Summary
Zebrafiskfostre/larver udvikler sig eksternt og er optisk gennemsigtige. Bioakkumulering af mikroplast i fisk i de tidlige livsstadier vurderes let med fluorescerende mærkede mikroperler.
Abstract
Som en ny type miljøforurenende stoffer er mikroplast i vid udstrækning blevet fundet i vandmiljøet og udgør en høj trussel mod vandorganismer. Bioakkumulering af mikroplast spiller en central rolle i deres toksiske virkninger; Som partikel er deres bioakkumulationer imidlertid forskellige fra mange andre forurenende stoffer. Beskrevet her er en mulig metode til visuelt at bestemme akkumulering og distribution af mikroplast i zebrafisk embryoner eller larver ved hjælp af fluorescerende mikroplast. Embryoner udsættes for forskellige koncentrationer (0,1, 1 og 10 mg/l) fluorescerende mikroplast med en diameter på 500 nm i 120 timer. Det fremgår af resultaterne, at mikroplast kan bioakkumulere i zebrafiskembryoner/larver på en koncentrationsafhængig måde. Før udklækning findes stærk fluorescens omkring den embryonale chorion; mens der i zebrafisk larver, æggeblomme sæk, pericardium, og mave-tarmkanalen er de vigtigste akkumulerede steder af mikroplast. Resultaterne viser optagelse og internalisering af mikroplast i zebrafisk i tidlige livsstadier, hvilket vil danne grundlag for en bedre forståelse af mikroplastens indvirkning på vanddyr.
Introduction
Siden første syntetiseret i 1900-tallet, plast er meget udbredt på forskellige områder, hvilket resulterer i hurtig vækst i den globale produktion1. I 2018 blev der produceret ca. 360 millioner tons plast på verdensplan2. Plasten i det naturlige miljø nedbrydes til fine partikler på grund af kemiske, fysiske eller biologiske processer3. Generelt defineres fine plastpartikler <5 mm i størrelse som mikroplast4. Mikroplast er også udviklet til specifikke anvendelser, såsom mikroperler fra kosmetiske produkter5. Som næsten permanente forurenende stoffer akkumuleres mikroplast i miljøet og har tiltrukket sig stigende opmærksomhed fra forskere, politikere og offentligheden1,6. Tidligere undersøgelser dokumenterede, at mikroplast kan forårsage skadelige virkninger hos fisk, såsom gastrointestinale skader7, neurotoksicitet8, hormonforstyrrelser9, oxidativ stress10 og DNA-skade11. Mikroplastens toksicitet er imidlertid endnu ikke blevet fuldt afsløret12,13.
Zebrafiskembryoner tilbyder mange eksperimentelle fordele, herunder lille størrelse, ekstern befrugtning, optisk gennemsigtighed og store koblinger, og betragtes som en ideel modelorganisme til in vivo, der studerer virkningerne af forurenende stoffer på fisk i tidlige livsstadier. Desuden er der kun behov for begrænsede mængder teststoffer til vurdering af biologiske reaktioner. Her udsættes zebrafiskembryoner for forskellige koncentrationer af mikroplast (0,1, 1, 10 mg/l) i 5 dage, og bioakkumulation og distribution af mikroplast i zebrafiskembryoner/larver evalueres. Dette resultat vil fremme vores forståelse af toksiciteten af mikroplast til fisk, og den metode, der er beskrevet her, kan potentielt generaliseres for at bestemme akkumulering og distribution af andre typer fluorescerende materialer i de tidlige livsstadier af zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksne zebrafisk stammer fra China Zebrafish Resource Center (Wuhan, Kina). Forsøgene blev udført i overensstemmelse med den nationale vejledning "Laboratoriedyrsretningslinje for etisk gennemgang af dyrevelfærd (GB/T35892-2018).
1. Indsamling af embryoner
- Fisk i 20 L-glastanke med recirkulfiltreret trækvandssystem (pH 7,0 ± 0,2) ved en konstant temperatur (28 ± 0,5 °C) på en fotoperiode på 14:10 h lys: mørk.
- Foder fisk to gange dagligt med Artemia nauplii. Det anbefales, at maden gives ved max. 3% fiskevægt om dagen og skal spises inden for 5 minutter hver gang14.
- Overfør veludviklet voksen zebrafisk (med kropslængde på 3-4 cm) i gydetanken i et forhold på en mand til to kvinder natten før avlen.
BEMÆRK: Den følgende morgen begynder fisken at gyde efter starten af lyscyklussen. - Saml æg ved hjælp af en Pasteur pipette. Skyl med 10% Hanks opløsning flere gange, og kontroller derefter for befrugtning ved hjælp af et mikroskop. Befrugtede æg gennemgår kavalergangsperioden efter ca. 2 timers efter befrugtning (hpf) og kan tydeligt identificeres15.
- De befrugtede embryoner inkuberes i et 500 ml bægerglas, der indeholder 200 ml 10% Hanks opløsning med 1% methylenblåt til desinfektion ved 28 °C. Må ikke overstige en belastningshastighed på 1 embryo/2 ml opløsning.
BEMÆRK: 10% Hanks løsning består af 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4 og 4,2 mM NaHCO3.
2. Udarbejdelse af mikroplast suspensioner
- Beholdningsopløsningen af grønne fluorescerende mærkede polystyrenperler (10 mg/mL) med en nominel diameter på 500 nm (excitation/emission: 460/500 nm) i 10 minutter.
- Stamopløsningen fortyndes med 10% Hanks opløsning for at producere de ønskede eksponeringsopløsninger (0,1, 1 og 10 mg/L).
- Forbered altid eksponeringsopløsningerne af mikroplast før eksponering.
BEMÆRK: Ved vurderingen af mikroplasts toksiske virkninger bør der udvises forsigtighed, da tilstedeværelsen af konserveringsmidler, såsom natriumazid, i de kommercielle partikelformuleringer kan være giftig for forskellige organismer 16. Derfor bør disse tilsætningsstoffer fjernes eller redegøres for i kontrollerne, inden der udføres toksicitetsforsøg.
3. Mikroplasteksponering
- Vælg tilfældigt 6 nybefrugtede embryoner (4 hkf), og overfør derefter til hver brønd af 6-brønds plade, der indeholder 5 mL mikroplastopløsninger med forskellige koncentrationer. Medtag de kontrolgrupper, der indeholder 10% Hanks løsning.
- Brug tre eksemplarer brønde (med i alt 18 embryoner) for hver behandling.
- Embryonerne inkuberes under samme lys: mørk cyklus og temperatur som voksne (se 1.2) og observeres hver 12. time. Fjern de døde med det samme.
- Forny de mikroplastiske løsninger 90% hver 24. time. I eksponeringsperioden fodres fisken ikke.
BEMÆRK: Generelt begynder udklækningen af embryoet ved 48 hkf og afsluttes ved ca. 72 hkf.
4. Vurdering af mikroplastdistribution
- Ved 24, 48, 72, 96 og 120 timer efter befrugtning skal du tilfældigt vælge embryonerne / larverne (en fra hver af de tre replikater) og skylle med 10% Hanks opløsning.
- Overfør larverne til en petriskål og udsættes for 0,016% trikain til anæstesi.
- Forbered stamopløsningen af tricain: 4 mg tricainpulver opløses i 100 ml dobbeltdestilleret vand, og pH justeres til 7,0 med Tris-HCl (pH 9,0). Opbevar lageropløsningen i fryseren.
- Forbered arbejdsløsningen. Stamopløsningen fortyndes til den ønskede koncentration (0,016 %) med 10% Hanks opløsning ved stuetemperatur14.
- Arranger embryonerne/larverne og forbered dig på observation.
- Overhold fisken med et fluorescensmikroskop og billede med billedsoftware.
- Quantify fluorescens intensiteten i fisk med ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fordelingen og akkumuleringen af fluorescerende mikroplast er vist i figur 1 og tabel 1. Der observeres ingen synlig fluorescens i den ueksponerede gruppe (kontrol). Der findes imidlertid en ophobning af fluorescens omkring chorion efter eksponering for forskellige koncentrationer af mikroplast (24 hkf). Grøn fluorescens påvises også hos larver, og fluorescensniveauerne ser ud til at stige på en koncentrations- og tidsafhængig måde. Æggeblommesækken, pericardium og mave-tarmkanalen er de vigtigste akkumulerede steder for mikroplast (Figur 2).
Figur 1: Fordeling af fluorescerende mikroplast af polystyren i embryoner/larver af zebrafisk (40×). Der udtages prøver af fiskene fra kontrolgruppen, eller de grupper, der udsættes for 500-nm mikroplast ved 0,1, 1 og 10 mg/L. Skalastang 100 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Steder for mikroplastakkumulering i zebrafisklarver (40×). Der udtages prøver af larven fra gruppen, der udsættes for 500-nm mikroplast ved 10 mg/l i 120 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.
| koncentration | embryo | larve | ||||
| (mg/L) | 24 hkf | 48 hkf a | 48 hkf b | 72 hkf | 96 hkf | 120 hkf |
| Fortsat. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7.5±0.5 | 8.7±0.5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25,7 ±2,7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82.3±5.3 | 30.4 | 32,7 ±3,2 | 41,6±0,4 | 44.1±0.9 |
| a: kun to embryoner blev vurderet; b: Kun én larve blev vurderet. | ||||||
Tabel 1: Ændring af fluorescensniveauet hos zebrafisk efter eksponering for fluorescerende mikroplast (n=3). På grund af chorions indflydelse på absorptionen af fluorescerende mikroplast er dataene opdelt i to dele, embryoernes (før udklækning) og larver (efter udklækning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I henhold til retningslinjen om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål, såsom EU-direktiv 2010/63/EU, er tilladelse til dyreetik ikke obligatorisk for et forsøg med tidlige livsstadier for zebrafisk, før det stadium, hvor de kan fodres uafhængigt (5 dage efter befrugtningen)17. Bedste velfærdspraksis er imidlertid vigtig for at optimere brugen af zebrafisk, og f.eks. Ethyl 3-aminobenzoat metansulfat (MS-222, eller tricain), den rutinemæssigt anvendte agent i de fleste laboratorier, er ansat her for anæstesi og aktiv dødshjælp.
Før observation under mikroskopet skal embryoner og larver skylles, da mikroplast adsorberet på den udvendige overflade kan forstyrre resultaterne. Desuden kan autofluorescensen i embryonerne/larverne, især omkring æggeblommesækken, som er blevet rapporteret lejlighedsvis, være problematisk. Tilstedeværelsen af mange biomacromolecules, såsom flavins, nicotinamide-adenin dinukleotid (NAD), aromatiske aminosyrer, lipofusciner, avancerede glykering slutprodukter, og collage, vil udsende lys, når ophidset på passende bølgelængde.
Det er vigtigt at bemærke, at som partikelforurenende stoffer betragtes størrelsen af mikroplast som en af de afgørende faktorer for biotilgængelighed ogtoksicitet 18. Den nominelle diameter af mikroplast, der anvendes her, er 500 nm, hvilket er sammenlignet med porestørrelsen af embryokorrionen (inden for området 300 nm til 1 μm)19. Derfor forventes disse mikroplast ikke let at passere gennem zebrafisk chorion. Konsekvent er der kun lidt fluorescens synlig i embryonerne før udklækning (Figur 1). Da chorion vil fungere som en effektiv barriere mod partikler med stor størrelse, dechorionation proces før eksponering kan være nødvendig. Chorion kan fjernes nemt ved hjælp af pincet, men enzymatisk dechorionation med pronase foretrækkes, når embryonerne håndteres i løs vægt. Men selv om dechorionation vil øge biotilgængeligheden og lette screeningen med høj gennemstrømning for stoffers toksicitet, anbefales embryoet med chorion intakt at vurdere de forurenende stoffers økotoksicitet, når man overvejer eksponeringstilstanden i den "virkelige" verden.
Selv om der er gjort en betydelig indsats for at undersøge mikroplastens skadelige virkninger på fisk, er den nuværende viden, herunder bioakkumulering, fortsat begrænset eller endog modstridende. Disse inkonsekvenser på tværs af undersøgelser tilskrives hovedsageligt forskellene i partiklers egenskaber, herunder størrelse, massefylde og overfladeegenskaber (f.eks. overfladeladning). Mikroplastens opførsel i opløsningen er også afgørende for biotilgængeligheden. Mikroplastens fysiskkemiske egenskaber bør spores i løbet af eksponeringsvarigheden, og det aggregeringsfænomen, der kan forekomme, skal registreres. Faktisk anbefales det for de eksponeringer, der kræver, at mikroplasten skal suspenderes i en længere periode, sonikering eller omrøring med en magnetisk bar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer ingen konkurrerende eller finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (21777145, 22076170), og Programmet for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University (IRT_17R97).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
- SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , SAPEA. Berlin. (2019).
- Plastics Europe. Plastics-the facts 2019. , Plastics Europe. Brussels. (2019).
- Andrady, A. L. Microplastics in the marine environment. Marine Pollution Bulletin. 62, 1596-1605 (2011).
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris. National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).
- Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R. Microplastic in aquatic ecosystems. Angewandte Chemie International Edition. 56, 1720-1739 (2017).
- Lu, T., et al. Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria. Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).
- Huang, J. N., et al. Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata). Science of the Total Environment. 733, 138929 (2020).
- Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics. Particle and Fibre Toxicology. 17, 24 (2020).
- Jakubowska, M., et al. Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta. Science of the Total Environment. 740, 139922 (2020).
- Qiang, L., Cheng, J. Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 263, 128161 (2021).
- Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics. Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).
- Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences. Environmental Pollution. 261, 114089 (2020).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations. Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).
- Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research. Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).
- Pitt, J. A., et al. Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).
- Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, 1608-1618 (2013).
