Summary
Zebrafischembryonen/Larven entwickeln sich extern und sind optisch transparent. Die Bioakkumulation von Mikroplastik in Fischen im frühen Lebensstadium wird leicht mit fluoreszierend gekennzeichneten Mikroperlen beurteilt.
Abstract
Als neue Art von Umweltschadstoffen ist Mikroplastik in der aquatischen Umwelt weit verbreitet und stellt eine hohe Bedrohung für Wasserorganismen dar. Die Bioakkumulation von Mikroplastik spielt eine Schlüsselrolle bei ihrer toxischen Wirkung; Als Feinstaub unterscheiden sich ihre Bioakkumulation jedoch von vielen anderen Schadstoffen. Hier wird eine praktikable Methode beschrieben, um die Ansammlung und Verteilung von Mikroplastik in Zebrafischembryonen oder Larven mit fluoreszierenden Mikroplastiken visuell zu bestimmen. Embryonen sind unterschiedlichen Konzentrationen (0,1, 1 und 10 mg/L) fluoreszierender Mikroplastike mit einem Durchmesser von 500 nm für 120 h ausgesetzt. In den Ergebnissen wird gezeigt, dass Mikroplastik in Zebrafischembryonen/-larven konzentrationsabhängig bioakkumulieren kann. Vor dem Schlüpfen findet sich eine starke Fluoreszenz um die embryonale Chorion; während in ZebrafischLarven, der Dottersack, Perikard, und Magen-Darm-Trakt sind die wichtigsten angesammelten Standorte von Mikroplastik. Die Ergebnisse zeigen die Aufnahme und Internalisierung von Mikroplastik in Zebrafischen in frühen Lebensstadien, was die Grundlage für ein besseres Verständnis der Auswirkungen von Mikroplastik auf Wassertiere bieten wird.
Introduction
Seit der ersten Synthese in den 1900er Jahren werden Kunststoffe in verschiedenen Bereichen weit verbreitet, was zu einem schnellen Wachstum der globalen Produktionführt 1. Im Jahr 2018 wurden weltweit rund 360 Millionen Tonnen Kunststoffe produziert2. Die Kunststoffe in der natürlichen Umgebung werden durch chemische, physikalische oder biologische Prozesse zu feinen Partikeln abgebaut3. Im Allgemeinen sind feine Kunststoffpartikel <5 mm Größe als Mikroplastik4definiert. Mikroplastik ist auch für spezifische Anwendungen entwickelt, wie Mikroperlen aus kosmetischen Produkten5. Als nahezu permanente Schadstoffe häufen sich Mikroplastik in der Umwelt und haben immer mehr Aufmerksamkeit von Wissenschaftlern, politischen Entscheidungsträgern und der Öffentlichkeiterregt 1,6. Frühere Studien dokumentiert, dass Mikroplastik Nebenwirkungen bei Fischen verursachen könnte, wie Magen-Darm-Schäden7, Neurotoxizität8, endokrine Störung9, oxidativer Stress10 und DNA-Schäden11. Die Toxizität von Mikroplastik wurde jedoch bisher nicht vollständig aufgedeckt12,13.
Zebrafisch-Embryonen bieten viele experimentelle Vorteile, darunter geringe Größe, externe Befruchtung, optische Transparenz und große Kupplungen, und gilt als idealer Modellorganismus für die In-vivo-Untersuchung der Auswirkungen von Schadstoffen auf Fische in frühen Lebensstadien. Darüber hinaus werden für die Bewertung biologischer Reaktionen nur begrenzte Mengen an Prüfsubstanzen benötigt. Hier bei Zebrafischembryonen werden 5 Tage lang unterschiedlichen Konzentrationen von Mikroplastik (0,1, 1, 10 mg/L) ausgesetzt, und die Bioakkumulation und Verteilung von Mikroplastik in Zebrafischembryonen/Larven wird evaluiert. Dieses Ergebnis wird unser Verständnis über die Toxizität von Mikroplastik für Fische fördern, und die hier beschriebene Methode kann potenziell verallgemeinert werden, um die Ansammlung und Verteilung anderer Arten von fluoreszierenden Materialien in den frühen Lebensphasen von Zebrafischen zu bestimmen.
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Protocol
Erwachsene Zebrafische stammen aus dem China Zebrafish Resource Center (Wuhan, China). Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem nationalen Leitfaden "Laboratory Animal Guideline for Ethical Review of Animal Welfare (GB/T35892-2018) durchgeführt.
1. Embryo-Sammlung
- Halten Sie Fische in 20 L Glastanks mit zirkulierendem, mit Holzkohle gefiltertem Leitungswassersystem (pH 7,0 ± 0,2) bei konstanter Temperatur (28 ± 0,5 °C) auf einer Photoperiode von 14:10 h Hellwasser: dunkel.
- Füttern Sie Fisch zweimal täglich mit Artemia nauplii. Es wird empfohlen, dass das Essen mit max. 3% Fischgewicht pro Tag verabreicht wird und innerhalb von 5 min jedes Mal gegessen werden sollte14.
- Übertragen Sie gut entwickelte erwachsene Zebrafische (mit einer Körperlänge von 3-4 cm) in der Nacht vor der Zucht im Verhältnis von einem Männchen zu zwei Weibchen in den Laichbecken.
HINWEIS: Am nächsten Morgen beginnen die Fische nach dem Beginn des Lichtzyklus zu laichen. - Sammeln Sie Eier mit einer Pasteur Pipette. Spülen Sie mit 10% Hanks Lösung mehrmals, und überprüfen Sie dann auf Düngung mit einem Mikroskop. Befruchtete Eier durchlaufen die Spaltungszeit nach ca. 2 h nach der Befruchtung (hpf) und können eindeutig identifiziert werden15.
- Inkubieren Sie die befruchteten Embryonen in einem 500 ml Becher, der 200 ml 10% Hank-Lösung mit 1% Methylenblau zur Desinfektion bei 28 °C enthält. Überschreiten Sie nicht die Laderate von 1 Embryo/2 ml Lösung.
HINWEIS: 10% Hanks Lösung besteht aus 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4 und 4,2 mM NaHCO3.
2. Herstellung von Mikroplastiksuspensionen
- Sonicate die Stammlösung aus grünen fluoreszierend markierten Polystyrolperlen (10 mg/ml) mit einem Nenndurchmesser von 500 nm (Erregung/Emission: 460/500 nm) für 10 Minuten.
- Verdünnen Sie die Lagerlösung mit 10% Hanks Lösung, um die gewünschten Expositionslösungen (0,1, 1 und 10 mg/L) zu produzieren.
- Bereiten Sie die Belichtungslösungen von Mikroplastik immer vor der Exposition vor.
HINWEIS: Bei der Beurteilung der toxischen Wirkungen von Mikroplastik ist Vorsicht geboten, da das Vorhandensein von Konservierungsstoffen wie Natriumazid in den kommerziellen Partikelformulierungen für verschiedene Organismen toxisch sein kann 16. Daher sollten diese Zusatzstoffe bei den Kontrollen entfernt oder berücksichtigt werden, bevor Toxizitätsexperimente durchgeführt werden.
3. Mikroplastische Exposition
- Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 6 neu befruchtete Embryonen (4 hpf) aus und übertragen Sie dann in jeden Brunnen einer 6-Well-Platte, die 5 ml Mikroplastiklösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen enthält. Schließen Sie die Kontrollgruppen ein, die die Hank-Lösung von 10 % enthalten.
- Verwenden Sie dreifache Brunnen (mit insgesamt 18 Embryonen) für jede Behandlung.
- Inkubieren Sie die Embryonen unter dem gleichen Licht: dunkler Zyklus und Temperatur wie Erwachsene (siehe 1.2) und beobachten Sie alle 12 Stunden. Entfernen Sie die Toten sofort.
- Erneuern Sie die Mikroplastiklösungen um 90% alle 24 h. Während der Expositionsphase werden die Fische nicht gefüttert.
HINWEIS: Im Allgemeinen beginnt das Schlüpfen des Embryos bei 48 hpf und endet bei etwa 72 hpf.
4. Bewertung der Mikroplastikverteilung
- Wählen Sie nach der Befruchtung nach 24, 48, 72, 96 und 120 h nach der Befruchtung nach dem Zufallsprinzip die Embryonen/Larven (eine von jeder der drei Repliken) aus und spülen Sie mit 10% Hanks Lösung aus.
- Die Larven in eine Petrischale geben und 0,016% Tricain zur Anästhesie aussetzen.
- Bereiten Sie die Stammlösung von Tricain vor: 4 mg Tricainpulver werden in 100 ml doppelt destilliertem Wasser gelöst und den pH-Wert mit Tris-HCl (pH 9.0) auf 7,0 eingestellt. Bewahren Sie die Lagerlösung im Gefrierschrank auf.
- Bereiten Sie die Arbeitslösung vor. Verdünnen Sie die Stammlösung auf die gewünschte Konzentration (0,016%) mit 10% Hank-Lösung bei Raumtemperatur14.
- Die Embryonen/Larven anordnen und auf die Beobachtung vorbereiten.
- Beobachten Sie die Fische mit einem Fluoreszenzmikroskop und Bild mit Bildgebungssoftware.
- Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität bei Fischen mit ImageJ.
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Representative Results
Die Verteilung und Akkumulation fluoreszierender Mikroplastikisten ist in Abbildung 1 und Tabelle 1dargestellt. In der nicht exponierten Gruppe (Kontrolle) wird keine sichtbare Fluoreszenz beobachtet. Nach der Exposition gegenüber unterschiedlichen Konzentrationen von Mikroplastik (24 hpf) findet sich jedoch eine Ansammlung von Fluoreszenz, die die Chorion umgibt. Grüne Fluoreszenz wird auch in Larven nachgewiesen, und die Fluoreszenzspiegel scheinen in einer konzentrations- und zeitabhängigen Weise zu zunehmen. Der Dottersack, Perikard und Magen-Darm-Trakt sind die wichtigsten angesammelten Stellen von Mikroplastik (Abbildung 2).
Abbildung 1: Verteilung von fluoreszierenden Polystyrol-Mikroplastiken in Embryonen/Larven von Zebrafischen (40×). Die Fische werden aus der Kontrollgruppe entnommen, oder die Gruppen, die 500-nm-Mikroplastik bei 0,1, 1 und 10 mg/L ausgesetzt sind. Scale bar 100 'm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Standorte der Mikroplastikansammlung bei Zebrafischlarven (40×). Diese Larve wird von der Gruppe, die 500-nm Mikroplastik bei 10 mg/L für 120 Stunden ausgesetzt ist, abgetastet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Konzentration | Embryo | Larve | ||||
| (mg/L) | 24 hpf | 48 hpf a | 48 hpf b | 72 hpf | 96 hpf | 120 hpf |
| Cont. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3,0±0,2 | 2,6±0,7 | 3,3±0,3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5,0±0,1 | 5.3 | 7,5±0,5 | 8,7±0,5 | 10,0±1,9 |
| 0.1 | 7,0±0,9 | 26,1±2,9 | 8.9 | 18,4±0,7 | 16,3±2,8 | 25,7±2,7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82,3±5,3 | 30.4 | 32,7±3,2 | 41,6±0,4 | 44,1±0,9 |
| a: es wurden nur zwei Embryonen bewertet; b: Es wurde nur eine Larve bewertet. | ||||||
Tabelle 1: Die Veränderung des Fluoreszenzspiegels bei Zebrafischen nach Exposition gegenüber fluoreszierenden Mikroplastiken (n=3). Aufgrund des Einflusses der Chorion auf die Absorption fluoreszierender Mikroplastike werden die Daten in zwei Teile unterteilt, die der Embryonen (vor dem Schlüpfen) und larven (nach dem Schlüpfen).
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Discussion
Gemäß der Richtlinie über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, wie der EU-Richtlinie 2010/63/EU, ist die Tierethik-Genehmigung für ein Experiment mit frühen Lebensstadien von Zebrafischen erst in der Phase der unabhängigen Fütterung (5 Tage nach der Befruchtung)vorgeschrieben 17. Für die Optimierung der Verwendung von Zebrafischen ist jedoch eine bewährte Tierschutzpraxis wichtig, und beispielsweise sollten die humanen Methoden der Anästhesie und Der Euthanasie von Belang sein. Ethyl-3-Aminobenzoat-Methansulfat (MS-222, oder Tricain), das routinemäßig verwendete Mittel in den meisten Laboratorien, wird hier für Anästhesie und Euthanasie eingesetzt.
Vor der Beobachtung unter dem Mikroskop sollten die Embryonen und Larven vorgerinnen, da die auf der Außenoberfläche adsorbierten Mikroplastiken die Ergebnisse stören könnten. Darüber hinaus könnte die Autofluoreszenz in den Embryonen/Larven, insbesondere um den Gelbsack, die gelegentlich berichtet wurde, problematisch sein. Das Vorhandensein vieler Biomakromoleküle, wie Flavinen, Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD), aromatische Aminosäuren, Lipofuscine, fortgeschrittene Glykationsendprodukte und Collage, wird Licht aussenden, wenn es bei der entsprechenden Wellenlänge angeregt wird.
Es ist wichtig zu beachten, dass als Partikelschadstoff die Größe von Mikroplastik als einer der bestimmenden Faktoren der Bioverfügbarkeit und Toxizität18angesehen wird. Der hier verwendete Nenndurchmesser des Mikroplastiks beträgt 500 nm, was der Porengröße der Embryo-Chorion (im Bereich von 300 nm bis 1 m)19entspricht. Daher ist nicht zu erwarten, dass diese Mikroplastik leicht durch den Zebrafischchor passieren. Konsequenterweise ist in den Embryonen vor dem Schlüpfen nur wenig Fluoreszenz sichtbar (Abbildung 1). Da die Chorion als wirksame Barriere gegen die Partikel mit großer Größe wirkt, kann der Dechorionierungsprozess vor der Exposition erforderlich sein. Chorion kann leicht mit den Zangen entfernt werden, aber enzymatische Dechorionation mit Pronase wird bevorzugt, wenn die Embryonen in loser Schüttung behandelt werden. Obwohl die Dechorionation die Bioverfügbarkeit erhöhen und das Hochdurchsatz-Screening auf die Toxizität von Stoffen erleichtern wird, wird der Embryo mit intaktem Chorion eher empfohlen, um die Ökotoxizität von Schadstoffen zu bewerten, wenn man den Expositionszustand in der "realen" Welt berücksichtigt.
Obwohl beträchtliche Anstrengungen unternommen wurden, um die nachteiligen Auswirkungen von Mikroplastik auf Fische zu untersuchen, sind die derzeitigen Erkenntnisse, einschließlich der Bioakkumulation, nach wie vor begrenzt oder sogar widersprüchlich. Diese in der Studie untersuchten Inkonsistenzen werden hauptsächlich auf die Unterschiede der Eigenschaften von Partikeln zurückgeführt, einschließlich Größe, Dichte und Oberflächeneigenschaften (z. B. Oberflächenladung). Das Verhalten von Mikroplastik in der Lösung ist auch für die Bioverfügbarkeit entscheidend. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Mikroplastik sollten über die Expositionsdauer nachverfolgt werden, und das Aggregationsphänomen, das auftreten kann, sollte aufgezeichnet werden. Für die Expositionen, bei denen die Mikroplastik über einen längeren Zeitraum ausgesetzt werden muss, wird eine Beschallung oder ein Rühren mit einem Magnetbalken empfohlen.
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Disclosures
Der Autor erklärt keine konkurrierenden oder finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (21777145, 22076170) und dem Programm für Changjiang-Stipendiaten und innovatives Forschungsteam in der Universität (IRT_17R97) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
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