Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Arabidopsis'te Lokal ve Sistemik Yara Sinyallerinin Geniş Alan, Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Summary

Hücre dışı glutamat tetiklenen sistemik kalsiyum sinyali, bitkilerde mekanik yaralama ve otobur saldırısına karşı bitki savunma yanıtlarının indüksiyonu için kritik öneme sahiptir. Bu makalede, kalsiyum ve glutamaca duyarlı floresan biyosensörleri ifade eden Arabidopsis thaliana bitkilerini kullanarak her iki faktörün de mekansal ve zamansal dinamiklerini görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

Bitkiler, hem hasarlı hem de distal hasarsız kısımlarda savunma tepkileri vererek yaralama ve otçulluk gibi mekanik streslere yanıt verir. Bir yaprağın yaralanması üzerine, yara bölgesinde sitozolik kalsiyum iyon konsantrasyonunda (Ca2+ sinyali) bir artış meydana gelir. Bu sinyal, savunma yanıtlarının etkinleştirildiği hasarsız yapraklara hızla iletilir. Son araştırmalarımız, yaprağın yaralı hücrelerinden etrafdaki apoplast içine sızan glutamatın yara sinyali görevi aldığını ortaya koydu. Bu glutamat glutamat reseptörü benzeri Ca2+ geçirgen kanalları aktive eder ve bu da bitki genelinde uzun mesafeli Ca2+ sinyal yayılmasına yol açar. Bu olayların mekansal ve zamansal özellikleri, genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörleri ifade eden canlı bitkilerin gerçek zamanlı görüntülenmesiyle yakalanabilir. Burada, hem Ca2+ sinyallerinin dinamiklerini hem de yara almaya yanıt olarak meydana gelen apoplastik glutamazdaki değişiklikleri izlemek için bitki çapında, gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz. Bu yaklaşım, Yeşil Floresan Protein (GFP) bazlı Ca2+ ve glutamat biyosensörlerini ifade eden geniş alan floresan mikroskobu ve transgenik Arabidopsis bitkilerini kullanır. Buna ek olarak, yara kaynaklı, glutamat tetiklenen hızlı ve uzun mesafeli Ca2+ sinyal yayılımını kolayca ortaya çıkarmak için metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, tesis sistemik sinyalinin sinyal ve yanıt ağlarında nasıl yer aldığını araştırmaya yardımcı olmak için diğer bitki stresleri üzerindeki çalışmalara da uygulanabilir.

Introduction

Bitkiler biyotik streslerden kaçamazlar, örneğin, onları besleyen böcekler, bu nedenle otçul1gibi zorlukları tespit etmek ve daha sonra kendilerini korumak için sofistike stres algılama ve sinyal dönüştürme sistemleri geliştirmişlerdir. Yaralanma veya otçul saldırısı üzerine, bitkiler sadece yaralı bölgede değil, aynı zamanda hasarsız distal organlarda fitohormone jasmonik asit (JA) birikimi de dahil olmak üzere hızlı savunma yanıtları başlatır2. Bu JA daha sonra hem doğrudan hasar görmüş dokularda savunma tepkilerini tetikler hem de bitkinin hasarsız kısımlarında savunmayı önceden tetikler. Arabidopsis'te, yaralanma ile indüklenen JA birikimi, tesisin başka bir yerindeki hasardan sadece birkaç dakika içinde distal, bozulmamış yapraklarda tespit edildi ve yaralı yaprak3'tenhızlı ve uzun mesafeli bir sinyal iletildiğini düşündürdü. Ca2+, reaktif oksijen türleri (ROS) ve elektrik sinyalleri gibi çeşitli adayların,4,5bitkilerinde bu uzun mesafeli yara sinyalleri olarak hizmet etmesi önerilmiştir.

Ca2+, ökaryotik organizmalardaki en çok yönlü ve her yerde bulunan ikinci haberci elementlerden biridir. Bitkilerde, tırtıl çiğneme ve mekanik yaralama, hem yaralı yaprakta hem de çözülmemiş uzak yapraklarda sitozolik Ca2 + konsantrasyonunda ([Ca2+]sitot)sert artışlara neden olur6,7. Bu sistemik Ca2+ sinyali, JA biyosentez 8,9dahil olmak üzere aşağı akış savunma sinyal yollarının aktivasyonuna yol açan hücre içi Ca2+algılama proteinleri tarafından alınır. Ca2+ sinyallerinin bitki yarası yanıtlarındaki önemini destekleyen çok sayıda rapora rağmen, yaranın neden olduğu Ca2+ sinyallerinin mekansal ve zamansal özellikleri hakkında bilgi sınırlıdır.

Genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergeleri kullanılarak gerçek zamanlı görüntüleme, Ca2+ sinyallerinin uzamsal ve zamansal dinamiklerini izlemek ve ölçmek için güçlü bir araçtır. Bugüne kadar, bu tür sensörlerin tek bir hücre düzeyinde Ca2 + sinyallerinin dokulara, organlara ve hatta tüm bitkilere görselleştirilmesini sağlayan versiyonları geliştirilmiştir10. Bitkilerde kullanılan Ca2+ için genetik olarak kodlanmış ilk biyosensör, Aequorea victoria11denizanasından elde edilen biyolüminesan protein aequorin idi. Bu chemiluminescentprotein bitkiler12, 13 ,14 , 15,16,17,18çeşitli streslere yanıt Ca 2 + değişiklikleri tespit etmek için kullanılmış olsa da, ürettiği son derece düşük lüminesan sinyal nedeniyle gerçek zamanlı görüntüleme için uygun değildir. Sarı kameripler gibi Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı Ca2+ göstergeleri de19, 20 , 21, 22,23,24 tesislerinde bir dizi Ca2+sinyal olayının dinamiklerini araştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Bu sensörler görüntüleme yaklaşımlarıyla uyumludur ve en yaygın olarak, tümü iki florofor proteini, genellikle bir Siyan Floresan Proteini (CFP) ve Sarı Floresan Protein varyantı (YFP)10arasında kaynaşmış bir miyosin ışık zinciri kinazından Ca2+ bağlayıcı protein calmodulin (CaM) ve bir CaM bağlayıcı peptitten (M13) oluşur. Ca2+ bağlama, CaM ve M13 arasındaki etkileşimi teşvik eder ve sensörün konformasyonsal olarak değiştirilmesine neden olabilir. Bu değişiklik CFP ve YFP arasında enerji transferini teşvik eder, bu da CFP'den floresan emisyonunu azaltırken YFP'nin floresan yoğunluğunu arttırır. CfP'den YFP floresansına bu geçişin izlenmesi, Ca2+ seviyesindeki artışın bir ölçüsünü sağlar. Bu FRET sensörlerine ek olarak, GCaMP ve R-GECO gibi tek floresan protein (FP) bazlı Ca2+ biyosensörleri de bitki görüntüleme yaklaşımlarıyla uyumludur ve yüksek hassasiyetleri ve kullanım kolaylığı nedeniyle [Ca2+]cyt değişikliklerini incelemek için yaygın olarak kullanılır25 , 26,27,28,29,30. GCAMP'ler, yine CaM ve M13 peptidi ile kaynaşmış tek bir dairesel permütasyonlu (cp) GFP içerir. CaM ve M13 arasındaki Ca2+bağımlı etkileşim, sensörde cpGFP'nin protonasyon durumunda bir kaymayı teşvik eden ve floresan sinyalini artıran konformasyonsal bir değişikliğe neden olur. Böylece, Ca2+ seviyeleri yükseldikçe, cpGFP sinyali artar.

Mekanik yaralama veya otçul beslemeye yanıt olarak üretilen Ca2+ sinyallerinin dinamiklerini araştırmak için, bir GCaMP varyantı olan GCaMP3 ve geniş alan floresan mikroskobu6'yıifade eden transgenik Arabidopsis thaliana bitkilerini kullandık. Bu yaklaşım, bir yapraktaki yara bölgesinden tüm bitkiye uzun mesafeli bir Ca2+ sinyalinin hızlı iletimini görselleştirmeyi başarmıştır. Böylece, yara bölgesinde hemen [Ca2+cyt'de bir artış tespit edildi, ancak bu Ca2+ sinyali daha sonra yaralandıktan birkaç dakika sonra damar yoluyla komşu yapraklara yayılmıştır. Ayrıca, bu hızlı sistemik yara sinyalinin iletiminin Arabidopsis tesislerinde glutamat reseptör benzeri iki gen, Glutamat Reseptör Gibi (GLR ), GLR3.3ve GLR3.6 6mutasyonları ile kaldırıldığını bulduk. GSR'ler, yara yanıtı 3 , polen tüpü büyümesi 31 , kök gelişimi32, soğuk tepki 33 ve doğuştan gelen bağışıklık34dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde yer alan amino asit kapılı Ca2+kanalları olarak işlev görür. BGLR'ların bu iyi anlaşılan, geniş fizyolojik işlevine rağmen, ligand özgüllükleri, iyon seçicilikleri ve hücre altı lokalizasyonları gibi işlevsel özellikleri hakkında bilgiler sınırlıdır35. Bununla birlikte, son çalışmalar sırasıyla phloem ve ksilenm'de GLR3.3 ve GLR3.6'nın lokalize olduğunu bildirmektedir. Bitki GSR'leri, memeli sinir sisteminde glutamat, glisin ve D-serine gibi amino asitler tarafından aktive edilenmemelilerde iyonotropik glutamat reseptörleri (iGluR) 36 ile benzerliklere sahiptir37. Gerçekten de, yara bölgesinde 100 mM glutamat uygulanmasının, ancak diğer amino asitlerin, Arabidopsis'tehızlı, uzun mesafeli bir Ca2 + sinyaline neden olduğunu gösterdik Hücre dışı glutamatın muhtemelen bitkilerde bir yara sinyali görevi aldığını gösteren6. Bu yanıt,glutamatın bu reseptör benzeri kanallardan biri veya her ikisinde de etki ediyor olabileceğini öne sürenglr3.3 / glr3.6 mutantında kaldırılmıştır ve gerçekten de, AtGLR3.6'nın yakın zamanda bu glutamat seviyeleri tarafından kapılı olduğu gösterilmiştir38.

Bitkilerde, yapısal bir amino asit olarak rolüne ek olarak, glutamat da önemli bir gelişim düzenleyici olarak önerilmiştir39; ancak mekansal ve zamansal dinamikleri yeneksin anlaşılamamıştır. Tıpkı Ca2+için olduğu gibi, bu amino asidin canlı hücrelerdeki dinamiklerini izlemek için glutamat için genetik olarak kodlanmış birkaç gösterge geliştirilmiştir40,41. iGluSnFR, cpGFP ve Escherichia coli 42,43'tenbir glutamat bağlayıcı proteinden (GltI) oluşan GFP tabanlı tek FP glutamat biyosensördür. GltI'ye glutamat bağlanmasıyla indüklenen iGluSnFR'nin konformasyonsal değişimi, gelişmiş bir GFP floresan emisyonu ile sonuçlanır. Hücre dışı glutamatın bitki yarası yanıtında bir sinyal molekülü olarak etki edip etmediğini araştırmak için, bu biyosensörü apoplastik alanda lokalize etmek için iGluSnFR dizisini temel kitine sinyal peptid salgılama dizisi (CHIB-iGluSnFR) ile bağladık6. Bu yaklaşım, bu sensörü ifade eden transgenik Arabidopsis bitkileri kullanılarak apoplastik glutamat konsantrasyonundaki ([Glu]apo)herhangi bir değişikliğin görüntülenmesini sağladı. Yara sahasında iGluSnFR sinyalinde hızlı artışlar tespit ettik. Bu veriler, glutamanın hasarlı hücrelerden/ dokulardan yaralanarak apoplast'a sızdırdığı ve GGLR'leri aktive eden ve bitkilerde uzun mesafeli Ca2+ sinyaline yol açan bir hasar sinyali görevi gördüğü fikrini destekler6.

Burada, uzun mesafeli Ca2+ ve hücre dışı glutamat sinyallerinin dinamiklerini izlemek ve analiz etmek için genetik olarak kodlanmış biyosensörler kullanarak bitki çapında gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz6. Genetik olarak kodlanmış biyosensörleri ifade eden geniş alan floresan mikroskopisi ve transgenik bitkilerin mevcudiyeti, Ca2+ dalgaları gibi hızla iletilen uzun mesafe sinyallerini tespit etmek için güçlü, ancak kolayca uygulanan bir yaklaşım sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bitki malzemesi hazırlama

  1. 1,5 mL mikrotüpte yüzey, GCaMP3 veya CHIB-iGluSnFR'yi ifade eden Arabidopsis thaliana (Col-0 katılım) bitkisinin tohumlarını% 20 (v/v) NaClO ile 3 dakika çalkalayarak sterilize eder ve ardından steril damıtılmış su ile 5 kez yıkayın.
    NOT: Arabidopsis'in GCaMP3 veya CHIB-iGluSnFR'yi ifade eden transgenik çizgileri daha öncetanımlanmıştır 6.
  2. Steril bir kaputta, 30 mL steril (otoklavlı) Murashige ve Skoog (MS) ortamı [1x MS tuzları, %1 (w/v) sakkaroz, %0,01 (w/v) miyoinositol, %0,05 (w/v) MES ve %0,5 (w/v) gellan sakız; pH 5,7 1N KOH ile ayarlanmıştır]. Kapağı değiştirin ve cerrahi bantla sarın.
  3. 2 gün boyunca 4 °C'de karanlıkta inkübasyondan sonra, plakaları kullanımdan yaklaşık 2 hafta önce sürekli ışık altında (90-100 μmol m-2 s-1)bir büyüme odasına yatay olarak yerleştirin. 2 hafta sonra, arabidopsis yapraklarının sayısını en yaşlıdan en genç44'e kadar sayın (Şekil 1). Yara yanıtları tercihen hasarlı yapraktan (n) 3 ± ve n ± 56numaralı yapraklara hareket eder.
    NOT: Bu protokolde Petri kabı, yara ve glutamat etkilerinin floresan mikroskop altında görüntülenmesi için açılacaktır. Bu nedenle, bu deneydeki sonraki adımlar sıcaklık ve nem kontrollü oda koşullarında yapılmalıdır. Bunun nedeni, Ca2+ sinyallerinin de bu çevre koşullarındaki değişikliklerle ortaya çıkar. Ayrıca, biyosensör proteininin floresanının çıkarılması için kayıt sırasında mikroskoptan yayılan mavi ışığın, sitozolitik Ca2 + konsantrasyonu 45'in artmasına neden olabileceği ve bu nedenle bitkinin deneye başlamadan önce birkaç dakika boyunca mavi ışık ışınlanmasına alışması gerektiği bilinmektedir.

2. Kimyasal preparat

  1. L-Glutamat'ı sıvı büyüme ortamında çözün [1/2x MS tuzları, %1 (w/v) sakkaroz ve %0,05 (w/v) MES; pH 5.1 1N KOH ile ayarlanarak 100 mM çalışma çözümü yapın.
    NOT: Ca2+ dinamikleri üzerinde katyonla ilgili olası etkileri önlemek için sodyum glutamat gibi glutamat tuzlarının kullanımından kaçının.

3. Mikroskop ayarı ve gerçek zamanlı görüntülemenin yapılması

  1. 1x objektif lens (NA = 0.156) ve bir sCMOS kamera (Şekil 2) ile donatılmış motorlu floresan stereomikroskopunu açın ve cihaz ayarlarını 470/40 nm eksitasyon ışığı ile ışınlamak ve 535/50 nm filtreden geçen bir emisyon ışığı elde etmek için yapılandırın.
    NOT: GCaMP3 ve iGluSnFR sinyallerini gerçek zamanlı olarak tespit etmek için GFP'ye duyarlı herhangi bir floresan mikroskobu kullanılabilir, ancak tüm tesisten sinyal almak için düşük güçlü objektif lens ve geniş bir sCMOS çipine sahip son derece hassas bir kamera önerilir. Düşük güç hedefi, tüm arabidopsis tesisinin tepkisinin görüntülenmesini sağlar ve son derece hassas bir kameranın kullanılması, yara tetiklenen Ca2+ dalgasının hızlı zaman akışını yakalamak için gereken hızlı veri alımını sağlar. Bu çalışmada kullanılan floresan mikroskop için görüş alanının ve zamansal çözünürlüğün maksimum değerleri sırasıyla 3 cm x 3 cm ve saniyede 30 karedir (fps).
  2. Kapağı çıkarın ve kabı objektif merceğin altına yerleştirin.
  3. Bitkiden gelen floresan sinyalini kontrol edin ve bitkiler yeni çevre koşullarına adapte olana kadar karanlıkta yaklaşık 30 dakika bekleyin. Bu adaptasyon adımı gereklidir, çünkü nemdeki değişiklikler, yarayla ilgili olaylara müdahale edebilecek bitkilerde [Ca2+]sit yükselmesini sağlar.
  4. Tüm bitkiyi görüş alanında görmek için odağı ve büyütmeyi ayarlayın. Mevcut protokolde 0.63x büyütme kullanıldı.
  5. Gerçek zamanlı görüntülemeye başlamadan önce, mikroskop görüntüleme yazılımını kullanarak floresan sinyallerini algılamak için alma parametrelerini ayarlayın. Geçerli protokoldeki görüntüleme ayarları şunlardır: pozlama ve aralık süreleri sırasıyla 1,8 s ve 2 s (yani 0,5 fps) olarak ayarlanır. Kayıt süresini 11 dakika olarak ayarlayın.
  6. Bitkiyi mikroskoptan mavi ışık ışınlamasıyla uyumlulaştırma denemesine başlamadan önce 5 dakika boyunca görüntü, ardından Şimdi Çalıştır'a veya kullanılan mikroskop yazılımındaki eşdeğer komuta tıklayarak kayda başlayın. Ortalama taban çizgisi floresanını belirlemek için, yaralama veya glutamat uygulamasından önce en az 10 kare (yani, mevcut protokolde en az 20 s) kaydedin (bkz. Bölüm 4).
    1. Yara kaynaklı [Ca2+]cyt ve [Glu]apo değişikliklerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için, yaprak L1'in yaprak veya orta bölgesini makasla kesin (Şekil 3 ve Şekil 4).
    2. Glutamat tetiklenen [Ca2+] cyt değişikliklerinin gerçek zamanlıgörüntülenmesi için, ana damar boyunca yaprak 1'in kenarını (ucundan yaklaşık 1 mm) makasla kesin. En az 20 dakikalık iyileşme süresinden sonra, yaprağın kesme yüzeyine 10 μL 100 mM glutamat uygulayın (Şekil 5).
      NOT: Bu ön kesim, tepkileri tetiklemek için yaprak apoplastlarına glutamat erişimine izin vermek için gerekliydi. Ek olarak, yaprak L1'in kesilmiş yüzeyine bir damla damıtılmış su uygulanmasının, glutamat uygulamadan önce numunelerin geri kazanım sırasında kurumasını önlemek için kritik olduğu bulunmuştur.
  7. 11 dakikalık kaydı bitirdikten sonra verileri kaydedin.

4. Veri analizi

  1. Zaman içinde floresan yoğunluğu analizi için, floresan yoğunluğunun analiz edilmesi gereken yerde bir ilgi alanı (ROI) tanımlayın (Şekil 6 ve Şekil 7). Ca2+ dalgasının hız hesaplaması için analiz için 2 ROI (ROI1 ve ROI2) tanımlayın. Görüntüleme yazılımında, Zaman Ölçümü | | tanımla Daire çizin. Ek Açıklamalar ve Ölçüm | tıklayarak YATıRıM YTM'leri ile yatırım getirisi arasındaki mesafeyi ölçme Uzunluk | Basit Çizgi (Şekil 6).
  2. Ölçü 'ye tıklayarak zaman içinde her yatırım getirislerindeki ham floresan değerlerini (F) ölçün. Excel'e Her Şey'e | 'ye tıklayarak floresan sinyalini her zaman noktasında sayıya dönüştürmek için ham verileri bir elektronik tablo yazılımına dışa aktarma Dışa aktarma.
  3. Kaydedilen verilerdeki ilk10karenin (yani tedaviden önce) üzerindeki F ortalamasını hesaplayarak, F 0 olarak tanımlanan temel floresan değerini belirleyin.
  4. ΔF/ F = (F−F 0 ) / F 0 denklemini kullanarakFverilerini normalleştirin(ΔF/F ) ΔF floresandaki zamana bağlı değişikliktir.
  5. Ca2+ dalga hızı dalga analizi için, istatistiksel yazılım kullanılarak F0 verilerinden hesaplanan standart sapma(2x SD) × 2'ye yükselme kriterini kullanarak her yatırım getirisinde(t1 ve t2)ca 2+ artışının algılanmasını temsil eden önceden uyarılmış değerlerin üzerinde önemli bir sinyal yükselme noktası tanımlayın. F0 verilerinin %95'i ortalamadan 2x SD'ye düşüyor ve bu da sinyalde şans eseri bu seviyenin üzerinde bir yükselişin %≤5 olduğunu gösteriyor. Roi1 veROI2 arasındaki Ca 2+ artışının zaman farkını hesaplayın [t2- t1 zaman gecikmesi (Δt)] ve ROI1 ile ROI2 arasındaki mesafeyi ölçün, ardından herhangi bir Ca2+ dalgasının hızlarını belirleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

[Ca2+]cyt ve [Glu]apo'nun yaralamaya yanıt olarak sinyal yayılması Şekil 3, Şekil 4, Film S1ve Film S2'de sunulmuştur. GCaMP3'i ifade eden bitkilerde yaprak 1'in yaprak sapını kesmek (0 s'de), vaskültür (40 s'de)(Şekil 3 ve Film S1)yoluyla lokal olarak hızla indüklenen [Ca2+]sitosunda önemli bir artışa yol açtı. Daha sonra, sinyal birkaç dakika içinde (80 s'de) komşu yapraklara (yaprak 3 ve 6) hızla yayılmıştır (Şekil 3 ve Film S1).

CHIB-iGluSnFR'yi ifade eden bitkilerde yaprak 1 kesildikten sonra, kesim bölgesi çevresinde (2 s'de) hızlı bir [Glu]apo artışı gözlendi. Bu sinyal birkaç dakika içinde (160 s'de) lokal olarak vaskülat yoluyla yayılmıştır, ancak sistemik yapraklarda(Şekil 4 ve Film S2)gözlenmemiştir.

Glutamat uygulaması tarafından tetiklenen Ca2+ sinyal yayılımının gerçek zamanlı görüntülenmesi için, GCaMP3'ü ifade eden bitkilerde yaprak 1'in kenarı (uçtan yaklaşık 1 mm) Şekil 5A ve Film S3'tegösterildiği gibi kesilmiştir. Yaprak 1'in kenarının kesilmesi yerel bir [Ca2+]cyt artışına neden oldu (40 s'de) ancak bu sinyal birkaç dakika içinde (124 s'de) kayboldu. Bitkinin düzelmesinde yaklaşık 10 dakika bekledikten sonra, yaprak 1'in kesim yüzeyine 10 μL 100 mM glutamat uygulandı, bu da yerel olarak [Ca2+]cyt'ın (56 s'de) hızlı, önemli bir artışına ve distal yapraklara (104 s'de) sinyal yayılmasına neden oldu(Şekil 5B ve Film S4).

Sistemik yapraktaki yaranın neden olduğu [Ca2+cyt'deki değişiklikleri ölçmek için, Şekil 6A'da gösterildiği gibi GCaMP3'ü ifade eden bitkilerde temel bölgeye ve yaprak 6'nın ucuna iki ROI (ROI1 ve ROI2) ayarlanmıştır. Yaprak 1'in petiole'si kesildikten sonra ROI1 ve ROI2'deki GCaMP3 sinyal yoğunluğunun zaman seyri değişimi ölçüldü (Şekil 6B). ROI1'de [Ca2+]cyt'nin roi2'den daha erken bir artış tespit edildi (Şekil 6B). [Ca2+] cyt, yaralandıktan sonra yaklaşık 100 sn'de zirve yaptı, 10 dakikadan fazla sürdü ve iki faz sergiledi (Şekil 6B).

Mekanik yaralama üzerine Ca2+ dalgasının hızlarını belirlemek için, ROI1 ve ROI2'de önceden uyarılmış değerlerin üzerinde önemli bir sinyal yükselişinin zaman noktası belirlenmiştir (zaman gecikmesi; bkz. Bölüm 4) (Şekil 6C). RoI1 ve ROI2 arasındaki mesafe bu durumda 2,7 mm olduğundan (Şekil 6A), yaprak 6'daki Ca2+ sinyal hızı 0,15 mm/s olarak hesaplanmıştır. Mekanik hasara yanıt olarak [Glu]apo değişikliklerini ölçmek için, RoI1 Şekil 7A'dagösterildiği gibi L1 olarak işaretlenmiş yaprağın kesim yerinin yakınında ayarlanmıştır. [Glu] ROI1'deki apo imzası, yaralama üzerine yaklaşık 100 s'de tek bir tepe noktası sergilemıştır (Şekil 7B).

Figure 1
Şekil 1: Arabidopsis rozet yapraklarının numaralandırması. Arabidopsis yaprakları en yaşlıdan en gence (sol panel) sayılır. Yaprakların konumunun şematik diyagramı sağ panelde belirtilir. L: yaprak, C: cotyledons. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Bu çalışmada kullanılan birfloresan mikroskobu. [Ca2+]cyt ve [Glu]apo dinamikleri geniş alan floresan stereomikroskop ile görüntülenmiştir. R: Uzaktan kumanda, O: 1x objektif lens, C: sCMOS kamera, T: Trinoküler eğme tüpü, S: Aşama, P: Bitki malzemesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Yara kaynaklı uzun mesafe Ca2+ sinyal iletimi. GCaMP3'ü ifade eden bitkideki yaprak 1'in (L1) petiolesini (beyaz ok, 0 s) kesmek, sistemik yapraklara [yaprak 3 (L3) ve yaprak 6'ya (L6)] (turuncu oklar, 80 s) iletilen yerel [Ca2+]sit artışını (kırmızı ok, 40 s) tetikledi. Ölçek çubuğu, 5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Yara tetiklenen [Glu]apo yüksekliği. CHIB-iGluSnFR'yi ifade eden bitkilerde yaprak 1 'in (L1) (beyaz ok, 0 s) kesilmesi, vaskülattan yayılan [Glu]apo 'nun (kırmızı ok, 80 s) hızlı bir şekilde yükselmesine neden oldu (turuncu ok, 160 s). Ölçek çubuğu, 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Glutamat tetiklenen uzun mesafeli Ca2+ sinyal iletimi. (A) GCaMP3 'ü (beyaz ok, 0 s) ifade eden bitkilerde yaprak 1'in (L1) kenarının (uçtan yaklaşık 1 mm) kesilmesi [Ca2+]sit artışına (kırmızı ok, 40 sn) neden oldu. (B) L1'in kesme yüzeyine 100 mM glutamat uygulanması (beyaz ok, 0 s), distal yapraklara hızla yayılan yerel [Ca2+]sit artışına (kırmızı ok, 56 s) neden oldu [örneğin, yaprak 3 (L3), yaprak 4 (L4) ve yaprak 6 (L6)] (turuncu oklar, 104 s). Ölçek çubukları, 5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: [Ca2+] mekanik yaralamaya yanıt olarak sistemik yapraklardasit imzası. (A) GCaMP3'u ifade eden bitkilerde yaprak 6'nın (L6) genişletilmiş bir görüntüsü Şekil 3'tegösterilmiştir. Roi1 (mavi daire) ve ROI2 (pembe daire) sırasıyla taban ve uç bölgesinde ayarlanmıştır. Beyaz ok, yaprak 1'in yaprak saplarının (L1) kesik bölgesini gösterir. Bu durumda, YATıRıM YT1 ve YATıRıM YT2 arasındaki mesafe 2,7 mm idi. (B) ROI1 ve ROI2'deki [Ca2+]cyt imzalarının nicelemesi. Floresan yoğunluğu değişiklikleri görüntüleme yazılımı kullanılarak analiz edildi. (C) (B) içinde 0 s ile 80 s arasında genişletilmiş veri izi. Yatırım getirisi1 ve roi2'deki Ca2+ artışının algılama noktaları sırasıyla t1 ve t2olarak tanımlanmıştır, kriter olarak prestimülasyon değerlerinin standart sapmasının 2 kata yükselmesi (2x SD, noktalı çizgi). T2 - t1 değeri, geçerli protokolde zaman gecikmesi (Δt) olarak tanımlandı. Siyah ok kesme süresini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: [Glu] mekanik yaralamaya yanıt olarakapo imzası. (A) CHIB-iGluSnFR ifade eden bitkilerde yaprak 1'in (L1) genişletilmiş bir görüntüsü Şekil 4'tegösterilmiştir. RoI1, kesim alanının yakınında kuruldu. Beyaz ok kesim bölgesini gösterir. (B) ROI1'deki [Glu]apo imzasının niceliği görüntüleme yazılımı kullanılarak izlenir. Siyah ok kesme süresini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Film S1:Mekanik yaralamadan sonra uzun mesafeli Ca2+ iletimi. Yaprak 1'in (L1) petiole'sünde mekanik yaralama, distal yapraklara [örneğin yaprak 3 (L3) ve yaprak 6'ya (L6)] iletilen [Ca2+]sitt artışına neden oldu. Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.

Film S2: Kesmeye yanıt olarak apoplastik glutamat seviyelerinin yükselmesi. Yaprak 1'in (L1) mekanik yaralanması [Glu]apo'dahemen bir artışa neden oldu. Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.

Film S3: Kesmeyeyanıt olarak [Ca2+]cyt seviyelerinin yükselmesi. Yaprak 1'in (L1) kenarındaki mekanik yaralar hemen, lokal [Ca2+]sit yükselmesine neden oldu. Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.

Film S4: Glutamat uygulaması sistemik tetikler [Ca2+]sitartar. 100 mM glutamat uygulaması, Ca2+ iletimini sistemik yapraklara [örneğin, yaprak 3 (L3), yaprak 4 (L4) ve yaprak 6'ya (L6)] tetikledi. Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sistemik sinyalizasyon, bitkilerin lokalize dış çevresel uyaranlara yanıt vermesi ve daha sonra homeostazlarını tüm bitki seviyesinde tutması için önemlidir. Hayvanlar gibi gelişmiş bir sinir sistemi ile donatılamasalar da, mobil elektrik (ve muhtemelen hidrolik) sinyalleri ve ROS ve Ca2+ 46,47dalgalarının yayılması gibi faktörlere dayanarak hem organlar içinde hem de organlar arasında hızlı iletişim sağlarlar. Yukarıda açıklanan protokol, ca2+ ve apoplastik glutamanın dinamiklerini izleyerek bu sinyal sisteminin aktivitesinin bitki çapında, gerçek zamanlı olarak görüntülenmesini sağlar. Bu yöntem, yüksek mekansal çözünürlük ve kullanım kolaylığını birleştiren tesislerdeki hızlı ve uzun mesafeli sinyalleri anlamak için sağlam bir araç sağlar. Bu protokol ayrıca, örneğin hızlı sinyal sisteminin putatif elemanlarında kusurlu olan mutantları kullanarak veya Ca2+ kanal blokerleri (örneğin, LaCl3)veya diğer potansiyel olarak anahtar sinyalizasyon faaliyetlerinin inhibitörleri gibi farmakolojik reaktiflerin etkilerinin araştırılması gibi uzun mesafeli yara sinyallerinin altında kalan moleküler mekanizmalar hakkında yeni fizyolojik içgörüler sağlama potansiyeli sunmaktadır6. 

Açıklanan biyosensör görüntüleme yönteminin önemli bir avantajı, yüksek floresan verimine sahip tek FP biyosensörlerin kullanılmasıdır ve bu ölçümleri yapmak için gerekli ekipmanı ve planta kullanımlarını büyük ölçüde basitleştirir. Böylece floresan bazlı genetik kodlanmış göstergeler iki sınıfa ayrılır: 1) yoğunluk bazlı tek FP biyosensörler ve 2) oranmetrik FRET tabanlı biyosensörler10. Oranmetrik FRET tabanlı sensörler nicel olarak doğru olsa da, burada kullanılan GCaMP3 ve iGluSnFR de dahil olmak üzere yoğunluk tabanlı Ca2+ göstergeleri, genel olarak daha parlak Ca2+duyarlı sinyalleri ve daha basit mikroskop gereksinimleri nedeniyle hem daha yüksek zamansal çözünürlük hem de kullanım kolaylığı sağlar10. Örneğin, kırmızı floresan protein bazlı tek FP Ca 2+ göstergesi R-GECO1'in, oransalYC3.6 biyosensör27ile karşılaştırıldığında, hücre dışı ATP ve bitki savunma elicitors flg22 ve chitin'e yanıt olarak çok daha büyük bir sinyal değişikliği gösterdiği bildirilmiştir. Oranmetrik FRET tabanlı sensörlerin analizi için, iki dalga boyunda veri toplamak için birden fazla filtreye sahip özel bir mikroskop kullanmak da gereklidir, oysa tek FP tabanlı biyosensörler, cihazın verileri yalnızca bir dalga boyunda toplamasını gerektirir, tüm standart floresan mikroskoplarında bulunan bir yetenek10. Bununla birlikte, tek FP biyosensörleri kullanmanın bazı dezavantajları olduğunu belirtmek önemlidir. Bu yoğunluk tabanlı, tek FP biyosensörler, mutlak konsantrasyon değişikliklerini ölçmek veya saatler veya günler boyunca uzun süreli görüntüleme için tercih edilir. Bu sınırlama, örneğin GCaMP3 için Ca2+ seviyesine ek olarak, bu tek FP biyosensörlerden gelen sinyal yoğunluğunun sensör ifade seviyesi veya zaman içinde değişebilecek hücresel pH gibi parametreler gibi diğer faktörlerden etkilendiği düşünülmektedir.

Bugüne kadar, bu genetik olarak kodlanmış göstergelerin birçok yeni varyantı, sinyali gürültü oranına, dinamik menzile, kinetiklere ve sensör kararlılığına iyileştirmek için tasarlanmıştır. Örneğin, Nakai ve ark.26 ilk GCaMP'yi geliştirdikten sonra, GECO'lar gibi çeşitli ardışık varyantlar mutajensis ve dikkatli karakterizasyon48 , 49,50kombinasyonu ile oluşturulmuştur. G-GECO'nun (Green-GECO) dinamik aralığının GCaMP328'denyaklaşık iki kat daha büyük olduğu bildirilmiştir. Ayrıca, bu göstergelerdeki farklı floresan proteinlerle değiştirilmesi, B-GECO (Blue-GECO) ve R-GECO (Red-GECO) gibi farklı emisyon spektrumlarına sahip GECO varyantlarının üretilmesine yol açtı, bu da bu göstergelerin çok renkli görüntüleme uygulamalarında diğer GFP spektral varyantlarının yanı sıra kullanılmasını sağlar28. Benzer şekilde, GCaMP, yanıt hızı ve sinyal genliği için geliştirilmiş bir dizi sensörle geliştirilmeye ve geliştirilmeye devam etti50. Glutamat dinamiklerini izlemek için, bir dizi FRET tabanlı glutamat biyosensörü olan iGluSnFR dışında, Glutamat için FLuoresan Gösterge Proteinleri (FLIPE)geliştirilmiştir 40. FLIPE, E. coli'denalınan glutamat bağlayıcı protein ybeJ ile bağlanan CFP ve YFP'den oluşur. Glutamat ybeJ'ye bağlanması üzerine, glutamat konsantrasyonuna bağlı olarak FRET verimliliğinde bir azalma gözlenir. Bu nedenle, hem Ca2+ hem de glutamat için birden fazla tek FP ve oranmetrik sensör mevcuttur. Araştırmacılar, yüksek sinyal:gürültü (tek FP sensörleri) gibi ölçüm faktörleri için deneysel tasarıma ve gereksinimlere bağlı olarak sinyal dinamiklerini tespit etmek için uygun biyosensörü, son derece doğru nicelik ihtiyacına (FRET sensörlerinin üstün olduğu) dikkate almalıdır.

Burada yaralama için açıklanan geniş alanlı, tek FP görüntüleme yöntemi, diğer stres sistemik sinyalizasyon süreçlerine uygulandığında da yararlı olmalıdır. Otçul atak 6 , 51 ,52 ,tuz 20 vekuraklık53gibiçeşitli stres yanıtlarında uzun mesafeli Ca2+sinyalinin önemli bir rol oynamasını öneren çok sayıda raporun varlığına rağmen, sadece birkaç çalışma bu stres yanıtlarının neden olduğu hızlı uzun mesafeli Ca2+ sinyalleri ile ilgili spatiotemporal bilgileri sağlamıştır 6 ,7,20,52. Bu protokolde geniş alan floresan mikroskop kullanımı, mobil sinyal dinamiklerinin sadece yaprak yaprak iletişimde değil, aynı zamanda son zamanlarda gösterildiği gibi kökten çekime iletişimde de gerçek zamanlı gözlemlenmesine izin verir38. Arabidopsisprotokollerine odaklanmamıza rağmen, bu bitki çapında gerçek zamanlı görüntüleme yöntemi, tütün30gibi diğer bitki türlerinde hem biyotik hem de abiyotik stres yanıtlarında sistemik Ca2+ sinyalinin mekansal ve zamansal özelliklerini anlamak için sağlam bir araç sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Japonya Bilimi Destekleme Derneği'nden (17H05007 ve 18H05491) MT'ye, Ulusal Bilim Vakfı'ndan (IOS1557899 ve MCB2016177) ve Ulusal Havacılık ve Uzay İdaresi'nden (NNX14AT25G ve 80NSSC19K0126) SG'ye hibelerle desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32 (9), 1161-1174 (2009).
  2. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 387-415 (2018).
  3. Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
  4. Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
  5. Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 287-307 (2016).
  6. Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361 (6407), 1112-1115 (2018).
  7. Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10178-10183 (2018).
  8. Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171 (2), 249-269 (2006).
  9. Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227 (4), 1037-1050 (2020).
  10. Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
  11. Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29 (2), 229-234 (1967).
  12. Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23 (2), 267-278 (2000).
  13. Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  14. Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440 (3), 355-373 (2011).
  15. Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93 (12), 2095-2101 (2011).
  16. Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163 (2), 543-554 (2013).
  17. Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
  18. Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5242-5249 (2016).
  19. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  20. Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (17), 6497-6502 (2014).
  21. Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171 (3), 1771-1784 (2016).
  22. Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18849-18857 (2020).
  23. Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216 (4), 1161-1169 (2017).
  24. Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  25. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  26. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  27. Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
  28. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  29. Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142 (2017).
  30. DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58 (7), 1173-1184 (2017).
  31. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
  32. Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67 (6), 1853-1869 (2016).
  33. Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42 (12), 3326-3339 (2019).
  34. Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1497-1509 (2013).
  35. Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69 (17), 4151-4163 (2018).
  36. De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
  37. Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2 (1), 232 (2011).
  38. Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13 (640), (2020).
  39. Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58 (9), 2339-2358 (2007).
  40. Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  41. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4411-4416 (2008).
  42. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  43. Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
  44. Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. , (2013).
  45. Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83 (1), 102-111 (2007).
  46. Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67 (7), 2063-2079 (2016).
  47. Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90 (4), 698-707 (2017).
  48. Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (12), 4753-4758 (2006).
  49. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  50. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  51. Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29 (6), 1460-1479 (2017).
  52. Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31 (7), 1539-1562 (2019).
  53. Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15 (8), 1833-1845 (2003).

Tags

Biyoloji Sayı 172 kalsiyum GCaMP3 genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler glutamat iGluSnFR uzun mesafe sinyali yaralama
<em>Arabidopsis'te</em> Lokal ve Sistemik Yara Sinyallerinin Geniş Alan, Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y.,… More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter