Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Sarcomere تقصير متعدد القدرات خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية باستخدام الفلورسنت الموسومة بروتينات ساركومير.

Published: March 3, 2021 doi: 10.3791/62129
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 4, 4, 1, 1
1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics, Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering, Chuo University
* These authors contributed equally

Summary

يمكن استخدام هذه الطريقة لفحص تقصير الساركومير باستخدام خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات مع بروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت.

Abstract

يمكن إنتاج خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات (PSC-CMs) من كل من الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة متعددة القدرات (ES/iPS). توفر هذه الخلايا مصادر واعدة لنمذجة أمراض القلب. لأمراض عضلة القلب، وتقصير ساركومير هي واحدة من التقييمات الفسيولوجية القياسية التي تستخدم مع خلايا القلب الكبار لفحص الأنماط الظاهرية مرضهم. ومع ذلك، فإن الأساليب المتاحة ليست مناسبة لتقييم انكماش PSC-CMs، لأن هذه الخلايا لديها ساركوميرات متخلفة غير مرئية تحت المجهر التباين المرحلي. ولمعالجة هذه المسألة وإجراء تقصير الساركومير باستخدام PSC-CMs، استخدمت بروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت والتصوير الحي الفلوري. رقيقة Z-خطوط وخط M يقيمون في كلا الطرفين ووسط ساركومير، على التوالي. تم وضع علامات على بروتينات Z-line — α-Actinin (ACTN2) وTelethonin (TCAP) وبروتين LIM المرتبط بال أكتين (PDLIM3) - وبروتين واحد من خط M - Myomesin-2 (Myom2) - ببروتينات فلورية. يمكن التعبير عن هذه البروتينات الموسومة من الأليل الذاتية كطرق أو من الفيروسات المرتبطة بال أدينو (AAVs). هنا، نقدم طرق للتمييز بين الماوس والخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات لخلايا القلب، لإنتاج AAVs، وإجراء وتحليل التصوير الحي. كما نقوم بوصف طرق إنتاج طوابع البوليديمثيلسيلوكسيان (PDMS) لثقافة منقوشة من PSC-CMs ، مما يسهل تحليل تقصير الساركومير مع البروتينات الموسومة بالفلورسنت. لتقييم تقصير الساركومير، تم تسجيل صور الفاصل الزمني للخلايا النابضة بمعدل إطار مرتفع (50-100 إطار في الثانية) تحت التحفيز الكهربائي (0.5-1 هرتز). لتحليل طول الساركومير على مدار انكماش الخلية ، تعرضت الصور المسجلة الفاصل الزمني لSarcOptiM ، وهو مكون إضافي ل ImageJ / فيجي. توفر استراتيجيتنا منصة بسيطة للتحقيق في الأنماط الظاهرية لأمراض القلب في PSC-CMs.

Introduction

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفيات في جميع أنحاء العالم1 واعتلال عضلة القلب يمثل السبب الثالث للوفيات المرتبطة بالقلب2. اعتلال عضلة القلب هو مجموعة جماعية من الأمراض التي تؤثر على عضلات القلب. فتحت التطورات الأخيرة للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) والتمايز الموجه لخلايا iPS نحو خلايا القلب (PSC-CMs) الباب لدراسة خلايا القلب مع جينوم المريض كنموذج في المختبر لاعتلال عضلة القلب. ويمكن استخدام هذه الخلايا لفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض القلب، لتوضيح آلياتها الجزيئية، واختبار المرشحين العلاجية المختلفة3. هناك كمية هائلة من الاهتمام، وبالتالي، تم إنشاء خلايا iPS المشتقة من المريض (على سبيل المثال، اعتلال عضلة القلب الإفراطي [HCM]4،5، اعتلال عضلة القلب البطيني الأيمن غير المهيء بالقلب [ARVC]6، اعتلال عضلة القلب المتوسع [DCM]7، وأمراض القلب الميتوكوندريا ذات الصلة8،9). لأن واحدة من خصائص اعتلال عضلة القلب هو الخلل الوظيفي وتعطيل ساركومير، وهناك حاجة إلى أداة صالحة أن يقيس بشكل موحد وظيفة ساركومير.

تقصير ساركومير هو الأسلوب الأكثر استخداما لتقييم وظيفة الساركومير وانقباض خلايا القلب الكبار المستمدة من النماذج الحيوانية والبشر. لتنفيذ تقصير الساركومير، مطلوب ساركومير متطورة التي هي مرئية تحت مرحلة التباين. ومع ذلك، PSC-CMs مثقف في عرض المختبر ساركومير المتخلفة وغير منظمة، وبالتالي، غير قادرين على استخدامها لقياس ساركومير تقصير10بشكل صحيح . هذه الصعوبة في تقييم بشكل صحيح انقباض PSC-CMs يعوق استخدامها كمنصة لتقييم وظائف القلب في المختبر. لتقييم انكماش PSC-CMs بشكل غير مباشر ، تم استخدام مجهر القوة الذرية ، وصفائف البريد الدقيق ، والفحص المجهري لقوة الجر ، وقياسات المعاوقة لقياس آثار الحركة التي تمارسها هذه الخلايا على محيطها11،12،13. يمكن استخدام تسجيلات تصوير الفيديو المجهرية الأكثر تطورا والأقل غزوا للحركة الخلوية الفعلية (على سبيل المثال ، SI8000 من SONY) لتقييم قابليتها للانقباض بدلا من ذلك ، ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لا تقيس حركة الساركومير مباشرة أو قوة توليد الحركية14.

لقياس حركة الساركومير مباشرة في PSC-CMs ، تظهر نهج جديدة ، مثل وضع علامات الفلورسنت على بروتين الساركومير. على سبيل المثال، يستخدم Lifeact لتسمية أكتين خيوط (F-أكتين) لقياس حركة ساركومير15،16. خلايا iPS المعدلة وراثيا هي خيار آخر لوضع علامات على بروتينات الساركومير (على سبيل المثال، α-أكتينين [ACTN2] وميوميسين-2 [MYOM2]) بواسطة البروتين الفلوري17،18،19.

في هذه الورقة، ونحن نصف كيفية إجراء التصوير الفاصل الزمني لقياس تقصير الساركومير باستخدام Myom2-TagRFP (الماوس الجذعية الجنينية [ES] الخلايا) وACTN2-mCherry (خلايا iPS الإنسان). كما نظهر أن الثقافة المنقوشة تسهل محاذاة الساركومير. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بوصف طريقة بديلة لوضع العلامات على الساركومير، باستخدام الفيروسات المرتبطة بال أدينو (AAVs)، والتي يمكن تطبيقها على نطاق واسع على خلايا iPS المشتقة من المريض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات الماوس

  1. صيانة خلايا الماوس ES
    1. صيانة المتوسطة: مزيج 50 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS)، 5 مل من L-ألانين-L-الجلوتامين، 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 5 مل من 100 مليون صوديوم بيروفاتي، و 909 ميكرولتر من 55 مليون 2-ميركابتوثانول مع 450 مل من غلاسكو الحد الأدنى المتوسط الأساسي (GMEM). ملحق عامل مثبطة لسرطان الدم (LIF), CHIR-99021, و PD0325901 في تركيز نهائي من 1000 U/mL, 1 ميكرومتر, و 3 ميكرومتر, على التوالي. تعقيم المتوسطة من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
    2. FBS المتوسطة: مزيج 55 مل من FBS, 5.5 مل من L-ألانين-L-الجلوتامين, 5.5 مل من بيروفات الصوديوم, و 5.5 مل من NEAA إلى 500 مل من دولبيكو متوسط النسر المعدلة (DMEM) ارتفاع الجلوكوز. يخيط الوسط من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
    3. ثقافة SMM18 الماوس ES الخلايا التي تم طرقت TagRFP في موقع Myom2 على طبق الجيلاتينية 6 سم في وسط الصيانة كما هو موضح سابقا18. مرور كل 2-3 أيام.
  2. إعداد وسيطة التمايز الخالي من المصل (SFD)
    1. باسال SFD: مزيج 250 مل من هام F-12, 750 مل من المتوسط دولبيكو المعدلة إيسكوف (IMDM), 10 مل من B27 الملحق ناقص فيتامين (أ), 5 مل من ملحق N2، 10 مل من L-ألانين-L-الجلوتامين، 5 مل من 10٪ ألبوم مصل البقر في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS)، و 10 مل من البنسلين والستربتوميسين (10,000 U/mL). تصفية من خلال مصفاة 0.22 ميكرومتر لتعقيم.
    2. حل حمض الأسكوربيك في 5 ملغ / مل في الماء المقطر ومرشح من خلال مصفاة 0.22 ميكرومتر لتعقيم.
    3. تمييع 13 ميكرولتر من 1-ثيوغليسيرول إلى 1 مل من IMDM. هنا، تشير إلى هذا المخفف 1-ثيوغليسيرول كما MTG.
    4. أضف 10 ميكرولتر من حمض الأسكوربيك (5 ملغم/مل) و3 ميكرولتر من MTG إلى 1 مل من SFD القاعدي في يوم الاستخدام. هنا، تشير إلى هذا الخليط كما SFD كاملة.
  3. اليوم 0، تكوين الجسم الجنيني (EB) للتمايز
    1. حصاد SMM18 الماوس ES الخلايا مع بروتياز التربسين مثل المؤتلف (rTrypsin) والعد الخلايا.
    2. الطرد المركزي 5 × 105 خلايا في 300 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية، وإعادة الإنفاق في 10 مل من SFD كاملة، والبذور في طبق بيتري 10 سم. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 50 ساعة.
  4. يوم التمايز 2
    1. إضافة أكتيفين A، عامل النمو البطاني الوعائي البشري (hVEGF)، والبروتين مورفوجينيتي العظام 4 (BMP4) لإكمال SFD بتركيز نهائي من 5 نانوغرام / مل، 5 نانوغرام / مل، و 1.9 نانوغرام / مل، على التوالي.
      ملاحظة: قد تختلف تركيزات BMP4 اعتمادا على الكثير من BMP4. اختبر عدة تركيزات في تجربة صغيرة النطاق قبل استخدام الكثير الجديد وحدد أفضل تركيز للتمايز القلبي.
    2. نقل EBs من طبق بيتري إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي في 50-100 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية.
    3. وفي الوقت نفسه، أضف الوسيط المعد في الخطوة 1.4.1 إلى طبق بيتري لحماية ال EBs المتبقية التي تكون جافة.
    4. يستنشق supernatant من أنبوب 15 مل، وإعادة إنفاق EBs مع المتوسطة في طبق بيتري، ونقل الحل EB مرة أخرى إلى الطبق. ثم، زراعة EBs في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 46 ساعة.
  5. يوم التمايز 4
    1. الجيلاتينية طبق 10 سم الأنسجة المعالجة بزراعة مع 5 إلى 10 مل من الجيلاتين 0.1٪ لمدة 5 دقائق على الأقل. أسبيرات الجيلاتين الحق قبل بذر الخلايا.
    2. إعداد المتوسطة: مزيج عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، FGF10، وhVEGF لإكمال SFD في 5 نانوغرام / مل، 25 نانوغرام / مل، و 5 نانوغرام / مل التركيزات النهائية، على التوالي. للحصول على طبق 10 سم، قم بإعداد 10 مل.
    3. نقل الخلايا من طبق بيتري إلى أنبوب 15 مل. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني إلى طبق بيتري، يغسل عدة مرات، ونقل إلى أنبوب 15 مل لجمع الخلايا المتبقية. جهاز طرد مركزي عند 50-100 × غرام، 4 درجات مئوية، 3 دقائق.
    4. أسبيرات فائقة، إضافة 1 مل من rTrypsin، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    5. دوامة لفترة وجيزة إلى نأي EBs، إضافة 9 مل من 10٪ FBS المتوسطة، دوامة مرة أخرى، والعد الخلايا.
    6. الطرد المركزي 1.5 × 107 خلايا في 300 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، وإعادة الإنفاق مع وسائل الإعلام المعدة في الخطوة 1.4.2، والبذور في الطبق الجيلاتين. حضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة يومين.
      ملاحظة: بحلول اليوم 7 أو 8، يمكن ملاحظة الضرب المكثف ل PSC-CMs.
  6. اختيار المخدرات في التمايز اليومين 7 و 9: إعادة تغذية وسائل الإعلام مع بوروميسين (2 ميكروغرام / مل في التركيز النهائي) للقضاء على خلايا القلب غير في اليوم 7 و 9 من التمايز.
    ملاحظة: خط الأبوية من SMM18 هو syNP4 الماوس ES الخلايا، وإيواء NCX1 المروج يحركها puromycin مقاومة الجينات20.
  7. اليوم العاشر، أعيد طله للتجارب المستقبلية
    1. معطف لوحة ثقافة الزجاج القاع أو طبق التصوير 35 ملم تحتوي على غطاء البوليمر مع 0.1٪ الجيلاتين. لتعزيز النضج، معطف الأطباق مع صفين-511 E8 جزء (LN511-E8) في 1 ميكروغرام/سم2 لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة18. لثقافة PSC-CMs في أنماط اهتمام محددة، يرجى الرجوع إلى الخطوتين 4 و5 لإعداد طوابع البوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS).
    2. لحصاد SMM18 PSC-CMs، اغسل الطبق مرتين مع PBS، وطبق 1 مل من rTrypsin، واحتضان 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    3. جمع الخلايا في 9 مل من 10٪ FBS المتوسطة، تعليق، والعد الخلايا. صفيح الخلايا في 50,000-100,000 خلية في بئر واحد من لوحة من 24 بئرا أو 250,000-500,000 خلية في طبق تصوير 35 مم.
    4. الطرد المركزي عدد كاف من الخلايا (300 × ز، 3 دقائق) وإعادة إنفاق الخلايا مع SFD كاملة تكملها FBS (التركيز النهائي في 10٪).
    5. احتضان بين عشية وضحاها وتغيير الثقافة المتوسطة لإكمال SFD مع بوروميسين.
    6. من اليوم 14، تغيير الثقافة المتوسطة مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع مع SFD كاملة حتى اليوم 21-28، عندما Myom2-RFP يصبح بارزا. بالنسبة إلى عملية نقل بروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت، يرجى الرجوع إلى الخطوة 3.

2. تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

  1. إعداد وسائل الإعلام التمايز
    1. RPMI + B27-Ins: مزيج 500 مل من RPMI 1640 متوسطة، 10 مل من B27 ناقص الأنسولين، و 5.25 مل من L-ألانين-L-الجلوتامين.
    2. RPMI + B27 + Ins: مزيج 500 مل من RPMI، 10 مل من ملحق B27، و 5.25 مل من L-ألانين-L-الجلوتامين.
  2. صيانة خلايا iPS البشرية
    1. مرور خلايا iPS الإنسان مرتين في الأسبوع مع AK02N على LN511-E8 بعد الأسلوب المنشور سابقا مع بعض التعديلات21.
    2. حصاد الخلايا مع علاج 3 دقائق من rTrypsin وجمع في 10٪ FBS المتوسطة. عد الخلايا والطرد المركزي عند 300 × ز لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. البذور 75،000-125،000 الخلايا في بئر واحد من 6 لوحة بئر مع 2 مل من AK02N تكملها LN511-E8 و Y27632 في التركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل (0.1 ميكروغرام / سم2) و 10 ميكرومتر، على التوالي.
    3. حضانة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 واستبدال المتوسطة في اليوم التالي مع 2 مل من AK02N دون أي ملحق. تغيير وسائل الإعلام كل يومين إلى ثلاثة أيام والمرور كل ثلاثة إلى أربعة أيام.
  3. اليوم -4: إعادة اللوحة قبل التمايز
    1. معطف لوحة بئر 6 مع 0.5 ميكروغرام / سم2 من LN511-E8 المخفف في برنامج تلفزيوني. ثم، احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 أو 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. أسبيرات حل الطلاء الحق قبل بذر الخلايا.
    2. حصاد خلايا iPS البشرية مع rTrypsin وعدد الخلايا كما هو الحال في الخطوة 2.2.2.
    3. جهاز طرد مركزي 1.25 × 105 خلايا الآبار من لوحة 6-جيدا في 300 x ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية وإعادة الإنفاق في 2 مل من ملحق AK02N مع LN511-E8 (التركيز النهائي 0.5 ميكروغرام/مل أو 0.1 ميكروغرام/سم2)وY27632 (التركيز النهائي 10 ميكرومتر) لكل بئر.
    4. حل طلاء أسبيرات، البذور الخلايا resuspended في لوحة المغلفة، واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  4. أيام -3 و-1: استبدال المتوسطة مع 2 مل من AK02N.
  5. اليوم 0: استبدل الوسط ب 2 مل من RPMI+ B27-Ins المكمل مع CHIR99021 (التركيز النهائي 6 ميكرومتر) لكل بئر لبدء التمايز.
  6. اليوم الثاني: استبدل الوسط ب 2 مل من RPMI+B27-Ins مع WntC59 (التركيز النهائي 2 ميكرومتر) لكل بئر.
  7. اليوم الرابع: استبدل الوسط ب 2 مل من RPMI+B27-Ins لكل بئر.
  8. اليوم السابع واليوم التاسع: استبدل الوسط ب 2 مل من RPMI+B27+Ins مع بوروميسين (التركيز النهائي 10 ميكروغرام/مل) لكل بئر لثقافة PSC-CMs بشكل انتقائي.
    ملاحظة: خط ACTN2-mCherry، المستخدمة في هذه الدراسة، لديه شريط كاسيت من موقع الدخول الريبوسومي الداخلي (IRES)، الجينات المقاومة للpuromycin إدراجها في المنطقة 3′غير المترجمة (UTR) من الموضع TNNT2، وmCherry استبدال كودون وقف ACTN2. لتنقية خلايا القلب دون طرق في، يرجى الرجوع إلى الخطوتين 3 و 4.
  9. اليوم العاشر: إعادة اللوحة للتجارب المستقبلية
    1. طبق تصوير 35 مم مع غطاء بوليمر مع 0.5-1 ميكروغرام /سم2 من LN511-E8 المخفف في الجيلاتين 0.1٪. احتضان 2-4 ساعة في درجة حرارة الغرفة من أجل البقاء على المدى الطويل. لثقافة PSC-CMs في الأنماط المطلوبة، يرجى الرجوع إلى الخطوتين 4 و5 لإعداد طوابع PDMS.
    2. لحصاد الإنسان PSC-CMs، وغسل الطبق مرتين مع برنامج تلفزيوني، وتطبيق 1 مل من rTrypsin لكل بئر، واحتضان 3 دقائق في 37 درجة مئوية.
    3. جمع الخلايا في 4 مل من 10٪ FBS المتوسطة، تعليق، والعد الخلايا. لوحة 250،000-500،000 الخلايا لكل طبق التصوير 35 ملم.
    4. الطرد المركزي عدد كاف من الخلايا في 300 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية، وإعادة الإنفاق مع RPMI + B27 + Ins مع بوروميسين (10 ميكروغرام / مل)، ولوحة على طبق التصوير المغلفة 35 ملم.
    5. احتضان بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، استبدل الوسط الثقافي ب RPMI+B27+Ins مع بوروميسين (10 ميكروغرام/مل).
    6. من اليوم 14، تغيير الثقافة المتوسطة 2-3 مرات في الأسبوع مع RPMI + B27 + Ins حتى اليوم 21-28 للتصوير. بالنسبة إلى عملية نقل بروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت، يرجى الرجوع إلى الخطوة 3.

3. وضع العلامات الفلورية من ساركوميرس باستخدام الفيروسات المرتبطة أدينو

  1. التحضير قبل إنتاج AAV
    1. الحفاظ على خلايا HEK293T في DMEM تكملها FBS (التركيز النهائي 10٪) على لوحة زراعة الأنسجة 10 سم. خلايا المرور ثلاث مرات في الأسبوع.
    2. إعداد البولي إيثيلينمين (PEI) في 1 ملغم/ مل. مزيج 50 ملغ من البولي إيثيلينمين ماكس 40000 و 40 مل من المياه فائقة البور. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام 1 N NaOH. ثم، وجعل حجم النهائي إلى 50 مل مع المياه فائقة البور ومرشح من خلال مصفاة 0.22 ميكرومتر.
    3. إعداد ناقل مكوك مع جين تسمية ساركومير (على سبيل المثال، TCAP أو PDLIM3 تنصهر مع بروتين الفلورسنت الأخضر [GFP])، يقودها مروج القلب الخاصة، مثل تروبونين القلب T (cTNT)22.
      ملاحظة: لهذا المثال، استخدمنا GFP المحسن أحادية الأحرف مع طفرات V163A، S202T، L221V23.
  2. اليوم 0، مرور خلايا HEK
    1. عندما تصل الخلايا إلى التقاء، مرور 2.0 × 107 خلايا HEK293T إلى لوحة زراعة الأنسجة 15 سم مع 20 مل من DMEM مع 10٪ FBS.
  3. اليوم الأول، العدوى
    1. مزيج 13.5 ميكروغرام من ناقل المكوك، 26 ميكروغرام من pHelper (ناقلات الترميز E2A، E4، وVA من الفيروس الغدي)، 16.5 ميكروغرام من pRC6 (ناقل الترميز AAV2 النائب وAAV6 كاب الجينات)، و 1 مل من DMEM دون بيروفاتي الصوديوم (DMEM-Pyr).
    2. مزيج 224 ميكرولتر من جزيرة الأمير إدوارد (1 ملغم / مل، أعدت في الخطوة 3.1.2) و 776 ميكرولتر من DMEM-Pyr.
    3. امزج واحتضن محلول البلازميد وحل PEI في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    4. إضافة الحل plasmid/ PEI إلى خلايا HEK293T المعدة في الخطوة 3.2.
  4. اليوم الثاني، تغيير متوسط
    1. في 24 ساعة بعد transfection، تغيير المتوسطة إلى DMEM-Pyr. خلايا الثقافة حتى حصاد AAV في اليوم 7. سيتم إصدار AAV في وسائل الإعلام الثقافية.
  5. اليوم السابع، جمع AAV، التركيز، واستبدال العازلة باستخدام الحد الأدنى من طريقة تنقية24
    1. احتضان وحدة الترشيح الفائق الطرد المركزي (100k خفض الوزن الجزيئي [MWCO]) مع 5 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم، طرد مركزي وحدة الترشيح الفائق في 500 × ز لمدة 2 دقيقة و أسبر كل من الحلول المصفاة والمبقاة.
    2. نقل المتوسطة من طبق 15 سم التي أنتجت AAV إلى أنبوب مخروطي 50mL جديدة والطرد المركزي (500 × ز، 5 دقائق). تصفية supernatant من خلال 0.45 ميكرومتر حقنة مصفاة لإزالة حطام الخلية وتطبيق تعليق على وحدة الترشيح الفائق.
    3. الطرد المركزي في 2000 س ز لمدة 90 دقيقة أو حتى تركيز الثقافة الفائقة 0.5 إلى 1 مل.
    4. يستنشق الخيوط وتطبيق 15 مل من برنامج تلفزيوني لوحدة الترشيح الفائق.
    5. كرر الطرد المركزي حتى يصبح التركيز 0.5-1 مل.
    6. كرر 3.5.4 و 3.5.5.
    7. نقل AAV مركزة إلى أنبوب جديد 1.5 مل وتخزينها في 4 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن استخدام AAV في مرافق P1 ولكن اتبع القواعد واللوائح المحلية. ويمكن إنتاج AAV بالطرق التقليدية أيضا.
  6. حساب Titer AAV
    1. مزيج 5 ميكرولتر من AAV، 195 ميكرولتر من DMEM-Pyr، و 10 U من البنزوناز واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. إضافة 200 ميكرولتر من البروتين K العازلة (0.02 M تريس HCl و 1٪ SDS) و 5 ميكرولتر من البروتين K (20 ملغم / مل) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. إعداد بعناية 400 ميكرولتر من محلول الكحول 25:24:1 فينول / الكلوروفورم / ايزاميل الكحول، دوامة لمدة 1 دقيقة، والطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 1 دقيقة.
    4. نقل 200 ميكرولتر من المرحلة المائية إلى أنبوب جديد 1.5 مل، والتي سوف تسفر عن ما يقرب من نصف الجينوم AAV الأصلي.
    5. أضف 1 ميكرولتر من الجليكوجين (20 ملغم/مل) إلى 20 ميكرولتر من 3 م CH3COONa (درجة الحموضة 5.2) والدوامة. إضافة 250 ميكرولتر من 2-بروبانول إلى 100 ميكرولتر من الإيثانول 100٪ ودوامة مرة أخرى.
    6. حضانة عند -80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    7. أسبيرات فائقة وإضافة الإيثانول 70٪ إلى الأنبوب. ثم، الطرد المركزي في 20،000 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    8. أسبيرات فائقة والهواء الجاف حتى بيليه يصبح واضحا.
    9. إضافة 200 ميكرولتر من حمض تريس إيثيلينديمينتتراستيك (TE; درجة الحموضة 8.0) لحل الجينوم AAV. ثم، تمييع العينة 100 مرة مع TE.
    10. إعداد معيار مع pAAV-CMV-Vector عند 6.5 نانوغرام/ميكرولتر مع TE للحصول على 109 جينوم متجه (vg)/ ميكرولتر. ثم، وجعل سلسلة من تخفيف 10 أضعاف من 104 إلى 108 مع TE.
    11. مزيج 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي (أو المعايير)، 0.4 ميكرولتر من التمهيديات (5 ميكرومتر)، 3.6 ميكرولتر من الماء المقطر، و 5 ميكرولتر من مزيج سيد SYBR الأخضر. التمهيديات، وتقع على ITR، هي 5′-GGAACCCCTAGTGATGAGTT-3′ و 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
    12. أداء PCR في الوقت الحقيقي مع الشرط التالي: النطر الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 60 s، 40 دورات من الإزالة في 95 درجة مئوية لمدة 15 s، والعلج والتمداد في 60 درجة مئوية لمدة 30 s، تليها منحنى ذوبان.
    13. واستنادا إلى المعايير وقيم الأشعة المقطعية، توفر آلة PCR في الوقت الحقيقي عدد نسخ الجينوم المتجه في 1 ميكرولتر من العينة. حساب تيتر AAV الأصلي باستخدام المعادلة التالية: رقم نسخة المقدمة من PCR في الوقت الحقيقي (vg/μL) × 8 × 103 × 2، حيث 8 × 103 كعامل تمييع خلال عزل الجينوم AAV، و 2 كعامل الفرق من AAV (حبلا واحد) وبلازميد (حبلا مزدوجة).
  7. النقل إلى PSC-CMs
    1. عد PSC-CMs في بئر إضافي أو طبق إضافي.
    2. تمييع AAVs (1 × 104 إلى 1 × 106 vg / الخلية) لتعويض 50 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني. تطبيق AAVs في تعدد العدوى (MOI) من 1 × 104 إلى 1 × 106 vg / الخلية إلى PSC-CMs والثقافة PSC-CMs لمدة 3 أيام مع AAV في وسائط التمايز المقابلة للفأرة والإنسان PSC-CMs، ثم تغيير الوسائط إلى وسيط الثقافة دون AAV.
    3. استخدم PSC-CMs للتصوير بالخلايا الحية بعد 7 أيام أو أكثر بعد النقل.

4. [اختياري] AAV القائم على تنقية PSC-CMs

  1. إعداد AAV
    1. إعداد AAV كما هو موضح في الخطوة 3 باستخدام ناقل مكوك يعبر عن جين مقاوم للنسف تحت سيطرة مروج cTNT.
  2. النقل إلى التمييز بين خلايا iPS
    1. تمييز خلايا iPS البشرية لمدة 4 أيام بعد البروتوكول الموضح في الخطوة 2 وإحصاء عدد الخلايا في بئر إضافي.
    2. بعد تغيير متوسط في اليوم 4، تطبيق AAVs في وزارة الداخلية من 1 × 105 vg / الخلية للتمييز PSCs في وسائل الإعلام RPMI + B27-Ins.
    3. في اليوم 7، تحديث المتوسطة مع RPMI + B27 + Ins وإضافة 2.5-10 ميكروغرام / مل من blasticidin.
    4. في اليوم العاشر، تكون PSC-CMs جاهزة لإعادة اللوحة.

5. إعداد طوابع PDMS

  1. تصميم نمط الجهاز من شرائط 200 μm جنبا إلى جنب مع الأخاد 10-25 ميكرومتر بين شرائط باستخدام تصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) رسم البرمجيات.
  2. رسم نمط الأجهزة على قناع ضوئي الكروم المغلفة مع AZP1350 باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية من أداة الطباعة الحجرية maskless.
  3. تطوير نمط على قناع ضوئي في سلسلة من المطور الضوئي إيجابية (على سبيل المثال، الكروم etchant) وشطف مع الماء DI.
  4. يجفف رقاقة السيليكون على طبق ساخن عند 120 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  5. السماح للنافر لتبرد لدرجة حرارة الغرفة وتدور معطف مقاوم ضوئي سلبي SU-8 3010 لجعل ارتفاع 10-20 ميكرومتر مع 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية باستخدام تدور coater.
  6. خبز ناعم رقاقة في خطوتين على لوحة ساخنة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  7. بعد تبريد الرقاقة إلى درجة حرارة الغرفة، قم بتحميل الرقاقة على محاذاة القناع.
  8. استخدم جهاز محاذاة القناع لمحاذاة القناع على الرقاقة وعرض الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية.
  9. إجراء خبز ما بعد التعرض إلى رقاقة في خطوتين على لوحة ساخنة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  10. تطوير رقاقة في سلسلة من المطور SU-8 و 2-بروبانول، ثم تجفيف رقاقة مع تيار النيتروجين.
  11. نقل رقاقة في طبق بيتري من حجم مناسب.
  12. مزيج PDMS الاستومر ووكيل المعالجة في نسبة 10:1 ث / ث وصب الخليط في طبق بيتري.
  13. ديغا PDMS في مجفف حتى تختفي جميع فقاعات الهواء، ثم علاج PDMS على لوحة ساخنة في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  14. قشر PDMS الشفاء قبالة من القالب الرئيسي باستخدام ملاقط، ثم قطع الجزء مع التصميم ليكون ختم PDMS.
    ملاحظة: يمكن أن يكون الشكل مربعا، ومع ذلك، ينقل شكل مثمن النمط بشكل أفضل عند الحافة.

6. ثقافة منقوشة من خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات

  1. إزالة الغبار من سطح طوابع PDMS باستخدام شريط إصلاح.
  2. غمر الطوابع في الإيثانول 70٪ لتعقيم. ثم، ضربة الإيثانول قبالة سطح الطوابع باستخدام منفضة الهواء.
  3. تطبيق 5-10 ميكرولتر من 0.5 wt٪ 2-ميثاكريلوكسيثيل فوسفوريلتشولين (MPC) البوليمر / الإيثانول على سطح طوابع PDMS.
    ملاحظة: قد يتسبب التوزيع غير المتكافئ لبوليمر MPC في حدوث نمط معطل.
  4. احتضان 10-30 دقيقة حتى يتم تجفيف البوليمر MPC تماما.
  5. ضع الطوابع على اتصال مع قطع من لوحة ثقافة الزجاج القاع أو طبق التصوير 35 ملم مع غطاء البوليمر ووضع الوزن (على سبيل المثال، بطارية AAA) على الطابع لمدة 10 دقيقة.
  6. إزالة الوزن والطوابع. ثم تأكد من أن النمط قد تم نقله تحت المجهر.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق/الأطباق المختومة لمدة أسبوع واحد في درجة حرارة الغرفة.
  7. غسل الآبار مختومة / أطباق مع برنامج تلفزيوني مرتين.
  8. تمييع LN511-E8 مع برنامج تلفزيوني في 2-4 ميكروغرام / مل ومعطف الطبق مع LN511-E8 في 0.5-1 ميكروغرام / سم2. لPSC-CMs الإنسان، تمييع LN511-E8 مع محلول الجيلاتين 0.1٪ بدلا من برنامج تلفزيوني. ثم، حضانة لمدة ساعة واحدة على الأقل (على النحو الأمثل، أكثر من 4 ساعة).
  9. خلايا اللوحة كما هو موضح في الأقسام السابقة.

7. التصوير الفاصل الزمني للساركومير تحت المجهر الفلوري

  1. قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر المرتبط به وتوصيله، وكذلك جميع الأجهزة الطرفية المطلوبة.
  2. لإجراء التصوير الفاصل الزمني، التقط صورا بفاصل زمني بأعلى تكبير (عدسة 100X الهدف مع إمرسيون الزيت).
  3. حدد ظروف التصوير الحي. للحصول على بيانات تمثيلية جيدة، حاول ضبط معدل الإطارات الأعلى (يوصى بالحد الأدنى من 20 مللي ثانية أو 50 إطارا في الثانية). قم بفتح الغالق وتطبيق binning الضرورية (4 × 4) ومحصول من منطقة الاستحواذ لتحقيق أقصر فترات بين الصور أثناء التصوير الفاصل الزمني.
    ملاحظة: قد يختلف الإعداد استنادا إلى تكوينات المجاهر. يجب أن تكون الكاميرا عالية الحساسية وقادرة على نقل البيانات إلى الكمبيوتر المتصل بسرعة كافية. وتحقيقا لهذه الغاية، استخدمنا أوركا فلاش مع كاميرا الارتباط. لقد اختبرنا المجهر confocal الغزل واكتسبت الصور في 400 لقطة في الثانية الواحدة.
    1. [اختياري] إذا كان معدل الضرب للخلايا منخفضا ، فاستحضار الخلايا عن طريق تحفيز المجال الكهربائي.
  4. تشغيل سجل الفاصل الزمني
    1. تأكد من أن تظل الحقول المصورة في بؤرة التركيز أثناء تسجيل صورة الفاصل الزمني.
    2. حفظ الصور الفاصل الزمني في مجلد مناسب.

8. تحليل التصوير الفاصل الزمني باستخدام SarcOptiM ، وهو ImageJ / فيجي البرنامج المساعد

  1. تحميل سلسلة من الصور الفاصل الزمني في ImageJ. لتنسيق أوليمبوس VSI، افتح الملفات من خلال البرنامج المساعد OlympusViewer.
  2. ضبط سطوع وتباين الصورة لمراقبة نمط ساركومير بوضوح (صورة | ضبط | سطوع / تباين).
  3. افتح SarcOptiM بالنقر فوق قائمة أدوات أكثر (>>) وتحديد SarcOptiM.
  4. معايرة البرنامج عن طريق الضغط على Ctrl + Shift + P و 1 ميكرومتر زر على شريط الأدوات واتباع تعليمات مربعات الحوار.
  5. رسم خط عبر منطقة الساركومير التي سيتم استخدامها لقياس تقصير ساركومير.
  6. بدء تحليل تقصير ساركومير بالضغط على SingleCell (AVI) على شريط الأدوات. تظهر البيانات التمثيلية في الشكل 1 والشكل 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قياس تقصير الساركومير باستخدام خطوط مراسل PSC-CMs. واستخدمت أجهزة PSC-CMs التي تحمل اسم ساركومير لقياس تقصير الساركومير. خطوط التعبير عن Myom2-RFP وACTN2-mCherry من loci الذاتية. تم إدراج TagRFP إلى Myom2، ترميز M-البروتينات التي توطينها على خط M، في حين تم طرقت mCherry في لACTN2،الترميز α-Actinin، الذي ي توطين إلى Z-خط18،25. تم الحصول على صور الفاصل الزمني واستخدامها لتحديد تقصير الساركومير كما هو معروض في الشكلين 1 و 2 والفيلم 1-3.

للتغلب على الساركومير غير المنظم ل PSC-CMs ، تم استخدام طوابع PDMS محددة لثقافة PSC-CMs في نمط الشريط. عززت هذه الثقافة المنقوشة شكل خلية ممدود ونمط ساركومير أكثر تنظيما مقارنة بالخلايا المستزرعة في المنطقة غير النمطية(الشكلان 2B و 2C). مع هذه الميزة، عززت الثقافة المنقوشة انكماش أفضل للخلايا وقدمت ملف تعريف طول الساركومير السلس كما هو موضح في أفلام 2 و 3 والشكل 2D.

وضع علامات فلورية على بروتين خط Z باستخدام ناقلات AAV. لتصور الخط Z من PSC-CMs دون توليد خلايا iPS ، تم التعبير عن بروتينات Z-line الموسومة بالفلورسنت باستخدام تحويل AAV. اثنين من البروتينات الصغيرة Z-الخط, Telethonin (TCAP) وACTIN المرتبطة بروتين ليم (PDLIM3) مع GFP, تم وضع علامات وتعبئتها باستخدام كابسيد AAV6 (الشكل 3A). وبمجرد تمييز PSC-CMs وتنقيتها، تم نقل مركبات AAVs إلى PSC-CMs(الشكل 3B). وعبرت PSC-CMs المحولة عن إشارات GFP ساركومريك على طول PSC-CMs في وقت مبكر من ثلاثة أيام بعد النقل(الشكلان 3C و 3D). عادة، نقل AAV في وزارة الداخلية من 105 vg/cell كافية لتصور البروتينات ساركومير الموسومة الفلورسنت وتيتر أعلى قد يسبب توطين غير محددة من GFP إلى السيتوبلازم على الرغم من أنه يزيد من كثافة GFP الشاملة.

تنقية PSC-CMs باستخدام ناقلات AAV. تعتمد الأساليب الحالية على كاسيت اختيار الدواء الموجود بالفعل على جينوم PSC-CMs ، إما المعدل وراثيا أو خط الضربة القاضية. ومع ذلك ، فمن كثيفة العمالة لإنتاج مثل هذا الخط من خلايا iPS المشتقة من المريض. كما AAV ناقلات وقد ثبت لدفع التعبير عن البروتينات الفلورسنت المسمى Z-الخط دون الحاجة إلى طرق في، سعينا إلى إنشاء طريقة تنقية دون طرق في كذلك(الشكل 4). وتحقيقا لهذه الغاية، تم بناء ناقل AAV جديد، الذي يشفر الجين المقاوم لللتفات تحت سيطرة المروج cTNT،(الشكل 4A). تم تحويل AAV (MOI من 105 vg / الخلية) إلى التمييز بين خلايا iPS البشرية في اليوم 4. ثم عولجت الخلايا مع 2.5-10 ميكروغرام / مل من blasticidin (الحاجة إلى titrate لكل خط الخلية) بين اليومين 7 و 9 (الشكل 4B). في اليوم 14، كان نقاء PSC-CMs أكثر من 90٪(الشكل 4C).

Figure 1
الشكل 1: Sarcomere تقصير الماوس PSC - CMs المستمدة من خط الخلية Myom2 - TagRFP. أ. الجدول الزمني لتمايز الماوس PSC-CM. باء - ال 20 في المائ صور تمثيلية لتقصير الساركومير في نقاط زمنية مختلفة مع مناطق القياس كما هو مبين في الأشرطة الصفراء. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن ساركومير طول الملف الشخصي خلال انكماش خلايا القلب التي تم تحفيزها مع الكهرباء في 1 هرتز. كان معدل الإطارات 50 إطارا في الثانية. وكان حجم بكسل 0.26 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:بيانات تمثيلية تبين تقصير الساركومير ل PSC-CMs البشرية المستمدة من خط الخلية ACTN2-mCherry في ثقافة غير منقوشة ومنقوشة. أ. الجدول الزمني للتمايز بين PSC-CM الإنسان. باء - ال 20 في المائ و C. Cardiomyocytes المستزرعة في الثقافات غير المنقوشة تظهر أنماط ساركومير غير منظمة (B) في حين أن الثقافات المنقوشة تعزز المحاذاة الجيدة للساركومير (C). قياس المناطق التي تقدمها القضبان الصفراء. د- ملامح طول الساركومير المقابلة التي تم الحصول عليها خلال تقلص الخلايا الناجمة عن التحفيز الكهربائي في 0.5 هرتز و 100 لقطة لكل معدل الإطار الثاني. حجم البكسل = 0.26 ميكرومتر، شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الماوس PSC-CMs بعد AAV نقل لمدة 3 أيام. أ. خريطة متجه تخطيطي ل AAV لتسمية الساركومير. ويرتبط بروتين الساركومير (جين الفائدة، GOI) إلى GFP مع رابط غلي غلي غلي سير (L) وأعرب تحت سيطرة تروبونين القلب T (cTNT) المروج. باء - ال 20 في المائ الجدول الزمني للتمايز الماوس PSC-CM ونقل AAV. جيم و د. صور تمثيلية تظهر ترجمة ساركومير واضحة وملف تعريف طول الساركومير المقابل ل TCAP-GFP (C) و PDLIM3-GFP (D) بعد 3 أيام من النقل إلى PSC-CMs الناتجة من خط الخلية Myom2-TagRFP. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: Blasticidin تنقية الإنسان PSC - CMs دون طرق في. 
أ. خريطة متجه تخطيطي ل AAV ، حيث يتم إدراج كاسيت جين مقاومة blasticidin (BSR) في المصب إلى مروج cTNT. باء - ال 20 في المائ الجدول الزمني للتمايز PSC-CMs الإنسان، ونقل، واختيار blasticidin. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن بيانات تمثيلية تبين النسبة المئوية لخلايا cTNT + في PSC-CMs البشرية (تم تحويلها 105 vg/cell AAV6 في اليوم 4 ثم عولجت ب 2.5 ميكروغرام/مل blasticidin في اليومين 7 و9). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيلم 1 : الفلورسنت الوقت الفاصل الفيديو من الماوس PSC - CMs ولدت من خط الخلية Myom2 - TagRFP. وأظهرت إشارات RFP نمط ساركومير بعد ثقافة PSC-CM لمدة 28 يوما. وأظهرت الخلايا الضرب بشكل متزامن عندما حفزت مع الكهرباء في 1 هرتز. تم الحصول على الصور الفاصل الزمني كل 20 مللي ثانية مع عدسة 100X. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

الفيلم 2: فيديو الفلورسنت الفاصل الزمني لPSC-CMs الإنسان مع ACTN2-mCherry مثقف على طبق ثقافة غير منقوشة. PSC-CMs التعبير عن ACTN2-mCherry على طبق ثقافة غير منقوشة لم تظهر فقط عدم تنظيم الساركومير ولكن أيضا قدم انكماش التلويح، والتي من الصعب تحديد تقصير ساركومير. تم تحفيز الخلايا بالكهرباء بسرعة 0.5 هرتز وتم الحصول على الصور كل 10 مللي ثانية بعدسة 100X. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

الفيلم 3: فيديو الفلورسنت الفاصل الزمني لPSC-CMs الإنسان مع ACTN2-mCherry مثقف على طبق ثقافة منقوشة. عززت الثقافة المنقوشة محاذاة الساركومير وأجبرت الخلايا على شكل قضيب. سمحت هذه الطريقة لتقصير الساركومير في PSC-CMs بتحديدها بسهولة أكبر. تم الحصول على الفيديو من خلال تحفيز الخلايا بالكهرباء في 0.5 هرتز. كان معدل الإطارات 100 إطار في الثانية. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

ملفات CAD التكميلية. CAD ملفات لإنشاء الطوابع مع شرائط من 200 ميكرومتر العرض والأخاد من 10 ميكرومتر (Stamp_200x10.dxf)، 25 ميكرومتر (Stamp_200x25.dxf)، و 50 ميكرومتر (Stamp_200x50.dxf). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PSC-CMs لديها إمكانات كبيرة لاستخدامها كمنصة في المختبر لنموذج أمراض القلب واختبار آثار الأدوية. ومع ذلك، يجب أولا وضع طريقة دقيقة وموحدة لتقييم وظائف نظام PSC-CMs. معظم الاختبارات الوظيفية تعمل مع PSC-CMs، على سبيل المثال، الكهربية، والكالسيوم عابرة، والتمثيل الغذائي26،وكانت واحدة من أولى الدراسات المشتقة من المريض PSC-CM حول متلازمة QT طويلة27. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب تقييم الانقباض ، وهي واحدة من أهم وظائف خلايا القلب. مع خلايا القلب الكبار، ويستخدم على نطاق واسع تقصير ساركومير. في المقابل ، بسبب الساركومير المتخلف وغير المنظم من PSC-CMs ، فإن الطريقة القياسية لتقصير الساركومير لا تعمل مع هذه الخلايا. لذلك ، قدمنا طريقة بديلة لفحص تقصير الساركومير في PSC-CMs باستخدام بروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت. كما هو موضح، يمكن استخدام البروتينات المترجمة إلى خط M (MYOM2) أو Z-line (ACTN2 و TCAP و PDLIM3) المنصهرة مع البروتينات الفلورية لهذا النهج. وقد أظهرنا أيضا أنه يمكن التعبير عن البروتينات الموسومة بالفلورسنت من loci الذاتية أو من قبل AAVs. توفر AAVs مرونة أكبر للتعبير عن البروتينات الموسومة بالفلورسنت من loci الذاتية ، حيث يمكن تطبيق AAVs على أي نوع من PSC-CMs المشتقة من المريض. في المقابل ، قد يكون للتعبير عن البروتينات من loci الذاتية تأثير أقل على وظيفة الساركومير ، حيث أن مستوى التعبير عن الجينات منظم بإحكام ويمكن استخدامه أيضا لرصد نضوج PSC-CMs18.

على الرغم من أن Myom2-TagRFP، ACTN2-mCherry، و Lifeact كانت تستخدم جميع لفحص sarcomere تقصير16،18،19، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت هذه البروتينات تتداخل مع وظيفة ساركومير. في الآونة الأخيرة، أفيد Lifeact لإزعاج منظمة أكتين ومورفولوجياالخلوية 28. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن أنماط الانصهار (أي، موقع الاندماج GFP في N-term أو C-term من البروتين المستهدف) تؤثر أيضا على وظيفة الساركومير29. لذلك ، قبل استخدامها على نطاق واسع ، من المهم إجراء تقييم شامل ما إذا كانت بروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت تتداخل مع وظيفة الساركومير وما إذا كانت التفاعلات بين البروتين والبروتين تحدث في ساركومير في المختبر، في الجسم الحي، و / أو في خلايا القلب البالغة. توفر هذه الذخيرة من بروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت نقطة انطلاق جيدة لخيارات هندسة البروتين المستقبلية (أي تقصير بروتينات الساركومير إلى إشارات التعريب فقط). اختيار البروتينات لوضع علامة هو مفتاح آخر للنجاح. لقد الموسومة آخر Z-خط البروتين مع GFP, ومع ذلك, هذا البروتين عرض فقط توزيع السيتوبلازمية بدلا من توطين الساركومير. بالنسبة للتصوير الحي، قد يلعب استقرار البروتين دورا أيضا، حيث أنه، على سبيل المثال، إذا كان البروتين الموسوم غير مستقر، فإن مستوى الإشارة سيكون أقل. كما أن قابلية البروتين الفلوري للبروتين الفلوري مهمة أيضا، حيث سيتم إخماد إشارات البروتين غير المستقرة بسهولة أثناء التصوير.

لفحص قابلية انكماش PSC-CMs باستخدام أساليب غير الموصوفة، يمكن استخدام القياسات غير المباشرة للقوة الناتجة عن PSC-CMs (على سبيل المثال، صفائف الوظيفة الدقيقة، المجهر قوة الجر) أو الحركة (على سبيل المثال، الكشف عن الحركة عالية الدقة باستخدام SI8000)11،12،13،14. يمكن الجمع بين طريقتنا مع هذه الأساليب أو مع القياسات العابرة للعمل المستندة إلى الصبغة / الكالسيوم. قد يوفر النهج الجمعي المزيد من المعلومات حول كيفية تسبب المرض في خلل وظيفي في PSC-CMs المشتقة من المريض.

واحدة من التحديات في تقصير ساركومير في PSC-CMs هو العثور على ساركومير جيدة التي تتحرك خطيا، وإلا، قد تأتي بسهولة الخلايا خارج الخط للكشف عن ساركومير من SarcOptiM وتسبب ساركومير غير مستقر تقصير النتائج. هنا، ونحن نثبت أن استخدام ثقافة منقوشة ولدت مع طوابع PDMS قد توفر حركة ساركومير أكثر استقرارا وخطية. ومن المعروف أيضا ثقافة منقوشة لدعم نضوج PSC-CMs16، وهو أمر مهم لوظيفة ساركومير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

قدمت جامعة H.U. براءة اختراع تتعلق بهذه المخطوطة.

Acknowledgments

نود أن نعترف بجميع أعضاء المختبر في شعبة الطب التجديدي في جامعة جيتشي الطبية للمناقشة المفيدة والمساعدة التقنية. وقد دعمت هذه الدراسة المنح المقدمة من الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي؛ JP18bm0704012 و JP20bm0804018)، والجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS؛ JP19KK0219)، وجمعية التداول اليابانية (منحة للبحوث الأساسية) إلى جامعة H.U.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, NOF Corp. LIPIDURE-CM5206
2-Propanol Fujifilm wako 166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) ibidi 81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		 Takara 6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs N.A. We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
B-27 Supplement, minus insulin Thermo Fisher Scientific A18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587-010
Benzonase (25 U/µL) Merck Millipore 70746
Blasticidin S Hydrochloride Fujifilm wako 029-18701
BMP-4, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 314-BP-010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59) abcam ab142216
CAD drawing software, Robert McNeel and Associates, WA, USA Rhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 Sartorius VS2042
CHIR99021 Cayman 13122
Chromium etchant Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan N14B
Chromium mask coated with AZP1350 Clean Surface Technology Co., Japan CBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) Takara 9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose Sigma-Aldrich D6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate Sigma-Aldrich D5796
Ethanol (99.5) Fujifilm wako 057-00456
Fetal Bovine Serum Moregate 59301104
FGF-10, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant Fujifilm wako 060-04543
Gelatin from porcine skin powder Sigma-Aldrich G1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) Sigma-Aldrich G5154-500
GLASS BOTTOM culture plates MatTek P24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12 Thermo Fisher Scientific 11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) Thermo Fisher Scientific 35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt Fujifilm wako 196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) Nippi 892012
Mask aligner Union Optical Co., Ltd., Japan PEM-800
Maskless lithography tool NanoSystem Solutions, Inc., Japan D-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) Merck Millipore SLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18) N.A. Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU
PD0325901 Stemgent 04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Petri dish Sansei medical co. Ltd 01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer Dow Corning Corp., MI, USA SILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000) Polyscience 24765-1
Positive photoresist developer Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan NMD-3
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742
Proteinase K Takara 9034
Puromycin Dihydrochloride Fujifilm wako 166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein R&D Systems, Inc. 338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) Thermo Fisher Scientific 12604-039
RPMI1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875-119
Silicon wafer Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan N.A.
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070
Spin-coater Mikasa Co., Ltd., Japan MS-A100
Spininng confocal microscopy Oxford Instruments Andor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) Fujifilm wako 195-16053
SU-8 3010 Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 3010
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 developer
Tris-EDTA Nippon Gene 314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant Fujifilm wako 226-01781

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
  2. Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
  3. Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
  4. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  5. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  6. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  7. Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
  10. Cho, G. -S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
  11. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  12. Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
  13. Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
  14. Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
  15. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  16. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  17. Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
  18. Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
  19. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  20. Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
  21. Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
  22. Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
  23. Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
  24. Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
  25. Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. Yoshida, Y., et al. , (2020).
  26. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  27. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  28. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
  29. Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).

Tags

الطب، العدد 169، الخلايا الجذعية متعددة القدرات، خلايا القلب، تقصير الساركومير، التصوير الحي، بروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت، الطباعة الدقيقة
Sarcomere تقصير متعدد القدرات خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية باستخدام الفلورسنت الموسومة بروتينات ساركومير.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai,… More

Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai, T., Koiwai, K., Murakami, T., Suzuki, H., Hanazono, Y., Uosaki, H. Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.. J. Vis. Exp. (169), e62129, doi:10.3791/62129 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter