Summary
Bu yöntem, floresan etiketli sarkomere proteinleri ile pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler kullanarak sarkomere kısaltmasını incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler (PSC-CM) hem embriyonik hem de indüklenmiş pluripotent kök (ES/iPS) hücrelerinden üretilebilir. Bu hücreler kardiyak hastalık modellemesi için umut verici kaynaklar sağlar. Kardiyomiyopatiler için sarkom kısaltma, yetişkin kardiyomiyositlerle hastalık fenotiplerini incelemek için kullanılan standart fizyolojik değerlendirmelerden biridir. Bununla birlikte, mevcut yöntemler PSC-CM'lerin sözleşmelliğini değerlendirmek için uygun değildir, çünkü bu hücreler faz kontrastlı mikroskopi altında görünmeyen az gelişmiş sarkomlara sahiptir. Bu sorunu gidermek ve PSC-CM'ler ile sarkom kısaltması yapmak için floresan etiketli sarkomere proteinleri ve floresan canlı görüntüleme kullanılmıştır. İnce Z hatları ve bir M-hattı sırasıyla her iki uçta ve bir sarkomun merkezinde yer almaktadır. Z-line proteinler — α-Actinin (ACTN2), Teletonin (TCAP) ve aksin ilişkili LIM proteini (PDLIM3) — ve bir M-line protein — Myomesin-2 (Myom2) — floresan proteinlerle etiketlendi. Bu etiketli proteinler endojen alellerden knock-in olarak veya adeno ilişkili virüslerden (AAV' ler) ifade edilebilir. Burada fare ve insan pluripotent kök hücrelerini kardiyomiyositlere ayırt etme, AAV üretme, canlı görüntüleme yapma ve analiz etme yöntemlerini tanıtıyoruz. Ayrıca, floresan etiketli proteinlerle sarkom kısaltmasının analizini kolaylaştıran PSC-CM'lerin desenli kültürü için polidimetilsiloksan (PDMS) pulları üretme yöntemlerini de açıklıyoruz. Sarkom kısaltmasını değerlendirmek için, dayak hücrelerinin hızlandırılmış görüntüleri elektriksel uyarım (0,5-1 Hz) altında yüksek kare hızında (saniyede 50-100 kare) kaydedildi. Hücre kasılması boyunca sarkom uzunluğunu analiz etmek için, kaydedilen zaman atlamalı görüntüler ImageJ / Fiji için bir eklenti olan SarcOptiM'e tabi tutuldu. Stratejimiz, PSC-CM'lerdeki kardiyak hastalık fenotiplerini araştırmak için basit bir platform sağlar.
Introduction
Kardiyovasküler hastalıklar dünya çapında mortalitenin önde gelen nedenidir1 ve kardiyomiyopati kardiyak ilişkili ölümlerin üçüncü nedenini temsil eder2. Kardiyomiyopati, kalp kaslarını etkileyen toplu bir hastalık grubudur. İndüklenen pluripotent stem (iPS) hücrelerinin son gelişmeleri ve iPS hücrelerinin kardiyomiyositlere (PSC-CM) yönelik yönlendirilmiş farklılaşması, kardiyomiyopatinin in vitro modeli olarak hasta genomlu kardiyomiyositlerin incelenmesine kapı açmıştır. Bu hücreler kardiyak hastalıkların patofizyolojisini anlamak, moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmak ve farklı terapötik adayları test etmek için kullanılabilir3. Bu nedenle, hasta kaynaklı iPS hücreleri üretilmiştir (örneğin, hipertrofik kardiyomiyopati [HCM]4,5,aritmojenik sağ ventrikül kardiyomiyopatisi [ARVC]6, genişlemiş kardiyomiyopati [DCM]7ve mitokondriyal ilişkili kardiyomiyopatiler8,9). Kardiyomiyopatinin özelliklerinden biri sarkomların işlev bozukluğu ve bozulması olduğundan, sarkom fonksiyonunu düzgün bir şekilde ölçen geçerli bir araca ihtiyaç vardır.
Sarkom kısaltma, sarkom fonksiyonunu ve hayvan modellerinden ve insanlardan elde edilen yetişkin kardiyomiyositlerin sözleşmeliğini değerlendirmek için en yaygın kullanılan tekniktir. Sarkom kısaltması yapmak için faz kontrastı altında görülebilen iyi gelişmiş sarkomlar gereklidir. Bununla birlikte, PSC-CM'ler in vitro ekran az gelişmiş ve dağınık sarkomları kültüre eder ve bu nedenle, sarkom kısaltmasını düzgün bir şekilde ölçmek için kullanılamaz10. PSC-CM'lerin sözleşmelerinin sözleşmeye uygun şekilde değerlendirilmesindeki bu zorluk, kardiyak fonksiyonları in vitroolarak değerlendirmek için bir platform olarak kullanımlarını engeller. PSC-CM'lerin sözleşmelliğini dolaylı olarak değerlendirmek için atomik kuvvet mikroskopisi, mikro-post dizileri, çekiş kuvveti mikroskopisi ve empedans ölçümleri, bu hücrelerin uyguladıkları hareketin çevreleri üzerindeki etkilerini ölçmek için kullanılmıştır11,12,13. Gerçek hücresel hareketin daha sofistike ve daha az invaziv video-mikroskopi kayıtları (örneğin, SONY'den SI8000) sözleşmelerini alternatif olarak değerlendirmek için kullanılabilir, ancak bu yöntem doğrudan sarkom hareketini ölçmez veya üretimi zorlar kinetik14.
PSC-CM'lerde sarkomer hareketini doğrudan ölçmek için sarkom proteinine floresan etiketleme gibi yeni yaklaşımlar ortaya çıkıyor. Örneğin, Lifeact sarkom hareketi15,16ölçmek için filamentli aktinin (F-actin) etiketlemek için kullanılır. Genetiği değiştirilmiş iPS hücreleri, sarkom proteinlerini (örneğin, α-actinin [ACTN2] ve Myomesin-2 [MYOM2]) floresan protein17 , 18,19ile etiketlemek için başka bir seçenektir.
Bu yazıda Myom2-TagRFP (fare embriyonik sapı [ES] hücreleri) ve ACTN2-mCherry (insan iPS hücreleri) kullanılarak sarkom kısaltmasını ölçmek için zaman atlamalı görüntülemenin nasıl gerçekleştirildiğini açıklıyoruz. Ayrıca desenli bir kültürün sarkom hizalamasını kolaylaştırdığını gösteriyoruz. Ek olarak, hasta kaynaklı iPS hücrelerine yaygın olarak uygulanabilen adeno ilişkili virüsler (AAV' ler) kullanarak sarkom etiketlemesinin alternatif bir yöntemini açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fare pluripotent kök hücrelerinin farklılaşması
- Fare ES hücrelerinin bakımı
- Bakım ortamı: 50 mL fetal sığır serumu (FBS), 5 mL L-alanin-L-glutamin karıştırın, 5 mL esansiyel olmayan amino asit (NEAA), 5 mL 100 mM Sodyum Pirovat ve 909 μl 55 mM 2-Mercaptoethanol ile 450 mL Glasgow Minimum Esansiyel Orta (GMEM). Ek Lösemi inhibitör faktörü (LIF), CHIR-99021 ve PD0325901 sırasıyla 1000 U/mL, 1 μM ve 3 μM'lik son konsantrasyonda. Ortamı 0,22 μm filtre ile sterilize edin.
- FBS ortamı: 55 mL FBS, 5,5 mL L-alanin-L-glutamin, 5,5 mL Sodyum Piruvat ve 5,5 mL NEAA ila 500 mL Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) yüksek glikozu karıştırın. Sterilize etmek için ortamı 0,22 μm filtreden geçirin.
- TagRFP'nin myom2 lokusuna daha önce açıklandığı gibi bakım ortamında gelatinize edilmiş 6 cm'lik bir tabakta düşürttüği KültürSMM18fare ES hücreleri . Her 2-3 günde bir geçiş.
- Serumsuz farklılaşma (SFD) ortamının hazırlanması
- Bazal SFD: Ham'ın F-12'sinin 250 mL'sini, Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium'unun (IMDM) 750 mL'sini, 10 mL B27 takviyesi eksi A Vitaminini karıştırın, 5 mL N2 takviyesi, 10 mL L-alanin-L-glutamin, fosfat tamponlu salinde (PBS) %10 sığır serum albüminin 5 mL'si ve 10 mL penisilin ve streptomisin (10.000 U/mL). Sterilize etmek için 0,22 μm süzgeçten filtreleyin.
- Askorbik asidi damıtılmış suda 5 mg/mL'de çözün ve sterilize etmek için 0,22 μm süzgeçten filtreleyin.
- 13 μL 1-Tiyogliserol'u 1 mL IMDM'ye seyreltin. Burada, bu seyreltilmiş 1-Thioglycerol'e MTG olarak bakın.
- Kullanım gününde 1 mL bazal SFD'ye 10 μL askorbik asit (5 mg/mL) ve 3 μL MTG ekleyin. Burada, bu karışıma tam SFD olarak bakın.
- 0. Gün, farklılaşma için embriyoid vücut (EB) oluşumu
- SMM18 fare ES hücrelerini rekombinant tripsin benzeri bir proteaz (rTrypsin) ile hasat edin ve hücreleri sayın.
- Santrifüj 5 x 105 hücre 300 x g'da 4 °C'de 3 dakika, 10 mL tam SFD'de yeniden depolayın ve 10 cm'lik bir Petri kabına tohumlayın. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 50 saat boyunca kültüre edin.
- Farklılaşma günü 2
- SFD'yi sırasıyla 5 ng/mL, 5 ng/mL ve 1,9 ng/mL'lik son konsantrasyonda tamamlamak için Activin A, insan vasküler endotel büyüme faktörü (hVEGF) ve kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) ekleyin.
NOT: BMP4 konsantrasyonları BMP4'ün çok fazlalığına bağlı olarak farklılık gösterebilir. Yeni bir lot kullanmadan önce küçük ölçekli bir denemede birkaç konsantrasyonu test edin ve kardiyak farklılaşma için en iyi konsantrasyonu belirleyin. - EBs'yi petri kabından 15 mL'lik bir tüpe ve 50-100 x g'da santrifüje 4 °C'de 3 dakika aktarın.
- Bu arada, kalan ED'lerin kurumasını korumak için 1.4.1 adımında hazırlanan ortamı Petri kabına ekleyin.
- Süpernatantı 15 mL tüpten epire edin, EB'leri Petri kabındaki ortamla yeniden kullanın ve EB çözeltisini çanağa geri aktarın. Daha sonra, 46 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de EBs yetiştirin.
- SFD'yi sırasıyla 5 ng/mL, 5 ng/mL ve 1,9 ng/mL'lik son konsantrasyonda tamamlamak için Activin A, insan vasküler endotel büyüme faktörü (hVEGF) ve kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) ekleyin.
- Farklılaşma günü 4
- En az 5 dakika boyunca% 0.1 jelatin 5 ila 10 mL ile 10 cm doku kültürü ile işlenmiş bir yemek jelatin. Hücreleri tohumlamadan hemen önce jelatin aspirat.
- Ortamı hazırlayın: SFD'yi sırasıyla 5 ng/mL, 25 ng/mL ve 5 ng/mL son konsantrasyonda tamamlamak için temel fibroblast büyüme faktörünü (bFGF), FGF10 ve hVEGF'yi karıştırın. 10 cm'lik bir yemek için 10 mL hazırlayın.
- Petri kabından 15 mL'lik bir tüpe hücre aktarın. Petri kabına 5 mL PBS ekleyin, birkaç kez yıkayın ve kalan hücreleri toplamak için 15 mL'lik tüpe aktarın. 50-100 x g, 4 °C, 3 dk'da santrifüj.
- Aspirat supernatant, 1 mL rTrypsin ekleyin ve 3 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
- Girdap kısaca EBs ayrıştırmak için, eklemek 9 mL 10% FBS orta, girdap tekrar, ve hücreleri saymak.
- Santrifüj 1.5 x 107 hücre 300 x g, 4 °C 3 dakika, adım 1.4.2'de hazırlanan ortamla yeniden depolayın ve jelatinli yemeğe tohum atın. 2 gün boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de kuluçkaya yatır.
NOT: 7 veya 8. güne kadar PSC-CM'lerin kapsamlı bir şekilde dövdüğü gözlenebilir.
- Farklılaşma günlerinde ilaç seçimi 7 ve 9: Farklılaşmanın 7 ve 9. gününde kardiyomiyosit olmayanları ortadan kaldırmak için ortamı pürüzlü (son konsantrasyonda 2 μg/mL) ile yeniden besleyin.
NOT: SMM18'in ebeveyn hattı, NCX1 promotör tahrikli puromycin dirençli gen20'yibarındıran syNP4 fare ES hücreleridir. - 10. Gün, gelecekteki deneyler için yeniden bir bakış
- Cam tabanlı bir kültür plakasını veya %0,1 Jelatin içeren polimer kapaklı 35 mm görüntüleme kabını kaplayın. Olgunlaşmayı arttırmak için, bulaşıkları oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca 1 μg / cm2'de laminin-511 E8 parçası (LN511-E8) ile kaplayın18. PSC-CM'leri belirli ilgi çekici desenlerde kültüre etmek için lütfen polidimetilsiloksan (PDMS) pulları hazırlamak için 4.
- SMM18 PSC-CM'leri hasat etmek için, kabı PBS ile iki kez yıkayın, 1 mL rTrypsin uygulayın ve 37 °C'de 3 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri %10 FBS ortamının 9 mL'sinde toplayın, askıya alın ve hücreleri sayın. Hücreleri 50.000-100.000 hücrede, 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusunda veya 35 mm görüntüleme kabında 250.000-500.000 hücrede plakalayın.
- Yeterli sayıda hücreyi (300 x g, 3 dk) santrifüjlayın ve FBS ile desteklenmiş eksiksiz SFD ile hücreleri yeniden depolayın (%10'da son konsantrasyon).
- Bir gecede kuluçkaya yatırın ve SFD'yi puromycin ile tamamlamak için kültür ortamını değiştirin.
- 14. günden itibaren, Myom2-RFP'nin öne çıktığı 21-28. Floresan etiketli sarkomer proteinlerinin AAV tabanlı transdüksiyonu için lütfen Adım 3'e bakın.
2. İnsan pluripotent kök hücrelerinin farklılaşması
- Farklılaşma ortamlarının hazırlanması
- RPMI+B27-Ins: 500 mL RPMI 1640 orta, 10 mL B27 eksi insülin ve 5.25 mL L-alanin-L-glutamin karıştırın.
- RPMI + B27 + Ins: 500 mL RPMI, 10 mL B27 takviyesi ve 5.25 mL L-alanin-L-glutamin karıştırın.
- İnsan iPS hücrelerinin bakımı
- Bazı değişikliklerle daha önce yayınlanan yöntemi takiben LN511-E8'de AK02N ile haftada iki kez insan iPS hücrelerini pasajla21.
- rTrypsin'in 3 dakikalık bir tedavisi ile hücreleri hasat edin ve% 10 FBS ortamına toplayın. Hücreleri ve santrifüjleri 4 °C'de 3 dakika boyunca 300 x g'da sayın. Tohum 75.000-125.000 hücre 6 kuyu plakasının bir kuyusunda 2 mL AK02N ile desteklenmiş LN511-E8 ve Y27632 son konsantrasyonda 0.5 μg/mL (0.1 μg/cm2)ve 10 μM, sırasıyla.
- 37 °C ve %5 CO2'de kuluçkaya yatırın ve ertesi gün ortamı herhangi bir takviye olmadan 2 mL AK02N ile değiştirin. Medyayı iki ila üç günde bir değiştirin ve üç ila dört günde bir geçiş.
- Gün -4: farklılaşmadan önce replate
- PBS'de seyreltilmiş 0,5 μg/cm 2 LN511-E8 ile6 kuyu plakayı kapla. Daha sonra, 37 °C'de en az 30 dakika ve oda sıcaklığında% 5 CO2 veya 1 saat kuluçkaya yatırın. Tohumlama hücresinden hemen önce kaplama çözeltisini aspirat.
- rTrypsin ile insan iPS hücrelerini hasat edin ve Adım 2.2.2'deki gibi hücreleri sayın.
- Santrifüj 1.25 x10 5 hücre 300 x g'da 6 kuyulu bir plaka kuyusu için 4 °C'de 3 dakika ve 2 mL AK02N takviyesinde yeniden biriktirin LN511-E8 (son konsantrasyon 0,5 μg/mL veya 0,1 μg/cm2)ve kuyu başına Y27632 (son konsantrasyon 10 μM) ile kaplanmıştır.
- Aspirat kaplama çözeltisi, tohum resüspended hücreleri kaplama plakası içine, ve 37 °C ve% 5 CO2kuluçka.
- -3 ve -1 günleri: ortamı 2 mL AK02N ile değiştirin.
- 0. Gün: Farklılaşmayı başlatmak için ortamı kuyu başına CHIR99021 (son konsantrasyon 6 μM) ile birlikte 2 mL RPMI + B27-Ins ile değiştirin.
- 2. Gün: Ortayı kuyu başına WntC59 (son konsantrasyon 2 μM) ile 2 mL RPMI +B27-Ins ile değiştirin.
- 4. Gün: Ortayı kuyu başına 2 mL RPMI+B27-Ins ile değiştirin.
- 7. gün ve 9. gün: PSC-CM'leri seçici olarak kültüre etmek için ortayı 2 mL RPMI +B27+Ins ile puromycin (son konsantrasyon 10 μg/mL) ile değiştirin.
NOT: Bu çalışmada kullanılan ACTN2-mCherry hattı, iç ribozomal giriş bölgesi (IRES), TNNT2 locus'un 3′-çevrilmemiş bölgesine (UTR) yerleştirilen puromisin dirençli gen kasetine ve ACTN2'nin stop kodonunun yerini alan mCherry'ye sahiptir. Kardiyomiyositleri çalmadan arındırmak için lütfen Adım 3 ve 4'e bakın. - 10. Gün: gelecekteki deneyler için yeniden plaka
- 35 mm'lik bir görüntüleme kabını, %0,1 Jelatin ile seyreltilmiş LN511-E8'in0,5-1 μg/cm 2'si ile polimer kapaklı bir şekilde kaplayın. Uzun süreli canlılık için oda sıcaklığında 2-4 saat kuluçkaya yatırın. PSC-CM'leri istediğiniz desenlerde kültüre etmek için lütfen PDMS damgalarını hazırlamak için 4.
- İnsan PSC-CM'lerini hasat etmek için, kabı PBS ile iki kez yıkayın, kuyu başına 1 mL rTrypsin uygulayın ve 37 °C'de 3 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri %10 FBS ortamının 4 mL'sinde toplayın, askıya alın ve hücreleri sayın. Plaka 35 mm görüntüleme kabı başına 250.000-500.000 hücre.
- 4 °C'de 3 dakika boyunca 300 x g'da yeterli sayıda hücreyi santrifüj, puromycin (10 μg/mL) ile RPMI+B27+Ins ile yeniden depolayın ve kaplamalı 35 mm görüntüleme kabına plaka koyun.
- Bir gecede kuluçkaya yaslanın. Ertesi sabah, kültür ortamını RPMI +B27+Ins ile puromycin (10 μg/mL) ile değiştirin.
- 14. günden itibaren, görüntüleme için RPMI +B27+Ins ile haftada 2-3 kez kültür ortamını değiştirin. Floresan etiketli sarkomer proteinlerinin AAV tabanlı transdüksiyonu için lütfen Adım 3'e bakın.
3. Adeno ile ilişkili virüsler kullanan sarkomların floresan etiketlemesi
- AAV üretimi öncesi hazırlık
- 10 cm'lik doku kültürü plakasında FBS (son konsantrasyon %10) ile desteklenmiş HEK293T hücrelerini DMEM'de muhafaza edin. Pasaj hücreleri haftada üç kez.
- Polietilenin (PEI) 1 mg/mL'de hazırlayın. 50 mg polietileninimin MAX 40000 ve 40 mL ultra saf suyu karıştırın. 1 N NaOH kullanarak pH'ı 7,0'a ayarlayın. Ardından, ultra saf su ile son hacmi 50 mL'ye yapın ve 0,22 μm süzgeçten filtreleyin.
- Kardiyak troponin T (cTNT)22gibi kardiyomiyositlere özgü bir promotör tarafından tahrik edilen sarkom etiketleme geni (örneğin, TCAP veya PDLIM3 yeşil floresan protein [GFP] ile kaynaştırımış) ile bir mekik vektörü hazırlayın.
NOT: Bu örnekte, V163A, S202T, L221V23mutasyonları ile monomerik geliştirilmiş GFP kullandık.
- 0. Gün, geçiş HEK hücreleri
- Hücreler izdiah ulaştığında, 2.0 x 107 HEK293T hücrelerini % 10 FBS ile 20 mL DMEM ile 15 cm doku kültürü plakasına geçirin.
- 1. Gün, transfection
- Mekik vektörün 13,5 μg'si, 26 μg pHelper (adenovirüsün E2A, E4 ve VA'sını kodlayan bir vektör), 16,5 μg pRC6 (AAV2 Rep ve AAV6 Cap genlerini kodlayan bir vektör) ve sodyum piruvatsız (DMEM-Pyr) 1 mL DMEM'i karıştırın.
- 224 μL PEI (1 mg/mL, adım 3.1.2'de hazırlanmış) ve 776 μL DMEM-Pyr karıştırın.
- Plazmid çözeltisini ve PEI çözeltisini oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
- Plazmid/PEI solisini adım 3.2'de hazırlanan HEK293T hücrelerine ekleyin.
- 2. Gün, orta değişim
- Transfeksiyondan sonra 24 saat sonra ortayı DMEM-Pyr olarak değiştirin. 7. günde AAV hasadına kadar kültür hücreleri. AAV kültür medyasına yayınlanacak.
- 7. Gün, minimum saflaştırma yöntemi kullanılarak AAV toplama, konsantrasyon ve tamponikamesi 24
- 15 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS'de %1 BSA'nın 5 mL'si ile bir santrifüj ultrafiltrasyon ünitesini (100k moleküler ağırlık kesme [MWCO]) kuluçkaya yatırın. Ardından, ultrafiltrasyon ünitesini 500 x g'da 2 dakika boyunca santrifüjleyin ve hem filtrelenmiş hem de kalan çözümleri epire edin.
- AAV üreten 15 cm'lik çanaktan yeni bir 50mL konik tüpe ve santrifüje (500 x g, 5 dk) orta aktarın. Hücre kalıntılarını gidermek ve ultrafiltrasyon ünitesine süspansiyon uygulamak için süpernatantı 0,45 μm şırınd süzgeçten geçirin.
- 2000 x g'da 90 dakika boyunca veya kültür üstnatantını 0,5 ila 1 mL konsantre edene kadar santrifüj.
- Filtratı aspire edin ve ultrafiltrasyon ünitesine 15 mL PBS uygulayın.
- Konsantre 0,5-1 mL olana kadar santrifüjü tekrarlamayı tekrarlayın.
- 3.5.4 ve 3.5.5'i tekrarlayın.
- Konsantre AAV'yi yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve 4 °C veya -20 °C'de saklayın.
NOT: AAV P1 tesislerinde kullanılabilir, ancak yerel kural ve yönetmeliklere uyar. AAV konvansiyonel yöntemlerle de üretilebilir.
- AAV titresinin hesaplanması
- 5 μL AAV, 195 μL DMEM-Pyr ve 10 U benzonaz karıştırın ve 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- 200 μL proteinaz K tamponu (0,02 M Tris HCl ve% 1 SDS) ve 5 μL proteinaz K (20 mg/mL) ekleyin ve 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- 25:24:1 Fenol/kloroform/izoamil alkol çözeltisinin 400 μL'liğini, 1 dakika boyunca girdabı ve 1 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjü dikkatlice hazırlayın.
- Sulu fazın 200 μL'lik kısmını, orijinal AAV genomlarının yaklaşık yarısını sağlayacak yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
- 3 M CH 3 COONa (pH 5.2) ve girdabın 20 μL'sine1 μLGlikojen (20 mg/mL) ekleyin. 100 μL%100 etanol ve girdap için 250 μL 2-Propanol ekleyin.
- 15 dakika boyunca -80 °C'de kuluçkaya yaslanın. Daha sonra 4 °C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüj.
- Aspirat süpernatant ve tüpe% 70 etanol ekleyin. Ardından, 5 dakika boyunca 20.000 x g, 4 °C'de santrifüj.
- Pelet netleşene kadar süpernatantı ve havayı kurutun.
- AAV genomlarını çözmek için 200 μL Tris-Etylenediaminetetraacetic asit (TE; pH 8.0) ekleyin. Ardından, numuneyi TE ile 100 kat seyreltin.
- 109 vektör genom (vg)/ μL elde etmek için TE ile 6,5 ng/μL'de pAAV-CMV-Vector ile bir standart hazırlayın. Ardından, TE ile 104 ila 108 arasında bir dizi 10 kat seyreltme yapın.
- 1 μL numune DNA'sını (veya standartları), 0,4 μL astarı (5 μM), 3,6 μL damıtılmış suyu ve 5 μL SYBR Green ana karışımını karıştırın. ITR üzerinde bulunan primerler, 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ ve 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
- Aşağıdaki durumla gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin: 60 s için 95 °C'de ilk denatüre, 15 s için 95 °C'de 40 denatüre ve 30 s için 60 °C'de tavlama ve uzatma ve ardından erime eğrisi.
- Standartlara ve Ct değerlerine göre, gerçek zamanlı bir PCR makinesi, bir numunenin 1 μL'sinde vektör genomunun kopya sayısını sağlar. Aşağıdaki denklemi kullanarak orijinal AAV titerini hesaplayın: gerçek zamanlı PCR (vg/μL) x 8 x 103 x 2 tarafından sağlanan bir kopya numarası, burada AAV genom izolasyonu sırasında seyreltme faktörü olarak 8 x 103 ve AAV (tek iplik) ve plazmid (çift iplik) fark faktörü olarak 2.
- PSC-CM'lere dönüştürme
- PSC-CM'leri ekstra bir kuyuda veya ekstra bir tabakta sayın.
- PBS ile 50 μL'yi oluşturan AAV'leri (1 x 104 ila 1 x 106 vg/hücre) seyreltin. Fare ve insan PSC-CM'leri için karşılık gelen farklılaşma medyasında AAV ile 3 gün boyunca PSC-CM'lere ve kültür PSC-CM'lerine 1 x 104 ila 106 vg/hücreli enfeksiyonun (MOI) çokluğunda AAV'ler uygulayın, ardından medyayı AAV olmadan kültür ortamına değiştirin.
- 7 gün veya daha fazla transdüksiyon sonrası canlı hücre görüntüleme için PSC-CM'leri kullanın.
4. [İsteğe bağlı] PSC-CM'lerin AAV tabanlı saflaştırılması
- AAV'nin Hazırlanması
- CTNT promotörünün kontrolü altında blastisidin dirençli geni ifade eden bir mekik vektörü kullanarak AAV'yi Adım 3'te açıklandığı gibi hazırlayın.
- iPS hücrelerini farklılaştırmaya dönüştürme
- Adım 2'de açıklanan protokolü izleyerek 4 gün boyunca insan iPS hücrelerini ayırt edin ve ekstra bir kuyudaki hücre sayısını sayın.
- 4. günde ortam değiştirdikten sonra, RPMI+B27-Ins ortamlarındaki PSC'leri ayırt etmek için 1 x10 5 vg/hücre MOI'sinde AAV'ler uygulayın.
- 7. günde, ortamı RPMI +B27+Ins ile yenileyin ve 2,5-10 μg/mL blasticidin ekleyin.
- 10. günde, PSC-CM'ler yeniden sıçramaya hazırdır.
5. PDMS pullarının hazırlanması
- Bilgisayar destekli bir tasarım (CAD) çizim yazılımı kullanarak şeritler arasında 10-25 μm oluklarla birlikte 200 μm şeritlerin cihaz desenini tasarlayın.
- Maskesiz litografi aracının UV ışığını kullanarak cihazların desenini AZP1350 ile kaplanmış bir krom fotoküme çizin.
- Fotokütledeki deseni bir dizi pozitif fotoresist geliştiricide (örneğin, krom vbhant) geliştirin ve DI suyuyla durulayın.
- 120 °C'de sıcak bir plaka üzerinde 15 dakika boyunca bir silikon gofret susuzluk.
- Gofretin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve negatif fotoresist bir SU-8 3010'u döndürerek bir spin-coater kullanarak 30 s için 1500 rpm ile 10-20 μm yükseklik yapın.
- Gofreti üreticinin protokolüne göre sıcak bir tabakta iki adımda yumuşak pişirin.
- Gofret oda sıcaklığına soğuduktan sonra, gofret maske hizalayıcısına yükleyin.
- Maskeyi gofrete hizalamak ve gofret UV ışığına maruz bırakmak için bir maske hizalayıcı kullanın.
- Maruz kalma sonrası pişiriciyi, üreticinin protokolüne göre sıcak bir plaka üzerinde iki adımda gofrete yapın.
- Gofreti bir dizi SU-8 geliştiricisi ve 2-Propanol'da geliştirin, ardından gofreti bir nitrojen akışı ile kurutun.
- Gofret uygun boyutta bir Petri kabına aktarın.
- PDMS elastomer ve kürleyici maddesini 10:1 w/w oranında karıştırın ve karışımı Petri kabına dökün.
- Pdms'yi tüm hava kabarcıkları kaybolana kadar bir kurutucuda gazdan arındırın, ardından PDMS'yi 80 °C'de 2 saat boyunca sıcak plaka üzerinde iyileştirin.
- Kürlenmiş PDMS'yi bir cımbız kullanarak ana kalıptan soyun, ardından pdms damgası olacak tasarıma sahip kısmı kesin.
NOT: Şekil kare olabilir, ancak sekizgen bir şekil deseni kenarda daha iyi aktarır.
6. Pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerin desenli kültürü
- Tamir bandı kullanarak PDMS damgalarının yüzeyindeki tozu çıkarın.
- Pulları sterilize etmek için% 70 etanol içine batırın. Ardından, bir hava tozlayıcı kullanarak pulların yüzeyinden etanol üfleyin.
- PDMS pullarının yüzeyine 5-10 μL 0,5 wt% 2-methacryloyloxyethyl fosforilkolin (MPC) polimer/ etanol uygulayın.
NOT: MPC polimerinin düzensiz dağılımı örüntünün bozulmasına neden olabilir. - MPC polimer tamamen kuruyana kadar 10-30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Pulları cam tabanlı bir kültür plakasının kapakçıklarıyla veya polimer kapaklı 35 mm'lik bir görüntüleme kabıyla temas halinde yerleştirin ve damgaya 10 dakika boyunca bir ağırlık (örneğin, bir AAA pil) koyun.
- Ağırlığı ve pulları çıkarın. Ardından, desenin mikroskop altında aktarıldığını onaylayın.
NOT: Damgalı tabaklar/yemekler oda sıcaklığında 1 haftaya kadar saklanabilir. - Damgalı kuyuları / bulaşıkları PBS ile iki kez yıkayın.
- LN511-E8'i PBS ile 2-4 μg/mL'de seyreltin ve yemeği LN511-E8 ile 0,5-1 μg/cm2'dekaplayın. İnsan PSC-CM'leri için LN511-E8'i PBS yerine %0,1 jelatin çözeltisi ile seyreltin. Daha sonra en az 1 saat kuluçkaya yatırın (en uygun şekilde 4 saatten fazla).
- Plaka hücreleri önceki bölümlerde açıklandığı gibi.
7. Floresan mikroskop altında sarkomların hızlandırılmış görüntülemesi
- Mikroskobu, ilişkili bilgisayarı ve ayrıca gerekli tüm çevre birimlerini açın ve bağlayın.
- Hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirmek için, en yüksek büyütmeyle (yağ emerionlu 100X objektif lens) zaman atlamalı görüntüler yakalayın.
- Canlı görüntüleme koşullarını seçin. İyi temsili veriler elde etmek için en yüksek kare hızına ayarlamaya çalışın (saniyede en az 20 ms veya 50 kare önerilir). Zaman atlamalı görüntüleme sırasında görüntüler arasında en kısa aralıkları elde etmek için deklanşörü açın ve gerekli bir binning (4 X 4) ve alım alanının bir mahsulünü uygulayın.
NOT: Ayar mikroskopların yapılandırmalarına bağlı olarak değişebilir. Kameranın yüksek hassasiyete sahip olması gerekir ve verileri bağlı bilgisayara yeterince hızlı aktarabilir. Bu amaçla, Kamera bağlantısı ile ORCA flaşı kullandık. Dönen bir konfokal mikroskopiyi test ettik ve saniyede 400 karede görüntüler elde ettik.- [İsteğe bağlı] Hücrelerin dayak oranı düşükse, elektrik alanı stimülasyonu ile hücreleri uyandırın.
- Zaman atlamalı kaydı çalıştırma
- Zaman atlamalı görüntüyü kaydederken görüntü alanlarının odakta kaldığından emin olun.
- Zaman atlamalı görüntüleri uygun bir klasöre kaydedin.
8. Bir ImageJ / Fiji eklentisi olan SarcOptiM kullanılarak zaman atlamalı görüntülemenin analizi
- ImageJ'e bir dizi hızlandırılmış görüntü yükleyin. Olympus VSI formatı için dosyaları OlympusViewer Eklentisi aracılığıyla açın.
- Sarkom desenini net bir şekilde gözlemlemek için görüntünün parlaklığını ve kontrastını ayarlayın (Görüntü | | ayarlama Parlaklık/Kontrast).
- Diğer araçlar menüsünü (>>) tıklatıp SarcOptiM 'i seçerek SarcOptiM'iaçın.
- Araç çubuğundaki Ctrl + Shift + P ve 1 μm düğmesine basarak ve iletişim kutularının talimatlarını izleyerek programı kalibre edin.
- Sarkom bölgesi boyunca sarkom kısaltmasını ölçmek için kullanılacak bir çizgi çizin.
- Araç çubuğunda SingleCell (AVI) tuşuna basarak sarkom kısaltma analizini başlatın. Temsili veriler Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Darbeli PSC-CMs muhabir hatları kullanılarak sarkom kısaltması ölçülüyor. Sarkom kısaltmayı ölçmek için sarkom etiketli PSC-CM'ler kullanıldı. Hatlar myom2-RFP ve ACTN2-mCherry'yi endojen lociden ifade eder. TagRFP Myom2'yeeklendi , M-hattına lokalize olan M-proteinleri kodlarken, mCherry ACTN2'ye,Z-line18,25'eyerelleştiren α-Actinin kodlamasına girildi. Şekil 1 ve 2 ve Film 1-3'tesunulduğu gibi sarkom kısaltmasını belirlemek için zaman atlamalı görüntüler elde edilmiş ve kullanılmıştır.
PSC-CM'lerin dağınık sarkomlarının üstesinden gelmek için, çizgi deseninde PSC-CM'leri kültüre etmek için belirli PDMS pulları kullanıldı. Bu desenli kültür, desen olmayan alanda kültürlenen hücrelere kıyasla uzun bir hücre şeklini ve daha düzenli bir sarkom desenini teşvik etti (Şekil 2B ve 2C). Bu avantajla, desenli kültür hücrelerin daha iyi daralmasını teşvik etti ve Filmler 2 ve 3 ve Şekil 2D'degösterildiği gibi pürüzsüz bir sarkom uzunluğu profili sağladı.
AAV vektörleri kullanılarak Z-line proteinin floresan etiketlemesi. Psc-CM'lerin Z-serisini, darbeli iPS hücreleri oluşturmadan görselleştirmek için, floresan etiketli Z-line proteinleri AAV transdüksiyonu kullanılarak ifade edildi. GFP ile teletonin (TCAP) ve Actin ilişkili LIM proteini (PDLIM3) olan küçük Z-line proteinlerden ikisi AAV6 kapsid kullanılarak etiketlenmiş ve paketlenmiştir (Şekil 3A). PSC-CM'ler farklılaştırıldıktan ve saflaştırıldıktan sonra, AAV'ler PSC-CM'lere transdüklendi (Şekil 3B). Transdüklenmiş PSC-CM'ler, PSC-CM'ler boyunca sarkodeik GFP sinyallerini transdüksiyondan üç gün sonra ifade etti (Şekil 3C ve 3D). Tipik olarak, AAV'nin 105 vg/ hücre moi'sinde transdüksiyonu floresan etiketli sarkom proteinlerini görselleştirmek için yeterlidir ve daha yüksek bir titre, genel GFP yoğunluğunu artırsa da, GFP'nin spesifik olmayan lokalizasyonuna sitoplazmaya neden olabilir.
AAV vektörleri kullanılarak PSC-CM'lerin saflaştırılması. Mevcut yöntemler, transgenik veya darbe hattı olan PSC-CM'lerin genomunda bulunan ilaç seçim kasetine dayanır. Ancak, hasta kaynaklı iPS hücrelerinden böyle bir çizgi üretmek emek yoğundur. AAV vektörlerinin, floresan etiketli Z-line proteinlerin ifadesini darbeye gerek kalmadan yönlendirdiğini gösterdiğinden, temizleme yöntemini de çalmadan kurmaya çalıştık (Şekil 4). Bu amaçla, cTNT promotörünün kontrolü altında blastisin dirençli geni kodlayan yeni bir AAV vektörü inşa edilmiştir (Şekil 4A). AAV (105 vg/hücre moi) 4. günde insan iPS hücrelerini farklılaştırmaya aktarılmıştır. Daha sonra hücreler 7 ila 9 gün arasında 2,5-10 μg/mL blastisidin (her hücre hattı için titrat gerekir) ile tedavi edildi (Şekil 4B). 14. günde, PSC-CM'lerin saflığı% 90'dan fazlaydı (Şekil 4C).
Şekil 1: Myom2-TagRFP hücre hattından türetilen PSC-CM faresinin sarkomer kısaltılması. A. Fare PSC-CM farklılaşması için zaman çizelgesi. B. Sarı çubuklarla belirtildiği gibi ölçüm bölgeleri ile farklı zaman noktalarında sarkom kısaltması için temsili görüntüler. Ölçek çubuğu = 10 μm. C. 1 Hz'de elektrikle uyarılan kardiyomiyositlerin kasılması sırasında sarkom uzunluğu profili. Kare hızı saniyede 50 kareydi. Piksel boyutu 0.26 μm idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Desensiz ve desenli kültürde ACTN2-mCherry hücre hattından türetilen insan PSC-CM'lerinin sarkom kısaltmasını gösteren temsili veriler. A. İnsan PSC-CM farklılaşması için zaman çizelgesi. B. ve desensiz kültürlerde kültürlenen C. Kardiyomiyositler düzensiz sarkomer desenleri (B) gösterirken, desenli kültürler sarkomerenin (C) iyi bir hizalamasını teşvik eder. Sarı çubuklarla sunulan bölgelerin ölçülmesi. D. 0,5 Hz'de elektriksel stimülasyon ve saniyede 100 kare kare ile indüklenen hücre kasılması sırasında elde edilen sarkom uzunluğu profilleri. Piksel boyutu = 0,26 μm, ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 3 gün boyunca AAV transdüksiyondan sonra fare PSC-CM'leri. A. Sarkom etiketleme için AAV şematik vektör haritası. Sarkom proteini (ilgi geni, GOI), Gly-Gly-Gly-Ser bağlayıcı (L) ile GFP'ye bağlanır ve kardiyak troponin T (cTNT) promotörünün kontrolü altında ifade edilir. B. Fare PSC-CM farklılaşması ve AAV transdüksiyonunun zaman çizelgesi. C. ve D. Myom2-TagRFP hücre hattından oluşturulan PSC-CM'lere 3 günlük transdüksiyondan sonra net sarkom lokalizasyonunu ve TCAP-GFP (C) ve PDLIM3-GFP'nin (D) ilgili sarkom uzunluğu profilini gösteren temsili görüntüler. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Blasticidin İnsan PSC-CD'lerinin darbesiz saflaştırılması.
A. CTNT promotörüne bir blasticidin direnci gen kasetinin (BSR) aşağı akışa yerleştirildiği AAV'nin şematik vektör haritası. B. İnsan PSC-CM'lerinin zaman çizelgesi farklılaşma, transdüksiyon ve blasticidin seçimi. C. İnsan PSC-CM'lerindeki cTNT + hücrelerin yüzdesini gösteren temsili veriler (4. günde10 5 vg / hücre AAV6 transdüklenmiş, daha sonra 7 ve 9 günlerinde 2.5 μg / mL blasticidin ile tedavi edildi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: Myom2-TagRFP hücre hattından oluşturulan fare PSC-CM'lerinin floresan hızlandırılmış videosu. RFP sinyalleri 28 gün boyunca PSC-CM kültüründen sonra sarkoere deseni gösterdi. Hücreler, 1 Hz'de elektrikle uyarıldığında senkron olarak dayak gösterdi. Zaman atlamalı görüntüler her 20 ms'de bir 100X lensle elde edildi. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 2: Actn2-mCherry ile insan PSC-CM'lerin floresan zaman atlamalı videosu desensiz bir kültür yemeği üzerinde kültürlendi. Desensiz bir kültür yemeği üzerinde ACTN2-mCherry'yi ifade eden PSC-CM'ler sadece sarkomların dağınıklığını göstermekle kalmadı, aynı zamanda sarkom kısaltmasını belirlemenin zor olduğu bir el sallama kasılması da sundu. Hücreler 0,5 Hz'de elektrikle uyarıldı ve görüntüler 100X lensle her 10 ms'de bir elde edildi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 3: Actn2-mCherry ile insan PSC-CM'lerin floresan zaman atlamalı videosu desenli bir kültür yemeği üzerinde kültürlendi. Desenli kültür sarkomu hizalamayı teşvik etti ve hücreleri bir çubuk şekline zorladı. Bu yöntem PSC-CM'lerdeki sarkom kısalmasının daha kolay belirlenmesini sağladı. Video, hücrelerin 0,5 Hz'de elektrikle uyarılmasıyla elde edildi. Kare hızı saniyede 100 kareydi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek CAD dosyaları. 200 μm genişliğinde şeritler ve 10 μm (Stamp_200x10.dxf), 25 μm (Stamp_200x25.dxf) ve 50 μm (Stamp_200x50.dxf) oluklara sahip pullar oluşturmak için CAD dosyaları. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PSC-CM'ler, kalp hastalıklarını modellemek ve ilaçların etkilerini test etmek için bir in vitro platform olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, PSC-CMs işlevlerini değerlendirmek için önce doğru, birleşik bir yöntem oluşturulmalıdır. Fonksiyonel testlerin çoğu PSC-CM'ler ile çalışır, örneğin elektrofizyoloji, kalsiyum geçici ve metabolizma26ve ilk hasta kaynaklı PSC-CM çalışmalarından biri long-QT sendromuhakkındaydı 27. Bununla birlikte, bir kardiyomiyositin en önemli işlevlerinden biri olan kontrititeyi değerlendirmek hala zordur. Yetişkin kardiyomiyositlerde sarkom kısaltma yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna karşılık, PSC-CM'lerin az gelişmiş ve dağınık sarkomu nedeniyle, sarkom kısaltma için standart yöntem bu hücrelerde çalışmaz. Bu nedenle, floresan etiketli sarkom proteinleri kullanarak PSC-CM'lerde sarkom kısaltmasını incelemek için alternatif bir yöntem sunduk. Bu yaklaşım için, floresan proteinlerle kaynaşmış M-line (MYOM2) veya Z-line (ACTN2, TCAP ve PDLIM3) için lokalize proteinler kullanılabilir. Floresan etiketli proteinlerin endojen loci veya AAV'lerden ifade edilebileceğini de gösterdik. AAV'ler, floresan etiketli proteinleri ifade etmek için endojen lociden daha fazla esneklik sağlar, çünkü AAV'ler her türlü hasta kaynaklı PSC-CM'ye uygulanabilir. Buna karşılık, endojen lociden proteinleri ifade etmek sarkom fonksiyonu üzerinde daha az etkiye sahip olabilir, çünkü genlerin ekspresyon seviyesi sıkı bir şekilde düzenlenir ve PSC-CM'lerin olgunlaşmasını izlemek için de kullanılabilir18.
Myom2-TagRFP, ACTN2-mCherry ve Lifeactsarkom 16 , 18,19kısaltan sarkomu incelemek için kullanılsa da, bu proteinlerin sarkom fonksiyonuna müdahale edip etme olmadığı hala belirsizdir. Son zamanlarda, Lifeact'in actin organizasyonuna ve hücresel morfolojiye rahatsız olduğu bildirildi28. Füzyon desenlerinin (yani, hedef proteinin N veya C-dönemindeki GFP füzyon bölgesi) sarkom fonksiyonu29'uda etkilediğini belirtmek önemlidir. Bu nedenle, yaygın olarak kullanılmadan önce, floresan etiketli sarkomere proteinlerinin sarkomere fonksiyonuna müdahale edip etmediğini ve sarcomeres in vitro, in vivove / veya yetişkin kardiyomiyositlerde protein-protein etkileşimlerinin oluşup oluşmadığını iyice değerlendirmek önemlidir. Floresan etiketli sarkom proteinlerinden oluşan bu repertuar, gelecekteki protein mühendisliği seçenekleri için iyi bir başlangıç noktası sağlar (yani sarkom proteinlerini sadece lokalizasyon sinyallerine kısaltır). Etiketlenecek proteinleri seçmek başarının bir başka anahtarıdır. GFP ile başka bir Z-line proteini etiketledik, ancak bu protein sarkome lokalize etmek yerine sadece sitoplazmik bir dağılım gösterdi. Canlı görüntüleme için, protein stabilitesi de rol oynayabilir, örneğin etiketli bir protein kararsızsa, sinyal seviyesi daha düşük olacaktır. İğnesiz protein sinyalleri görüntüleme sırasında kolayca söndürüleceğinden, floresan proteinin fototability'i de önemlidir.
PSC-CM'lerin sözleşmelerini açıklananlar dışındaki yöntemler kullanarak incelemek için PSC-CM'ler (örneğin, mikro direk dizileri, çekiş kuvveti mikroskopisi) veya hareket (örneğin, SI8000 kullanılarak yüksek çözünürlüklü hareket algılama)11, 12,13,14tarafından oluşturulan dolaylı kuvvet ölçümleri kullanılabilir. Yöntemimiz bu yöntemlerle veya boya bazlı etki potansiyeli/kalsiyum geçici ölçümleri ile kombine edilebilir. Kombinatoryal yaklaşım, bir hastalığın hasta kaynaklı PSC-CM'lerde nasıl işlev bozukluğuna neden olduğu hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir.
PSC-CM'lerde sarkom kısaltmasındaki zorluklardan biri, doğrusal olarak hareket eden iyi bir sarkom bulmaktır, aksi takdirde, hücreler SarcOptiM'in sarkom tespiti için kolayca hattan çıkabilir ve kararsız sarkom kısaltma sonuçlarına neden olabilir. Burada, PDMS damgaları ile oluşturulan desenli bir kültürün kullanılmasının daha kararlı ve doğrusal bir sarkom hareketi sağlayabileceğini gösteriyoruz. Desenli bir kültürün psc-cms16olgunlaşmasını desteklediği de bilinmektedir Sarkom fonksiyonu için önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
H.U. bu makaleyle ilgili bir patent başvurusunda bulundu.
Acknowledgments
Jichi Tıp Üniversitesi Rejeneratif Tıp Bölümü'ndeki tüm laboratuvar üyelerini yararlı tartışma ve teknik yardım için kabul etmek istiyoruz. Bu çalışma Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı'nın (AMED) hibeleri ile desteklenmiştir; JP18bm0704012 ve JP20bm0804018), Japonya Bilimi Destekleme Derneği (JSPS; JP19KK0219) ve Japon Dolaşım Topluluğu (Temel Araştırma Hibesi) H.U.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
- Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
- Cho, G. -S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
- Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
- Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
- Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
- Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
- Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
- Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
- Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
- Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. Yoshida, Y., et al. , (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
- Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).
