Summary
ゼブラフィッシュ胚/幼虫は外部に発達し、光学的に透明である。初期段階における魚のマイクロプラスチックの生物蓄積は、蛍光標識されたマイクロビーズで容易に評価される。
Abstract
新しいタイプの環境汚染物質として、マイクロプラスチックは水生環境で広く発見され、水生生物に高い脅威を与えています。マイクロプラスチックの生体蓄積は、その毒性作用において重要な役割を果たす。しかし、粒子状として、その生物蓄積は他の多くの汚染物質とは異なります。ここで説明する、ゼブラフィッシュ胚または幼虫におけるマイクロプラスチックの蓄積および分布を蛍光マイクロプラスチックを用いて視覚的に決定する方法である。胚は、120時間の直径500 nmの蛍光マイクロプラスチックの異なる濃度(0.1、1、および10 mg/L)に曝露される。マイクロプラスチックは、濃度依存的な方法でゼブラフィッシュ胚/幼虫に生物蓄積できることを結果に示した。孵化する前に、強い蛍光は胚絨毛の周りに見られる;ゼブラフィッシュの幼虫では、黄身嚢、心膜、消化管がマイクロプラスチックの主な蓄積部位です。この結果は、初期の段階でのゼブラフィッシュのマイクロプラスチックの取り込みと内在化を示し、マイクロプラスチックが水生動物に及ぼす影響をよりよく理解するための基礎となる。
Introduction
1900年代に初めて合成されて以来、プラスチックは様々な分野で広く使用されており、その結果、世界生産1の急速な成長が生まれる。2018年には、世界中で約3億6000万トンのプラスチックが生産されました。自然環境のプラスチックは、化学的、物理的または生物学的プロセスに起因する微粒子に分解する。一般に、微細プラスチック粒子<5mmの大きさは、マイクロプラスチック4と定義される。マイクロプラスチックは、化粧品5からのマイクロビーズなどの特定の用途のために設計されています。ほぼ永久的な汚染物質として、マイクロプラスチックは環境に蓄積され、科学者、政策立案者、一般の人々1、6から注目を集めています。以前の研究では、マイクロプラスチックが、胃腸損傷7、神経毒性8、内分泌破壊9、酸化ストレス10およびDNA損傷11などの魚に悪影響を及ぼす可能性があることを文書化した。しかし、マイクロプラスチックの毒性は、これまでのところ12,13に完全には明らかにされていない。
ゼブラフィッシュ胚は、小型、外受精、光学透過性、大型クラッチなど多くの実験的利点を提供し、初期段階での魚に対する汚染物質の影響を研究する生体にとって理想的なモデル生物と考えられています。また、生物学的応答の評価には限られた量の試験物質しか必要とされない。ここで、ゼブラフィッシュ胚は5日間、マイクロプラスチックの異なる濃度(0.1、1、10mg/L)にさらされ、ゼブラフィッシュ胚/幼虫中のマイクロプラスチックの生物蓄積および分布が評価される。この結果は、魚に対するマイクロプラスチックの毒性に関する我々の理解を進め、ここで説明する方法は、ゼブラフィッシュの初期段階における他の種類の蛍光物質の蓄積と分布を決定するために一般化される可能性がある。
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Protocol
成虫ゼブラフィッシュは、中国ゼブラフィッシュ資源センター(中国武漢)から生まれました。実験は、国家ガイド「動物福祉の倫理的見直しのための実験動物ガイドライン(GB/T35892-2018)」に準拠して実施されました。
1. 胚コレクション
- 14:10時間の光の光の上に一定の温度(28±0.5 °C)で再循環炭水システム(pH7.0 ±0.2)を持つ20のLガラスタンクで魚を維持する:暗い。
- アルテミア・ナウプリイで魚を1日2回食べさせる。1日あたり最大3%の魚の体重で食べ物を与え、14時間ごとに5分以内に食べるべきであることをお勧めします。
- よく発達した成体のゼブラフィッシュ(体長3~4cm)を、繁殖前夜に1匹の雄から2匹のメスの比率で産卵槽に移します。
注:翌朝、魚は光サイクルの発症後に産卵し始めます。 - パスツールピペットを使用して卵を収集します。ハンクの溶液を10%で数回リンスし、顕微鏡で受精をチェックします。受精卵は約2時間後の受精後に切断期間(hpf)を受け、15を明確に同定することができる。
- 28°Cで消毒するために1%メチレンブルーの1%メチレンブルーと10%のハンクの溶液の200 mLを含む500 mLビーカーに受精胚をインキュベートします。 1胚/2 mL溶液の負荷率を超えないようにしてください。
注:10%ハンクのソリューションは137 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.25 mM Na2HPO 4、0.44 mM KH2PO4、1.3mM CaCl2、1.0mM MgSO4および4.2 mM NaHCO3で構成されています。
2. マイクロプラスチック懸濁液の調製
- 緑色蛍光標識ポリスチレンビーズ(10 mg/mL)のストック溶液を、公称直径500nm(励起/放出:460/500nm)で10分間超音波処理します。
- 10%ハンク溶液でストック溶液を希釈し、必要な露出溶液(0.1、1、および10 mg/L)を生成します。
- 常に、マイクロプラスチックの露光液を調製してから、露光する前に準備してください。
注:マイクロプラスチックの毒性効果を評価する際には注意が必要です, 例えば、アジドナトリウムのような防腐剤の存在, 市販の粒子製剤中, 異なる生物に有毒であることができるので注意してください 16.したがって、これらの添加剤は、毒性実験を行う前に、コントロール内で除去または考慮する必要があります。
3. マイクロプラスチック露光
- 新たに受精した胚6個(4hpf)をランダムに選択し、5 mLのマイクロプラスチック溶液を含む6ウェルプレートの各ウェルに異なる濃度で移す。10%Hankの溶液を含むコントロールグループを含めます。
- 各治療に三重井戸(合計18個の胚)を使用してください。
- 同じ光の下で胚をインキュベート:暗いサイクルと大人と温度(1.2を参照)、12時間ごとに観察します。すぐに死者を取り除きます。
- マイクロプラスチックソリューションを24時間ごとに90%更新します。暴露期間中、魚は餌を与えられていない。
注:一般的に、胚の孵化は48 hpfで始まり、約72 hpfで完了する。
マイクロプラスチック分布の評価
- 受精後24、48、72、96、および120時間で、胚/幼虫(3つの複製のそれぞれから1つ)をランダムに選択し、10%ハンクの溶液ですすいでください。
- 幼虫をペトリ皿に移し、麻酔のために0.016%トリカインにさらします。
- トリケーヌのストック溶液を調製:トリケーヌ粉末の4mgを100mLの二重蒸留水に溶解し、Tris-HCl(pH 9.0)でpHを7.0に調整します。ストックソリューションを冷凍庫に保管します。
- 作業ソリューションを準備します。ストック溶液を所望の濃度に希釈する(0.016%)室温14で10%ハンクの溶液で.
- 胚/幼虫を配置し、観察の準備をします。
- 蛍光顕微鏡で魚を観察し、画像化ソフトウェアで画像を観察します。
- ImageJ で魚の蛍光強度を定量化します。
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Representative Results
蛍光マイクロプラスチックの分布と蓄積を図1および表1に示す。未露光群(対照)では可視蛍光は認められない。しかし、異なる濃度のマイクロプラスチック(24 hpf)に曝露した後、絨毛膜を取り囲む蛍光の蓄積が見られる。緑色蛍光は幼虫でも検出され、蛍光レベルは濃度依存的および時間依存的に増加するように見える。黄身嚢、心膜、および胃腸管は、マイクロプラスチックの主な蓄積部位である(図2)。
図1:ゼブラフィッシュの胚/幼虫における蛍光ポリスチレンマイクロプラスチックの分布(40×魚は対照群からサンプリングされるか、または0.1、1および10mg/Lで500nmマイクロプラスチックに曝露されたグループである。
図2:ゼブラフィッシュ幼虫中のマイクロプラスチック蓄積部位(40×)。 この幼虫は、10 mg/Lで500nmのマイクロプラスチックに曝露された群から120時間サンプリングされる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 濃度 | 胚 | 幼虫 | ||||
| (mg/L) | 24 hpf | 48 hpf a | 48 hpf b | 72 hpf | 96 hpf | 120 hpf |
| 続き。 | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7.5±0.5 | 8.7±0.5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25.7±2.7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82.3±5.3 | 30.4 | 32.7±3.2 | 41.6±0.4 | 44.1±0.9 |
| a: 2つの胚のみが評価された。 b: 1つの幼虫のみを評価した。 | ||||||
表1:蛍光マイクロプラスチックへの暴露後のゼブラフィッシュにおける蛍光レベルの変化(n=3)。 絨毛膜が蛍光微小プラスチックの吸収に及ぼす影響により、データは胚(孵化前)と幼虫(孵化後)の2つの部分に分けられる。
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Discussion
EU指令2010/63/EUのような科学的目的で使用される動物の保護に関するガイドラインによれば、動物倫理許可は、独立した摂食が可能である段階までゼブラフィッシュの初期のライフステージ(受精後5日間)17の実験には必須ではない。しかし、ゼブラフィッシュの使用を最適化するためには最善の福祉実践が重要であり、例えば、麻酔と安楽死の人道的方法が懸念されるべきである。エチル3-アミノ安息香酸メタンスルファ剤(MS-222、またはトリケーヌ)は、最も多くの実験室で日常的に使用される薬剤で、麻酔および安楽死のためにここで使用される。
顕微鏡下で観察する前に、胚と幼虫は、外部表面に吸着されたマイクロプラスチックが結果を妨げる可能性があるため、すすいでください。さらに、胚/幼虫、特に時折報告されている黄身嚢の周りの自己蛍光は問題になる可能性があります。フラビン、ニコチンアミド-アデニンジヌクレオチド(NAD)、芳香族アミノ酸、リポフスチン、高度な糖化末端産物、およびコラージュのような多くの生体高分子の存在は、適切な波長で励起されると発光する。
粒子状汚染物質として、マイクロプラスチックのサイズは、バイオアベイラビリティ、および毒性18の決定因子の一つとして考えられていることに注意することが重要です。ここで用いられるマイクロプラスチックの公称直径は500nmであり、これは胚絨毛の細孔サイズ(300nm〜1μmの範囲内)19と比較される。したがって、これらのマイクロプラスチックは、ゼブラフィッシュ絨毛を容易に通過することは期待されていない。一貫して、孵化前の胚に見える蛍光はほとんど存在しない(図1)。絨毛は大きなサイズの粒子に対する効果的なバリアとして機能するので、露出前のデコールリオネーションプロセスが必要になる可能性があります。絨毛膜は鉗子を用いて容易に除去することができるが、胚を一括して扱う場合はプロナーゼによる酵素的デコール化が好ましい。しかし、デコールリオネーションは生体利用能を高め、物質の毒性に対するハイスループットスクリーニングを容易にするが、雑音をそのまま含む胚は、「現実」の世界における暴露の状態を考慮する際に汚染物質の生態毒性を評価することをより推奨する。
マイクロプラスチックが魚に及ぼす悪影響の調査に多大な努力が注がれていますが、生体蓄積を含む現在の知識は限られた、あるいは矛盾しています。これらの全体研究の不整合は、主にサイズ、密度、表面特性(表面電荷など)を含むパーティクルの特性の違いに起因します。ソリューション内のマイクロプラスチックの挙動は、バイオアベイラビリティにも重要です。マイクロプラスチックの物理化学的特性は、曝露期間にわたって追跡されるべきであり、発生する可能性のある凝集現象を記録する必要があります。実際には、マイクロプラスチックを長期間中断する必要がある暴露のために、超音波処理または磁気バーで攪拌することをお勧めします。
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Disclosures
著者は、競合する利益や財政的利益を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(21777145、22076170)、長江学者と大学の革新的研究チームのためのプログラム(IRT_17R97)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
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