Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Sarkomisk förkortning av pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter med fluorescerande taggade sarkomproteiner.

Published: March 3, 2021 doi: 10.3791/62129
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 4, 4, 1, 1
1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics, Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering, Chuo University
* These authors contributed equally

Summary

Denna metod kan användas för att undersöka sarkomförkortning med hjälp av pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter med fluorescerande taggade sarkomproteiner.

Abstract

Pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter (PSC-CMs) kan framställas från både embryonala och inducerade pluripotenta stamceller (ES/iPS). Dessa celler ger lovande källor för hjärtsjukdom modellering. För kardiomyopatier är sarkomförkortning en av de standard fysiologiska bedömningar som används med vuxna kardiomyocyter för att undersöka deras sjukdom fenotyper. De tillgängliga metoderna är dock inte lämpliga för att bedöma kontraktiliteten hos PSC-CMs, eftersom dessa celler har underutvecklade sarkomerer som är osynliga under faskontrastmikroskopi. För att ta itu med det här problemet och utföra sarkomförkortning med PSC-CMs användes fluorescerande taggade sarkomproteiner och fluorescerande live-imaging. Tunna Z-linjer och en M-linje finns i båda ändarna respektive i mitten av en sarkom. Z-line proteiner – α-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP) och aktin-associerade LIM protein (PDLIM3) – och ett M-line protein – Myomesin-2 (Myom2) – var märkta med fluorescerande proteiner. Dessa märkta proteiner kan uttryckas från endogena alleler som knock-ins eller från adeno-associerade virus (AAV). Här introducerar vi metoderna för att differentiera mus och mänskliga pluripotenta stamceller till kardiomyocyter, för att producera AAV och för att utföra och analysera live-imaging. Vi beskriver också metoderna för att producera polydimethylsiloxane (PDMS) stämplar för en mönstrad kultur av PSC-CMs, vilket underlättar analysen av sarkom förkorta med fluorescerande-märkta proteiner. För att bedöma sarkomförkortning registrerades timelapse-bilder av de slående cellerna vid en hög framerate (50-100 bilder per sekund) under elektrisk stimulering (0,5-1 Hz). För att analysera sarkomlängd under cellkontraktionen utsattes de inspelade timelapse-bilderna för SarcOptiM, ett plugin-program för ImageJ/Fiji. Vår strategi ger en enkel plattform för att undersöka hjärtsjukdomar fenotyper i PSC-CMs.

Introduction

Hjärt-kärlsjukdomar är den främsta orsaken tilldödlighet över hela världen 1 och kardiomyopati representerar den tredje orsaken till hjärtrelaterade dödsfall2. Kardiomyopati är en kollektiv grupp sjukdomar som påverkar hjärtmusklerna. Den senaste utvecklingen av inducerade pluripotenta stamceller (iPS) och riktad differentiering av iPS-celler mot kardiomyocyter (PSC-CMs) har öppnat dörren för att studera kardiomyocyter med patientens genom som en in vitro-modell av kardiomyopati. Dessa celler kan användas för att förstå patofysiologin hos hjärtsjukdomar, för att belysa deras molekylära mekanismer och för att testa olika terapeutiska kandidater3. Det finns ett enormt intresse, således har patientbaserade iPS-celler genererats (t.ex. hypertrofisk kardiomyopati [HCM]4,5, arytmogen rätt ventrikulär kardiomyopati [ARVC]6, dilaterad kardiomyopati [DCM]7, och mitokondriell-relaterade kardiomyopatier8,9). Eftersom en av egenskaperna hos kardiomyopati är dysfunktion och störningar av sarkomerer, behövs ett giltigt verktyg som enhetligt mäter sarkomfunktion.

Sarkomförkortning är den mest använda tekniken för att bedöma sarkomfunktion och kontraktiliteten hos vuxna kardiomyocyter som härrör från djurmodeller och människor. För att utföra sarkomförkortning krävs välutvecklade sarkomerer som är synliga under faskontrast. PSC-CMs odlade in vitro-display underutvecklade och oorganiserade sarkomerer och kan därför inte användas för att korrekt mäta sarkomstförkortning10. Denna svårighet att korrekt bedöma kontraktiliteten hos PSC-CMs hindrar deras användning som en plattform för att bedöma hjärtfunktioner in vitro. För att indirekt bedöma PSC-CMs kontraktilitet har atomkraftmikroskopi, mikropostmatriser, traktionskraftmikroskopi och impedansmätningar använts för att mäta effekterna av den rörelse som dessa celler utövar på sin omgivning11,12,13. Mer sofistikerade och mindre invasiva videomikroskopiinspelningar av faktisk cellulär rörelse (t.ex. SI8000 från SONY) kan användas för att alternativt bedöma deras kontraktilitet, men denna metod mäter inte direkt sarkomrörelse eller kraftgenereringskinetik14.

För att direkt mäta sarkomrörelse i PSC-CMs växer nya metoder, såsom fluorescerande märkning till sarkomprotein, fram. Lifeact används till exempel för att märka filamentöst aktin (F-aktin) för att mäta sarkomrörelse15,16. Genetiskt modifierade iPS-celler är ett annat alternativ för märkning av sarkomproteiner (t.ex. α-aktinin [ACTN2] och Myomesin-2 [MYOM2]) med fluorescerande protein17,18,19.

I det här dokumentet beskriver vi hur man utför timelapse-avbildning för att mäta sarkomförkortning med Myom2-TagRFP (mus embryonala stamceller [ES] och ACTN2-mCherry (mänskliga iPS-celler). Vi visar också att en mönstrad kultur underlättar sarkomisk anpassning. Dessutom beskriver vi en alternativ metod för sarkommärkning, med hjälp av adeno-associerade virus (AAV), som kan tillämpas i stor utsträckning på patient-härledda iPS-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Differentiering av mus pluripotenta stamceller

  1. Underhåll av mus ES-celler
    1. Underhållsmedium: Blanda 50 ml fetala bovinserum (FBS), 5 ml L-alanin-L-glutamin, 5 ml icke-essentiell aminosyra (NEAA), 5 ml 100 ml natrium pyruvat och 909 μl 55 mM 2-merkaptoethanol med 450 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM). Komplettera leukemihämmande faktor (LIF), CHIR-99021 och PD0325901 vid en slutlig koncentration av 1000 U/ml, 1 μM respektive 3 μM. Sterilisera mediet genom ett filter på 0,22 μm.
    2. FBS medium: Blanda 55 ml FBS, 5,5 ml L-alanin-L-glutamin, 5,5 ml natrium pyruvat och 5,5 ml NEAA till 500 ml dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) hög glukos. Filtrera mediet genom ett filter på 0,22 μm för sterilisering.
    3. Kultur SMM18 mus ES celler där TagRFP slogs in i Myom2 locus på en gelatiniserad 6 cm skål i underhållsmedium som tidigarebeskrivits 18. Passage var 2-3 dagar.
  2. Beredning av serumfri differentiering (SFD) medium
    1. Basal SFD: Blanda 250 ml av Hams F-12, 750 ml Iscoves modifierade Dulbecco's Medium (IMDM), 10 ml B27-tillägg minus vitamin A, 5 ml N2 tillägg, 10 ml L-alanin-L-glutamin, 5 ml 10% bovint serum albumin i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 10 mL penicillin och streptomycin (10 000 U/ml). Filtrera genom 0,22 μm sil för sterilisering.
    2. Lös upp askorbinsyra vid 5 mg/ml i destillerat vatten och filtrera genom 0,22 μm sil för sterilisering.
    3. Späd 13 μL 1-Thioglycerol till 1 ml IMDM. Häri, se denna utspädda 1-Thioglycerol som MTG.
    4. Tillsätt 10 μL askorbinsyra (5 mg/ml) och 3 μL MTG till 1 ml basal SFD på användningsdagen. Häri, se denna blandning som fullständig SFD.
  3. Dag 0, embryoidkroppsbildning (EB) för differentiering
    1. Skörda SMM18 mus ES-celler med en rekombinant trypsinliknande proteas (rTrypsin) och räkna cellerna.
    2. Centrifugera 5 x 105 celler vid 300 x g i 3 min i 4 °C, återanvänd i 10 ml komplett SFD och frö till en 10 cm Petri-skål. Odla cellerna vid 37 °C och 5% CO2 för 50 h.
  4. Differentiering dag 2
    1. Tillsätt Activin A, human vaskulär endoteltillväxtfaktor (hVEGF) och benmorfogenetiskt protein 4 (BMP4) för att slutföra SFD vid en slutlig koncentration av 5 ng/mL, 5 ng/mL respektive 1, 9 ng/ml.
      OBS: BMP4-koncentrationerna kan variera beroende på partiT BMP4. Testa flera koncentrationer i en småskalig studie innan du använder ett nytt parti och bestäm den bästa koncentrationen för hjärt differentiering.
    2. Överför EBs från en Petri-skål till ett 15 ml-rör och centrifugera vid 50-100 x g i 3 min vid 4 °C.
    3. Tillsätt under tiden mediet som bereds i steg 1.4.1 i Petri-skålen för att skydda de återstående EB:erna från att vara torra.
    4. Aspirera supernaten från 15 ml-röret, återanvänd EBs med mediet i Petri-skålen och överför EB-lösningen tillbaka till skålen. Odla sedan EB vid 37 °C och 5% CO2 i 46 h.
  5. Differentiering dag 4
    1. Gelatinisera en 10 cm vävnadskulturbehandlad maträtt med 5 till 10 ml 0,1% gelatin i minst 5 min. Aspirera gelatin precis innan du sår celler.
    2. Förbered medium: Blanda grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF), FGF10 och hVEGF för att slutföra SFD vid 5 ng/mL, 25 ng/mL respektive 5 ng/mL slutliga koncentrationer. För en 10 cm skål, förbered 10 ml.
    3. Överför celler från Petri-skålen till ett 15 ml-rör. Tillsätt 5 ml PBS till Petri-skålen, tvätta flera gånger och överför till 15-ml-röret för att samla de återstående cellerna. Centrifugera vid 50-100 x g, 4 °C, 3 min.
    4. Aspirera supernatant, tillsätt 1 ml rTrypsin och inkubera vid 37 °C i 3 min.
    5. Vortex kort för att skilja EBs, tillsätt 9 ml 10% FBS medium, virvel igen och räkna cellerna.
    6. Centrifugera 1,5 x 107 celler vid 300 x g, 4 °C i 3 min, återanvänds med mediet förberett i steg 1.4.2 och sådd i den gelatiniserade skålen. Inkubera vid 37 °C och 5% CO2 i 2 dagar.
      OBS: Dag 7 eller 8 kan omfattande misshandel av PSC-CMs observeras.
  6. Läkemedelsval vid differentieringsdagarna 7 och 9: Återmata media med puromycin (2 μg/ml vid den slutliga koncentrationen) för att eliminera icke-kardiomyocyter dag 7 och 9 differentiering.
    OBS: Föräldralinjen för SMM18 är syNP4 mus ES-celler, som hyser NCX1 promotordriven puromycinresistent gen20.
  7. Dag 10, replatera för framtida experiment
    1. Täck en kulturplatta med glasbotten eller en 35 mm bildform som innehåller ett polymerlock med 0,1% Gelatin. För att förbättra mognaden, täck disken med laminin-511 E8 fragment (LN511-E8) vid 1 μg/cm2 i 30-60 min vid rumstemperatur18. För att odla PSC-CMs i specifika intressemönster, se steg 4 och 5 för att förbereda PDMS-stämplar (Polydimethylsiloxane).
    2. För att skörda SMM18 PSC-CMs, tvätta skålen två gånger med PBS, applicera 1 ml rTrypsin och inkubera 3 min vid 37 °C.
    3. Samla celler i 9 ml 10% FBS medium, suspendera och räkna cellerna. Plätera cellerna på 50 000-100 000 celler i en brunn på en 24-brunnsplatta eller 250 000-500 000 celler i en 35 mm bildbehandlingsform.
    4. Centrifugera ett tillräckligt antal celler (300 x g, 3 min) och återanvänd cellerna med komplett SFD kompletterat med FBS (slutlig koncentration vid 10%).
    5. Inkubera över natten och ändra kulturmediet för att slutföra SFD med puromycin.
    6. Från dag 14, ändra kulturmediet två till tre gånger i veckan med komplett SFD fram till dag 21-28, då Myom2-RFP blir framträdande. För AAV-baserad transduktion av fluorescerande märkta sarkomproteiner, se steg 3.

2. Differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller

  1. Förberedelse av differentieringsmedier
    1. RPMI+B27-Ins: blanda 500 ml RPMI 1640 medium, 10 ml B27 minus insulin och 5,25 ml L-alanin-L-glutamin.
    2. RPMI +B27+Ins: blanda 500 ml RPMI, 10 ml B27 tillägg och 5,25 ml L-alanin-L-glutamin.
  2. Underhåll av mänskliga iPS-celler
    1. Passage mänskliga iPS celler två gånger i veckan med AK02N på LN511-E8 efter tidigare publicerad metod med vissa modifieringar21.
    2. Skörda celler med en 3 min behandling av rTrypsin och samla i 10% FBS medium. Räkna celler och centrifugera vid 300 x g i 3 min vid 4 °C. Frö 75 000-125 000 celler i en brunn med 6 brunnsplatta med 2 ml AK02N kompletterat med LN511-E8 och Y27632 vid den slutliga koncentrationen på 0,5 μg/ml (0,1 μg/cm2)respektive 10 μM.
    3. Inkubera vid 37 °C och 5% CO2 och ersätt mediet följande dag med 2 ml AK02N utan tillägg. Byt media varannan till var tredje dag och passera var tredje till fjärde dag.
  3. Dag -4: replatera före differentiering
    1. Täck en 6 brunnsplatta med 0,5 μg/cm2 LN511-E8 utspädd i PBS. Inkubera sedan i minst 30 min vid 37 °C och 5 % CO2 eller 1 timme vid rumstemperatur. Aspirera beläggningslösning precis innan du sår celler.
    2. Skörda mänskliga iPS-celler med rTrypsin och räkna celler som i steg 2.2.2.
    3. Centrifugera 1,25 x 105 celler för en brunn av en 6-brunnsplatta vid 300 x g i 3 min vid 4 °C och återanvänd i 2 ml AK02N-tillägg med LN511-E8 (slutlig koncentration 0,5 μg/ml eller 0,1 μg/cm2)och Y27632 (slutlig koncentration 10 μM) per brunn.
    4. Aspirate beläggning lösning, frö återanvända celler i den belagda plattan och inkubera vid 37 °C och 5% CO2.
  4. Dagar -3 och -1: ersätt medium med 2 ml AK02N.
  5. Dag 0: Ersätt medium med 2 ml RPMI+B27-Ins kompletterat med CHIR99021 (slutlig koncentration 6 μM) per brunn för att starta differentiering.
  6. Dag 2: Ersätt medium med 2 ml RPMI+B27-Ins med WntC59 (slutlig koncentration 2 μM) per brunn.
  7. Dag 4: Byt ut medium mot 2 ml RPMI+B27-Ins per brunn.
  8. Dag 7 och dag 9: Ersätt medium med 2 ml RPMI+B27+Ins med puromycin (slutlig koncentration 10 μg/ml) per brunn för att selektivt odla PSC-CMs.
    OBS: ACTN2-mCherry linje, som används i denna studie, har en kassett av inre ribosomal ingång webbplats (IRES), puromycin-resistent gen som sätts in i 3′-oöversatta regionen (UTR) av TNNT2 locus och mCherry ersätter stop codon actn2. För att rena kardiomyocyt utan inknyckning, se steg 3 och 4.
  9. Dag 10: replatera för framtida experiment
    1. Täck en 35 mm bildform med ett polymerlock med 0,5-1 μg/cm2 LN511-E8 utspädd i 0,1% Gelatin. Inkubera 2-4 timmar vid rumstemperatur för långsiktig lönsamhet. Information om hur du odlar PSC-CMs i önskade mönster finns i steg 4 och 5 för att förbereda PDMS-stämplar.
    2. För att skörda mänskliga PSC-CMs, tvätta skålen två gånger med PBS, applicera 1 ml rTrypsin per brunn och inkubera 3 min vid 37 °C.
    3. Samla celler i 4 ml 10% FBS medium, suspendera och räkna cellerna. Tallrik 250 000-500 000 celler per 35 mm bildfat.
    4. Centrifugera ett tillräckligt antal celler vid 300 x g i 3 min vid 4 °C, återanvänd med RPMI+B27+Ins med puromycin (10 μg/ml) och platta på den belagda 35 mm bildfatet.
    5. Inkubera över natten. Nästa morgon, ersätt odlingsmediet med RPMI +B27+Ins med puromycin (10 μg/ml).
    6. Från dag 14, byt kulturmedium 2-3 gånger i veckan med RPMI +B27+Ins till dag 21-28 för avbildning. För AAV-baserad transduktion av fluorescerande märkta sarkomproteiner, se steg 3.

3. Fluorescerande märkning av sarkomer med adeno-associerade virus

  1. Förberedelse före AAV-produktion
    1. Underhåll HEK293T celler i DMEM kompletteras med FBS (slutlig koncentration 10%) på en 10 cm vävnad kultur platta. Passageceller tre gånger i veckan.
    2. Förbered polyetylnimin (PEI) vid 1 mg/ml. Blanda 50 mg polyetylnimin MAX 40000 och 40 ml ultrapurevatten. Justera pH till 7,0 med 1 N NaOH. Gör sedan den slutliga volymen till 50 ml med ultrapurevatten och filtrera genom en 0,22 μm sil.
    3. Förbered en skyttelvektor med en sarkomisk märkningsgen (t.ex. TCAP eller PDLIM3 smält med ett grönt fluorescerande protein [GFP]), drivet av en kardiomyocytspecifik promotor, såsom hjärt troponin T (cTNT)22.
      OBS: För detta fall använde vi monomeric förbättrad GFP med mutationer av V163A, S202T, L221V23.
  2. Dag 0, passage HEK-celler
    1. När celler når confluency, passage 2,0 x 107 HEK293T celler till en 15 cm vävnad kulturplatta med 20 mL DMEM med 10% FBS.
  3. Dag 1, transfection
    1. Blanda 13,5 μg av skyttelvektorn, 26 μg pHelper (en vektorkodning E2A, E4 och VA av adenovirus), 16,5 μg pRC6 (en vektorkodning AAV2 Rep och AAV6 Cap gener) och 1 ml DMEM utan natrium pyruvat (DMEM-Pyr).
    2. Blanda 224 μL PEI (1 mg/ml, beredd i steg 3.1.2) och 776 μL DMEM-Pyr.
    3. Blanda och inkubera plasmidlösningen och PEI-lösningen i rumstemperatur i 30 min.
    4. Tillsätt plasmid/PEI-lösningen till HEK293T-cellerna som bereds i steg 3.2.
  4. Dag 2, medelstor förändring
    1. Vid 24 h efter transfection, byt medium till DMEM-Pyr. Odlingsceller fram till skörd av AAV dag 7. AAV kommer att släppas ut i kulturmedierna.
  5. Dag 7, AAV-insamling, koncentration och buffertersättning med minimal reningmetod24
    1. Inkubera en centrifugal ultrafiltreringsenhet (100k molekylvikt cut-off [MWCO]) med 5 ml 1% BSA i PBS vid rumstemperatur i 15 min. Centrifugera sedan ultrafiltreringsenheten vid 500 x g i 2 min och aspirera både filtrerade och återstående lösningar.
    2. Överför medium från den 15 cm långa skålen som producerade AAV till ett nytt koniskt rör på 50 mL och centrifuger (500 x g, 5 min). Filtrera supernatanten genom en 0,45 μm sprutsil för att avlägsna cellskräp och applicera suspension på ultrafiltreringsenheten.
    3. Centrifugera vid 2000 x g i 90 min eller tills du koncentrerar kulturens supernatant 0,5 till 1 ml.
    4. Aspirera filtratet och applicera 15 ml PBS på ultrafiltreringsenheten.
    5. Upprepa centrifugationen tills koncentratet blir 0,5-1 ml.
    6. Upprepa 3.5.4 och 3.5.5.
    7. Överför koncentrerad AAV till ett nytt 1,5 ml-rör och förvara vid 4 °C eller -20 °C.
      OBS: AAV kan användas i P1-anläggningar men följa lokala regler och förordningar. AAV kan också produceras med konventionella metoder.
  6. Beräkning av AAV titer
    1. Blanda 5 μL AAV, 195 μL DMEM-Pyr och 10 U benzonas och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
    2. Tillsätt 200 μL proteinas K-buffert (0,02 M Tris HCl och 1% SDS) och 5 μL proteinas K (20 mg/ml) och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
    3. Förbered försiktigt 400 μL av en 25:24:1 Fenol/kloroform/isoamylalkohollösning, virvel i 1 min och centrifugera vid 20 000 x g i 1 min.
    4. Överför 200 μL vattenfasen till ett nytt 1,5 ml-rör, vilket ger ungefär hälften av de ursprungliga AAV-genomen.
    5. Tillsätt 1 μL glykogen (20 mg/ml) till 20 μL 3 M CH3COONa (pH 5.2) och virvel. Tillsätt 250 μL 2-Propanol till 100 μL 100% etanol och virvel igen.
    6. Inkubera vid -80 °C i 15 min. Centrifug vid 20 000 x g i 30 min vid 4 °C.
    7. Aspirera supernatanten och tillsätt 70% etanol till röret. Sedan centrifug vid 20 000 x g, 4 °C i 5 min.
    8. Aspirera supernatant och lufttorka tills pelleten blir klar.
    9. Tillsätt 200 μL Tris-Etylendiaminetetraacetic acid (TE; pH 8.0) för att lösa AAV-genomen. Späd sedan exemplet 100 gånger med TE.
    10. Förbered en standard med pAAV-CMV-Vector vid 6,5 ng/μL med TE för att erhålla 109 vektorgenom (vg)/ μL. Gör sedan en serie 10-faldig utspädning från 104 till 108 med TE.
    11. Blanda 1 μL prov-DNA (eller standarderna), 0,4 μL primers (5 μM), 3,6 μL destillerat vatten och 5 μL SYBR Green master mix. Primers, som ligger på ITR, är 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ och 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
    12. Utför PCR i realtid med följande tillstånd: Initial denatur vid 95 °C för 60 s, 40 denatureringscykler vid 95 °C för 15 s samt glödgning och förlängning vid 60 °C i 30 s, följt av smältkurva.
    13. Baserat på standarder och Ct-värden ger en PCR-maskin i realtid kopieringsnumret för vektorgenom i 1 μL av ett prov. Beräkna den ursprungliga AAV-titern med hjälp av följande ekvation: ett kopieringsnummer som tillhandahålls av PCR i realtid (vg/μL) x 8 x 103 x 2, där 8 x 103 som utspädningsfaktor under isolering av AAV-genom och 2 som skillnadsfaktor för AAV (enkelsträng) och plasmid (dubbelsträng).
  7. Transduktion till PSC-CMs
    1. Räkna PSC-CMs i en extra brunn eller extra maträtt.
    2. Späd ut AAV (1 x 104 till 1 x 106 vg/cell) för att utgör 50 μL med PBS. Applicera AAV vid multiplicity of infection (MOI) på 1 x 104 till 1 x 106 vg/cell på PSC-CMs och culture PSC-CMs i 3 dagar med AAV i motsvarande differentieringsmedium för mus och mänskliga PSC-CMs och ändra sedan media till kulturmedium utan AAV.
    3. Använd PSC-CMs för live-cell imaging efter 7 dagar eller mer efter omföring.

4. [Frivillig] AAV-baserad rening av PSC-CMs

  1. Förberedelse av AAV
    1. Förbered AAV enligt beskrivningen i steg 3 med hjälp av en skyttel vektor uttrycker blasticidin-resistent gen under kontroll av cTNT promotor.
  2. Transduktion till differentiering av iPS-celler
    1. Differentiera mänskliga iPS-celler i 4 dagar efter protokollet som beskrivs i steg 2 och räkna antalet celler i en extra brunn.
    2. När du har bytt medium dag 4, applicera AAV på MOI på 1 x 105 vg/cell för att differentiera PSC i RPMI +B27-Ins media.
    3. Vid dag 7, uppdatera medium med RPMI +B27+Ins och tillsätt 2,5-10 μg/ml blasticidin.
    4. Dag 10 är PSC-CMs redo att replatera.

5. Förberedelse av PDMS-stämplar

  1. Designa enhetsmönstret på 200 μm-remsor tillsammans med 10-25 μm spår mellan remsorna med hjälp av en datorstödd design (CAD) ritprogramvara.
  2. Rita mönstret av enheter på en kromfotomask belagd med AZP1350 med UV-ljus av ett masklöst litografiverktyg.
  3. Utveckla mönstret på fotomasken i en serie positiva fotoresistutvecklare (t.ex. krom etchant) och skölj med DI-vatten.
  4. Torka av en kiselskiva på en kokplatta vid 120 °C i 15 min.
  5. Låt skivan svalna till rumstemperatur och snurra en negativ fotoresist SU-8 3010 för att göra en höjd av 10-20 μm med 1500 rpm i 30 s med en spin-coater.
  6. Mjukbaka skivan i två steg på en kokplatta enligt tillverkarens protokoll.
  7. När skivan svalnat till rumstemperatur, ladda skivan på maskjusteraren.
  8. Använd en maskjusterare för att justera masken på skivan och utsätta skivan för UV-ljus.
  9. Utför bakningen efter exponeringen till skivan i två steg på en kokplatta enligt tillverkarens protokoll.
  10. Utveckla skivan i en serie SU-8-utvecklare och 2-Propanol och torka sedan skivan med en kväveström.
  11. Överför skivan till en petriskål av lämplig storlek.
  12. Blanda PDMS elastomer och dess härdningsmedel i ett förhållande 10:1 w/w och häll blandningen i Petri-skålen.
  13. Avgasa PDMS i en desiccator tills alla luftbubblor försvinner och härda sedan PDMS på värmeplattan vid 80 °C i 2 timmar.
  14. Skala av det härdade PDMS från huvudformen med en pincett och skär sedan ut delen med designen för att vara en PDMS-stämpel.
    OBS: Formen kan vara fyrkantig, men en åttkantig form överför mönstret bättre vid kanten.

6. Mönstrad kultur av pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter

  1. Ta bort damm från ytan på PDMS-stämplar med hjälp av mendtejp.
  2. Sänk ner frimärkena i 70% etanol för att sterilisera. Blås sedan etanol från ytan av frimärkena med en luftdubbe.
  3. Applicera 5-10 μL 0,5 wt% 2-metakryloyloxyetylfosforylkolin (MPC) polymer/etanol på ytan av PDMS-stämplar.
    OBS: Ojämn fördelning av MPC-polymer kan orsaka ett stört mönster.
  4. Inkubera 10-30 min tills MPC-polymeren är helt torkad.
  5. Placera frimärkena i kontakt med täcken på en kulturplatta med glasbotten eller en 35 mm bildform med ett polymerlock och lägg en vikt (t.ex. ett AAA-batteri) på stämpeln i 10 minuter.
  6. Ta bort vikt och frimärken. Bekräfta sedan att mönstret har överförts under mikroskop.
    OBS: Stämplade tallrikar/tallrikar kan förvaras upp till 1 vecka i rumstemperatur.
  7. Tvätta de stämplade brunnarna/diskarna med PBS två gånger.
  8. Späd LN511-E8 med PBS vid 2-4 μg/ml och täck skålen med LN511-E8 vid 0,5-1 μg/cm2. För mänskliga PSC-CMs, späd LN511-E8 med 0,1% gelatinlösning istället för PBS. Inkubera sedan i minst 1 timme (optimalt, mer än 4 timmar).
  9. Plåtceller enligt beskrivningen i tidigare avsnitt.

7. Timelapse-avbildning av sarkomer under fluorescerande mikroskop

  1. Slå på och anslut mikroskopet, den associerade datorn och även all nödvändig kringutrustning.
  2. För att utföra timelapse-avbildning, fånga timelapse-bilder med den högsta förstoringen (100X objektiv lins med oljeelektion).
  3. Välj live-avbildningsförhållanden. Om du vill hämta bra representativa data kan du försöka justera till den högsta bildhastigheten (minst 20 ms eller 50 bildrutor per sekund rekommenderas). Öppna slutaren och applicera en nödvändig binning (4 X 4) och en gröda av förvärvsområdet för att uppnå de kortaste intervallen mellan bilderna under timelapse-avbildningen.
    Obs: Inställningen kan variera beroende på mikroskopens konfigurationer. Kameran måste vara högkänslig och kunna överföra data till den anslutna datorn tillräckligt snabbt. För detta ändamål använde vi ORCA-blixt med kameralänk. Vi har testat en snurrande konfokal mikroskopi och har införskaffat bilder med 400 bilder per sekund.
    1. [Valfritt] Om cellernas slaghastighet är låg, framkalla cellerna genom elektrisk fältstimulering.
  4. Kör tidsfördröjningsposten
    1. Se till att de bildade fälten förblir i fokus när du spelar in timelapse-bilden.
    2. Spara timelapse-bilderna i en lämplig mapp.

8. Analys av timelapse-bildbehandling med SarcOptiM, ett ImageJ / Fiji-plugin

  1. Läs in en serie timelapse-bilder i ImageJ. För Olympus VSI-format öppnar du filer via OlympusViewer Plugin.
  2. Justera bildens ljusstyrka och kontrast för att tydligt observera sarkommönstret (Bild | Justera | Ljusstyrka/kontrast).
  3. Öppna SarcOptiM genom att klicka på menyn Fler verktyg (>>) och välja SarcOptiM.
  4. Kalibrera programmet genom att trycka på Ctrl + Skift + P och 1 μm-knappen i verktygsfältet och följa dialogrutorna.
  5. Rita en linje över sarkomens region som ska användas för att mäta sarkomförkortningen.
  6. Starta sarkomförkortningsanalysen genom att trycka på SingleCell (AVI) i verktygsfältet. Representativa uppgifter visas i figur 1 och figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mäta sarkom förkorta med hjälp av knock-in PSC-CMs reporter linjer. Sarkom-märkta PSC-CMs användes för att mäta sarkom förkortning. Linjerna uttrycker Myom2-RFP och ACTN2-mCherry från endogen lokus. TagRFP sattes in i Myom2, kodning M-proteiner som lokaliserar till M-linjen, medan mCherry slogs in i ACTN2, kodning α-Actinin, som lokaliserar till Z-linje18,25. Timelapse-bilder erhölls och användes för att bestämma sarkomförkortning som presenteras i figurerna 1 och 2 och film 1-3.

För att övervinna den oorganiserade sarkomen hos PSC-CMs användes specifika PDMS-stämplar för att odla PSC-CMs i randmönstret. Denna mönstrade kultur främjade en långsträckt cellform och ett mer organiserat sarkommönster jämfört med celler som odlades i icke-mönsterområdet (figurerna 2B och 2C). Med denna fördel främjade den mönstrade kulturen bättre sammandragning av cellerna och gav en jämn sarkomlängdsprofil som visas i filmerna 2 och 3 och figur 2D.

Fluorescerande märkning av Z-line protein med hjälp av AAV vektorer. För att visualisera Z-linjen av PSC-CMs utan att generera knock-in iPS celler, fluorescerande-taggade Z-line proteiner uttrycktes med hjälp av AAV transduktion. Två av små Z-line proteiner, Telethonin (TCAP) och Actin-associerade LIM protein (PDLIM3) med GFP, var märkta och förpackade med AAV6 capsid (Figur 3A). När PSC-CMs hade differentierats och renats omvandlades AAV till PSC-CMs(figur 3B). De transducerade PSC-CMs uttryckte sarkomiska GFP-signaler längs PSC-CMs så tidigt som tre dagar efter transduktion (figurerna 3C och 3D). Vanligtvis är transduktion av AAV vid en MOI på 105 vg/cell tillräcklig för att visualisera fluorescerande taggade sarkomproteiner och en högre titer kan orsaka icke-specifik lokalisering av GFP till cytoplasma även om det ökar den totala GFP-intensiteten.

Rening av PSC-CMs med hjälp av AAV vektorer. Nuvarande metoder förlitar sig på den läkemedelsvalskassett som redan finns på genomet av PSC-CMs, antingen transgena eller knock-in line. Det är dock arbetsintensivt att producera en sådan linje från patientbaserade iPS-celler. Eftersom AAV-vektorer har visat sig driva uttrycket av fluorescerande märkta Z-line proteiner utan behov av knock-in, försökte vi etablera reningsmetoden utan inknöjande också (Figur 4). För detta ändamål konstruerades en ny AAV-vektor, som kodar blasticidinresistent gen under kontroll av cTNT-promotorn (Figur 4A). AAV (MOI av 105 vg/cell) omvandlades till differentiering av mänskliga iPS celler dag 4. Därefter behandlades celler med 2,5-10 μg/ml blasticidin (behov av titrering för varje cellinje) mellan dag 7 och 9 (Figur 4B). Dag 14 var renheten hos PSC-CMs mer än 90% (Figur 4C).

Figure 1
Bild 1:Sarkomförkortning av mus-PSC-CMs som härletts från Myom2-TagRFP-cellinjen. A. Tidslinjen för differentiering av MUS PSC-CM. B. Jag är inte så bra på Representativa bilder för sarkom förkortas i olika tidpunkter med mätområden som indikeras av gula staplar. Skalstång = 10 μm. C. Sarkomlängdsprofil under sammandragning av kardiomyocyterna som stimulerades med el vid 1 Hz. Bildhastigheten var 50 bilder per sekund. Pixelstorleken var 0,26 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativa uppgifter som visar sarkomisk förkortning av de mänskliga PSC-CMs som härrör från ACTN2-mCherry-cellinjen i icke-mönstrad och mönstrad kultur. A. Tidslinjen för mänsklig PSC-CM-differentiering. B. Jag är inte så bra på och C. Kardiomyocyter odlade i icke-mönstrade kulturer visar oorganiserade sarkommönster (B) medan mönstrade kulturer främjar en bra anpassning av sarkomen (C). Mätområden som presenteras av gula staplar. D. Jag är inte så bra på Motsvarande sarkomlängdsprofiler som erhålls vid cellkontraktion framkallas genom elektrisk stimulering vid 0,5 Hz och en bildhastighet på 100 bildrutor per sekund. Pixelstorlek = 0,26 μm, skalstång = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Mus PSC-CMs efter AAV-omrörning i 3 dagar. A. Schematisk vektor karta över AAV för sarkom märkning. Ett sarkomprotein (intressegen, GOI) är kopplat till GFP med en Gly-Gly-Gly-Ser linker (L) och uttrycks under kontroll av hjärt troponin T (cTNT) promotor. B. Jag är inte så bra på Tidslinjen för mus PSC-CM differentiering och AAV-transduktion. C. och D. Representativa bilder som visar tydlig sarkomlokalisering och motsvarande sarkomlängdsprofil för TCAP-GFP (C) och PDLIM3-GFP (D) efter 3 dagars transduktion till PSC-CMs som genererats från Myom2-TagRFP-cellinjen. Skalstång = 10 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4:Blasticidin Rening av mänskliga PSC-CMs utan knackning. 
A. Schematisk vektor karta över AAV, där en blasticidin-resistens genkassett (BSR) sätts in nedströms till cTNT promotor. B. Jag är inte så bra på Tidslinjen för valet av mänskliga PSC-CMs-differentiering, transduktion och blasticidin. C. Representativa data som visar procentandelen cTNT + celler i mänskliga PSC-CMs (transduced 105 vg/cell AAV6 dag 4 och sedan behandlas med 2,5 μg/mL blasticidin dag 7 och 9). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Film 1: Fluorescerande timelapse-video av mus-PSC-CMs som genereras från Myom2-TagRFP-cellinjen. RFP signaler visade ett sarkom mönster efter PSC-CM kultur i 28 dagar. Cellerna visade slå synkront när stimuleras med el vid 1 Hz. Timelapse-bilderna förvärvades var 20: e ms med en 100X-lins. Skalstång = 5 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Film 2: Fluorescerande timelapse video av de mänskliga PSC-CMs med ACTN2-mCherry odlade på en icke-mönstrad kulturrätt. PSC-CMs som uttrycker ACTN2-mCherry på en icke-mönstrad kulturrätt visade inte bara oorganisering av sarkom utan också en vinkande sammandragning, för vilken det är svårt att bestämma sarkom förkortning. Cellerna stimulerades med el vid 0,5 Hz och bilder förvärvades var 10 ms med en 100X lins. Skalstång = 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Film 3: Fluorescerande timelapse video av de mänskliga PSC-CMs med ACTN2-mCherry odlade på en mönstrad kulturrätt. Den mönstrade kulturen främjade justering av sarkomen och tvingade cellerna till en stångform. Denna metod gjorde det lättare att bestämma sarkomförkortningen i PSC-CMs. Videon erhölls genom att stimulera cellerna med el vid 0,5 Hz. Bildhastigheten var 100 bilder per sekund. Skalstång = 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Kompletterande CAD-filer. CAD-filer för att skapa frimärken med remsor på 200 μm bredd och spår på 10 μm (Stamp_200x10.dxf), 25 μm (Stamp_200x25.dxf) och 50 μm (Stamp_200x50.dxf). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PSC-CMs har stor potential att användas som en in vitro-plattform för att modellera hjärtsjukdomar och testa effekterna av droger. En korrekt och enhetlig metod för att bedöma funktioner för kusp-CMs måste dock först fastställas. De flesta av funktionella tester fungerar med PSC-CMs, t.ex. elektrofysiologi, kalciumtransient och metabolism26, och en av de första patient-härledda PSC-CM studierna handlade om long-QT syndrom27. Kontraktilitet, en av de viktigaste funktionerna hos en kardiomyocyt, är dock fortfarande svår att bedöma. Med vuxna kardiomyocyter används sarkomförkortning i stor utsträckning. På grund av psc-CMs underutvecklade och oorganiserade sarkom fungerar däremot inte standardmetoden för sarkomförkortning med dessa celler. Därför har vi presenterat en alternativ metod för att undersöka sarkomförkortning i PSC-CMs med fluorescerande taggade sarkomproteiner. Som visats kan proteiner lokaliserade till M-linjen (MYOM2) eller Z-line (ACTN2, TCAP och PDLIM3) som är smälta med fluorescerande proteiner användas för detta tillvägagångssätt. Vi har också visat att fluorescerande märkta proteiner kan uttryckas från endogen lokus eller av AAV. AAV ger mer flexibilitet för att uttrycka fluorescerande märkta proteiner än endogen lokus, eftersom AAV kan appliceras på alla typer av patientbaserade PSC-CMs. Att uttrycka proteiner från endogen lokus kan däremot ha en mindre effekt på sarkomfunktionen, eftersom generens uttrycksnivå är tätt reglerad och kan också användas för att övervaka mognaden av PSC-CMs18.

Även om Myom2-TagRFP, ACTN2-mCherry och Lifeact alla användes för att undersöka sarkomförkortningen16,18,19, är det fortfarande oklart om dessa proteiner stör sarkomfunktionen. Nyligen rapporterades Lifeact störa actin organisation och cellulära morfologi28. Det är också viktigt att notera att fusionsmönster (dvs. GFP-fusionsanläggningen vid N-term eller C-term av målprotein) också påverkar sarkomfunktionen29. Därför, innan de används i stor utsträckning, är det viktigt att noggrant bedöma om fluorescerande taggade sarkomproteiner stör sarkomfunktionen och om proteinproteininteraktioner förekommer i sarkomer in vitro, in vivooch/ eller hos vuxna kardiomyocyter. Denna repertoar av fluorescerande märkta sarkomproteiner ger en bra utgångspunkt för framtida proteintekniska alternativ (dvs. förkorta sarkomproteinerna till endast lokaliseringssignaler). Att välja proteiner att tagga är en annan nyckel till framgång. Vi har taggat ett annat Z-linjeprotein med GFP, men detta protein visade bara en cytoplasmisk fördelning snarare än att lokalisera till sarkom. För live-avbildning kan proteinstabilitet också spela en roll, eftersom till exempel om ett märkt protein är instabilt kommer signalnivån att vara lägre. Fotostabiliteten hos det fluorescerande proteinet är också viktig, eftersom instabila proteinsignaler lätt kommer att släckas under avbildning.

För att undersöka kontraktiliteten hos PSC-CMs med andra metoder än beskrivna kan indirekta mätningar av kraft som genereras av PSC-CMs (t.ex. mikropostmatriser, dragkraftmikroskopi) eller rörelse (t.ex. högupplöst rörelsedetektering med SI8000)11,12,13,14 användas. Vår metod kan kombineras med dessa metoder eller med färgbaserad verkan potential/ kalcium transienta mätningar. Kombinatoriska metoden kan ge ytterligare information om hur en sjukdom orsakar dysfunktion i patient-härledda PSC-CMs.

En av utmaningarna med sarkomstförkortning i PSC-CMs är att hitta en bra sarkom som rör sig linjärt, annars kan cellerna lätt komma ur linjen för sarkomdetektering av SarcOptiM och orsaka instabila sarkomförkortningsresultat. Här visar vi att användning av en mönstrad kultur som genereras med PDMS-stämplar kan ge en stabilare och linjär sarkomisk rörelse. En mönstrad kultur är också känd för att stödja mognaden av PSC-CMs16, vilket är viktigt för sarkomisk funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

H.U. har lämnat in ett patent relaterat till manuskriptet.

Acknowledgments

Vi vill uppmärksamma alla labbmedlemmar vid avdelningen för regenerativ medicin vid Jichi Medical University för den hjälpsamma diskussionen och den tekniska hjälpen. Denna studie stöddes av bidragen från Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 och JP20bm0804018), Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219) och Japanese Circulation Society (Grant for Basic Research) till H.U.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, NOF Corp. LIPIDURE-CM5206
2-Propanol Fujifilm wako 166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) ibidi 81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		 Takara 6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs N.A. We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
B-27 Supplement, minus insulin Thermo Fisher Scientific A18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587-010
Benzonase (25 U/µL) Merck Millipore 70746
Blasticidin S Hydrochloride Fujifilm wako 029-18701
BMP-4, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 314-BP-010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59) abcam ab142216
CAD drawing software, Robert McNeel and Associates, WA, USA Rhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 Sartorius VS2042
CHIR99021 Cayman 13122
Chromium etchant Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan N14B
Chromium mask coated with AZP1350 Clean Surface Technology Co., Japan CBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) Takara 9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose Sigma-Aldrich D6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate Sigma-Aldrich D5796
Ethanol (99.5) Fujifilm wako 057-00456
Fetal Bovine Serum Moregate 59301104
FGF-10, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant Fujifilm wako 060-04543
Gelatin from porcine skin powder Sigma-Aldrich G1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) Sigma-Aldrich G5154-500
GLASS BOTTOM culture plates MatTek P24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12 Thermo Fisher Scientific 11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) Thermo Fisher Scientific 35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt Fujifilm wako 196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) Nippi 892012
Mask aligner Union Optical Co., Ltd., Japan PEM-800
Maskless lithography tool NanoSystem Solutions, Inc., Japan D-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) Merck Millipore SLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18) N.A. Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU
PD0325901 Stemgent 04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Petri dish Sansei medical co. Ltd 01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer Dow Corning Corp., MI, USA SILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000) Polyscience 24765-1
Positive photoresist developer Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan NMD-3
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742
Proteinase K Takara 9034
Puromycin Dihydrochloride Fujifilm wako 166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein R&D Systems, Inc. 338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) Thermo Fisher Scientific 12604-039
RPMI1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875-119
Silicon wafer Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan N.A.
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070
Spin-coater Mikasa Co., Ltd., Japan MS-A100
Spininng confocal microscopy Oxford Instruments Andor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) Fujifilm wako 195-16053
SU-8 3010 Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 3010
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 developer
Tris-EDTA Nippon Gene 314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant Fujifilm wako 226-01781

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
  2. Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
  3. Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
  4. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  5. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  6. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  7. Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
  10. Cho, G. -S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
  11. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  12. Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
  13. Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
  14. Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
  15. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  16. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  17. Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
  18. Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
  19. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  20. Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
  21. Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
  22. Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
  23. Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
  24. Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
  25. Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. Yoshida, Y., et al. , (2020).
  26. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  27. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  28. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
  29. Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).

Tags

Medicin Utgåva 169 Pluripotent stamcell kardiomyocyt sarkomförkortning levande avbildning fluorescerande taggade sarkomproteiner mikrokontakttryck
Sarkomisk förkortning av pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter med fluorescerande taggade sarkomproteiner.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai,… More

Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai, T., Koiwai, K., Murakami, T., Suzuki, H., Hanazono, Y., Uosaki, H. Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.. J. Vis. Exp. (169), e62129, doi:10.3791/62129 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter