шкала, 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6:[Ca2+] сигнатурациты в системных листьях в ответ на механическое ранение. (A) Расширенное изображение листа 6 (L6) у растений, экспрессивных GCaMP3, показано на рисунке 3. ROI1 (синий круг) и ROI2 (розовый круг) были установлены в области основания и наконечника соответственно. Белая стрелка указывает на место разреза черешка листа 1 (L1). В этом случае расстояние между ROI1 и ROI2 составило 2,7 мм. (B) Количественная оценка сигнатур [Ca2+]cyt в ROI1 и ROI2. Изменения интенсивности флуоресценции были проанализированы с использованием программного обеспечения для визуализации. (C)Расширенный след данных в (B) между 0 с и 80 с. Точки обнаружения увеличения ROI1 и ROI2 ca2+ были определены как t1 и t2соответственно, используя в качестве критерия повышение до 2x стандартного отклонения значений престимуляции (2x SD, пунктирная линия). Значение t2 - t1 было определено как time-lag(Δt)в текущем протоколе. Черная стрелка указывает время среза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7:[Glu]апо сигнатура в ответ на механическое ранение. (A) Расширенное изображение листа 1 (L1) у растений, экспрессирующих CHIB-iGluSnFR, показано на рисунке 4. ROI1 был установлен в непосредственной близости от места разреза. Белая стрелка указывает на область разреза. (B) Количественное забвениеапосигии [Glu] в ROI1 контролируется с помощью программного обеспечения для обработки изображений. Черная стрелка указывает время среза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Фильм S1: Передача Ca2+ на дальние расстояния после механического ранения. Механическое ранение на черешку листа 1 (L1) вызвало увеличениециты [Ca2+],передаваемое на дистальные листья [например, лист 3 (L3) и лист 6 (L6)]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Фильм S2: Повышение уровня апопластического глутамата в ответ на резку. Механическое ранение листа 1 (L1) вызвало немедленное увеличение [Glu]апо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Фильм S3: Повышениеуровняцита [Ca2+] в ответ на разрезание. Механическое ранение на краю листа 1 (L1) вызвало немедленное локальное [Ca2+] повышениециты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Фильм S4: Применение глутамата вызывает системное [Ca2+]увеличениекеты. Применение глутамата 100 мМ вызывало передачу Ca2+ на системные листья [например, лист 3 (L3), лист 4 (L4) и лист 6 (L6)]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Системная сигнализация важна для растений, чтобы реагировать на локализованные внешние раздражители окружающей среды, а затем поддерживать свой гомеостаз на уровне всего растения. Хотя они не оснащены развитой нервной системой, как животные, они используют быструю связь как внутри, так и между органами, основанными на таких факторах, как мобильные электрические (и, возможно, гидравлические) сигналы и распространяющиеся волны АФК и Ca2 +46,47. Протокол, описанный выше, позволяет в режиме реального времени визуализировать активность этой сигнальной системы в масштабах всего растения путем мониторинга динамики Ca2+ и апопластического глутамата в ответ на ранение. Этот метод обеспечивает надежный инструмент для понимания быстрых и дальних сигналов в растениях, сочетающих в себе высокое пространственно-временное разрешение и простоту использования. Этот протокол также предлагает потенциал для обеспечения нового физиологического понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе передачи сигналов раны на большие расстояния, например, путем использования мутантов, которые являются дефектными в мнимых элементах быстрой сигнальной системы, или исследования эффектов фармакологических реагентов, таких как блокаторы каналов Ca2+ (например, LaCl3)или ингибиторы других потенциально ключевых сигнальных активностей6. 

Одним из важных преимуществ описанного метода биосенсорной визуализации является использование биосенсоров с одним ФП с высоким выходом флуоресценции, что значительно упрощает как необходимое оборудование для выполнения этих измерений, так и их использование в растениях. Таким образом, основанные на флуоресценции генетически закодированные показатели делятся на два класса: 1) однофамисорные биосенсоры на основе интенсивности и 2) ратиометрические биосенсоры на основе ФРЕТ10. Хотя логометрические датчики на основе FRET являются количественно точными, индикаторы Ca2+, основанные на интенсивности, включая используемые здесь GCaMP3 и iGluSnFR, обеспечивают как более высокое временное разрешение, так и простоту использования благодаря их в целом более яркому сигналу Ca2+и их более простым требованиям микроскопа10. Например, сообщалось, что индикатор R-GECO1 на основе красного флуоресцентного белка на основе одного FP Ca2+ показывает гораздо большее изменение сигнала в ответ на внеклеточные АТФ и выразители защиты растений flg22 и хитин по сравнению с ратиометрическим биосенсором YC3.627. Для анализа логометрических датчиков на основе FRET также необходимо использовать специализированный микроскоп с несколькими фильтрами для сбора данных на двух длинах волн, тогда как биосенсоры на основе одного FP требуют, чтобы устройство собирало данные только на одной длине волны, что можно найти во всех стандартных флуоресцентных микроскопах10. Однако важно отметить, что есть некоторые недостатки использования однофамилсоров. Эти однофамиловые биозоры на основе интенсивности не являются предпочтительными для количественной оценки изменений абсолютной концентрации или для долгосрочной визуализации в течение многих часов или дней. Это ограничение связано с тем, что в дополнение, например, к уровню Ca2+ для GCaMP3, интенсивность сигнала от этих биосенсоров с одним ФП, как полагают, зависят от других факторов, таких как уровень экспрессии датчика или такие параметры, как клеточный рН, которые могут меняться со временем.

На сегодняшний день многие новые варианты этих генетически закодированных индикаторов были разработаны для улучшения отношения сигнал/шум, динамического диапазона, кинетики и стабильности датчика. Например, после того, как Nakai et al.26 разработали первый GCaMP, различные последовательные варианты, такие как GECOs, были сгенерированы комбинацией мутагенеза и тщательной характеристики48,49,50. Динамический диапазон G-GECO (Green-GECO), как сообщается, примерно в два раза больше, чем у GCaMP328. Кроме того, замена различными флуоресцентными белками в этих показателях привела к генерации вариантов GECO с различными спектрами излучения, таких как B-GECO (Blue-GECO) и R-GECO (Red-GECO), что позволяет использовать эти индикаторы наряду с другими спектральными вариантами GFP в многоцветных приложениях визуализации28. Аналогичным образом, GCaMP продолжает развиваться и совершенствоваться с серией датчиков, улучшенных для скорости отклика и амплитуды сигнала, которые теперь доступны50. Для мониторинга динамики глутамата, кроме iGluSnFR, была разработана серия биосенсоров глутамата на основе FRET, FLuorescent Indicator Proteins for Glutamate (FLIPE)40. FLIPE состоит из CFP и YFP, которые связаны через глутаматсвязывающий белок ybeJ, взятый из E. coli. При связывании глутамата с ybeJ наблюдается зависящая от концентрации глутамата снижение эффективности FRET. Таким образом, как для Ca2+, так и для глутамата доступно несколько одно-FP и логометрических датчиков. Исследователи должны рассмотреть подходящий биосенсор для обнаружения динамики сигнала в зависимости от экспериментального дизайна и требований к измерительным факторам, таким как высокий сигнал: шум (датчики с одним FP) по сравнению с потребностью в высокоточном количественном измерении (где датчики FRET превосходят).

Широкоугольный метод визуализации с одним ФП, описанный здесь для ран, также должен быть полезен при применении к другим процессам передачи сигналов о стрессе. Несмотря на наличие многочисленных сообщений, которые предполагают решающую роль передачи сигналов Ca2+ на большие расстояния в различных реакциях на стресс, таких как атака травоядных животных6,51,52,соль20и засуха53, тольконесколько исследований предоставили пространственно-височную информацию, связанную с быстрыми сигналами Ca2 +, вызванными этими стрессовыми реакциями6,7,20,52. Использование широкопольного флуоресцентного микроскопа в этом протоколе также позволяет в режиме реального времени наблюдать динамику мобильного сигнала не только в связи между листьями, но и в связи корень-побег, как недавно было показано38. Хотя мы сосредоточились на протоколах для Arabidopsis,этот метод визуализации в режиме реального времени для всего растения также обеспечивает надежный инструмент для понимания пространственных и временных характеристик системной передачи сигналов Ca2 + как в биотических, так и в абиотических реакциях на стресс у других видов растений, таких как табак30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Японского общества содействия развитию науки (17H05007 и 18H05491) MT, Национального научного фонда (IOS1557899 и MCB2016177) и Национального управления по аэронавтике и исследованию космического пространства (NNX14AT25G и 80NSSC19K0126) SG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32 (9), 1161-1174 (2009).
  2. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 387-415 (2018).
  3. Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
  4. Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
  5. Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 287-307 (2016).
  6. Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361 (6407), 1112-1115 (2018).
  7. Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10178-10183 (2018).
  8. Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171 (2), 249-269 (2006).
  9. Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227 (4), 1037-1050 (2020).
  10. Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
  11. Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29 (2), 229-234 (1967).
  12. Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23 (2), 267-278 (2000).
  13. Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  14. Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440 (3), 355-373 (2011).
  15. Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93 (12), 2095-2101 (2011).
  16. Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163 (2), 543-554 (2013).
  17. Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
  18. Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5242-5249 (2016).
  19. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  20. Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (17), 6497-6502 (2014).
  21. Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171 (3), 1771-1784 (2016).
  22. Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18849-18857 (2020).
  23. Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216 (4), 1161-1169 (2017).
  24. Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  25. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  26. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  27. Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
  28. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  29. Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142 (2017).
  30. DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58 (7), 1173-1184 (2017).
  31. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
  32. Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67 (6), 1853-1869 (2016).
  33. Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42 (12), 3326-3339 (2019).
  34. Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1497-1509 (2013).
  35. Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69 (17), 4151-4163 (2018).
  36. De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
  37. Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2 (1), 232 (2011).
  38. Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13 (640), (2020).
  39. Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58 (9), 2339-2358 (2007).
  40. Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  41. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4411-4416 (2008).
  42. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  43. Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
  44. Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. , (2013).
  45. Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83 (1), 102-111 (2007).
  46. Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67 (7), 2063-2079 (2016).
  47. Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90 (4), 698-707 (2017).
  48. Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (12), 4753-4758 (2006).
  49. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  50. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  51. Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29 (6), 1460-1479 (2017).
  52. Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31 (7), 1539-1562 (2019).
  53. Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15 (8), 1833-1845 (2003).

Tags

Биология выпуск 172 кальций GCaMP3 генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры глутамат iGluSnFR сигнал дальнего следования ранение
Широкоугольная визуализация в реальном времени локальных и системных сигналов раны при <em>арабидопсисе</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y.,… More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter