Generazione di equivalenti di pelle umana vascolarizzata auto-assemblati

Summary

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere la generazione e l'analisi volumetrica di equivalenti cutanei umani vascolarizzati utilizzando tecniche accessibili e semplici per la coltura a lungo termine. Per quanto possibile, viene descritta la logica dei passaggi per consentire ai ricercatori la possibilità di personalizzare in base alle loro esigenze di ricerca.

Abstract

Gli equivalenti della pelle umana (HSE) sono costrutti ingegnerizzati dai tessuti che modellano componenti epidermici e dermici della pelle umana. Questi modelli sono stati utilizzati per studiare lo sviluppo della pelle, la guarigione delle ferite e le tecniche di innesto. Molte HSE continuano a mancare di vascucolatura e vengono inoltre analizzate attraverso sezioni istologiche post-coltura che limita la valutazione volumetrica della struttura. Presentato qui è un protocollo semplice che utilizza materiali accessibili per generare equivalenti di pelle umana vascolarizzati (VHSE); sono descritte più avanti le tecniche di imaging volumetrico e quantificazione di questi costrutti. In breve, i VHSE sono costruiti in 12 inserti di coltura del pozzo in cui le cellule dermiche ed epidermiche vengono seminate nel gel collagene di tipo I della coda del ratto. Il compartimento dermico è costituito da fibroblasti e cellule endoteliali disperse in gel di collagene. Il compartimento epidermico è costituito da cheratinociti (cellule epiteliali della pelle) che si differenziano all'interfaccia aria-liquido. È importante sottolineare che questi metodi sono personalizzabili in base alle esigenze del ricercatore, con risultati che dimostrano la generazione di VHSE con due diversi tipi di cellule fibroblatrici: fibroblasti dermici umani (hDF) e fibroblasti polmonari umani (IMR90). I VHSE sono stati sviluppati, immagini attraverso microscopia confocale e analizzati volumetricamente utilizzando software computazionale a punti di tempo di 4 e 8 settimane. Viene descritto un processo ottimizzato per correggere, macchiare, immagine e VHSE chiari per l'esame volumetrico. Questo modello completo, l'imaging e le tecniche di analisi sono facilmente personalizzabili in base alle specifiche esigenze di ricerca dei singoli laboratori con o senza precedente esperienza HSE.

Introduction

La pelle umana svolge molte funzioni biologiche essenziali tra cui agire come barriera immunitaria / meccanica, regolare la temperatura corporea, partecipare alla ritenzione idrica e ai ruoli^{sensoriali 1,2,3,4}. Anatomicamente, la pelle è l'organo più grande del corpo umano ed è composta da tre strati principali (epidermide, derma e ipodermide) e possiede un complesso sistema di componenti del sistema stromale, vascolare, ghiandolare e immunitario / nervoso oltre alle cellule epidermiche. L'epidermide stessa è composta da quattro strati di cellule che vengono continuamente rinnovati per mantenere la funzione barriera e altre strutture della pelle nativa (cioè sudore e ghiandole sebacee, unghie)³. La fisiologia della pelle è importante nella funzione immunitaria, nella guarigione delle ferite, nella biologia del cancro e in altri campi, portando i ricercatori a utilizzare una vasta gamma di modelli, dalle monocolture in vitro ai modelli animali in vivo. I modelli animali offrono la capacità di studiare la piena complessità della fisiologia della pelle, tuttavia, i modelli animali comunemente usati come i topi hanno differenze fisiologiche significative rispetto all'uomo⁵. Queste limitazioni, e l'aumento del costo dei modelli animali, hanno portato molti ricercatori a concentrarsi sullo sviluppo di modelli in vitro che riflettano più da vicino la^{fisiologia della pelle umana 1,6}. Di questi, uno dei tipi di modello più semplici è l'equivalente epidermico umano (HEE; noto anche come modelli cutanei a mezzo spessore) che sono composti solo da cheratinociti epidermico su una matrice dermica acellulare, ma catturano la differenziazione epidermica e la stratificazione osservate in vivo. Sulla base di ciò, i modelli contenenti componenti dermici ed epidermici (cheratinociti e fibroblasti) sono spesso indicati come equivalenti della pelle umana (HSE), modelli di pelle a pieno spessore o costrutti organotipici della pelle (OSC). In breve, questi modelli sono generati incapsulando le cellule dermiche all'interno di matrici di gel e seminando cellule epidermiche in cima. La differenziazione epidermica e la stratificazione possono quindi essere ottenute attraverso mezzi specializzati e l'esposizione^{all'aria 7}. Gli equivalenti cutanei sono stati più spesso generati attraverso tecniche di auto-assemblaggio utilizzando gel dermici fatti di collagene di tipo I (sia di coda di ratto che di origine bovina)^1,8, ma modelli simili hanno incorporato altri componenti della matrice come la fibrina^9,10, fibroblasto derivato^{1 1,12}, membrane cadaveriche de-epidermizzate^13,14,15,16,gel disponibili in commercio e altri^{1,12,13,17,18,19}. Attualmente, ci sono equivalenti di pelle disponibili in commercio (come precedentemente^{rivisto 1,2}). Tuttavia, questi sono principalmente sviluppati a scopo terapeutico e non possono essere facilmente personalizzati per specifiche domande di ricerca.

Gli HSE sono stati applicati in studi sulla guarigione delle ferite, l'innesto, la tossicologia e la malattia/sviluppo della pelle^{11,12,13,16,8,20,21,22,23}. Sebbene la coltura 3D modelli in modo più completo le funzioni del tessuto umano rispetto alle^{colture 2D 24}, l'inclusione di diversi tipi di cellule che riflettono più accuratamente la popolazione in vivo consente studi sulla coordinazione cellulare-cellulare in tessuti^{complessi 24,25,26}. La maggior parte degli HSE include solo fibroblasti dermici e cheratinociti epidermico²⁷, sebbene l'ambiente cutaneo in vivo includa molti altri tipi di cellule. Recenti studi hanno iniziato a includere più popolazioni cellulari; queste includono cellule endoteliali in vascucolatura^{10,28,29,30,31,32,33,34}, adipociti nel tessuto sub-cutaneo^35,36,componenti^{nervosi 19,21}, cellule staminali^27,37,38, cellule^{immunitarie 10,39,40,41,42}e altri modelli specifici di malattia/cancro^{16,40,43,44,45,46,47}. Particolarmente importante tra questi è la vascucolatura; mentre alcuni HSE includono cellule vascolari, nel complesso mancano ancora elementi capillari completi con connettività su tutto il derma^{10,29 ,}stabilità estesa in vitro²⁸e densità del vaso appropriata. Inoltre, i modelli HSE sono tipicamente valutati attraverso sezioni istologiche post-coltura che limita l'analisi della struttura tridimensionale degli HSE. L'analisi tridimensionale consente la valutazione volumetrica della densità^{vascolare 48,49, nonché} la variazione regionale dello spessore epidermico e della differenziazione.

Sebbene gli HSE siano uno dei modelli organotipiche più comuni, ci sono molte sfide tecniche nel generare questi costrutti tra cui l'identificazione di una matrice extracellulare appropriata e densità cellulari, ricette multimediali, procedure adeguate di interfaccia liquido dell'aria e analisi post-coltura. Inoltre, mentre i modelli HEE e HSE hanno pubblicato protocolli, non esiste un protocollo dettagliato che incorpora vascucolatura dermica e imaging volumetrico piuttosto che analisi istologiche. Questo lavoro presenta un protocollo accessibile per la coltura di equivalenti di pelle umana vascolarizzati (VHSE) provenienti principalmente da linee cellulari commerciali. Questo protocollo è scritto per essere facilmente personalizzabile, consentendo un adattamento diretto a diversi tipi di cellule ed esigenze di ricerca. Nell'interesse dell'accessibilità, della disponibilità e dei costi, l'uso di prodotti semplici e tecniche di generazione è stato prioritario rispetto all'uso di prodotti disponibili in commercio. Vengono inoltre descritti semplici metodi di imaging volumetrico e quantificazione che consentono di valutare la struttura tridimensionale del VHSE. La traduzione di questa procedura in un protocollo robusto e accessibile consente ai ricercatori non specializzati di applicare questi importanti modelli in medicina personalizzata, ingegneria tissutale vascolarizzata, sviluppo di innesti e valutazione dei farmaci.

Protocol

1. Preparazione alla cultura 3D

1. Preparare lo stock di collagene della coda di ratto a 8 mg/mL, utilizzando^{i protocolli stabiliti 50,51,52}. In alternativa, il collagene della coda di ratto può essere acquistato dai venditori (vedi elenco dei materiali) a concentrazioni appropriate.
   NOTA: Il collagene può essere preparato o acquistato a diverse concentrazioni nell'intervallo di 3-10 mg/mL, o superiore^{a 50,51,52}. I calcoli nel protocollo presuppongono una concentrazione di 8 mg/mL ma possono essere regolati in base alle esigenze del ricercatore.
2. Espandere le linee cellulari: Le cellule endoteliali e fibroblatrici devono essere pronte per la semina all'inizio della generazione di componenti dermici di collagene 3D (fase 2). I cheratinociti devono essere pronti il giorno 7 della cultura 3D. Un costrutto VHSE completo richiede 7,5 x 10⁵ cellule endoteliali; 7,5 x 10⁴ fibroblasti; e 1,7 x 10⁵ cheratinociti per la generazione(tabella 1).
   NOTA: Queste densità sono appropriate per inserti di coltura tissutale permeabili di dimensioni 12 o equivalenti. La densità e il formato delle cellule possono essere scalati verso l'alto o verso il basso in base alle esigenze del ricercatore. Per chiarire, questa quantità di cellule endoteliali e fibroblatrici selencherà 1-3 componenti dermici, mentre ogni componente epidermico richiede 1,7 x 10⁵ cheratinociti.
3. Eseguire tutta la centrifugazione delle celle in questo protocollo per 5 minuti a 300 x g, ma questa potrebbe essere ridotta per tipi di cellule più fragili.

2. Generazione di componenti dermici di collagene 3D

NOTA: il passaggio 2 è una procedura sensibile al tempo e deve essere completato in un'unica impostazione. Si consiglia di completare un controllo di qualità dello stock di collagene per garantire una corretta gelazione e omogeneità prima di iniziare la semina dei componenti dermici, vedere la risoluzione dei problemi nella discussione.

1. Preparazione e semina dello strato di collagene acellulare
   1. Preparare due tubi a microcentrifugo con punta da 1,7 ml, uno per il supporto cellulare e uno per il derma cellulare. Le quantità fornite in questo passaggio prepareranno 1 mL di collagene da 3 mg/mL (concentrazione di collagene bersaglio), sufficiente per (3) VHSE di dimensioni 12. Le equazioni sono elencate se è necessaria la regolazione. Sia il volume che la densità possono essere scalati in base alle esigenze del ricercatore (i numeri di riferimento comuni sono riportati nella tabella 2).
   2. Ad ogni tubo, aggiungere 100 μL di coltura di grado 10x salina tamponata da fosfati (PBS) (un tubo produrrà 3 VHSE) e aggiungere 8,6 μL di 1 N NaOH. Posizionare tubi limitati sul ghiaccio bagnato per raffreddare per almeno 10 minuti.
      C_s = Concentrazione dello stock di collagene
      V_f = Volume finale di collagene necessario
      C_{t =} Concentrazione target di collagene
      V_s = Volume di collagene di serie necessario per la quantità desiderata (V_f)
      V_pbs = Volume di 10X PBS necessario per la concentrazione target di collagene (C_t)
      V_NaOH = Volume di 1N NaOH necessario per C_{t
      Supporti} V = Volume di supporti, sospensione delle chiamate o ddH2O necessari per C_t
      
      
      
      
   3. Preparare pipette a spostamento positivo da 1000 e 250 μL per l'uso e mettere da parte. Poiché i passaggi successivi sono sensibili al tempo, è conveniente caricare le punte delle pipette e impostare i volumi (rispettivamente 375 μL e 125 μL). Inoltre, impostare una normale pipetta da 1000 μL per 516 μL.
      NOTA: Le pipette a spostamento positivo possono essere sostituite con pipette normali se necessario, ma a causa dell'elevata viscosità del collagene e della sensibilità tempo / temperatura di questa procedura, si raccomandano pipette a spostamento positivo per aiutare a produrre risultati di semina coerenti. Se si utilizzano pipette normali, utilizzare movimenti lenti.
   4. Preparare la coltura inserire piastre di pozzo: utilizzare forcelle sterili per posizionare tre inserti di coltura di dimensioni di 12 po 'in una piastra sterile di coltura tissutale a 12 porsi, posizionare nelle colonne al centro.
   5. Impostare mezzi freddi appropriati per i tipi di fibroblasti e cellule endoteliali.
   6. Dopo il raffreddamento dei tubi con punta, posizionare un tubo (per il supporto cellulare) su un rack con il contenuto visibile. Lasciare l'altro tubo (per il derma cellulare) sul ghiaccio.
   7. Rimuovere 8 mg/mL di collagene dalla refrigerazione e posizionarsi sul ghiaccio umido.
      NOTA: Non utilizzare ghiaccio congelatore o refrigeratori da banco a -20 °C, in quanto ciò congelerà il collagene.
   8. Al tubo chiuso a freddo, aggiungere 516 μL di mezzi e aggiungere immediatamente 375 μL di collagene freddo utilizzando la pipetta a spostamento positivo da 1000 μL. Erogare collagene nella soluzione (non sul lato del tubo). Rimuovere immediatamente la punta della pipetta vuota e passare alla pipetta di spostamento positiva preparata da 250 μL per mescolare.
      1. Mescolare rapidamente ma delicatamente per evitare la formazione di bolle, non rimuovere la punta dalla soluzione, se possibile. Mescolare fino a quando la soluzione è di colore omogeneo, che in genere richiede circa 5 cicli di pipetta o 10 s (se si utilizzano mezzi con rosso fenolo, il colore diventerà più chiaro e uniforme). Durante la miscelazione, assicurarsi di disegnare da diverse posizioni del tubo (inferiore e superiore) per una miscelazione uniforme.
         NOTA: Questo può essere eseguito con 516 μL di acqua di grado di coltura cellulare o altro liquido di grado di coltura cellulare, tuttavia, il rosso fenolo della maggior parte dei mezzi è un buon indicatore della miscelazione. Utilizzare fibroblasti o mezzi endoteliali utilizzati per espansioni 2D.
   9. Disperdere immediatamente 125 μL di collagene acellulare sulla membrana di ciascuno dei tre inserti di coltura da 12 po '. Per garantire una copertura uniforme del gel di collagene acellulare, scuotere il piatto; se ciò non crea una copertura uniforme della membrana, utilizzare la punta della pipetta per dipingere essenzialmente la membrana diffondendo delicatamente il collagene intorno; evitare di applicare pressione sulla membrana. La gelazione inizia quasi immediatamente; eseguire rapidamente questo passaggio per garantire una copertura uniforme.
      NOTA: Ci sarà collagene acellulare in eccesso. Il volume può essere ridotto, tuttavia, preparare meno di 1 mL di sospensione del collagene può causare difficoltà a mescolare la soluzione e gelazione insufficiente.
   10. Spostare immediatamente la piastra da 12 pozze di pozzo in un incubatore di coltura cellulare a 37 °C per lasciarlo gelare per almeno 20 minuti (il collagene cellulare può gelare più a lungo se necessario; durante questo periodo di gelazione, procedere al passaggio 2.2). Rimuovere la sospensione di collagene dal ghiaccio e riposizionare nella refrigerazione (il collagene è più stabile a 4 °C).
2. Sospensione cellulare e preparazione semina
   NOTA: per la sequenza temporale delle impostazioni cultura di questo protocollo, questo corrisponde al giorno di immersione 1 (SD1)
   1. Durante la gelazione del supporto del collagene acellulare, tripinare e contare le linee cellulari endoteliali e fibroblatrici.
   2. Sospendere 7,5 x 10⁵ cellule endoteliali e 7,5 x 10⁴ fibroblasti in 258 μL dei rispettivi mezzi e combinare sospensioni cellulari per creare un'aliquota di 516 μL. Mantenere le sospensioni cellulari sul ghiaccio bagnato fino all'uso.
   3. Preparare pipette a spostamento positivo da 1000 e 250 μL per l'uso e mettere da parte. Poiché i passaggi successivi sono sensibili al tempo, è conveniente caricare le punte delle pipette e impostare i volumi (rispettivamente 375 μL e 250 μL). Inoltre, impostare una normale pipetta da 1000 μL per 516 μL.
3. Semina di collagene carica di cellule del compartimento dermico
   1. Dopo il periodo di gelazione, rimuovere la piastra di 12 pozza di collagene acellulare dall'incubatrice.
      NOTA: Se questo collagene non viene gelato dopo 30 minuti, non continuare la procedura in quanto probabilmente c'è stato un errore durante la semina o lo stock di collagene potrebbe avere un problema (vedi risoluzione dei problemi in discussione).
   2. Rimuovere il tubo chiuso da 1,7 ml dal ghiaccio umido (contiene 10x PBS e NaOH). Posizionare il tubo in un rack in modo che il contenuto sia visibile. Allentare/aprire tutti i tappi (sospensione cellulare, tubo chiuso a freddo).
   3. Rimuovere il collagene di serie (8 mg/mL) dalla refrigerazione a 4 °C e posizionarlo sul ghiaccio umido. Lascia il cappuccio aperto.
   4. Aggiungere i 516 μL di sospensione cellulare raffreddata al tubo chiuso a freddo. Utilizzare la pipetta di spostamento positivo da 1000 μL per pipettare immediatamente 375 μL di soluzione di collagene freddo direttamente nella soluzione del tubo chiuso.
   5. Espellere tutto il collagene dalla pipetta nel tubo e scartare la punta positiva della pipetta di spostamento. Passare immediatamente alla pipetta di spostamento positivo da 250 μL e mescolare la soluzione di collagene.
   6. Mescolare la soluzione di collagene come completato in precedenza (rapidamente ma delicatamente per prevenire la formazione di bolle), non rimuovere la punta dal gel, se possibile. Mescolare fino a quando la soluzione è omogenea (circa 5 cicli di pipetta o 10 s). Durante la miscelazione assicurarsi di disegnare da diverse posizioni del tubo (inferiore e superiore) per una miscelazione uniforme.
   7. Una volta miscelato, trasferire immediatamente 250 μL di soluzione di collagene cellulare sui supporti di collagene cellulare in ciascuno dei tre inserti di coltura da 12 porsi. Per garantire una copertura uniforme del supporto del collagene acellulare, scuotere il piatto e / o utilizzare la pipetta di spostamento positivo per spostare delicatamente il collagene cellulare appena seminato senza disturbare lo strato acellulare.
   8. Spostare immediatamente la piastra da 12 pozzi in un incubatore di coltura cellulare a 37 °C per lasciarlo gelare per almeno 30 minuti. Riposizionare il collagene nella refrigerazione a 4 °C dopo l'uso.
   9. Dopo il tempo gel di 30 minuti, inclinare delicatamente la piastra per valutare la gelazione. Assicurarsi che il collagene sia solidificato.
   10. Aggiungere 500 μL e 1000 μL di mezzi di miscelazione (mezzi di manutenzione metà endoteliale e metà fibroblasto) rispettivamente alla camera superiore e inferiore dell'inserto (prima in alto, poi in basso per evitare che la pressione idrostatica spinva il collagene verso l'alto). Aggiungere lentamente i supporti sul lato del pozzo, non direttamente sul gel di collagene, per ridurre al minimo l'interruzione del collagene.
       1. Assicurarsi che il gel di collagene sia sommerso, aggiungere più mezzi, se necessario. Posizionare la piastra del pozzo nell'incubatrice cellulare per l'incubazione notturna. In questa fase, i media contengono il 10% di FBS; il normale supporto di manutenzione per ogni riga di cella (sequenza temporale e schema indicati nella figura 1, A).
          NOTA: i supporti in tutte le impostazioni cultura VHSE possono essere adattati per tipi di cellule personalizzate; potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione.
4. Submersion Day 2 (SD2) modifica multimediale
   1. Cambiare il 10% dei supporti FBS nei pozzi VHSE al 5% di fbs mezzo fibroblasto, mezzo endoteliale integrato con acido L-Ascorbico da 100 μg/mL. Aggiungere 500 μL alla camera superiore dell'inserto di coltura sul lato del pozzo (ancora una volta, aggiungere con attenzione alla parete laterale per ridurre al minimo l'interruzione del collagene) e aggiungere 1000 μL alla camera inferiore.
   2. Rinnovare i supporti ogni 2 giorni (SD4 e SD6) fino al Submersion Day 7 (SD7).
   3. Utilizzare una pipetta manuale per rimuovere i supporti dai pozzi. L'uso di un aspiratore è possibile ma può causare danni o distruzione del costrutto.
      NOTA: L'acido L-ascorbico deve essere composto fresco ogni 2-3 giorni (si ossida in soluzione per produrre perossido di idrogeno in modo da indurre stress ossidativo ed eventualmente danni cellulari⁵³). Pertanto, i supporti devono essere cambiati ogni 2-3 giorni da SD2 fino alla fine della coltura VHSE poiché è presente acido L-ascorbico. È più facile fare uno stock di media e aggiungere una quantità preparata al momento di acido L-ascorbico a un'aliquota media ogni giorno di alimentazione. Utilizzare acqua o mezzi di coltura come solvente e preparare acido L-ascorbico fresco a 100 mg/mL. L'acido L-ascorbico stimola la sintesi del collagene da parte dei fibroblasti ad un ritmo appropriato e favorisce la stabilità del collagene^54,55,56; diminuisce inoltre la permeabilità endoteliale e mantiene l'integrità della parete^{del vaso 56,57} e contribuisce inoltre alla formazione di barriere epidermiche^6,58.

3. Semina di componenti epidermici e induzione di stratificazione

1. Giorno di immersione 7 (SD7): cheratinociti di semi
   NOTA: Cheratinociti di semi per stabilire l'epidermide su SD7. Questo punto di tempo può essere spostato in base alle esigenze del ricercatore. La durata della coltura di immersione senza cheratinociti non deve superare i 9 giorni, poiché una immersione più lunga spesso porta ad un aumento della contrazione dermica. Se la contrazione si verifica prima di SD7, si consiglia di ridurre il periodo di immersione a 5 giorni e l'epidermide del seme su SD5. Ottimizzare il periodo di immersione in base alle esigenze per esperimenti specifici (vedere la risoluzione dei problemi nella discussione).
   1. Cheratinociti di coltura (N/TERT-1^20,59 o altre cellule appropriate) al limite di confluenza prima della trippsinizzazione e del seeding sui VHSE. Per le cellule N/TERT-1, la confluenza non deve superare significativamente il 30% per evitare la differenziazione non voluta dei cheratinociti nella coltura 2D⁵⁹. Per altre linee cellulari appropriate, come i cheratinociti epidermici umani primari, viene generalmente utilizzato un limite di confluenza del 75-80%⁶⁰.
   2. Dopo la tripsinzizzazione, contare e sospendere 510.000 cellule in 600 μL di mezzi di differenziazione HSE (Human Skin Equivalent) integrati con FBS al 5%(Tabella 1).
      NOTA: 510.000 cellule in 600 μL consentono 170.000 cellule/costrutto durante la semina di 200 μL per costrutto (3 VHSE).
   3. Utilizzando una pipetta manuale, raccogliere e scartare bene i supporti attualmente nella camera inferiore e superiore per ogni costrutto. Assicurati di raccogliere più media possibile. Raccogliere i supporti che possono essere bloccati direttamente sotto la membrana permeabile posizionando delicatamente la punta della pipetta sotto la membrana dell'inserto di coltura e facendo cadere temporaneamente l'inserto fuori posto. I supporti potrebbero essere rimasti bloccati a causa della tensione superficiale. Assicurarsi che gli inserti si siedano piatti nei loro pozzi prima di procedere. L'uso di un aspiratore è possibile ma può causare danni o distruzione del costrutto.
   4. Aggiungere 1 mL di supporti HSE integrati con FBS al 5% alla camera inferiore di ogni pozzo. Quindi aggiungere 200 μL di sospensione cellulare alla camera superiore di ogni pozzo. Semina direttamente sulla superficie del costrutto dermico. Lascia cheratinociti si accontenti di 2 ore nell'incubatrice.
   5. Due ore dopo la semina dei cheratinociti, aggiungere con cura 300 μL di supporti HSE integrati con FBS al 5% di FBS alla camera superiore di ogni costrutto bene; pipettare lentamente i supporti sul lato dell'inserto di coltura. Caricare i supporti nella camera superiore con molta attenzione per non disturbare i cheratinociti sistemati che potrebbero non aver ancora aderito strettamente al gel di collagene sottostante.
   6. Dopo aver caricato il supporto, posizionare di nuovo il costrutto nell'incubatore.
2. Giorno di immersione 8/9 (SD8 o SD9)
   1. Make up mezzi HSE integrati con acido L-ascorbico 1% FBS e 100 μg/mL.
   2. Rimuovere i supporti sia dalle camere superiore che da quello inferiore con un pipettor manuale.
   3. Aggiungere prima 500 μL nella camera superiore e poi 1 mL nella camera inferiore. (Questo passaggio può essere fatto su SD8 o SD9)
3. Giorno di immersione 9/10 (SD9 o SD10, questo dovrebbe essere il giorno dopo il passaggio 3.2)
   1. Crea mezzi di differenziazione HSE senza siero con acido L-ascorbico da 100 μg/mL.
   2. Rimuovere i supporti sia dalle camere superiore che da quello inferiore con un pipettor manuale.
   3. Caricare 500 μL nella camera superiore e 1 mL nella camera inferiore.
4. Interfaccia aria-liquido Giorno 1 (ALI1)
   NOTA: ALI viene eseguita il giorno dopo il passaggio 3.3.
   1. Sollevare ogni costrutto all'interfaccia aria-liquido (ALI) rimuovendo i rifiuti multimediali solo dalla camera superiore. Utilizzare una pipetta manuale per avvicinarsi il più possibile allo strato epidermico senza toccarlo o danneggiarlo.
   2. Inclinare leggermente la piastra a diverse angolazioni per raccogliere il supporto. Rimuovere il più possibile i supporti in questo passaggio. Aggiungere circa 2 mL di acqua sterile ai pozzi circostanti nella piastra per mantenere l'umidità costante; mantenere i pozzi pieni d'acqua in tutta la cultura.
   3. Controllare la piastra qualche ora dopo per assicurarsi che i cheratinociti siano ancora all'interfaccia aria-liquido. Se c'è un supporto nella camera superiore rimuoverlo. Tenere traccia della quantità di supporti rimossi per ogni pozzo VHSE (il volume iniziale delle camere superiore e inferiore (1500 μL) - supporti rimossi = un buon punto di partenza per l'alimentazione ALI).
      NOTA: I VHSE non richiedono necessariamente lo stesso livello di supporto per il sollevamento dell'aria; di solito se i VHSE sono seminati insieme, hanno bisogno di circa lo stesso livello di supporti per il sollevamento dell'aria, ma non è sempre così. Regolare i volumi in base alle esigenze per mantenere l'ALI, ma assicurarsi che i livelli dei supporti non siano così bassi che i VHSE si asciughino. È più sicuro essere cauti e rimuovere piccole quantità di media ogni giorno fino a quando non è stato raggiunto un equilibrio tra sollevamento dell'aria e idratazione.
5. ALI Giorno 2 (ALI2)
   1. Da questo momento in su, utilizzare solo mezzi HSE senza siero integrati con acido L-ascorbico da 100 μg/mL. Cambia supporto nell'ALI Day 2 (ALI2). Se nella camera superiore sono presente supporti, rimuoverlo e aggiungerlo alla quantità di supporti rimossi registrati in precedenza. Calcolare il volume di supporti necessari utilizzando l'equazione nel passaggio precedente. Ad esempio: se 200 μL di supporti sono stati rimossi dalla camera superiore, aggiungere 1300 μL per stabilire ALI (come 1500 μL - 200 μL = 1300 μL)
   2. Utilizzare il volume calcolato per caricare nella camera inferiore di ogni pozzo, quindi riposizionare la piastra nell'incubatore di celle. Tenere traccia del volume utilizzato al giorno. Quando si utilizzano le quantità di collagene raccomandate negli inserti di coltura a 12 pozzi, la gamma usuale di valori ALI scende tra 750 μL e 1300 μL. In genere, il volume diminuisce rispetto alla maturazione della coltura e diventa coerente intorno alla settimana 2/3 di ALI. A seconda delle specifiche delle impostazioni cultura, questo numero può cambiare e deve essere ottimizzato (come descritto in 3.4.2 - 4.1).

4. Mantenimento di routine dell'equivalente vascolare della pelle umana

1. Dall'ALI Day 3 (ALI3) all'endpoint di coltura: rinnovare i supporti della camera inferiore ogni 2-3 giorni utilizzando supporti HSE senza siero con acido L-ascorbico da 100 μg/mL. Continuare a regolare e tenere traccia del livello del supporto necessario nella camera inferiore per ALI, come descritto al passaggio 3.5.2.
2. Poiché la superficie epidermica deve rimanere a contatto con l'aria, controllare e regolare quotidianamente il livello del supporto fino a quando non vengono stabiliti livelli di ALI coerenti. Lo strato epidermico dovrebbe sembrare idratato, non asciutto, ma non dovrebbero esserci supporti raggruppati sopra il costrutto. Le culture con 8 settimane di ALI hanno fornito la morfologia e l'espressione più coerenti; tuttavia, a seconda dell'applicazione, possono essere appropriate culture da 4 a 12 settimane. Potrebbe essere necessario ottimizzare la durata delle impostazioni cultura per diverse condizioni cellulari e di coltura.
   NOTA: Cambiare i media lunedì, mercoledì, venerdì è una buona pratica. I VHSE sono sani durante il fine settimana, ma i media dovrebbero essere cambiati presto il lunedì e in ritardo il venerdì. Dopo aver completato completamente i passaggi da 1 a 4, la generazione di un VHSE è completa. I passaggi 5-end del protocollo sono tecniche opzionali di elaborazione e imaging ottimizzate per questo tipo di costrutto 3D.

5. Fissazione e permeabilizzazione dei costrutti 3D

NOTA: il passaggio 5 è stato ottimizzato per le tecniche di imaging specifiche di questo costrutto 3D descritte nel resto del protocollo. I passaggi seguenti non sono necessari per generare un VHSE.

1. Fissazione/permeabilizzazione
   1. Rimuovere con cura tutti i supporti dalle camere superiori e inferiori di ogni pozzo nel punto finale del periodo di coltura.
      NOTA: Lo strato epidermico è possibilmente fragile, maneggia con cura e non agita l'epidermide con pipettazione aggressiva.
   2. Aggiungere il 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS (pH 6.9) alla parete della camera superiore (non direttamente sul costrutto) e quindi alla camera inferiore, per pre-fissare ogni costrutto. Aggiungere 1 mL per camera ed esporre per 5 minuti a temperatura ambiente.
      ATTENZIONE: PFA è pericoloso e deve essere maneggiato con cura e adeguate attrezzature di protezione personale (DPI), compresa la protezione degli occhi.
   3. Rimuovere la soluzione PFA al 4% dopo 5 minuti e aggiungere lo 0,5% di Triton X 100 in soluzione PFA al 4% alle camere superiore e inferiore come descritto nel passaggio precedente. Esporre per 1 ora a temperatura ambiente; Il costrutto VHSE d'ora in tanto non richiede un ambiente sterile.
   4. Dopo 1 ora, rimuovere con cura la soluzione di permeabilizzazione/fissazione da entrambe le camere e lavare il campione 3 volte con 1x PBS.
   5. Conservare campioni in PBS in refrigerazione a 4 °C o macchiare immediatamente. Per conservare i campioni, avvolgere il piatto in un involucro di plastica e quindi sventare per ridurre al minimo l'evaporazione e l'esposizione alla luce
      NOTA: Punto di pausa - Dopo la fissazione e la permeabilizzazione, questa procedura può essere sospesa poiché i campioni sono stabili per diverse settimane se preparati come descritto nel passaggio 5.1.5. In alternativa, la colorazione (come descritto nel passaggio 6) può essere completata immediatamente dopo il passaggio 5.

6. Colorazione immunofluorescente dei costrutti 3D

1. Preparazione del costrutto
   NOTA: I VHSE macchiano bene se separati dalla membrana porosa dell'inserto di coltura; la separazione dalla membrana è necessaria anche per l'imaging non ostruito e consente volumi ridotti per la colorazione.
   1. Per preparare il costrutto per la colorazione immunofluorescente, capovolgere un inserto e posizionarlo sopra il suo pozzo sulla piastra del pozzo (se il VHSE cade, cadrà nel pozzo con PBS)(Figura supplementare 1A).
   2. Stabilizzare l'inserto con una mano sul pozzo utilizzando forcep a punta fine e/o un coltello di precisione per tagliare circa la metà della circonferenza della membrana dell'inserto. Tagliare il più vicino possibile all'alloggiamento in plastica con una mano delicata per evitare danni al costrutto VHSE.
   3. Utilizzando le forcep a punta fine, afferrare il bordo del lembo della membrana tagliata e rimuovere delicatamente la membrana porosa dall'inserto e il costrutto VHSE. Fallo con molta attenzione e lentamente per evitare danni alla struttura del costrutto VHSE. Se il costrutto VHSE si separa facilmente, dovrebbe cadere nel pozzo sottostante, se rimane bloccato sul lato della camera, utilizzare le forcep di punta fine o una piccola scoopula per spostarlo nel pozzo. Essere molto consapevoli dello strato epidermico in quanto di solito è fragile (Figura supplementare 1A).
      NOTA: A volte la membrana non si stacca facilmente o si stacca a pezzi, se ciò accade utilizzare gli strumenti per allontanare attentamente la membrana e il costrutto VHSE. Assicurarsi che i VHSE non si asciughino durante questo processo immersione in PBS, se necessario.
   4. Una volta che il VHSE è nel pozzo, scartare tutti i pezzi rimanenti della membrana dell'inserto e mantenere l'alloggiamento dell'inserto di coltura in ogni pozzo per tenere i VHSE in posizione sommersa durante la colorazione.
2. macchiatura
   NOTA: La colorazione e la manipolazione/manipolazione associate e i lavaggi devono essere eseguiti il più delicatamente possibile poiché i VHSE possono essere fragili. Se parti dell'epidermide si sollevano, i pezzi possono essere macchiati separatamente; gli strati superiori dell'epidermide sono fragili e attraversano la desquamazione^{naturale 4}, ma per l'analisi è importante mantenere l'integrità il più possibile.
   1. Preparare bene le macchie di anticorpi primari scelte in 700 μL di tampone di blocco per costrutto (in genere, tutti gli anticorpi primari possono essere nella stessa soluzione di colorazione, ma questo dovrebbe essere confermato per nuovi anticorpi). 700 μL funziona per dimensioni di 12 pozzi, ma può essere regolato per altri formati di coltura. Le concentrazioni raccomandate di anticorpi primari e secondari con ricetta tampone di blocco sono fornite nella tabella 3 (può essere necessaria l'ottimizzazione).
   2. Rimuovere qualsiasi PBS dal pozzo utilizzando una pipetta manuale, fare attenzione a pipettare lontano dai VHSE (poiché i VHSE galleggiano, l'aspirazione del vuoto non è raccomandata).
   3. Aggiungere la soluzione di macchia primaria ad ogni pozzo e posizionare l'alloggiamento dell'inserto della coltura nel pozzo per mantenere il VHSE immerso nel fluido(Figura supplementare 1B). Avvolgere la piastra del pozzo con un involucro di plastica. Lamina e macchia per 48 ore in refrigerazione a 4 °C senza agitazione o dondolo (il dondolo può danneggiare il costrutto VHSE).
   4. Dopo 48 ore, preparare anticorpi secondari e macchie chimiche in 700 μL di tampone di blocco (per pozzo).
   5. Rimuovere l'alloggiamento dell'inserto delle impostazioni cultura e la soluzione di macchia primaria e lavare con 1x PBS, 3x per 5 minuti prima di aggiungere la soluzione di macchia secondaria. Posizionare l'alloggiamento dell'inserto delle impostazioni cultura nel pozzo per mantenere sommerso il costrutto VHSE( Figura supplementare 1B). Esporre per 48 ore in refrigerazione a 4 °C senza agitazione o dondolo.
   6. Dopo un'esposizione di 48 ore, rimuovere la soluzione di macchia con un pipettor manuale e lavare delicatamente 3 volte con PBS; non pipettare il fluido direttamente sui VHSE in quanto potrebbero essere fragili. Reidratare con PBS in eccesso e riposizionare l'inserto di coltura nel pozzo per mantenere il VHSE sommerso e idratato durante lo stoccaggio (conservare avvolgendo in involucro di plastica e foglio per ridurre al minimo l'evaporazione e l'esposizione alla luce)
3. Clearing (opzionale & terminale)
   NOTA: la compensazione è facoltativa per l'imaging. Se completato, deve essere fatto dopo la colorazione / imaging del campione completamente poiché la compensazione impedisce ulteriori colorazioni, può alterare le prestazioni del fluoroforo e può danneggiare la struttura VHSE. Esistono più metodi di compensazione^{dei tessuti 49,61,62} e possono essere ottimizzati per progetti specifici. La compensazione del salicilato metile, descritta di seguito, è semplice ed efficace per il VHSE. La seguente tecnica di radura deve essere completata in contenitori di vetro e le punte delle pipette devono essere in vetro o polipropilene (il polistirolo si dissolverà a contatto con il salicilato di metile). Completare tutte le procedure di pulizia in un'area ben ventilata o in una cappa aspirante.
   1. Aggiungere il 100% di metanolo a un piccolo contenitore di vetro poco profondo (le piastre di Petri in vetro funzionano bene). Utilizzare il contenitore più piccolo possibile che si adatta al costrutto (per ridurre al minimo i rifiuti di reagente).
   2. Rimuovere il costrutto dalla piastra del pozzo utilizzando forcep/scoopula(Figura supplementare 1C) e posizionare nel contenitore riempito di metanolo. Aggiungere più metanolo se il costrutto non è sommerso.
   3. Disidratare il costrutto VHSE in metanolo per immersioni di 3 x 10 minuti; sostituire completamente il metanolo dopo ogni immersione e rimuovere prontamente il metanolo dopo l'ultimo bagno. Nel corso di questa procedura, il costrutto può diventare più opaco e ridursi leggermente.
      NOTA: Queste durate e ripetizioni sono state ottimizzate, ma il metanolo e le seguenti procedure di salicilato metile potrebbero dover essere personalizzati, a seconda del formato di coltura e delle macchie specifiche.
   4. Subito dopo aver rimosso il metanolo, aggiungere il salicilato di metile e immergere il VHSE in immersioni di 5 x 5 minuti. Sostituire completamente il reagente dopo ogni immersione e lasciare il VHSE nella soluzione a 5a immersione per lo stoccaggio. Nel corso di questa procedura, il costrutto diventa trasparente.
   5. Immagine del costrutto o del negozio a 4 °C. Dopo la schiarita, completare tutte le immagini il prima possibile, poiché i fluorofori possono degradarsi nel salicilato di metile in pochi giorni. La compensazione fa sì che i costrutti diventino fragili e lo stoccaggio esteso, sebbene non raccomandato, richiede un controllo regolare per garantire che vi sia una quantità sufficiente di salicilato di metile.

7. Imaging confocale di costrutti 3D

NOTA: L'imaging attraverso la plastica per coltura tissutale non produrrà la stessa qualità dell'immagine dell'imaging attraverso il vetro coverslip, questo metodo descrive la fabbricazione di un pozzo personalizzato con fondo di vetro per prevenire l'essiccazione durante l'imaging confocale. In genere, questo è sufficiente per almeno 3 ore di imaging.

1. Due giorni prima dell'imaging: preparare il polidimetilsilossano (PDMS)
   1. Preparare PDMS^48,63,64 ad una concentrazione suggerita di [9:1], base: crosslinker. Preparare 30 g di PDMS totale: 27 g di componente di base e 3 g di retino. Posizionare qualsiasi recipiente di miscelazione pulito su una bilancia di pesatura e tarare la bilancia. Aggiungere la base (27 g) e quindi aggiungere il retino (3 g) per ottenere un totale di 30 g. Aggiungere sempre la base prima del retino.
   2. Mescolare vigorosamente la soluzione per almeno 4 minuti; questo creerà piccole bolle. Dopo una miscelazione sufficiente, versare il PDMS in una piastra di Petri da 100 mm o in un contenitore simile resistente al calore a fondo piatto.
   3. De-gas il PDMS in una camera a vuoto fino a quando tutte le bolle dalla miscelazione scompaiono e il PDMS è chiaro. Rilasciare lentamente il vuoto e rimuovere il PDMS (lentamente). Mettere il piatto in forno per curare durante la notte (50-60 °C); assicurarsi che il piatto sia seduto piatto per la polimerizzazione uniforme del PDMS.
      NOTA: Dopo la polimerizzazione, il PDMS deve essere chiaro e la superficie deve essere liscia e non appiccicosa (la appiccicosa può indicare una miscelazione inadeguata).
2. Un giorno prima dell'imaging: preparazione del pozzo PDMS
   1. Utilizzando un punzone in acciaio o un coltello di precisione portatile, punzonare o tagliare un pozzo circolare dalla lamiera PDMS preparata al punto 7.1. Il pozzo dovrebbe avere circa le stesse dimensioni del costrutto VHSE. Tagliare una patch quadrata attorno al pozzo circolare per creare un singolo pozzo PDMS. L'importo di 30 g di PDMS preparato dovrebbe produrre almeno quattro pozzi personalizzati.
      NOTA: Il pozzo PDMS deve essere vicino alle dimensioni del costrutto VHSE. Deve limitare il movimento del campione durante l'imaging. Più pozzi possono essere fabbricati contemporaneamente e conservati a tempo indeterminato in un contenitore pulito.
   2. Utilizzando un copriscivolo di vetro di dimensioni simili al pozzo PDMS, aggiungere la colla cianoacrilato (ad esempio, super colla) sulla superficie inferiore del PDMS (la superficie liscia che era a contatto con la piastra di Petri) e spalmare uniformemente con una punta di pipetta usa e getta. Centrare e premere bene il PDMS sul vetro lasciando una finestra di vetro trasparente all'interno del cerchio perforato (assicurarsi che la colla non sia imbrattata sopra la finestra di visualizzazione).
      NOTA: Se disponibile, l'incollaggio al plasma del PDMS al coverslip è un'alternativa^65,66,67.
   3. Lasciare asciugare la colla per diverse ore, o durante la notte, prima dell'uso. Questi sono riutilizzabili fino a quando non si rompono dalla normale usura.
      NOTA: Non è consigliabile macchiare i campioni nel PDMS incollato ben utilizzato per l'imaging. Questi pozzi tengono il fluido per diverse ore ma possono perdere durante la colorazione più lunga.
3. Imaging VHSE
   NOTA: se si utilizzano campioni non chiari per l'imaging, utilizzare PBS come soluzione di imaging. Se si imaging con campioni cancellati, utilizzare il salicilato di metile (o la soluzione di compensazione scelta) come soluzione di imaging.
   1. Aggiungere alcune gocce di soluzione di imaging nel pozzo PDMS e verificare la presenza di perdite (in caso di perdita, ripararla con un punto / striscio di super colla cianoacrilato o utilizzare un altro pozzo).
   2. Mantenere bene la soluzione di imaging nel PDMS quando si aggiunge il VHSE. Utilizzando palette o forcep a punta fine (Figura supplementare 1C), rimuovere il costrutto dalla piastra da 12 pozzi e posizionarlo nel PDMS bene sul coperchio del vetro. Posizionare il costrutto con l'orientamento dell'interesse rivolto verso l'obiettivo. Ad esempio, per immagini l'epidermide usando un microscopio invertito, assicurarsi che l'epidermide sia rivolta verso il basso, verso il vetro.
      1. In alternativa, per un microscopio verticale, affrontare l'epidermide verso l'alto. Le seguenti procedure di imaging sono descritte per un microscopio invertito, ma potrebbero essere facilmente adattate per un montante.
         NOTA: Fare attenzione quando si manipola il VHSE per evitare danni. Trasferire sopra la piastra del pozzo in caso di caduta del VHSE. Una scoopula piegata a punta piatta è il modo più semplice per trasferire il costrutto( Figura supplementare 1C).
   3. Assicurarsi che il campione sia seduto piatto nel pozzo e che nessuna porzione dell'epidermide o del derma sia piegata sotto il campione. Se si verifica una piegatura, manipolare delicatamente il campione con forcep o una scoopula; l'aggiunta temporanea di una soluzione di imaging aggiuntiva per far galleggiare il VHSE può aiutarlo a raddrizzare. La piegatura o la rughe del campione possono essere viste a occhio o utilizzando il microscopio.
   4. Riempire il pozzo con la soluzione di imaging, utilizzando un fluido sufficiente per mantenere il campione idratato; troppo fluido farà galleggiare il campione, con conseguente movimento durante l'imaging. Il costrutto dovrebbe essere seduto sulla finestra di visualizzazione del vetro; testare il movimento inclinando bene il PDMS. Se c'è movimento, rimuovere del fluido; aggiungere e rimuovere la goccia di fluido in modo saggio fino a quando il movimento non si ferma.
   5. Posizionare uno scivolo di vetro sul pozzo per ridurre al minimo l'evaporazione durantel'imaging ( Figura supplementare 1D). Per sessioni di imaging più lunghe, controllare frequentemente il campione per garantire livelli di fluido adeguati. Se accessibile, è possibile utilizzare una camera umidificata durante l'imaging (anche se in genere non è necessaria).
   6. Posizionare il campione sullo stadio del microscopio e l'immagine attraverso la finestra delle copertine divetro ( Figura supplementare 1D). Questa tecnica consente almeno 3 ore di imaging confocale continuo, ma l'idratazione del campione deve essere controllata regolarmente, con l'aggiunta di una soluzione di imaging quando necessario.
      NOTA: Se il campione viene eliminato, il salicilato di metile degrada la colla nel tempo. L'incollaggio della colla del PDMS può essere ri applicato tra le esecuzioni di imaging; oppure il campione può essere trasferito periodicamente in nuovi pozzi. Nei pozzi con legame al plasma, questo non sarà un problema.
   7. Dopo l'imaging, far galleggiare il campione con il più possibile il fluido di imaging nel pozzo. Utilizzare una scoopula o una punta fine per trasferire il campione nel suo pozzo di stoccaggio. Eseguire il trasferimento su una piastra del pozzo in caso di caduta del campione.
   8. Ogni copripispaglia PDMS e superiore in vetro può essere ri utilizzato fino a quando non si rompono. Pulire il vetro inferiore prima dell'imaging, sia all'interno che all'esterno del pozzo. Prima di riuso, controllare sempre la presenza di perdite e riparare con la colla, se necessario.
   9. Archiviare i campioni come descritto al passaggio 6.3.6 e aggiungere PBS ogni pochi mesi per mantenerli; se i campioni vengono cancellati, conservare in vetro utilizzando salicilato di metile e controllare regolarmente i livelli. I campioni cancellati possono degradarsi rapidamente (in pochi giorni) e devono essere coniati il prima possibile.

Representative Results

Qui viene presentato un protocollo per la generazione di equivalenti della pelle umana vascolarizzati in vitro (VHSE) utilizzando la trascrittasi inversa telomerasi (TERT) cheratinociti immortalati (N/TERT-1^20,59),fibroblasti dermici umani adulti (hDF) e cellule endoteliali microvascolari umane (HMEC-1)(Figura 1). Inoltre, la natura personalizzabile di questo protocollo è evidenziata dimostrando anche la generazione e la stabilità VHSE quando si utilizzano fibroblasti polmonari comunemente disponibili (IMR90) anziché hDF. La generazione del VHSE è completata nei passaggi da 1 a 4, mentre i passaggi da 5 a 7 sono tecniche opzionali di elaborazione e imaging dei punti finali ottimizzate per questi VHSE. È importante notare che i VHSE possono essere elaborati in base a specifiche domande di ricerca e i passaggi 5-7 non sono necessari per generare il costrutto. Imaging volumetrico, analisi e rendering 3D sono stati completati per dimostrare un metodo di analisi volumetrica. Questi protocolli di preparazione e imaging dei costrutti volumetrici preservano la struttura VHSE sia a livello microscopico che macroscopico, consentendo un'analisi 3D completa.

La caratterizzazione dell'epidermide e del derma mostra marcatori immunofluorescenti appropriati per la pelle umana nei costrutti VHSE (Figura 2, 3). La citocheratina 10 (CK10) è un marcatore cheratinocita di differenziazione precoce che di solito segna tutti gli strati sovrabasali negli equivalenti^{cutanei 18,30,68} (Figura 2). Involucrina e filaggrina sono marcatori di differenziazione tardiva nei cheratinociti e segnano gli strati soprabasali più alti negli equivalenti^{cutanei 12,30,68,69} (Figura 2). Un colorante nucleare fluorescente di gran lunga rosso (vedi elenco dei materiali) è stato utilizzato per contrassegnare i nuclei sia nell'epidermide che nel derma, con il Col IV che segna la vascucolatura del derma(Figura 2, Figura 3, Figura 4). I componenti della membrana basale epidermica (BM) non sono sempre correttamente espressi nelle colture HSE^15,16; e la colorazione Col IV del BM non è osservata in modo coerente utilizzando questo protocollo. I componenti e la struttura BM focalizzati sulla ricerca trarrebbero vantaggio dall'ottimizzazione aggiuntiva di supporti, celle e imaging¹⁴.

Sebbene l'imaging confocale attraverso la maggior parte delle colture VHSE spesso produca immagini ad alta risoluzione che sono sufficienti per l'analisi computazionale del derma e dell'epidermide, il metodo di compensazione descritto consente un imaging dei tessuti più profondo. La compensazione migliora la profondità di penetrazione laser confocale e l'imaging efficace nei VHSE può essere raggiunto a oltre 1 mm per i campioni cancellati (rispetto a ~ 250 μm per i non chiari). La tecnica di compensazione descritta (disidratazione del metanolo e salicilato di metile) corrisponde sufficientemente all'indice di rifrazione in tutto il tessuto campione VHSE⁶¹. La cancellazione del VHSE ha permesso l'imaging diretto attraverso l'intero costrutto senza manipolazione (ad esempio, riorientando il costrutto per l'immagine separata del derma e dell'epidermide) (Figura 3).

Le immagini volumetriche consentono la generazione di rendering 3D per mappare la vascucolatura in ogni costrutto (Figura 4). In breve, sono stati presi set di immagini confocali in orientamento dermico-epidermico di diversi sotto-volumi di VHSE per rilevare la macchia di Collagen IV (marcando le pareti dei vasi) e i nuclei (contrassegnati da un colorante nucleare fluorescente di gran lunga rosso). Gli stack di immagini vengono caricati in software computazionale (vedere elenco dei materiali) e un algoritmo personalizzato (basato ^{su queste origini 48,70,71,72,73,74,75}) viene utilizzato per il rendering e la quantificazione 3D come descritto in precedenza⁴⁸. Questo algoritmo segmenta automaticamente il componente vascolare in base alla macchia Col IV. La segmentazione volumetrica viene passata a un algoritmo di scheletrizzazione basato sulla marcia^{veloce 75,76,77}. La scheletrizzazione trova il centro definitivo di ogni recipiente contrassegnato col IV e i dati risultanti possono essere utilizzati per calcolare il diametro del vaso e la frazione vascolare (Figura 4). La microscopia fluorescente widefield è un'opzione accessibile se la microscopia a scansione laser non è disponibile; la rete vascolare e l'epidermide possono essere immagini con microscopia fluorescente a campo largo (Figura supplementare 2). La quantificazione tridimensionale è possibile utilizzando l'imaging widefield dei VHSE piuttosto che la microscopia a scansione laser, anche se potrebbe richiedere più filtraggio e deconvoluzione delle immagini a causa della luce fuori piano.

Figura 1: Cronologia schematica della generazione equivalente della pelle umana vascolarizzata. A) Mostra la progressione del modello VHSE da 1) semina di componenti dermici, 2) semina cheratinocita sulla componente dermica, 3) stratificazione epiteliale tramite interfaccia liquido dell'aria e mantenimento della coltura. L'elaborazione post-coltura e l'imaging volumetrico possono essere eseguite all'endpoint delle impostazioni cultura. B) Immagini della fotocamera della macrostruttura hDF VHSE negli inserti delle impostazioni cultura al loro endpoint culturale, 8 settimane. Vari livelli di contrazione sono normali per i VHSE; la contrazione può essere ridotta come descritto dal protocollo. (1 & 2) Campioni meno contratti. (3 & 4) Più campioni contratti producono ancora elementi cutanei adeguati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Caratterizzazione epidermica mediante marcatori immunofluorescenti. Tutte le immagini sono state scattate di VHSE al punto di tempo della coltura di 8wk tramite microscopia confocale. I metodi di colorazione corrispondenti sono descritti nel passaggio 6 del protocollo. Marcatori epiteliali propri sono presenti sia nei VHSE hDF (colonna sinistra) che nei VHSE IMR90 (colonna destra). Involucrina e Filaggrin sono marcatori di differenziazione tardiva dei cheratinociti e dimostrano che l'epidermide è completamente stratificata in entrambi i tipi VHSE. La citocheratina 10 è un marcatore di differenziazione precoce che identifica gli strati sovrabasali nei VHSE. I nuclei sono mostrati nelle viste ortogonali in giallo. Le immagini di proiezione en face e orthogonal max sono state rese tramite software computazionale; Le immagini vengono ridimensionate individualmente con sottrazione di sfondo e filtraggio mediano per chiarezza. Le barre di scala sono di 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Confronto tra VHSE non liquidato e VHSE cancellato. Questo VHSE è stato generato con IMR90 e le immagini sono state scattate al punto di tempo della coltura di 4wk tramite microscopia confocale. Collagen IV è mostrato in ciano; I nuclei sono mostrati in magenta; magenta nel rendering 3D cancellato rappresenta il consolidamento dei nuclei nello strato epidermico del VHSE. L'immagine VHSE non chiara è un esempio di attenuazione laser nei costrutti VHSE più spessi, attraverso la compensazione (metanolo e salicilato metile) l'intero costrutto può essere immaginato con poca /nessuna attenuazione laser dal lato dermico del costrutto. Le impostazioni di imaging, tra cui linea laser, guadagno e foro stenopeico, sono state abbassate per il VHSE cancellato per ridurre la sovrasaturazione. La compensazione e l'imaging sono state completate come descritto nei passaggi 6 & 7 del protocollo. Le immagini di proiezione massima ortogonale e il rendering 3D sono stati completati con software computazionale, il rendering 3D è stato generato da immagini di costruzione cancellate. Le immagini vengono ridimensionate individualmente con sottrazione di sfondo e filtraggio mediano per chiarezza. Le barre di scala sono 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi tridimensionale della vascu caratteristica all'interno dei VHSE. Le immagini volumetriche scattate tramite microscopia confocale consentono la quantificazione dei parametri vascolari negli endpoint delle impostazioni cultura attraverso l'analisi computazionale delle immagini. Dai sottoconsci VHSE, il rilevamento della macchia di Collagen IV (ciano) segna le pareti endoteliali della vascolarizzazione e consente la segmentazione del vascolare in base alla posizione del collagene IV; i dati di segmentazione vengono quindi scheletrati e viene trovato il centro di ogni recipiente (magenta). Esempi di scheletrizzazione 3D sono mostrati per campioni VHSE IMR90 di 4 settimane e 8 settimane, non cancellati. I dati risultanti di un insieme di esperimenti VHSE IMR90 sono stati utilizzati per calcolare i diametri del recipiente e le frazioni vascolari per quattro sottoconc volumi (ciascuno 250 μm nella direzione z) all'interno di ogni costrutto, i dati sono stati calcolati in media per VHSE e ulteriormente calcolati in media per punto di tempo di coltura. Questi dati mostrano l'omeostasi della rete vascolare che copre durate di coltura di 4 e 8 settimane con diametri rilevanti per la pelle umana in vivo⁷⁸e la frazione vascolare nello stesso ordine della pelle umana in vivo⁷⁹ (la frazione vascolare nei costrutti di collagene ha dimostrato di essere^{personalizzabile 48 e} potrebbe essere ulteriormente ottimizzata per aumentare i valori). I dati sono rappresentati come mezzi ± media di errore standard (S.E.M); n = 3 per ogni punto di tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

media	Componenti
Linea cellulare fibroblasto dermico umano (hDF)	DMEM HG
	Siero bovino fetale al 5% (FBS)
	1% Penicillina/Streptomicina (P/S)
Linea di cellule fibroblatrici IMR90	DMEM/HAM F12 50:50
	FBS al 10%
	1% P/S
Linea cellulare Endoteliale HMEC-1	MCDB131 Supporto di base
	FBS al 10%
	1% P/S
	L-glutammina [10 mM]
	Fattore di crescita epidermico (FEG) [10 ng/mL]
	Idrocortisone [10 μg/mL]
N/TERT-1 Linea cellulare cheratinocita	Base multimediale K-SFM
	1% P/S
	Estratto di ipofisi bovino (BPE) [25 μg/mL], dal kit di integratori K-SFM
	Fattore di crescita epidermico (EGF) [0,2 ng/mL], dal kit di integratori K-SFM
	CaCl2 [0,3 mM]
Differenziazione equivalente della pelle umana (HSE)	3:1 DMEM: F12 del prosciutto
	1% P/S
	0,5 μM Idrocortisone
	0,5 μM Isoproterenolo
	0,5 μg/mL Insulina

Tabella 1: Ricette multimediali. Vengono fornite ricette mediali per la coltura 2D dei fibroblasti dermici umani, dei fibroblasti IMR90, dell'HMEC-1 e dei cheratinociti N/TERT-1. Queste ricette sono state utilizzate per espandere le linee cellulari prima di generare VHSE. I mezzi di differenziazione equivalenti per la pelle umana (HSE) sono usati per generare VHSE; viene data una ricetta di base, durante porzioni di coltura di immersione e induzione di stratificazione, devono essere aggiunte quantità di rastremazione di FBS come descritto nella fase 3 del protocollo. Ricetta HSE basata su queste fonti^11,80.

Concentrazione di collagene (Cs) :	8	mg/mL
Volume desiderato (Vf):	1	Ml
Normalizzazione della regolazione naoh*:	1	X
*Ogni lotto di collagene deve essere testato per determinare la quantità di NaOH necessaria per impostare il pH 7 - 7,4
		Concentrazione di collagene desiderata (mg/mL)
	2	3	4	5
10X PBS (Vpbs)	0.1	0.1	0.1	0.1
Stock di collagene (V s)	0.25	0.375	0.5	0.625
1N Naoh (VNaoH)	0.00575	0.008625	0.0115	0.014375
Supporti (Vmedia)	0.64425	0.516375	0.3885	0.260625

Tabella 2: Tabella di riferimento per il calcolo del collagene. La tabella di riferimento fornisce concentrazioni di collagene comunemente desiderate calcolate assumendo una concentrazione di 8 mg/mL di collagene e un volume finale desiderato di 1 mL; tutti i valori sono in mL. Le equazioni utilizzate per calcolare questi importi sono fornite nel passaggio 2.2 del protocollo. È importante controllare il pH per ogni stock di collagene; se necessario, le quantità di NaOH devono essere aggiunte per ottenere pH 7 - 7.4 (dopo l'aggiunta di PBS, NaOH, stock di collagene, mezzi). Il protocollo è stato ottimizzato per i VHSE utilizzando una concentrazione di collagene di 3 mg/mL; possono essere necessari cambiamenti nella concentrazione di collagene per diverse linee cellulari/risultati finali^{desiderati 48}.

Anticorpo primario	fonte	concentrazione	usare
Filaggrin (AKH1) mouse monoclonale IgG	Santa Cruz; sc-66192 (200 μg/mL)	[1:250]	Marcatore di differenziazionetardiva 15
Involucrina coniglio policlonale IgG	Proteintech; 55328-1-AP (30 μg/150 μL)	[1:250]	Marcatore di differenziazione terminaletardiva 15
Citocheratina 10 (DE-K10) topo IgG, supernatante	Santa Cruz; sc-52318	[1:350]	Marcatore epidermico sovrabasale14,36,59
Collagen IV coniglio policlonale	Proteintech; 55131-1-AP	[1:500]	Parete vascolare endoteliale67
DRAQ 7	Segnalazione cellulare; 7406 (0,3 mM)	[1:250]	Marcatore nucleare
Anticorpo secondario	fonte	concentrazione	usare
Capra Anti-Coniglio IgG DyLight™ 488 Coniugato	Invitrogen; 35552 (1 mg/mL)	[1:500]	Collagene IV secondario
Anticorpo Anti-Rabbit IgG (H&L) (GOAT), DyLight™ 549 Coniugato	Immunochimica di Rockland; 611-142-002	[1:500]	Involucrina secondaria
Capra Anti-Mouse IgG (H&L), DyLight™ 488	Termoscie scientifico; 35502 (1 mg/mL)	[1:500]	Filaggrin o Citokeratina 10 secondario
BUFFER DI BLOCCO (500 mL)
Reagente	importo
ddH2O	450 mL
10 x PBS	50 mL
Albumina di siero bovino (BSA)	5 g
Interpolazione 20	0,5 mL
Gelatina di pesce ad acqua fredda	1 g
Azide di sodio (10% di azide di sodio in diH2O)	5 mL (concentrazione finale dello 0,1 %)

Tabella 3: Anticorpi primari e secondari con ricetta tampone bloccante. Gli anticorpi elencati e le macchie chimiche sono stati utilizzati per la colorazione indicati nella figura 2, figura 3, figura 4. La colorazione è stata completata come indicato nel passaggio 6 del protocollo utilizzando la ricetta del buffer di blocco elencata qui. Alcune ottimizzazioni delle concentrazioni di colorazione e della durata possono essere richieste a seconda delle tecniche di coltura scelte e delle linee cellulari.

Tabella supplementare 1: Elenco delle abbreviazioni. Elenco delle abbreviazioni incluso per comodità del lettore. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura supplementare 1 : Ausiliotecnico VHSE per la manipolazione. La gestione dei VHSE è impegnativa soprattutto durante la fissazione, l'elaborazione e la colorazione. A-D corrisponde alle istruzioni nei passaggi 5-7. A mostra la manipolazione tecnica della rimozione della membrana porosa da un inserto di coltura per garantire una corretta colorazione. B mostra come mantenere ogni VHSE sommerso durante la colorazione e lo stoccaggio. C mostra il modo più sicuro e semplice per spostare i costrutti nei pozzi di imaging PDMS. D mostra un VHSE seduto in un pozzo di imaging PDMS: il pozzo PDMS è incollato a uno scivolo di vetro sul fondo, creando una finestra per l'imaging, uno scivolo di vetro è posizionato sopra per mantenere l'umidità attraverso lunghe serie di imaging. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: La microscopia standard a fluorescenza a campo largo può essere utilizzata per valutare i VHSE. L'imaging widefield può essere utilizzato per l'imaging volumetrico per la valutazione di routine quando la microscopia a scansione laser non è disponibile. Ad esempio, l'imaging dei VHSE sia dagli aspetti apicali che basolaterali è mostrato come proiezioni en face e ortogonali (Ortho.). (In alto) L'epidermide è stata immagine usando involucrina e nuclei come marcatori. (In basso) La vascucolatura dermica è stata immagine usando collagene IV come marcatore. Le immagini vengono sottratte in background per chiarezza. La luce fuori piano porta agli artefatti "striature" o "flare" evidenti nelle viste ortogonali. L'imaging widefield può essere utilizzato per la quantificazione, ma può richiedere una maggiore elaborazione delle immagini. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Questo protocollo ha dimostrato un metodo semplice e ripetibile per la generazione di VHSE e la loro analisi tridimensionale. È importante sottolineare che questo metodo si basa su poche tecniche specializzate o pezzi di apparecchiature, rendendolo accessibile per una vasta gamma di laboratori. Inoltre, i tipi di cellule possono essere sostituiti con modifiche limitate nel protocollo, consentendo ai ricercatori di adattare questo protocollo alle loro esigenze specifiche.

Una corretta gelazione del collagene è un passo impegnativo per stabilire la cultura della pelle. Soprattutto quando si utilizzano preparati grezzi senza purificazione, i contaminanti di traccia potrebbero influenzare il processo di gelazione. Per garantire la coerenza, i gruppi di esperimenti devono essere eseguiti con lo stesso stock di collagene che verrà utilizzato per la generazione VHSE. Inoltre, la gelazione dovrebbe idealmente verificarsi ad un pH di 7-7,4 e i contaminanti in traccia possono spostare il pH. Prima di utilizzare qualsiasi stock di collagene, una pratica di gel cellulare deve essere fatta alla concentrazione desiderata e il pH deve essere misurato prima della gelazione. Completare questo controllo di qualità del collagene prima di iniziare la semina dei componenti dermici identificherà i problemi con una corretta gelazione e omogeneità del collagene prima di impostare un esperimento completo. Invece di seminare collagene cellulare direttamente su un inserto di coltura, seminare del collagene su una striscia di pH che valuta l'intera scala del pH e verificare un pH di 7-7,4. La gelazione può essere valutata applicando una goccia della soluzione di gel di collagene su una piastra di plastica di coltura di copra o tessuto (si consiglia una piastra di pozzo per simulare i lati confinati di un inserto di coltura). Dopo il tempo di gelazione, il collagene dovrebbe essere solido, cioè non dovrebbe fluire quando la piastra è inclinata. Sotto la microscopia a contrasto di fase, il collagene dovrebbe apparire omogeneo e chiaro. Le bolle occasionali dalla semina del collagene sono normali ma grandi macchie amorfe di collagene opaco all'interno del gel trasparente indicano un problema probabilmente a causa di una miscelazione insufficiente, pH errato e / o incapacità di mantenere il collagene refrigerato durante la miscelazione.

Le quantità di semina cellulare e il supporto possono essere regolati. Nel protocollo precedente, le quantità di cellule incapsulate sono state ottimizzate per un inserto da 12 pozzetti a 7,5 x^{10 4} fibroblasti e 7,5 x 10⁵ cellule endoteliali per mL di collagene con 1,7 x 10⁵ cheratinociti seminati sopra il costrutto dermico. Le densità cellulari sono state ottimizzate per questo protocollo VHSE sulla base degli studi preliminari e della precedente ricerca che indaga la generazione di reti vascolari 3D in varie concentrazioni di collagene⁴⁸ e generazione HSE^22,80,81. In sistemi simili, le densità delle cellule endoteliali pubblicate sono 1,0 x 10⁶ cellule/mL collagene^48; le concentrazioni di fibroblasti variano spesso da 0,4 x 10⁵ cellule/mL di collagene^22,28,82 a 1 x 10⁵ cellule/mL di collagene^{8,58,83,84,85;} e le concentrazioni di cheratinociti vanno da 0,5 x 10⁵ [cellule/cm²]⁸⁰ a 1 x 10⁵ [cellule/cm²]⁸. Le densità cellulari possono essere ottimizzate per cellule specifiche e domande di ricerca. Le colture tridimensionali con cellule contrattili, come i fibroblasti, possono contrarsi portando alla riduzione della vitalità e alla perdita^{di coltura 86,87}. Devono essere completati esperimenti preliminari per testare la contrazione del compartimento dermico (che può verificarsi con più cellule dermiche, più cellule dermiche contrattili, colture di immersione più lunghe o matrici più morbide) e per testare la copertura superficiale epidermica. Inoltre, il numero di giorni di immersione e la velocità di assottigliamento del contenuto siero possono anche essere personalizzati se si verifica un'eccessiva contrazione dermica o è richiesto un diverso tasso di copertura dei cheratinociti. Ad esempio, se si nota una contrazione durante il periodo di immersione dermica o mentre i cheratinociti stanno stabilendo un monostrato di superficie, muoversi più rapidamente attraverso il processo di rastremazione del siero e aumentare i VHSE ad ALI può aiutare a prevenire ulteriori contrazioni. Allo stesso modo, se la copertura dei cheratinociti non è ideale, cambiare il numero di giorni in cui il VHSE è sommerso senza siero può aiutare ad aumentare la copertura del monostrato epidermico e mitigare la contrazione poiché il siero viene lasciato fuori. I cambiamenti nelle densità cellulari o altri suggerimenti di cui sopra devono essere ottimizzati per le colture specifiche e gli obiettivi di ricerca.

Per stabilire una corretta stratificazione dell'epidermide durante il periodo dell'interfaccia del liquido d'aria (ALI), è fondamentale controllare e mantenere regolarmente i livelli di fluido in ogni pozzo in modo che ALI e l'idratazione appropriata di ogni costrutto siano mantenuti per tutta la lunghezza della coltura. I livelli dei supporti devono essere controllati e monitorati giornalmente fino a quando non vengono stabiliti livelli di ALI coerenti. Lo strato epidermico dovrebbe sembrare idratato, non asciutto, ma non dovrebbero esserci pool di mezzi sul costrutto. Durante l'ALI, il costrutto svilupperà un colore bianco/giallo opaco che è normale. Lo strato epidermico probabilmente si svilupperà in modo non uniforme. Comunemente, i VHSE sono inclinati a causa della semina del collagene o della contrazione dermica. È anche normale osservare una porzione epidermica più alta al centro del costrutto in costrutti più piccoli (24 dimensioni del pozzo) e una formazione di cresta attorno al perimetro del VHSE in 12 dimensioni del pozzo. La contrazione dei costrutti¹³ può cambiare queste formazioni topografiche e/o non può essere osservata affatto.

La colorazione e l'imaging dei VHSE introducono la manipolazione meccanica ai VHSE. È molto importante pianificare e limitare la manipolazione di ogni cultura. Quando è necessaria la manipolazione, mantenere movimenti delicati quando si rimuovono i VHSE dalle membrane di inserimento, quando si aggiungono soluzioni di colorazione o lavaggio alla superficie del costrutto e quando si rimuovono e si sostituiscono i VHSE nei loro pozzi di archiviazione / imaging durante la preparazione dell'imaging. In particolare, gli strati apicali della componente epidermica possono essere fragili e sono a rischio di arare gli strati epidermici basali. Gli strati apicali dell'epidermide sono fragili e passano attraverso la desquamazione anche nel tessuto nativo⁴, ma per un'analisi accurata della struttura epidermica è importante ridurre al minimo danni o perdite. Se gli strati epidermici sollevano dal costrutto, possono essere immagini separatamente. Gli strati basali dell'epidermide sono molto probabilmente ancora attaccati al derma mentre parti degli strati apicali possono staccarsi. Per la visualizzazione dell'epidermide, una macchia nucleare è utile per osservarlo poiché i nuclei densi sono una caratteristica degli strati inferiore e medio dell'epidermide.

L'imaging confocale della post-fissazione VHSE è stato discusso nel protocollo, ma è anche possibile immaginare i VHSE in tutta la coltura tramite tomografia a coerenza ottica verticale (OCT)^{88,89,90,91,92,93}. I VHSE sono abbastanza stabili da resistere all'imaging senza incubazione o umidificazione per almeno due ore senza effetti evidenti. Poiché OCT è privo di etichette e non invasivo, è possibile tracciare lo spessore epidermico durante la maturazione. È probabile che vengano utilizzate anche altre modalità di imaging non invasivo.

L'imaging volumetrico delle strutture dermiche ed epidermiche combinate può essere impegnativo a causa dell'attenuazione laser più profonda nel VHSE. Questo può essere mitigato imaging del costrutto in due orientamenti, dal lato epidermico (Figura 1) e dal lato dermico (Figura 2), consentendo una buona risoluzione delle strutture vascolari dermiche e dell'epidermide. Inoltre, il campione può essere cancellato, consentendo immagini volumetriche dell'intera struttura con attenuazione minima. Sono stati tuttavia tentati diversi metodi di compensazione, il metodo del salicilato metanolo/metile descritto ha dato i migliori risultati. I ricercatori interessati a ottimizzare altri metodi di compensazione sono diretti verso queste^{recensioni 49,61,62}. Se si cancella, si consiglia di visualizzare completamente il campione prima della compensazione, poiché il metodo può danneggiare i fluorofori e /o la struttura. Inoltre, l'imaging deve essere completato il prima possibile dopo la compensazione, poiché la fluorescenza potrebbe svanire in pochi giorni.

Per semplicità e accessibilità, questo protocollo utilizzava le miscele multimediali più semplici presenti nella letteratura^{precedente 11,80}. Sebbene ci siano molti vantaggi nell'utilizzo di semplici miscele multimediali, vengono riconosciuti anche i limiti di questa scelta. Altri gruppi hanno studiato gli effetti di specifici componenti multimediali sulla salute epidermica e dermica e hanno scoperto che altri additivi^{multimediali 94}, come acidi grassi /lipidi liberi esterni, migliorano lo strato corneo dell'epidermide e migliorano la funzione barriera cutanea. Sebbene i nostri marcatori immunofluorescenti mostrino un'adeguata differenziazione e stratificazione nell'epidermide, a seconda degli studi condotti, potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione dei media. Inoltre, un'analisi approfondita del BM epidermico non è stata condotta durante la valutazione dei VHSE qui presentati. L'integrità del BM è un'indicazione importante degli equivalenti cutanei; vari gruppi hanno svolto ricerche sulla durata della coltura e sui suoi effetti sui segni BM^{95, nonché} sull'analisi della presenza di fibroblasti e sugli effetti aggiunti del fattore di crescita sull'espressione^{BM 14}. È importante notare che l'analisi del componente BM deve essere valutata e ottimizzata quando si utilizza questo protocollo.

In questo protocollo viene descritta una procedura per la generazione VHSE, dimostrando risultati dopo 8 settimane in ALI. Le culture VHSE sono state coltivate fino a 12 settimane in ALI senza notevoli cambiamenti o perdite di vitalità, ed è possibile che possano essere vitali più a lungo. È importante sottolineare che questo protocollo è facilmente adattabile ai tipi di cellule comunemente disponibili, come dimostrato dalla sostituzione dei fibroblasti dermici con fibroblasti polmonari IMR90. A seconda delle esigenze del ricercatore e delle risorse disponibili, i tipi di cellule e le miscele multimediali sulla coltura possono essere regolati, anche se tipi di cellule più dissimili possono richiedere l'ottimizzazione dei supporti. In sintesi, queste procedure hanno lo scopo di fornire chiarezza sulla coltura dei VHSE per lo studio della biologia e delle malattie della pelle. Per massimizzare l'accessibilità, il protocollo è stato sviluppato questo semplice e robusto utilizzando apparecchiature, linee cellulari e reagenti comuni come un approccio efficace minimo che può essere ulteriormente personalizzato in base alle esigenze specifiche degli studi di ricerca.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N NaOH	Fisher Chemical	S318-100	(Dilute from Lab stock)
4% Paraformaldehyde	ACROS Organics	#41678-5000, Lot # B0143461	Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9
Autoclaved forceps	Fine Science Tools	#11295-00	Dumont #5 forceps
CaCl2	Fisher bioreagents	Cat # BP510-250, Lot # 190231	Rnase, Dnase, Protease-Free
Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1)	ATCC	CRL-3243	SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult	ATCC	PCS-201-012	Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90)	ATCC	CCL-186	Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1			Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines.
Centrifuge	Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R		(standard lab equipment)
Computational Software	MATLAB	MATLAB 2020a	MathWorks, Natick, MA.
Confocal Microscope	Leica TCS SPEII confocal		Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy.
Cover Glass (22 x 22)	Fisher Scientific	12-545F	0.13-0.17 mm No.1 Thickness
Cyanoacrylate super glue or silicone grease	Glue Masters	#THI0102	Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred
DMEM media base	Corning; Mediatech, Inc	REF # 10-013-CM; Lot # 26119007	DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
DMEM/F-12 50/50	Corning; Mediatech, Inc	REF # 10-090-CV; Lot # 21119006	DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethanol	Decon Labs	#V1101	(standard lab reagent)
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	Cat # FB12999102, Lot # AE29451050	Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered
Fine tip forceps	Fine Science Tools	#11295-00	Dumont #5 forceps
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218	Made up in 0.1% BSA in PBS
Hydrocortisone	Alpha Easar	Lot # 5002F2A	made up in DMSO
Insulin (human)	Peprotech	Lot # 9352621
Inverted Light/Phase Contrast Microscope	VWR	76317-470	(standard lab equipment)
Isoproterenol	Alfa Aesar	#AAJ6178806	DL-Isoproterenol hydrochloride, 98%
Keratinocyte-SFM (1x) media base	Gibco; Life Technologies Corporation	REF #: 10724-011; Lot # 2085518	Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium
L-Ascorbic Acid	Fisher Chemical	Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7	Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt
L-glutamine (solid)	Fisher Bioreagents	CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9	L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder
MCDB 131 media base	Gen Depot	CM034-050, Lot # 03062021	MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered
Metal punches	Sona Enterprises (SE)	791LP, 12PC	Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8" or 1/2".
Methanol	Fisher Chemical	CAS # 67-56-1	(optional). For clearing dehydration step.
Methyl Salicylate	Fisher Chemical	O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8	(optional). For clearing.
Microtubes, 1.7 mL	Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics	Cat # 24-282; Lot # 19467	1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free
PBS, 10x Culture grade or autoclaved	APEX Bioresearch Products	Cat # 20-134, Lot # 202237	PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated.
PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium	Genesee Scientific Corporation	Ref # 25-508; Lot # 07171015
PBS, 1x non-Culture grade	APEX Bioresearch Products	Cat # 20-134, Lot # 202237	PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water.
Penicillin/Streptomycin	Gibco; Life Technologies Corporation	Ref # 15140-122, Lot # 2199839	Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin)
Petri Dish, glass, small	Corning	PYREX 316060	(optional). To be used as a clearing container
Petri Dishes, 100 mm	Fisher Scientific	FB0875713	Use for making up PDMS.
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	GMID 02065622, Batch # H04719H035	Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI)
	Dow Corning	GMID 02065622, Batch # H047JC4003	DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent
note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components.
Positive Displacement Pipettes (1000 & 250 uL)	Gilson	1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L	M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL
Positive Displacement Tips/Pistons (1000 & 250 uL)	Gilson	1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S	Sterilized capillaries and pistons
Round tipped scoopula			(optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging
Supplements for Keratinocyte-SFM media	Gibco; Life Technologies Corporation	Ref # 37000-015, Lot # 2154180	Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014)
Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 µm pore size	Corning; Costar	REF # 3462 - Clear; Lot # 14919057	Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates,
Tissue Culture Plates, 12 well size	Greiner Bio-one; CellStar	Cat # 665 180; Lot # E18103QT	12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic
Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area	Genesee Scientific Corporation	Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B	Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene
Triton x 100	Ricca Chemical Company	Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34	Wetting agent
Trypsin 0.25%	Corning; Mediatech, Inc	Ref # 25-053-CI	0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate
Type 1 Collagen isolated from Rat tail	Pel-Freez Biologicals	56054-1	Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249)
Vaccum chamber, benchtop	Bel-Art	F42010-0000	(standard lab equipment)
Handheld Precision knife	X-Acto	X3311	(X-Acto knife optional if purchased steel punches)