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Neuroscience

Um ensaio baseado em placas para a medição da liberação de monoamina endógena em fatias cerebrais agudas

Published: August 11, 2021 doi: 10.3791/62127
Automatic Translation
*1, *2, 3, 2
1Department of Medicine, School of Medicine, Universidad de Atacama, 2Department of Molecular, Cellular, and Biomedical Sciences, City University of New York School of Medicine at City College, 3Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Este método introduz uma técnica simples para a detecção de liberação endógena de monoamina usando fatias cerebrais agudas. A configuração usa uma placa de 48 poços contendo um suporte de tecido para liberação de monoamina. A monoamina liberada é analisada pelo HPLC juntamente com a detecção eletroquímica. Além disso, esta técnica fornece um método de triagem para a descoberta de drogas.

Abstract

Neurotransmissores de monoamina estão associados a inúmeras doenças neurológicas e psiquiátricas. Modelos animais de tais condições têm mostrado alterações na liberação e dinâmica de absorção de neurotransmissores de monoamina. Métodos tecnicamente complexos como eletrofisiologia, Voltammetry Ciclílica de Varredura Rápida (FSCV), imagem, microdiálise in vivo, optogenética ou uso de radioatividade são necessários para estudar a função monoamina. O método aqui apresentado é uma abordagem otimizada em duas etapas para detectar a liberação de monoamina em fatias cerebrais agudas usando uma placa de 48 poços contendo suportes teciduais para examinar a liberação de monoamina, e cromatografia líquida de alto desempenho, juntamente com a detecção eletroquímica (HPLC-ECD) para medição de liberação de monoamina. Resumidamente, seções cerebrais de ratos contendo regiões de interesse, incluindo córtex pré-frontal, hipocampo e estriado dorsal foram obtidas usando um cortador de tecido ou vibratome. Essas regiões de interesse foram dissecadas de todo o cérebro e incubadas em um tampão fisiológico oxigenado. A viabilidade foi examinada ao longo do curso de tempo experimental, por 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium brometo (MTT). As regiões cerebrais dissecadas agudamente foram incubadas em diferentes condições de drogas que são conhecidas por induzir a liberação de monoamina através do transportador (anfetamina) ou através da ativação da liberação vesicular exociótica (KCl). Após a incubação, os produtos liberados no supernasciente foram coletados e analisados por meio de um sistema HPLC-ECD. Aqui, a liberação de monoamina basal é detectada pelo HPLC a partir de fatias cerebrais agudas. Esses dados suportam resultados in vivo e in vitro anteriores mostrando que a versão de amph e kcl induzem a liberação de monoamina. Este método é particularmente útil para estudar mecanismos associados à liberação dependente de transporte de monoamina e oferece uma oportunidade de triagem de compostos que afetam a liberação de monoamina de forma rápida e de baixo custo.

Introduction

Uma infinidade de doenças neurológicas e psiquiátricas estão associadas à desregulação ou à manutenção insuficiente do neurotransmissor de monoamina (dopamina [DA], serotonina [5-HT], norrepinefrina [NE]) homeostasis1,2,3. Essas condições incluem, mas não se limitam a, depressão1,2, esquizofrenia2, ansiedade2, vício4, menopausa5,6,7, dor8 e doença de Parkinson3. Por exemplo, vários modelos de ratos da menopausa mostraram que a desregulação ou redução de monoaminas dentro do hipocampo, córtex pré-frontal e estriato podem estar associados tanto à depressão quanto ao declínio cognitivo, que é visto em mulheres que experimentam a menopausa. A desregulação das monoaminas nesses modelos tem sido extensivamente examinada por meio do HPLC-ECD, embora os estudos não discriminaram o conteúdo medido do neurotransmissor versus a liberação de neurotransmissores5,6,7. As monoaminas são liberadas clássicamente no espaço extracelular através da liberação vesicular dependente de Ca2+, e são recicladas de volta através de seu respectivo sistema de recaptação de membrana plasmática (transportador de dopamina, DAT; transportador de serotonina, SERT; transportador de norepinefrina, NET)10,11. Por outro lado, os dados sugerem que esses transportadores são capazes de liberar ou monoaminas efflux, uma vez que drogas de abuso como anfetamina (ANFE) e 3,4-Methylenedioximethamfetamina (MDMA) são conhecidas por liberar DA e 5-HT, respectivamente através de seus sistemas de transporte12,13, 14,15,16,17 . Assim, uma compreensão mecanicista adequada da dinâmica de liberação de monoaminas é crucial para o desenvolvimento de farmacoterapeias específicas e direcionadas.

Uma ampla gama de técnicas foram empregadas para estudar a liberação de monoaminas como a Voltammetry Ciálica de Varredura Rápida (FSCV)18, in vivo microdiálise13, imagem19, pré-inincubtação com monoaminas radiolabeled20, optogenética e, mais recentemente, sensores fluorescentes geneticamente codificados e fotometria21,22 . A microdiálise FSCV e in vivo são as principais técnicas utilizadas para o estudo da liberação de monoaminas. O FSCV é usado para estudar a liberação exocitomática estimulada de, principalmente, DA em fatias cerebrais agudas e in vivo23. Como o FSCV usa eletrodos para estimular ou evocar a liberação, a principal fonte de liberação de neurotransmissores é a liberação vesicular dependente de Ca218,24,25,26,27,28,29,30,31 . A microdiálise in vivo juntamente com o HPLC mede mudanças nos níveis de neurotransmissor extracelular usando uma sonda colocada em uma área cerebral de interesse13,32. Semelhante ao FSCV, uma grande limitação à microdiálise in vivo é a dificuldade em determinar a fonte de liberação de neurotransmissores: liberação vesicular dependente de Ca2+ ou dependente de transporte. Vale ressaltar que ambos os métodos permitem a medição direta da liberação de monoamina. Através do recente avanço da optogenética, pesquisas demonstram a detecção da liberação de 5-HT e DA em um curto espaço de tempo com especificidade requintada do tipo celular21,22. No entanto, essas estratégias requerem técnicas e equipamentos complexos e caros, e medem indiretamente a liberação de monoamina, especificamente através da monoamina que liga aos receptores. Além disso, as monoaminas radiolabeladas também são usadas para estudar a dinâmica da monoamina. As monoaminas radiolabeladas podem ser pré-carregadas em vários sistemas de modelo, como células heterólogas que superexpressam cada transporte monoamina20,33,34,35,36,37,38,39,40, neurônios primários20, sinapstos33,39,41, 42, e cortes cerebrais agudas43,44. No entanto, a radioatividade representa danos potenciais ao experimentador, e os analitos rotulados com trítio podem não recapitular fielmente a dinâmica endógena da monoamina45,46. Sistemas de superfusão combinados com métodos de detecção off-line, como o HPLC-ECD, permitiram a detecção de monoaminas de múltiplas fontes de tecido. Aqui, este protocolo fornece como um método otimizado e de baixo custo, simples e preciso usando fatias cerebrais agudas para medir diretamente a liberação de basal endógeno e estimulada.

As fatias cerebrais agudas permitem testar hipóteses mecanicistas, principalmente porque preservam o microambiente anatômico in vivo, e mantêm sinapses intactas47,48,49,50,51,52. Em alguns estudos, fatias cerebrais agudas ou tecido cerebral picado têm sido usados em conjunto com uma técnica de superfusão usando KCl para estimular a liberação mediada ca2+53,54,55,56. Os sistemas de superfusão têm sido fundamentais para avançar a compreensão do campo sobre os mecanismos de liberação de neurotransmissores, incluindo as monoaminas. No entanto, esses sistemas são relativamente caros, e o número de câmaras disponíveis para análise de tecidos varia de 4 a 12. Em comparação, o método aqui apresentado é barato, permite a medição de 48 amostras de tecido, podendo ser refinado para usar até 96 amostras de tecido. Cada poço dentro da placa de 48 poços contém suportes de tecido que usam filtros para separar o produto liberado do tecido, e as monoaminas liberadas são então coletadas e analisadas pelo HPLC-ECD. É importante ressaltar que este método permite a medição simultânea de 5-HT, DA e NE de diferentes áreas cerebrais, como o córtex pré-frontal, o hipocampo e o estriado dorsal após o tratamento com agentes farmacológicos que modulam a liberação de monoamina. Assim, o experimentador pode responder a várias perguntas usando um sistema multi-poço barato que aumenta o número de amostras testadas e, assim, reduzindo o número de animais utilizados.

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Protocol

Todos os experimentos, incluindo manejo de animais e coleta de tecidos, foram realizados de acordo com a Universidade da Flórida e o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), seguindo o protocolo aprovado 201508873 (UF) e 1071 (CCNY). Para reagentes e tampão, consulte o Arquivo Suplementar.

1. Prepare fatias agudas do cérebro de ratos

NOTA: Neste experimento foram utilizados ratos machos adultos (250-350 g). No entanto, essa configuração é funcional para diferentes pontos de desenvolvimento, ratos fêmeas e outras espécies. Se usar um animal menor, como ratos, o experimentador pode ajustar-se para otimizar o protocolo usando um número diferente de fatias cerebrais ou socos por condição. O buffer de dissecção será referido como Buffer 1; o buffer efflux será referido como Buffer 2.

  1. Prepare o Buffer 1 conforme mencionado no Arquivo Suplementar. Tampão saturado 1 com oxigênio borbulhando com 95%/5% (O2/CO2) por 20 min no gelo. Remova 50 mL de Buffer 1 e esfrie no gelo em um pequeno béquer ou uma placa de Petri. Este tampão é usado para segurar o cérebro inteiro colhido agudamente.
  2. Anestesiar um ou dois ratos adultos (250-350 g) com 1%-2% de isoflurane, decapitá-los usando uma guilhotina e remover rapidamente seus cérebros. Coloque imediatamente o cérebro no tampão oxigenado gelado 1 no recipiente a partir do passo 1.1.
    NOTA: Certifique-se de que isoflurano e guilhotina sejam usados com segurança. Isoflurano aberto sob um capô de fumaça.
  3. Usando um vibratome ou compresstome, corte 300 μm de seções cerebrais coronais de cada região de interesse (Figura 1). Tampão borbulhante 1 deve estar presente enquanto as seções estão sendo feitas. Usando uma espátula de aço inoxidável, transfira cuidadosamente e imediatamente fatias cerebrais em uma nova placa de Petri cheia de tampão oxigenado gelado 1 (Figura 2).
  4. Mais dissecar fatias cerebrais (por exemplo, socos, corte) movendo cuidadosamente as fatias para lâminas de vidro (Figura 1G) usando atlas cerebral de rato57. Por exemplo, identifique o estriado dorsal baseado em sua estrutura escura e estriada, e identifique o hipocampo com base em sua proximidade com o córtex e estrutura espiral única. Os hemisférios direito e esquerdo podem ser separados para usar como controle e fatias experimentais (Figuras 2G - H). Aqui, o estriado dorsal foi ainda dissecado em socos de 2 mm (Figura 1G).
  5. Usando uma pipeta de transferência de plástico com a ponta cortada, transfira fatias ou socos cerebrais em pequenos recipientes imersos em buffer 1 gelado oxigenado com borbulhante de oxigênio. Estes recipientes podem ser de malha de aço inoxidável, ou pequenas placas de Petri cheias de tampão (Figura 1H).

2. Liberação de monoamina endógena ex-vivo de fatias cerebrais ou socos

NOTA: O dispositivo utilizado para esta seção consiste em uma placa de 48 poços e um suporte de tecido feito de seis unidades de filtro de microcentrifuuagem sem os filtros de inset conectados a uma linha de carbogen (Figura 2). Para fazer o suporte, use uma haste de plástico resistente (por exemplo, de um raspador de célula) e super cole as unidades do filtro de microcentrifuagem sem os filtros de entrada para ele. Deixe secar por 1-2 dias. O tempo necessário para o experimento de liberação endógena da monoamina e concentrações de anfetamina, fluoxetina e cocaína são baseados na literatura atual e protocolos anteriores13,20,58.

  1. Ativação tecidual
    1. Transfira o tecido cerebral da etapa 1.1.5 para cada poço da câmara efflux e permita a recuperação por 30-50 min a 37 °C em um aquecedor de slides em 0,5-1 mL de Buffer 2 oxigenado, com borbulhamento constante e suave (Figura 2B1).
    2. Durante esta incubação, diluir as drogas à concentração desejada para o experimento. Todas as drogas devem ser dissolvidas no Buffer 2, e as concentrações são baseadas na literatura atual.
  2. Primeira incubação
    1. Mova o suporte tecidual com tecido cerebral para poços contendo 500 μL de Buffer oxigenado 2 e incubar por 20 min a 37 °C. Certifique-se de que o mínimo para nenhum buffer seja transportado tocando no suporte na borda do poço até que não haja excesso de buffer no suporte.
    2. Em experimentos com agentes farmacológicos, como inibidores de transporte de monoamina, incubar as amostras de tecido com as drogas diluídas no Buffer 2 oxigenado (por exemplo, 10 μM fluoxetina, 40 μM de cocaína; ver Figura 2B2). O volume final em cada poço será de 500 μL.
  3. Segunda incubação
    1. Mova o suporte com o tecido para um novo conjunto de poços contendo 500 μL total Buffer 2 com ou sem a concentração desejada de cada droga. Certifique-se de que não há excesso de sobra de buffer. Cada poço representa um n = 1 para condições experimentais. Cada condição experimental é realizada em triplicado.
    2. Um poço inclui um Buffer 2 oxigenado, o próximo 10-30 μM AMPH, e o poço final inclui 10-30 μM AMPH mais inibidores de transporte de monoamina. Cada droga é dissolvida em Buffer 2 oxigenado.
    3. Incubar o tecido por 20 min a 37 °C com 500 μL da condição da droga.
      NOTA: Poços adicionais podem incluir um buffer K+ alto Oxigenado com ou sem os inibidores do transporte de monoamina. Dissolva cada droga no Buffer oxigenado 2 (500 μL).
    4. Durante esta segunda incubação de 20 min, colete a solução dos poços da primeira incubação na etapa 2.2.1 e transfira para tubos de microcentrifuuge contendo 50 μL de ácido polelorico de 1 N ou ácido fosfórico (dependente do tipo de HPLC, concentração final 0.1 N). O volume final da amostra será de 550 μL. Mantenha tubos de microcentrifuuge no gelo e rotule os tubos #1.
    5. Após a segunda incubação de 20 minutos, mova o suporte de tecido com seções cerebrais ou socos para um poço vazio e mantenha a placa no gelo. Transfira o supernatante para tubos de microcentrifuuge contendo 50 μL de ácido per polemérico de 1 N ou ácido fosfórico. O volume final da amostra será de 550 μL. Mantenha tubos de microcentrifuuge no gelo e rotule os tubos #2.
    6. Adicione 1 mL de tampão gelado 1 a cada tecido que contenha poços. Colete todo o tecido usando pinças pequenas e transfira para limpar tubos de microcentrifuuuagem.
    7. Mantenha tubos com tecido cerebral a -80 °C. Descarte os 1 mL de Tampão 1 (Figura 2B4).
    8. Soluções de filtro obtidas a partir de cada incubação utilizando tubos de filtro de microcentrifuuge (0,22 μm) a 2.500 x g por 2min. Use o filtrado para determinar o teor de monoamina usando HPLC com detecção eletroquímica (Figura 2B5).

3. Viabilidade tecidual

  1. Ensaio MTT
    NOTA: Uma preocupação significativa em relação a esta configuração experimental é a viabilidade tecidual, pois o tecido pode ser usado por até várias horas59. Um ensaio MTT60,61 é usado para determinar a viabilidade tecidual até o final da experimentação. Este ensaio baseia-se na conversão do sal de tetrazolium amarelo MTT (3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium brometo) em cristais de formazan roxo por células viáveis com metabolismo adequado.
    1. O experimento pós-experimento mantém um grupo separado de amostras de tecido e as separa em dois grupos.
    2. Incubar um grupo por 20 min a 37 °C em Tritão X-100 (1%) dissolvido no Buffer 2 como controle. O tratamento triton X-100 resulta em morte celular. Mantenha o segundo grupo no Buffer 2 e não incubar em Triton X-100 (controle de viabilidade tecidual).
    3. Adicionar MTT (solução de estoque 5 mg/mL em PBS, pH 7.4) a ambos os grupos no Buffer oxigenado 2 a uma concentração final de 0,5 mg/mL.
    4. Incubar as amostras de tecido por 20 min a 37 °C, lavar com PBS e transferir para tubos de microcentrifuuge contendo 250 μL de uma mistura de SDS (10%, w/v), DMF (25%, v/v) e água para dissolver os cristais formazan.
    5. Incubar as amostras por 24 h.
    6. Centrifugar os tubos a 10.000 x g por 10 min e medir a absorvência do supernante (200 μL) a 562 nm e 690 nm usando um leitor de microplape. A viabilidade tecidual é calculada da seguinte forma: (A562-A690)/peso tecidual.

4. Análise HPLC de monoaminas

  1. Quantifique a liberação de monoamina de cada condição experimental usando o HPLC-ECD de acordo com protocolos anteriores13,44, usando uma coluna de fase inversa.
    1. Prepare a fase móvel necessária para detecção. Este é composto por ácido fosfórico de 100 mM, ácido cítrico de 100 mM, 0,1 mM EDTA-Na2, 600 mg/L ácido octanesulfônico, 8% v/v acetonitrila (pH final 6.0). A composição da fase móvel depende do tipo de HPLC e coluna utilizada.
    2. Defina o potencial do detector eletroquímico (eletrodo de carbono de 2 mm glassy,) para 0,46 V, e defina a vazão para 0,05 mL/min.
    3. Carregar 5 μL de cada amostra, incluindo padrões de neurotransmissores no HPLC para autoinjeção e detecção. A quantidade de cada amostra adicionada depende do tipo de HPLC utilizado.
    4. Uma vez que o HPLC tenha concluído a execução, use o software de análise HPLC dado para adquirir e analisar os dados do cromatógrafo.
    5. Analise o teor de monoamina usando uma curva padrão composta por cada monoamina (Dopamina: DA, Norepinephrine: NE e Serotonina: 5-HT; Figura 2C). Use os cromatógrafos resultantes para obter a área sob a curva (AUC) com base nas diretrizes do fabricante.

5. Preparar tecidos para quantificação de proteínas

  1. Ensaio de proteína
    1. Adicione tampão de lise gelada mais inibidores de protease (0,1 g/1 mL) a cada tubo de microcentrífuga contendo seções/socos cerebrais e homogeneize usando um homogeneizador de pilão. Os tubos de microcentrifuuge devem ser mantidos no gelo enquanto homogeneizam para evitar a degradação da proteína.
    2. Incubar o tecido homogeneiza por 1h a 4 °C com rotação de luz.
    3. O tecido centrífuga homogeneiza a 16.000 x g por 15 min a 4 °C e recupera o sobrenante.
    4. Determine a concentração de proteínas nos supernantes, com albumina de soro bovino (BSA) como padrão.
    5. Normalize o teor de monoamina em cada amostra cerebral para o teor total de proteína (μg) medido em 250 μL de tecido cerebral lysed. Use a fórmula abaixo para determinar a proteína nmol monoamina/g. df = fator de diluição.

Equation 1

6. Análise estatística

  1. Analise a liberação de monoamina (nmol/g) usando ANOVA unidirecional seguido do teste de comparações múltiplas de Sidak para comparações pós-hoc.
  2. Analise a viabilidade do tecido usando o teste t de um aluno não remunerado para grupos independentes (Controle vs. 1% Triton X-100).
  3. Para todas as análises estatísticas, coloque o nível alfa para ≤ 0,05.

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Representative Results

Esta técnica descreve o uso de fatias cerebrais para medir a liberação de monoaminas endógenas usando HPLC com detecção eletroquímica baseada em uma placa de 48 poços com um suporte interno de tecido. A configuração experimental é retratada na Figura 1 e Figura 2. Inicialmente, para garantir a viabilidade tecidual até o final da experimentação, foi realizado um ensaio de MTT (4-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium, um tetrazole. Após experimentos funcionais, as fatias cerebrais agudas são metabolicamente ativas e permanecem viáveis em comparação com aquelas que são incubadas com 1% Triton X-100, uma condição de morte celular (Figura 3).

Aguda, 20 min, o tratamento de seções cerebrais hipocampais e pré-frontais com AMPH induz um aumento significativo nos níveis extracelulares de cada monoamina (Figura 4A,B). AMPH (30 μM) aumentou o nível de 5-HT extracelular de fatias hipocampais e fatias de córtex pré-frontal em 220 vezes e 64 vezes, NE extracelular por 19 vezes e 8 vezes, e DA extracelular em 8 vezes e 7 vezes, respectivamente. Experimentos semelhantes foram realizados na presença de fluoxetina (10 μM), um inibidor seletivo de recaptação de serotonina. A inibição do SERT com fluoxetina evita o aumento do 5-HT extracelular induzido pela AMPH tanto no hipocampo quanto no córtex pré-frontal. Em contraste, a fluoxetina não impacta o efeito de AMPH em DA ou NE extracelular nas mesmas áreas cerebrais, consistente com sua seletividade para SERT (Figura 4A,B). Todas as condições experimentais foram realizadas em triplicado.

A liberação de monoaminas de socos de estriato dorsal de 2 mm foram medidas em seguida. Aguda, 20 min, o tratamento de socos de estriato dorsal com AMPH (10 μM) induz um aumento de 35 vezes nos níveis extracelulares de DA (Figura 4C) sobre os níveis basais. A detecção da DA foi focada no estriato dorsal devido aos níveis basais mais baixos de 5-HT e NE relatados anteriormente nesta região62,63. Assim, o AMPH induz um pequeno aumento dependente de dose no 5-HT extracelular em comparação com os níveis de DA extracelulares induzidos pelo AMPH (dados não mostrados). A incubação de socos de estriato dorsal com cocaína (40 μM), um bloqueador de transporte de monoamina, resultou em uma inibição significativa da DA extracelular induzida por AMPH quando comparada a socos incubados unicamente com AMPH (Figura 4C). Esses dados suportam ainda mais achados anteriores indicando que o DA induzido pela AMPH efflux através do DAT16.

Finalmente, para demonstrar a liberação exocitotótica de monoaminas, as seções cerebrais foram incubadas com KCl (40 mM). Aumentar a concentração de KCl extracelular para evocar a despolarização da membrana via incubação com 40 mM de CTI é suficiente para induzir a liberação exocintótica de monoaminas quando comparada com as condições de controle (Figura 5). Nem a fluoxetina nem a cocaína bloqueiam o aumento dos níveis extracelulares de monoaminas induzidas pela despolarização da membrana KCl.

Figure 1
Figura 1: Corte cerebral aguda de rato e preparação de secção. (A) Um cérebro de rato é colocado em uma matriz cerebral. Um corte superior denota a parte superior do quiasmo óptico; o corte inferior é 3 mm posterior da base do hipotálamo. Foram feitos cortes para remover o hipocampo e o estriado, e para garantir uma base horizontal para colar o espécime ao compresstome ou vibratome com segurança antes do corte. (B-D) A super cola se espalhou ao redor da base do palco, os cérebros foram colados, imediatamente cobertos com agarose, e a agarose foi solidificada usando o grampo congelado em (D). (E-F) Uma compresstome foi usada para fazer fatias de 300 μm para o cérebro de rato, e fatias foram colocadas em tampão oxigenado até o uso. (G) Seções foram colocadas em um slide e foram feitos socos de 2 mm do estriado dorsal. (G) Os sodas do estriato dorsal (superior), recortes do hipocampo (meio) e recortes do córtex (inferior) são mantidos a 4 °C em tampão de dissecção oxigenada antes de iniciar experimentos funcionais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuração experimental para experimento efflux. (A) A câmara efflux consiste em uma placa de cultura tecidual de 48 poços e uma bandeja de suporte de tecido conectada à linha carbogen. (B) Um diagrama mostrando o desenho experimental para o experimento efflux de monoamina endógena no qual a ativação tecidual (B1), pré-incubação com/sem inibidores de transporte de monoamina (B2), experimento efflux (B3) e o processamento final da amostra são apresentados (B4-B5). (C) O painel à esquerda mostra um experimentador carregando o perfusato no HPLC em preparação para injeção automática. O painel da direita mostra um cromatógrama representativo denotando os picos padrão da monoamina. A área sob a curva (AUC) é medida para cada padrão de monoamina e amostras cerebrais. Após a calibração, o AUC medido para cada amostra cerebral é convertido em concentração de NM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: As fatias agudas do cérebro eram viáveis no final da experimentação. Um ensaio MTT foi realizado para determinar a viabilidade tecidual e comparado com Triton X-100 1%, o que induz a morte celular. O resultado do ensaio MTT mostrou que, ao final de 6h, as amostras de tecido ainda eram viáveis. Os resultados são expressos como a média ± SEM (N = 6). P < 0,0001, teste t não pago. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: A anfetamina induz a liberação de monoamina em fatias cerebrais agudas do hipocampo, córtex pré-frontal e socos do estriado dorsal. (A-B) As fatias de hipocampal e córtex pré-frontal incubadas em 30 μM AMPH resultam em um aumento significativo na liberação de 5-HT, DA e NE. A fluoxetina inibe significativamente a liberação de 5-HT, mas não tem impacto na liberação de DA ou NE nessas regiões. (C) 2 mm socos de estriatum dorsal foram incubados em cocaína (40 μM) ou AMPH (30 μM). A ANF estimulou a liberação da da DA e o pré-tratamento com cocaína levou a uma redução significativa da liberação da DA induzida pelo AMPH. Todas as medidas estão em nmol/g de proteína. As estatísticas representam um ANOVA unidirecional seguido pelo teste de comparação múltipla de Sidak. Os resultados são expressos como a média ± SEM (N = 6). As estatísticas representam um ANOVA unidirecional com o teste de comparação múltipla de Sidak (** p = 0,01, *** p = 0,001, **** p = 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Alto K+ extracelular resulta em liberação de monoamina através da despolarização da membrana. (A-B) KCl (40 mM) induz a despolarização da membrana e a liberação de todas as três monoaminas no HPC e PFC. Em ambas as áreas cerebrais, o pré-tratamento com fluoxetina (10 μM) não afeta o efeito do KCl na liberação extracelular da monoamina. (C) KCl (40 mM) induz a despolarização da membrana e a liberação de DA no estriado dorsal, e o pré-tratamento com cocaína (40 μM) não afeta o efeito da LCL na liberação da DA. As estatísticas representam um ANOVA unidirecional seguido pelo teste de comparação múltipla de Sidak. Os resultados são expressos como a média ± SEM (N = 6). As estatísticas representam um ANOVA unidirecional com o teste de comparação múltipla de Sidak (***p < 0,001, ****p < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Complementar: Receitas para buffers e soluções. Clique aqui para baixar este arquivo. 

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Discussion

As medidas de liberação de monoaminas têm sido realizadas durante anos em vários sistemas como células heterólogas, culturas neuronais, sinapstosas cerebrais, fatias cerebrais agudas ex vivo e animais inteiros13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 . Tais preparações permitiram que o campo da neurociência explorasse mecanismos básicos de liberação de neurotransmissores que podem levar à descoberta de novos agentes farmacológicos para distúrbios neurológicos e psiquiátricos onde as monoaminas desempenham um papel. Apesar do amplo uso desses métodos, existem certas limitações quanto à fonte e/ou à quantidade de liberação endógena da monoamina, particularmente em procedimentos radioativos. Além disso, as preparações de corte cerebral ex vivo aguda têm sido amplamente utilizadas em conjunto com abordagens eletrofisiológicas, farmacológicas, genéticas, moleculares, imunocitômicas e outras abordagens18,24,25,47,50,51,59,69,70 , pois preservam a arquitetura tecidual, e retêm tanto a atividade neuronal quanto as conexões sinápticas. Assim, as fatias cerebrais oferecem vantagens excepcionais quando comparadas com outros modelos in vitro, como sistemas heterologos, neurônios cultivados primários e sináttoses. Em grande parte, sua vantagem é que esses sistemas podem reproduzir muitos aspectos do ambiente in vivo.

Sensores eletrofisiológicos, optogenéticos, fluorescentes e abordagens voltamétricas oferecem resolução temporal e espacial requintada para examinar mecanismos associados à liberação de monoamina, particularmente DA. No entanto, a premissa básica para o uso dessas abordagens é que a estimulação elétrica ou induzida pela luz dos neurônios induz a liberação vesicular exociótica clássica e bem documentada dependente do cálcio de neurotransmissores18,21,22,24,27,30. Uma das limitações mais perceptíveis dessas abordagens é que as monoaminas liberadas por meio de mecanismos alternativos (ou seja, liberação não vesicular) não são detectadas por essas técnicas. Moléculas de neurotransmissores radiolabeled também têm sido usadas para estudar a liberação de monoamina, mas essa abordagem tem limitações significativas. As células ou amostras de tecido são carregadas com concentrações não fisiológicas de neurotransmissores rotulados que não recapitulam fielmente o ambiente nativo20,42,46. Curiosamente, alguns estudos documentam o uso de fatias cerebrais em sistemas de superfusão para examinar a liberação endógena da monoamina53,54,56. No entanto, esses estudos usam neurotransmissores radioativos, e aqueles que examinam o neurotransmissor endógeno focam apenas em condições K+ e não fisiológicas para induzir a liberação de neurotransmissores.

O método atualmente apresentado pode ser usado para examinar a liberação de monoamina mediada por transporte de tecido nativo. Isso permite que o experimentador supere as limitações dos neurotransmissores tritiados. Além disso, esta abordagem fornece uma configuração simples para medir a liberação endógena de monoamina com mais precisão através de uma detecção direta de monoaminas em vez da medição indireta ao usar sensores fluorescentes ou monoamina com rótulo de radiolafina. Está bem estabelecido que a anfetamina atua como um agente de liberação de transporte de monoamina no córtex pré-frontal71, estriatum dorsal56,72 e hipocampal39 regiões cerebrais. Estes achados foram confirmados usando este sistema de placas de 48 poços. Além disso, este método pode ser um suplemento aos métodos atualmente utilizados que medem o conteúdo total de monoamina usando HPLC-ECD, mas não examinaram a liberação de monoamina5,6,7. Este método fornece um novo aerador projetado para medir a liberação endógena de monoaminas de fatias cerebrais agudas usando HPLC juntamente com detecção eletroquímica.

Ao usar este método, é fundamental que os tecidos cerebrais sejam mantidos frios em tampão oxigenado durante o experimento para evitar a deterioração. Além disso, é crucial que os tecidos utilizados sejam ativados em um tampão contendo pargyline para evitar a degradação da monoamina. Além disso, o experimentador pode ter que solucionar vários aspectos deste método. Primeiro, dependendo do ponto de tempo do desenvolvimento ou espécies do animal, pode-se precisar criar seções menores ou maiores ou usar mais ou menos seções, fatias ou socos por condição. Em segundo lugar, dependendo da região cerebral de interesse, haverá quantidades variadas de cada neurotransmissor. Em terceiro lugar, embora seja fundamental garantir uma bolha consistente de oxigênio quando observado, o experimentador deve ter o cuidado de não fornecer oxigenação excessiva, pois isso pode levar à remoção acidental do tecido do poço. Finalmente, como existem vários tipos de dispositivos HPLC e diferentes colunas de separação, o experimentador terá que determinar, com base na literatura, qual dispositivo ou coluna funcionaria melhor para sua experiência.

Embora este método forneça ao experimentador a capacidade de obter dados ex-vivo rápidos e precisos sobre a liberação de monoaminas endógenas, existem limitações que devem ser mantidas em mente. Como se trata de uma abordagem ex vivo, redes e conexões são cortadas, portanto, as fatias ou socos não são representativos de um sistema intacto. Outra limitação importante dessa abordagem é a falta de temporal, e a resolução espacial como liberação de monoamina é medida em uma escala de tempo de minutos, e de uma população de locais de liberação. O refinamento futuro da abordagem pode permitir uma otimização da resolução de tempo e espaço. Experimentos adicionais também examinarão os mecanismos associados aos eventos de liberação. Tendo demonstrado a validade do método atual, experimentos futuros exigirão dissecar os eventos moleculares que levam à liberação da monoamina. Experimentos adicionais incluirão buffer efflux sem Ca2+free e inibidores seletivos de liberação vesicular como controles adicionais. Como a distribuição regional das monoaminas e seus transportadores são três eventos independentes, experimentos futuros devem incorporar uma farmacologia mais extensa e um estudo de curso de tempo, uma vez que diferentes condições de medicamentos podem exigir tempos de incubação mais curtos ou mais longos. Por exemplo, com base na distribuição regional ou tipo de tecido utilizado, outros experimentos podem usar bloqueadores farmacológicos mais específicos para NET, SERT ou DAT, como desipramina, fluoxetina e GBR12909, respectivamente. Além disso, embora o tecido tenha permanecido viável durante todo o experimento, o experimentador é incapaz de descartar a possibilidade de que a função de transporte de monoamina possa ter sido afetada durante toda a duração de todo o processo. O equipamento necessário para este método é de baixo custo, no entanto, é necessário ter acesso a um HPLC-ECD caro. Isso pode ser mitigado por instalações principais, já que muitos atualmente têm acesso a HPLC-ECDs para uso comunitário. Apesar dessas limitações, o método atual fornece um procedimento fundamental, que pode ser ainda mais manipulado para investigar a liberação de monoamina.

Em geral, este método fornece um procedimento simples, de alto rendimento e de baixo custo em duas etapas para avaliar a liberação simultânea de monoaminas de neurônios roedores adultos usando fatias cerebrais agudas ex vivo de diferentes regiões cerebrais. Idealmente, esse método pode ser combinado com protocolos in vivo, e fornece dados preliminares, permitindo assim que o experimentador diminua o número de animais necessários nos modelos in vivo, conforme recomendado nos "três Rs" (Substituição, Redução e Refinamento) do bem-estar animal. Assim, é viável implementar essa plataforma ex vivo para a triagem de moléculas potencialmente terapêuticas com o objetivo de descobrir novos agentes farmacológicos para o tratamento de condições associadas à desregulamentação na homeostase monoamina.

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Disclosures

Os autores não têm revelações.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Fondecyt Initiation Fund N 11191049 a J.A.P. e NIH grant DA038598 à G.E.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48 Well plate NA NA Assay
Acetonitrile Fischer Scientific A998-1 Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous Sigma Aldrich C1016 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software Anetc
Citric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
D-(+)-Glucose Sigma 1002608421 Dissection Buffer
DMF Sigma Aldrich D4551 MTT Assay
EDTA-Na2 Sigma Aldrich Mobile Phase
GraphPad Software Graphpad Software, Inc Statistical Analysis
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Lysis buffer
HEPES Sigma Aldrich H3375 Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric Anetc HPLC, LC-EC system
HPLC Amuza HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid Sigma Aldrich A5960 Dissection Buffer
Magnesium Sulfate Sigma 7487-88-9 KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree Millipore C7554 Assay - 6 to fit in 48 well plate
MTT Thermo Fisher M6494 MTT Assay
Nanosep VWR 29300-606 Assay; protein assay
Octanesulfonic acid Sigma Aldrich V800010 Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate Sigma Aldrich P8013 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
Potassium Chloride Sigma 12636 KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic Sigma 1001655559 KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z Precissonary Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P2714 Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761 Dissection Buffer
Sodium Chloride Sigma S3014 KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma Aldrich L3771 Lysis buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 MTT Assay / Lysis buffer

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Um ensaio baseado em placas para a medição da liberação de monoamina endógena em fatias cerebrais agudas
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Pino, J. A., Awadallah, N., Norris, A. M., Torres, G. E. A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (174), e62127, doi:10.3791/62127 (2021).

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