Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Bruke GAL4-UAS-systemet for funksjonell genetikk i Anopheles gambiae

Published: April 15, 2021 doi: 10.3791/62131
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Vector Biology, Liverpool School of Tropical Medicine, 2IMBB FORTH, 3Department of Biology, University of Crete

Summary

Det todelte GAL4-UAS-systemet er et allsidig verktøy for modifikasjon av genuttrykk på en kontrollert romlig måte som tillater funksjonell genetisk analyse i Anopheles gambiae. Prosedyrene beskrevet for bruk av dette systemet er en semi-standardisert kloning strategi, sexing og screening av pupper for fluorescerende protein markører og embryo fiksering.

Abstract

Det todelte GAL4-UAS-systemet er et allsidig og kraftig verktøy for funksjonell genetisk analyse. Essensen av systemet er å krysse transgene 'driver' linjer som uttrykker gjær transkripsjon faktor GAL4 på en vevsspesifikk måte, med transgene 'responder' linjer bærer en kandidat gen / RNA interferens konstruksjon hvis uttrykk er kontrollert av Upstream Activation Sequences (UAS) som binder GAL4. I det påfølgende avkom uttrykkes gen- eller silencingkonstruksjonen på en foreskrevet romlig måte, slik at de resulterende fenotypene kan analysees og genfunksjonen utledes. Det binære systemet muliggjør fleksibilitet i eksperimentelle tilnærminger til skjermfenotyper generert av transgene uttrykk i flere vevsspesifikke mønstre, selv om alvorlige treningskostnader blir indusert. Vi har tilpasset dette systemet for Anopheles gambiae, den viktigste malariavektoren i Afrika.

I denne artikkelen tilbyr vi noen av de vanlige prosedyrene som brukes under GAL4-UAS-analyse. Vi beskriver An. gambiae GAL4-UAS linjer allerede generert, samt kloning av nye responder konstruksjoner for upregulation og RNAi knockdown. Vi spesifiserer en trinnvis guide for sexing av myggpupper for å etablere genetiske kryss, som også inkluderer screening avkom for å følge arv av fluorescerende genmarkører som merker driveren og responderinnsettinger. Vi presenterer også en protokoll for rydding av An. gambiae embryoer for å studere embryonal utvikling. Til slutt introduserer vi potensielle tilpasninger av metoden for å generere driverlinjer gjennom CRISPR / Cas9-innsetting av GAL4 nedstrøms målgener.

Introduction

Det todelte GAL4-UAS-systemet er arbeidshesten for funksjonell karakterisering av gener i insektmodellorganismen Drosophila melanogaster1,2,3. For å bruke GAL4-UAS-systemet krysses transgene driverlinjer, som uttrykker gjærtranskripsjonsfaktoren GAL4 under kontroll av en regulatorisk sekvens, med responderlinjer som bærer et gen av interesse eller RNA-interferens (RNAi) konstruert av en oppstrøms aktiveringssekvens (UAS) anerkjent av GAL4. Avkommet til dette korset uttrykker transgene av interesse for et romlig mønster diktert av promotoren som kontrollerer GAL4-uttrykket (figur 1). Fenotyper som vises ved avkom av fører-responder kryss kan vurderes for å belyse funksjonen til kandidatgener. Selv om D. melanogaster har blitt brukt til å undersøke gener fra andre organismer4,5,6,7, har GAL4-UAS-systemet nå blitt tilpasset for bruk i insekter av medisinsk og landbruksmessig betydning for å gi direkte analyse i arten av interesse 8,9,10,11,12,13,14.

I den afrikanske malariamyggen, Anopheles gambiae, ble GAL4-UAS-systemet først testet av cellelinje co-transfection9. Flere konstruksjoner ble analysert for effektivitet i forskjellige parvise kombinasjoner og fant at 14 tandemly gjentatte UAS supplert med en liten kunstig intron (UAS-14i) viste det bredeste spekteret av aktiveringspotensial når de ble brukt med et panel av GAL4-drivere. For å demonstrere in vivo-funksjonalitet ble disse konstruksjonene deretter brukt til å lage to separate transgene An. gambiae linjer av PiggyBac transformasjon8: en driverlinje som bærer GAL4 drevet av en midgutspesifikk promotor, og en responderlinje som inneholder både luciferase og forbedrede gule fluorescerende protein (eYFP) gener under regulering av UAS-sekvenser. Tarmspesifikk luciferaseaktivitet og fluorescens i avkom indikerte at systemet var effektivt i Anopheles. Siden da har driverlinjer blitt opprettet som uttrykker transgenes i andre vev som er viktige for vektorkapasitet og insektmiddelresistens, inkludert oenocytter15 og hemocytter16, og i et nær allestedsnærværende mønster10. Tallrike UAS-linjer har også blitt generert til analysegener som antas å være involvert i metabolisme og fangstmediert insektmiddelresistens, kutikulær hydrokarbonsyntese og fluorescerende merke forskjellige celle- og vevstyper (tabell 1). For responderlinjene utføres nå stedsstyrt integrasjon av transgene av ΦC31 katalysert rekombinasjonskassettutveksling17,18 for å fikse den genomiske konteksten til de UAS-regulerte genene. På denne måten normaliseres transgene uttrykk når det gjelder genomisk innsettingsplassering, noe som gir en mer nøyaktig sammenligning av fenotypiske effekter av forskjellige kandidatgener.

Responderlinjene som er opprettet til dags dato, er utformet for enten å uttrykke transgene enten på forhøyede nivåer eller for å redusere genuttrykk gjennom RNA-interferens (RNAi). Vanligvis er cDNA-kloner smeltet sammen til UAS-sekvensen for å generere passende uttrykksplasmider, men fulle genomiske sekvenser er også mulig forutsatt at de ikke er for store for kloning. For å generere silencing konstruksjoner, har vi brukt tre forskjellige metoder for å oppnå passende tandem inverterte sekvenser som danner hårnål dsRNA som stimulerer RNAi. Disse har inkludert fusjon PCR, asymmetrisk PCR og kommersiell syntese av hårnål konstruksjoner. Felles for hver metode er inkludering av en intronsekvens mellom de inverterte sekvensene for å gi kloningsstabilitet. Responder plasmider der et gen av interesse / RNAi konstruksjon kan settes inn er utviklet15. Disse plasmidene har også de nødvendige ΦC31 attB-stedene for RMCE (beskrevet i Adolfi medfølgende JoVE-papir som beskriver RCME-teknikken i detalj). Protokoller som dekker de viktige trinnene som kreves når du velger sekvensen for innsetting i en av disse plasmidene for overtrykk, er inkludert i dette manuskriptet. I tillegg beskrives og illustreres to protokoller for RNAi hårnålkonstruksjonsoppretting.

Når du oppretter nye linjer, er identifisering av sjeldne transgene individer avgjørende å avle fra for å etablere og opprettholde transgene kolonier. Viktigst for GAL4-UAS-systemet er det en nødvendighet å skille mellom responder- og driverlinjene for å etablere kryss og identifisere individuelle avkom som bærer begge transgenes. Dette oppnås ved å bruke forskjellige dominerende valgbare markørgener knyttet til driver- og responderkassettene. Vanligvis er dette fluorescerende markørgener som er tydelig skille ved hjelp av optiske filtre (f.eks. eYFP, eCFP, dsRed). Det er viktig at markører uttrykkes i et kjent og pålitelig romlig mønster, da dette gjør identifisering av abnormiteter og forurensning enklere. Fluorescerende markørgenuttrykk reguleres rutinemessig av den syntetiske 3xP3-promotoren , noe som forårsaker øye- og ventral ganglia-spesifikt uttrykk i alle stadier av An. gambiae utvikling19. Fluorescerende markører kontrollert av 3xP3 er inkludert i alle transformasjonsplasmider beskrevet i denne artikkelen. En protokoll som beskriver de vanlige metodene som brukes til å screene fluorescerende An. gambiae pupae GAL4-UAS linjer er inkludert her.

Et av nøkkelelementene i GAL4-UAS-systemet er nødvendigheten av å krysse de differensialmerkede driver- og responderlinjene. For å gjøre dette må mann og kvinner fra hver linje skilles før parring. Voksne er lett å skille fra syne, men for å etablere genetiske kryss er det fornuftig å skille kjønnene før voksen fremvekst for å sikre at parring ikke har skjedd. Den generelle størrelsesforskjellen mellom mann og kvinne An. gambiae pupper er for variabel til å være en effektiv og pålitelig metode for kjønnsbestemmelse20. I stedet gir klare morfologiske forskjeller i de ytre kjønnsorganene et pålitelig grunnlag for sexing i An. gambiae. I denne artikkelen beskriver vi en pålitelig metode for sexing An. gambiae pupper for å sette opp passende kryss.

Figure 1
Figur 1 – Diagrammatisk fremstilling av prosessen for bruk av det todelte GAL4-UAS-systemet i Anopheles gambiae. (A) Hovedkomponentene i en eksempelvektor (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]) er avbildet, med detaljer om tilgjengelige begrensningssteder (EcoRI, NheI, XhoI og NcoI) innenfor de mange kloningsstedene som er egnet for bruk til å sette inn hårnålkonstruksjonen eller kodesekvensen for genet av interesse. Strukturen på forankringslinjen er også avbildet. (B) Kryssingstrinnet er illustrert som indikerer bruk av menn fra førerlinjen (bærer GAL4-driver av en arrangør av interesse og eCFP drevet av 3xP3-promotoren) og kvinner fra responderlinjen (bærer genet av interesse eller hårnålkonstruksjon kontrollert av en UAS-promotor og en eYFP-markør kontrollert av 3xP3-promotoren). (C) En diagrammatisk representasjon av GAL4 kjøreuttrykk av genet av interesse for korsets avkom i B og en liste over noen av de typiske fenotypene som vurderes. Forkortelser: Multiple Cloning Site (MCS), Recombinase mediert kassettutveksling (RMCE), Oppstrøms Activator Sequence (UAS), forbedret gult fluorescerende protein (eYFP), forbedret cyan fluorescerende protein (eCFP). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Det er bruken av kryss som gir den todelte naturen til GAL4-UAS-systemet, som har klare fordeler i forhold til mer lineære tilnærminger. For eksempel kan mange flere kombinasjoner av fører- og responderlinjer vurderes enn det som ville være mulig hvis en ny transgen linje måtte genereres og vedlikeholdes for hver promotor / genkombinasjon. Enda viktigere er at det tillater analyse av gener som produserer dødelige eller sterile fenotyper når deres uttrykk er forskrekket som er vanskelig å skape / vedlikeholde i et lineært system. Slike dødelige fenotyper kan manifestere seg i alle utviklingsstadier, avhengig av genfunksjonen og romlige uttrykk, men observeres oftest under embryonal utvikling. Visualisering av myggembryoutvikling krever rydding av den ugjennomsiktige korionen som dekker eggene. Følgende metoder beskrevet i Trpiš (1970)21 og Kaiser et al. (2014)22, beskriver vi protokollene vi bruker for å fikse embryoer, samtidig som vi opprettholder strukturell integritet, og bleking for å fjerne endokorionen som tillater mikroskopisk visualisering og avbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og bygging av UAS-konstruksjoner

  1. Design og montering av vektorer for kandidatgenuttrykk
    1. Bestem sekvensen som skal brukes til kandidatgenregulering.
      1. Sekvenser cDNA/gDNA fra interessestammen og sammenlign den med den publiserte sekvensen for å bekrefte identiteten og identifisere potensielle SNPer og begrensningssteder for diagnostisk sammendrag.
      2. Forsikre deg om at den fremre primeren som brukes til genforsterkning dekker den innfødte Kozak-sekvensen og start codon, der det er hensiktsmessig. En primer med ~ 10 bp binding oppstrøms start codon vil omfatte Kozak-sekvensen.
      3. Inkluder stoppkodonen i fragmentet forsterket fra den omvendte primeren under de fleste omstendigheter. Bruk 3' termineringssekvenser gitt i de beskrevne plasmidvektorene, eller forsterk fra kandidatens genomiske sekvenser.
      4. Bestill kommersielle sekvenser med spesifikk codon bias hvis ønskelig.
    2. Bruk standard undermerkingsprosedyrer for å sette inn genkassetter i UAS plasmidvektorer, for eksempel pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15 (figur 1) for både upregulering og RNAi-konstruksjoner.
    3. Produser transgene mygg laget ved hjelp av ΦC31 rekombinasjon mediert kassettutveksling10,17,18,23.
  2. Opprettelse av RNAi hårnål konstruksjoner: enkelt trinn forsterkning ved hjelp av asymmetrisk PCR15,24
    1. Ekstrakt genomisk DNA (gDNA) fra voksen kvinne An. gambiae bærer ønsket kandidat gen ved hjelp av Livak metode25.
      1. Design den fremre primeren for å binde seg til målekson ved 5 ' av ønsket fragment rettet mot nabointronen. Design 3' enden av en broprimer for å binde seg til slutten av den foregående eksonen for å forsterke intronet. 5' enden er komplementær til et lite fragment av måleksonen umiddelbart etter intronen.
    2. Kjør en asymmetrisk PCR-reaksjon som beskrevet i Xiao (2006)24 (figur 2).
    3. Klone det rensede PCR-produktet til en passende vektor som bærer UAS-promotoren (f.eks. pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15).
      MERK: Enzymer på det multippel kloningsstedet som passer for pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] kloning15 og de neste trinnene som kreves er angitt i figur 1. Enkelt enzym fordøyelse er viktig som bare ett begrensningssted er tilsatt. Defosforylering av plasmidet vil forbedre kloningseffektiviteten.
  3. Bygging av RNAi hårnål konstruksjoner: Fusion PCR av cDNA og gDNA15
    1. Ekstrakt genomisk DNA (gDNA) fra voksen kvinne An. gambiae bærer ønsket kandidat gen ved hjelp av Livak metode25.
      1. Inkluder gDNA i en PCR-reaksjon for å forsterke målområdet til ekson- og intronsekvensene sammen (figur 2).
      2. Design 3' enden av den fremre primeren for å binde seg til eksonsekvensen for omvendt mål for å forsterke mot målets intronsekvens og 5'-enden for å bære et begrensningssted for å lette kloning.
      3. Design reverse primer (1) for å binde seg til 5' enden av intronen og 5' end overheng bærer de første basene av den fremre sekvensen av naboeksonen. Dette overhenget brukes i fusjons-PCR.
      4. Rens ønsket reaksjonsprodukt.
    2. Trekk ut RNA, fjern DNA ved hjelp av DNases og forbered cDNA fra voksen kvinne An. gambiae bærer ønsket kandidatgen etter produsentens protokoller.
    3. Bruk cDNA i en PCR-reaksjon for å forsterke målområdet bare for exon (figur 2).
      1. Design fremoverprimer (2) slik at 3' enden binder seg ved 3' enden av den komplementære mål exon-sekvensen og 5' enden av primeren bærer et begrensningssted for bruk i kloning.
        MERK: Den fremre primeren fra 1.3.1.2 kan brukes igjen i denne andre reaksjonen. Dette vil imidlertid bety at et enkelt enzym fordøyelse er viktig. Å bruke en annen fremoverprimer med et annet begrensningssted vil tillate dobbelt sammendrag som kan øke kloningseffektiviteten.
      2. Design omvendt primer (2) - den 3' enden binder seg til 5' enden av naboeksonen som forsterker måleksonen. 5' enden binder seg til 3' enden av intronene fremover strand. Dette overhenget brukes i fusjons-PCR.
      3. Rens ønsket reaksjonsprodukt.
    4. Inkluder produktene i trinn 1.3.1 og 1.3.2 som maler for en fusion PCR-reaksjon ved hjelp av standardkonsentrasjoner med Forward primers 1 og 2. Rens ønsket produkt.
    5. Fordøye det rensede produktet for å generere overheng for kloning. Klone inn i en passende vektor nedstrøms UAS promotør. Passende enzymer for pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] kloning15 og de neste trinnene som kreves er angitt i figur 1.

Figure 2
Figur 2 - Diagrammatisk representasjon av opprettelsen av RNAi-konstruksjoner for innsetting i pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] ved hjelp av to metoder: (A) Enkelttrinn asymmetrisk PCR (tilpasset fra Xiao. Y H et al (2006) og (B) multippel trinn fusjon PCR. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

2. En. gambiae pupper screening

  1. Innsamling av pupper for mikroskopisk karakterisering
    MERK: Gjennom disse protokollene refererer vann til destillert vann supplert med 0,01% damsalt.
    1. Bakre An. gambiae mygg ved hjelp av standardprotokoller (f.eks. MR426) til puppetrinnet.
      FORSIKTIG: Pass på at du ikke skader pupper gjennom hele denne prosessen.
    2. Samle pupper på en klar flat tallerken som er egnet for bruk med et stereomikroskop (f.eks. en 100 x 15 mm plast petriskål, unngå kantene).
      MERK: For å samle pupper bruker vi en 3 ml plast Pasteur pipette med ca 10 mm kutt fra enden for å utvide enden og forhindre skade på myggene. Screening og sexing kan fullføres på enkeltpersoner, men dette er veldig tregt. Det anbefales å utføre screening og sexing på grupper på 50-200 pupper (størrelsen på gruppen er mulig begrenset av størrelsen på parabolen som brukes og er underlagt personlig preferanse). Hvis et stort antall blir screenet, kan effektiviteten økes ved først å justere pupper ca 4 til 5 dypt i linjer, og flytte målpuppene ut av denne linjen.
    3. Bruk en Pasteur pipette, fjern forsiktig nesten alt vannet fra rundt puppene. La akkurat nok vann rundt pupper slik at de er effektivt umotimile, men kan flyttes lett med en fin børste. Hvis de blir vanskelige å flytte, så tilsett mer vann.
      MERK: Når nok vann fjernes, vil puppene ligge på deres side, slik at visualisering av øyne for fluorescensdeteksjon og identifisering av dimorfiske kjønnsorganer (figur 4DE).
      FORSIKTIG: Pass på at puppene ikke avkalkes. Hvis bare et svært lite volum vann er igjen, kan det redusere ytterligere med varmen fra mikroskopets lampe og når det deles mellom bassenger av pupper. Ytterligere vann må noen ganger tilsettes under prosessen ved hjelp av en 3 ml Pasteur pipette til ønsket(e) gruppe(r).
  2. Identifisering av fluorescerende markører i pupper
    MERK: Bruk av et stereoskop med lav forstørrelse tillater screening av bredt felt, sortering kan gjøres på et invertert sammensatt mikroskop, men må gjøres individuelt.
    1. Ved screening for en fluorescerende markør er det først avgjørende å kjenne de forventede mønstrene for uttrykk og arv. Vurder følgende:
      1. Farge(r): bestemmer hvilke filtre som skal visualisere uttrykket.
      2. Romlig uttrykksmønster: Forstå hvor og i hvilket livsstadium du forventer å se uttrykk.
      3. Forholdet mellom forskjellige fenotyper: fastslå hvilken prosentandel av befolkningen som skal bære markører av interesse.
    2. Utfør fluorescerende screening i mørket, da selv lite lys kan forstyrre oppløsningen av fluorescens. Bruk imidlertid en lampe ved siden av stereoskopet når lys er nødvendig for andre manipulasjoner.
      FORSIKTIG: Sørg for at arbeidsområdet rundt det fluorescerende stereoskopet er klart før du slår av lysene.
    3. Slå på fluorescerende pære og la den være varm i produsentens anbefalte periode (normalt 10-15 min). Velg ønsket filter på det fluorescerende stereoskopet og kontroller at det er en farget lysstråle som er synlig som er rettet mot midten av sceneplaten. Hvis dette ikke er synlig eller er veldig svakt, kan det hende at fluorescerende pære ikke er fullstendig oppvarmet, lukkeren er lukket eller mikroskopoptikken ikke er godt justert.
    4. Bruk hvitt lys, sentrer puppene i synsfeltet og få dem i fokus. Denne forstørrelsen må kanskje endres når du bytter mellom forskjellige filtre, avhengig av fluorescensintensiteten.
    5. Bruk en fin detaljmalingsbørste for å sikre at den undersøkte puppene ikke overlapper.
    6. Slå av det hvite lyset på stereoskopet og bruk det fine fokuset for å få området av puppene som bærer fenotypen av interesse i fokus. Det fluorescerende mønsteret skal være synlig. Eksempler på 3xP3 promotorstyrt fluorescens finnes i figur 3.
      1. Bruk den laveste forstørrelsen der den forventede fluorescerende fenotypen på en pålitelig måte kan skilles fra personer uten fluorescene.
      2. For stammer med lys fluorescens, bruk et lysfeltlys med lav intensitet også under screening, hvis fluorescerende signalet fortsatt er tydelig identifiserbart.
      3. Når du er ferdig med primærscreeningen, skanner du raskt populasjoner under andre filtre for å oppdage potensiell forurensning.
        FORSIKTIG: Sørg for at det er en klar avstand mellom gruppene av sorterte pupper for å forhindre forurensning ved puppebevegelse. Vær oppmerksom på at størrelsen på gruppene vil endres etter hvert som pupper blir kjønnet, og at avstander kan virke større når du ser under forstørrelse. Vær spesielt forsiktig når bassengene ikke er innenfor synsfeltet.

Figure 3
Figur 3 - Anopheles gambiae pupae som uttrykker fluorescerende markører drevet av 3xP3 promotor (A) eYFP, (B) dsRed og (C) eCFP. Forstørrelse: A= 16X, B, C = 20X.

  1. Sexing Pupper
    1. Samle pupper. Fjern overflødig vann, men gi tilstrekkelig slik at anal padler deler seg litt fra kjønnsorganene for å hjelpe visualisering og morfologisk karakterisering (figur 4D, E).
    2. Hvis noen pupper / e ikke er på deres side, bruk en fin detaljmalingsbørste for å forsiktig snu puppen og flytte anal padler slik at ytre kjønnsorganer kan identifiseres.
    3. Separat pupper basert på særegne ytre kjønnsorganer; hannene har et langt rør som ekstruderer fra det endelige dorsalsegmentet omtrent halvparten av lengden på anal padlene (figur 4B). De ytre kjønnsorganene til kvinnelige pupper er betydelig kortere og bifurcate (figur 4A).
      MERK: Noen ganger, hvis det fjerde instar larval exoskeleton forblir festet eller de ytre kjønnsorganene er skadet (figur 4C), er sikker identifisering av kjønn vanskeligere. Når kjønn av en pupa ikke er klart, er det best praksis å kaste det bort. Hvis individet skal holdes, bør puppen få lov til å dukke opp isolert og kjønn bestemmes ved hjelp av voksne morfologiske egenskaper. Det er sannsynlig at hvis kjønnsorganene er skadet, kan individet ikke mate vellykket.
    4. Lag et basseng for hvert kjønn i motsatt ende av parabolen til det unsexed bassenget, flytte identifiserte pupper over parabolen ved hjelp av en fin detaljering pensel. Merk undersiden av retten der de to bassengene samles for å identifisere dem senere.
    5. Når både sexing og fluorescerende screening er nødvendig, utfør fluorescerende screening først, siden det er den raskere prosessen til de to.

Figure 4
Figur 4 - Sexing Anopheles gambiae pupae. Individuelle pupper som indikerer de ytre kjønnsorganene til (A) en kvinne (B) en mann og (C) en person som ikke lett kan identifiseres på grunn av ufullstendig løsrivelse av larval exoskeleton. Forstørrede bilder nedenfor fremhever de ytre kjønnsorganene. Pupae med ♀ (kvinne) og ♂ (mann) som indikerer de ytre kjønnsorganene i pupper med (D) ~ 50% av puppen nedsenket i vann og med (E) alt vann fjernet fremhever forskjellen i enkel visualisering av de ytre kjønnsorganene. Forstørrelse: A, B, C = 40x, D, E = 30x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

  1. Sexbekreftelse som voksne
    1. Inntil en svært lav feilfrekvens er demonstrert, bekreft pupper sexing av voksen morfologi etter fremveksten. Del sexed pupae i grupper på 10 eller mindre i et klart 20 ml rør med noen få ml vann, tett med en ball av bomullsull, merket med forventet kjønn og la det dukke opp over natten.
      MERK: Ettersom voksne overføres neste morgen, er det ikke nødvendig å forsyne nye voksne med mat.
    2. Bekreft kjønn av fremvoksende voksne ved hjelp av morfologiske egenskaper neste dag.
    3. Hvis noen menn er til stede i de kvinnelige samlingene, kast hunnene, i tilfelle parring allerede har skjedd.
    4. Hvis noen kvinner er til stede i mannlig samling, fjern kvinnen / s og hold hannene for kryssing.
  2. Oppsett av GAL4-UAS-systemet krysser
    1. Aspirer ønsket antall mannlige og kvinnelige voksne fra rørene i trinn 2.4 inn i et bur eller en liten bøtte satt opp på standard måte for An. gambiae oppdrett.
      MERK: Pass på at du ikke skader de voksne under denne overføringen.
    2. Bruk ca 50 kvinner med like mange menn, når ~ 2000 voksne er nødvendig fra avkommet.
      MERK: Når et kryss skal mates flere ganger for å generere flere partier opptil 200 av hvert kjønn, kan det settes opp i 30cm x 30cm x 30cm bur. Når bare et lite antall kvinner (<20) er tilgjengelige for korset, legger vi til ~ 4 ganger antall menn for å øke sannsynligheten for vellykket parring.
    3. Blod mate de kryssede hunnene og bakre avkom til passende stadium, etter standardprotokoller26, for å gjennomføre fenotypisk vurdering (f.eks. insektmiddelresistens, vektorkapasitet og fitness kostnadsanalyser).
    4. Der mors effekt av transgene uttrykk er sannsynlig, sett opp gjensidige kryss av driveren og responder linjer og analyse forventet fenotype.
      MERK: Krysser ved hjelp av 'heterozygote' eller blandede populasjoner av fører- og responderlinjer, produserer avkom med hver av 4 mulige genotyper. Dette gir wild type, UAS bare og GAL4 bare kontroller, samt transheterozygotes GAL4-UAS som å analysere fenotype. Hvis homozygote populasjoner krysses, setter du opp flere kryss for å gi passende kontroller for å sammenligne fenotyper. Avkom bør screenes som ovenfor separere avkom bære både eller bare enten markør, samt negativer, for fenotypisk vurdering.
  3. Etablering av homozygote populasjoner fra linjer generert gjennom RCME med alternative fluorescerende markører
    MERK: Det er viktig at fluorescerende markør for begge linjene er til stede på samme genomiske sted, og de er helt skille.
    1. Sett opp et foreldrekors på ca. 200 voksne med like mange differensialmerkede menn på den ene linjen og kvinner i den andre linjen etter screening for å velge personer som viser riktig fluorescens og sex, som beskrevet ovenfor. Rundt en uke senere blod mate korset ved hjelp av etablerte protokoller26.
      1. Bak F1-avkommet til puppene ved hjelp av standardprotokoller og samle pupper som beskrevet tidligere.
    2. Skjerm for fluorescens velge de som bærer begge foreldremarkører (transheterozygot). Sett opp en F1 intercross med disse puppene.
    3. En uke senere, blod mate F1 kvinner og bakre avkom til puppetrinnet etter standard protokoller.
    4. Screen F2-pupaen ved å velge de som bare viser en av markørene. Disse vil være homozygote for innsetting. Bare 25% av avkommet vil være homozygot for hver innsetting, så sørg for at nok avkom blir oppdrettet for å gi et lagerbur (400-500).
      MERK: Valget av transheterozygot avkom må være helt strengt, ellers blir prosessen forurenset, og fullstendig homozygositet kan ikke oppnås. Dobbeltsjekk alt avkom som er valgt for F1 intercross.

3. En. gambiae embryo clearing protokoll

  1. Blodfôring og vedlikehold
    1. Bakre An. gambiae mygg til voksne etter standardprotokoller (f.eks.
    2. Blodfôr 5-7 dager gamle kvinnelige voksne, noe som sikrer at de fleste er fullt oppslukt.
      FORSIKTIG: Gjennom hele denne protokollen er det viktig å jobbe raskt for å sikre at egg ikke får lov til å desiccate.
  2. Indusert egglegging
    1. 3 dager etter blodfôring samler egg gjennom indusert legging.
    2. Monter oviposisjonskammeret.
      1. Fyll oviposisjonskannen med vann til en dybde på ca. 5 mm. Fest potten til den ene enden av et 50 ml polypropylenrør, tidligere kuttet med en hacksag slik at begge ender er åpne. (Vi bruker en plastskive til en gryte (figur 5); men det originale lokket på røret kan brukes i stedet).
      2. Dekk den andre enden av det avskårne polypropylenrøret med materiale (slange/strømpebukser) eller deler av latekshansken festet med et elastisk bånd, slik at voksne kan innføres, men ikke kan unnslippe (figur 5). Andre alternative oviposisjonskammerdesign eksisterer og kan brukes26.
    3. Introduser forsiktig 10-15 kvinner (blod matet i trinn 3.1.2) til oviposisjonskammeret. Dekk oviposisjonskammeret for å produsere mørke og la det stå i 20 minutter.
      FORSIKTIG: Unngå å flytte ovidposisjonskannen når egg er lagt for å forhindre stranding og uttørking av egg.
    4. Løsne forsiktig 50 ml polypropylenrøret fra oviposisjonspotten, samtidig som du sikrer ikke å frigjøre myggene. Hvite egg skal være synlige. Kontroller at det er lagt tilstrekkelig for foreskrevet formål. Gjenta om nødvendig.
    5. Dekk potten (for støvbeskyttelse) og la egg modnes til utviklingsstadiet av interesse.
    6. Bruk en fin detaljmalingsbørste til å plukke opp egg fra gryten og legg dem på vann i en 40 mm2 utgravd glassblokk.

Figure 5
Figur 5 – Eksempel på et oviposisjonskammer (A) demontert for å markere komponentene og (B) som er montert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

  1. Embryofiksing
    FORSIKTIG: Utfør alle festetrinn (trinn 3.3) i en avtrekkshette på grunn av bruk av formaldehyd.
    1. Forbered FAA-løsning som beskrevet i Kaiser et al. (2014)22. FAA består av 3,6 M formaldehyd, 0,87 M eddiksyre og 8,5 M absolutt etanol som består av volum med destillert vann (dH2O).
      1. For 10 ml FAA kombinerer 2,68 ml 13,42 M formaldehyd, 4,96 ml 17,14 M etanol og 0,5 ml 17,4 M eddiksyre med 1,86 ml destillert H2O. Fixative kan oppbevares i minst 3 måneder i en tett forseglet glassbeholder, oppbevart i et bestemt kjemisk skap.
    2. Fjern forsiktig vannet fra glassblokken med en mikropipette og dekk egg i 500 μL FAA og oscillate forsiktig (~ 25 RPM) på en orbital shaker ved romtemperatur i 30 minutter. Ingen fargeendring er synlig på dette tidspunktet.
    3. Skyll eggene grundig med destillert vann. Utfør skylling 15 ganger for å fjerne alle spor av formaldehyd. Bruk en 1000 μL mikropipette, tilsett og fjern deretter 1 ml dH2O om gangen for ikke å skade eggene mens du gjør det.
    4. Oppbevar avløpsvann fra skylling i en utpekt formaldehydbeholder for avhending i henhold til sikkerhetsretningslinjer.
    5. På dette tidspunktet kan faste egg lagres ved 4 °C over natten i vann for å holde dem hydrert.
  2. Bleking av embryo
    FORSIKTIG: Utfør alle blekingstrinn (trinn 4) i en avtrekkshette på grunn av potensiell frigjøring av klorgass når natriumhypokloritt og eddiksyre kombineres.
    1. Forbered blekingsløsning (Trpiš-løsning - beskrevet i Trpiš (1970)21 og modifisert i henhold til Kaiser et al. (2014)22). Trpiš-oppløsning er 0,59 M natriumhypokloritt og 0,35 M eddiksyre oppløst i destillert H2O.
      1. For en 10 ml ovolum av Trpiš-oppløsning, kombiner 2,68 ml 2,2 M natriumhypokloritt og 0,2 ml 17,4 M eddiksyre med 7,12 ml destillert H2O.
        MERK:Trpiš-oppløsningen kan oppbevares i minst 3 måneder i en tett forseglet glassbeholder og oppbevares i et sikkert kjemisk skap. Løsningen må kanskje virveles etter lagring og bør alltid åpnes i en avtrekkshette ved frigjøring av klorgass.
    2. Dekk faste egg med 1 ml Trpiš-løsning og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Egg vil begynne å utvikle bleke flekker etter rundt 5 minutter med inkubasjon, og til slutt nå en melkehvit farge når den er ryddet.
    3. Skyll eggene som i trinn 3.3.3 for å fjerne Trpiš-oppløsningen.
    4. Oppbevar avløpsvann i en bestemt avfallsbeholder og kast det med overflødig vann ned i avløpet.
  3. Lagring
    1. Oppbevars i 500 μL dH2O og oppbevar mellom 2-8 °C i noen dager. Fjern det meste av vannet forsiktig før visning og avbildning på masse, men unngå uttørking av eggene ved å legge et lite volum vann i klokkeglasset. Dette vil ikke forstyrre fotografering av eggene. Individuelle egg kan plasseres på mikroskopsklie for høyere forstørrelsesavbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3xP3-uttrykk for eYFP, dsRed og eCFP gir pålitelig, lett gjenkjennelig identifikasjon av individer som har markørgenene som produserer uttrykk i øyne og ventral ganglia av An. gambiae pupper (figur 3). Differensialmorfologien som observeres i mannlige og kvinnelige ytre kjønnsorganer som brukes til sexing og et eksempel på en uidentifiserbar pupper, fremheves i figur 4. Fjerning av alt vann fra pupper øker sexing vanskeligheter som anal padler uklar visualisering av kjønnsorganer (Figur 4D, E). Det todelte GAL4-UAS-systemet tillater modifikasjon av genuttrykk på en kontrollert romlig-temporal måte som kan visualiseres ved å krysse allestedsnærværende (figur 6A,C) og oenocyttdriver (figur 6B,D) linjer med responderlinjen UAS-mCD8:mCherry10. De morfologiske egenskapene som observeres i ulike stadier av embryonal utvikling ved 12, 24 og 36 h innleggslegging, er klare etter ferdigstillelse av protokoll nummer 3 (figur 7).

Figure 6
Figur 6 - Vevsspesifikk uttrykksvisualisering. (A, B) Larver og (C, D) voksne som uttrykker mCherry drevet av (A, C) allestedsnærværende og (B, D) oenocyte spesifikke driverlinjer. Forstørrelse: A,B=32X, C=25X, D=40X. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Figure 7
Figur 7 – Eksempelresultater for embryorydding. Bilder av embryoer etter den beskrevne protokollen (A) 12, (B) 24 og (C) 36 timer etter oviposisjon og (D) et mislykket forsøk på å bruke husholdningsblekemiddel der overbleking forårsaket misfarging og sprengning av embryoer. Forstørrelse: 50x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Type Linje Innhold 3xP3-indikator Beskrivelse Kilde
Responder mCherry UAS-mCD8:mCherry eCFP, eYFP Uttrykker mCherry-kodesekvensen når den krysses med en driverlinje Adolfi. A et al (2018)
16i UAS-RNAi cyp4g16 eYFP Inneholder en RNAi hårnål konstruksjon som er rettet mot cyp4g16 som uttrykkes og forårsaker knockdown av cyp4g16 når krysset med en driver linje Lynd. A et al (2020)
17i UAS-RNAi cyp4g17 eYFP Inneholder en RNAi hårnål konstruksjon som er rettet mot cyp4g17 som uttrykkes og forårsaker knockdown av cyp4g17 når krysset med en driver linje Lynd. A et al (2020)
M2 UAS-cyp6m2 eYFP Uttrykker cyp6m2 når krysset med en driverlinje Adolfi. A et al (2019)
P3 UAS-cyp6p3 eYFP Uttrykker cyp6p3 når krysset med en driverlinje Adolfi. A et al (2019)
e2 UAS-GSTe2 eYFP Uttrykker GSTe2 når den krysses med en driverlinje Adolfi. A et al (2019)
SAP2 UAS-Sap2 eYFP Uttrykker Sap2 når krysset med en driverlinje Ingham. V et al (2019)
FAS1899i UAS-RNAi FAS1899 eYFP Inneholder en RNAi hårnål konstruksjon som er rettet mot FAS1899 som uttrykkes og forårsaker knockdown av FAS1899 når krysset med en driver linje Grigoraki. L et al (2020)
3050i UAS-RNAi Desat3050 eYFP Inneholder en RNAi hårnål konstruksjon som er rettet mot Desat3050 som uttrykkes og forårsaker knockdown av Desat3050 når krysset med en driver linje Grigoraki. L et al (2020)
Wnd UAS-eYFPnls-luc eCFP Når krysset med en GAL4 linje eYFP uttrykkes. Generert ved hjelp av piggybac (MR4-kode: MRA-1165) Lynd. A et al (2011)
Mbl UAS-eYFPnls-luc eCFP Når krysset med en GAL4 linje eYFP uttrykkes. Generert ved hjelp av piggybac (MR4-kode: MRA-1164) Lynd. A et al (2011)
Dokking A11 VG-LRIM1 eCFP Bære de nødvendige attP-dokkingstedene som kreves for ΦC31 mediert kassettutveksling Lynd.A et al (2019)
Driver + forankring A10 Ubi-A10 GAL4 eCFP Inneholder transkripsjonsfaktoren GAL4-kodesekvensen som styres av an. gambiae Polyubiquitin-c (PUBc)- genet. Har også attP-dokkingstedene som kreves for ΦC31 mediert kassettutveksling Adolfi. A et al (2018)
Sjåfør Gareth Oenocyte enhancer-GAL4 dsRed Uttrykker GAL4 kontrollert av en oenocyte spesifikk forsterker Lynd. A et al (2012)
hml- GAL4 hml-GAL4-hml- GAL80 eYFP-nls Uttrykker GAL4 og GAL80 drevet av en hemocyttspesifikk promotor Pondeville. E et al (2020)
F carboxypeptidase promotor - GFY-GAL4 dsRed Uttrykker GAL4 i midgut og når krysset med en UAS-linje vil uttrykke YFP. Generert ved hjelp av piggybac (MR4-kode: MRA-1167) Lynd. A et al (2011)
Dgl carboxypeptidase promotor - GFY-GAL4 dsRed Uttrykker GAL4 i midgut og når krysset med en UAS-linje vil uttrykke YFP. Generert ved hjelp av piggybac (MR4-kode: MRA-1166) Lynd. A et al (2011)

Tabell 1 - Tabell med publiserte linjer, korte beskrivelser og referansen som opprettelsesmetoden beskrives i. Katalognumrene for linjer som for øyeblikket er lagret i MR4-repositoriet, er angitt i beskrivelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forståelse av mygggenfunksjon er viktig for å utvikle nye tilnærminger for å kontrollere Anopheles og påvirke malariaoverføring. GAL4-UAS-systemet som er beskrevet er et allsidig og kraftig system for funksjonell analyse av kandidatgener, og til dags dato har vi brukt systemet til å undersøke det genetiske grunnlaget for insektmiddelresistens17 og cuticular hydrokarbonproduksjon15,23, samt å fluorescerende merke forskjellige myggcellepopulasjoner8 . Så langt har responderkonstruksjoner blitt generert gjennom begrensning av enzym kloning i en plasmid, som bærer et multippel kloningssted nedstrøms UAS (figur 1, tabell 1). På grunn av konstruksjonenes modulære karakter som bærer flere elementer (attB-steder, 3xP3-YFP og sigøynerisolatorsekvenser), er det imidlertid mulig med mer moderne teknikker for å konstruere nye responderplasmider. Vanligvis kan sekvenser for overekspressering forsterkes fra cDNA eller gDNA ved hjelp av PCR, men kommersiell syntese kan noen ganger redusere arbeidet og tiden som er involvert i å generere nye konstruksjoner. Det er viktig å sekvensere målgenene når de er forsterket fra respektive maler for å validere identitet og identifisere potensielle SNPer. Dette er spesielt relevant når kommersielt syntetiserer DNA, da det ikke anbefales å stole utelukkende på databasemerknader.

Generering av sekvenser for RNAi-konstruksjoner er ofte mer komplisert på grunn av kravet om å klone en iboende ustabil invertert gjentakelse av målsekvensen for dsRNA-dannelse av hårnålproduktet. Denne kloningen oppnås ofte ved å inkludere en intronsekvens mellom repetisjonene for å muliggjøre stabil replikasjon i Escherichia coli, og effektiv skjøting i mygg27. Forsterkning av hårnålkonstruksjoner ved hjelp av asymmetrisk PCR er effektiv på grunn av enkelttrinnsnaturen. I tidlige sykluser av asymmetrisk PCR forsterkes tråden av den fremre primeren fortrinnsvis forsterket, da denne primeren leveres til reaksjonen i overkant (2x konsentrasjon av broprimer). Dette produktet akkumuleres som enkeltstrenger. 3' enden av disse trådene er komplementær til begynnelsen av målet exon. I midtfasesykluser dannes en løkke som de komplementære 3' end annealene til starten av måleksonen. Når dette skjer, forsterkes den komplementære sekvensen av måleksonen fra 3'-enden og genererer et produkt [invertert-exon: intron: exon]. I sene sykluser forsterkes dette sluttproduktet av den fremre primeren og kan lett isoleres og klones. En lignende omvendt repetisjonskonstruksjon kan produseres ved fusjon PCR28 som angitt i figur 2. For begge metodene må imidlertid et egnet målsted som oppfyller de nødvendige egenskapene for RNAi24 være rett ved siden av et inntron av passende størrelse for kloning. Når et passende mål ikke er tilgjengelig, kan en modifisert fusjon PCR eller kommersiell syntese brukes der de inverterte sekvensene er smeltet sammen med en intronsekvens som tre separate fragmenter i henholdsvis en PCR-reaksjon eller i silico. Vi har med hell brukt det fjerde intronet av Drosophila hvite genet som en spaltet spacer sekvens23. I dette tilfellet krevde selskapet en avstandsstykke (intron) på minst lik lengde til målets repetisjonssekvenser for å tillate effektiv syntese. Etter hvert som kostnaden for kommersiell syntese øker med størrelsen og kompleksiteten til fragmentet, syntetiseres vanligvis bare hårnålen eller genfragmentet og klones deretter inn i ønsket vektor i motsetning til syntese av hele plasmidet. Ved bruk av kommersiell syntese for å generere konstruksjoner for transgenese, er det viktig å huske på at den forventede sekvensmerknaden kan ha forskjeller, for eksempel SNPer, sammenlignet med sekvenser som er tilstede i laboratoriestammer. I tillegg er det viktig å vurdere virkningen av Kozak-sekvenser og sikre at de er inkludert i den endelige konstruksjonen der det er nødvendig29.

Som beskrevet ovenfor utvider separasjon av GAL4- og UAS-komponentene potensialet for hver linje som tillater evaluering i kombinasjoner og analyse av dødelige eller skadelige fenotyper. For eksempel ble det observert svært forskjellige resistensfenotyper når de uttrykte metabolske enzymer allestedsnærværende, i stedet for i tarmen eller oenocytter, som tidligere ble antatt å være noen av hovedvevene som gir insektmiddelresistens17. Videre har vevsspesifikk uttrykk/nedslag av gener involvert i kutikulær hydrokarbonproduksjon fremhevet oenocyttenes rolle i larvutvikling og voksen eclosjon15,23. Fremover kan genereringen av driverlinjer med alternativt romlig-temporalt vevsspesifikk GAL4-uttrykk godt forenkles av CRISPR-Cas-teknologi. Tidligere førerlinjer ble generert med begrenset kunnskap om promotorsekvenser for å regulere uttrykk og ble ofte "truffet og savnet" i sin aktivitet, noe som ofte forsterkes av posisjonseffekter. Dette kan overvinnes ved målrettet innsetting av GAL4 med et selvklebende peptid (for eksempel T2A)30 nedstrøms for et målgen som skal produsere uttrykk for GAL4 på den romlige måten av det målrettede genet31. Denne strategien har blitt effektivt brukt i D. melanogaster32, inkludert genereringen av et bibliotek med aksjer som uttrykker GAL4 under kontroll av forskjellige endogene promotører33. Selv om det ikke er testet mye i mygg ennå, og det er anekdotiske spørsmål rundt effektiviteten av samuttrykk, er allsidigheten og tilpasningsevnen til denne målrettede tilnærmingen spennende.

Selv når du bruker slike metoder for driverproduksjon, er sexing og screening av pupper på en effektiv og pålitelig måte grunnleggende for bruken av GAL4-UAS-systemet i mygg. Protokollene som er beskrevet her er robuste metoder for småskalaanalyse. Når høyere myggtall kreves, blir det svært tidkrevende å manuelt screene for genotype. Dette kan overvinnes ved å krysse homozygote driver- og responderlinjer slik at alt avkom vil være transheterozygot, og krever derfor ikke streng screening og separasjon. Det er ofte mulig å skille homozygote mygg basert på intensiteten av markørfluorescens og dermed å intercross disse for å produsere stabile homozygote linjer. Effekten av denne metoden er imidlertid noe avhengig av brukerens kjennskap til uttrykksmønstre. Noen linjer har heller ikke konsekvente, entydige forskjeller i uttrykk når det gjelder kopinummer for indikatorer. En enklere måte å generere homozygote linjer på er beskrevet i protokoll 2.6, og gjelder når to linjer er generert med forskjellige fluorescerende markører i samme genomiske locus (f.eks. gjennomΦC31-stedet  rettet transformasjon til samme forankringslinje). Enten eller begge linjene kan gjøres pålitelig homozygote gjennom enkel kryssing og screening. Metoden er avhengig av å kunne skille mellom de forskjellige fluorescerende markørene, og av de mest brukte markørene, kan eCFP, eYFP og dsRED diskrimineres entydig ved hjelp av passende filtersett. Dessverre overlapper utslippsspektraet til eGFP betydelig med eCFP og eYFP og kan generelt ikke brukes sammen med disse markørene, selv om dsRED og eGFP gjør en passende sammenkobling.

Høyere gjennomstrømning av analyse kan også oppnås ved automatisk sortering av fluorescerende merkede larver. Dette har blitt beskrevet med Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS) machine34, som opererer på samme måte som en fluorescensaktivert cellesortering for å gate individuelle mygg basert på deres markøruttrykk. Metoden har også blitt brukt til å isolere differensialmerkede menn og kvinner34. På grunn av størrelse har større stadier som pupper ennå ikke blitt vist ved hjelp av COPAS-systemet. Automatisert kjønnssortering for voksne ved hjelp av video- og maskinlæringsalgoritmer er også utviklet for store feltutgivelser35, men dette er ennå ikke kostnadseffektivt for skalaen som GAL4-UAS-systemtransgenics vanligvis brukes på. Differensialt taggede kjønn er ennå ikke tilgjengelige for GAL4-UAS mygg, og så manuell sexing som pupper er fortsatt nødvendig for å utføre spesifikke kryss. Metoden beskrevet her for sexing pupper basert på morfologiske forskjeller i ytre kjønnsorganer er robust. Det er imidlertid gjenstand for operatørfeil, og for traineer er det god praksis å bekrefte nøyaktigheten av sexing ved å observere om riktig voksensex er isolert. Når du er trygg på 100% nøyaktighet, kan puppene plasseres direkte i parringsburet for å spare tid.

Vi beskriver også en tilpasset metode for analyse av embryoutvikling gjennom fiksering og avklaring av egg etter presist tidsinnhenting. Våre tidligere forsøk på å fjerne embryoer ved hjelp av husholdningsblekemiddel som beskrevet i Goltsev, Rezende, et al.36, Rezende, Martins, et al.37, Vargas, Farnesi, et al.38 og Chang, Liu, et al.39, forårsaket brenning av embryoene som angitt i figur 7D. Klorkonsentrasjonen i husholdningsblekemiddel kan variere betydelig, så vi valgte å bruke kjemikalier av høy kvalitet. Vi har brukt denne metoden for å observere omfanget av embryoutvikling etter genetisk modifikasjon av hormonell aktivering. Gjennom observasjon av det utviklende embryoet ble det klart at fraværet av larval klekking skyldtes utviklingsendringer i stedet for fruktbarhetsproblemer hos de voksne. Lignende teknikker har blitt brukt til immuno-histokjemi og RNA hybridisering som beskrevet av Clemons, Flannery, et al.40 og Juhn og James 41 henholdsvis. Som vi har vist, har GAL4-UAS-systemet i An. gambiae vist seg uvurderlig for å undersøke bestemte aspekter ved myggbiologi og utvikling, og de grunnleggende protokollene beskrevet for transgene design, fluorescerende screening, manuell pupae sexing og embryorydding er nødvendig for effektiv utnyttelse av dette viktige systemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi anerkjenner takknemlig finansiering fra LSTM og IVCC (Adriana Adolfi), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (PhD studentship til BCP:MR/P016197/1), Wellcome (Sir Henry Wellcome Postdoctoral fellowship til LG: 215894/Z/19/Z) som har innlemmet Gal4UAS-analyse i forslagene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 x 15 mm plastic Petri dish SLS 2175546 Pack of 10
1000 µL Gilson Pipette Gilson F144059P
20/25 mL Universal Tubes Starlab E1412-3020 Pack of 400
3 mL Pasteur Pipettes SLS G612398 Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped
50 mL Falcon Tubes Fisher Scientific 11512303
Absolute Ethanol Fisher Scientific BP2818-500 500 mL
Acetic Acid SLS 45726-1L-F 1 L
Cages SLS E6099 30x30x30 with screen port
Fine Paint Brushes Amazon UKDPB66 KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)
Fish food Amazon Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L 
Formaldehyde Solution Sigma Aldrich F8775
Mouth Aspirator John Hock 612
Pond Salt Amazon Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L 
Pupae Pots Cater4you SP8OZ 250 pots with lids
Small Plastic Buckets Amazon 2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10) 
Sodium Hypochlorite Fisher Scientific S25552

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, A. H., Perimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Duffy, J. B. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Journal of Genetics and Development. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  3. Dow, J. A. ELS. , John WIley & Sons, Ltd. (2012).
  4. Edi, C. V., et al. CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Genetics. 10 (3), 1004236 (2014).
  5. Daborn, P. J., et al. Using Drosophila melanogaster to validate metabolism-based insecticide resistance from insect pests. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (12), 918-924 (2012).
  6. Riveron, J. M., et al. Genome-wide transcription and functional analyses reveal heterogeneous molecular mechanisms driving pyrethroids resistance in the major malaria vector Anopheles funestus across Africa. Genes Genomes Genetics. 7 (6), 1819-1832 (2017).
  7. Riveron, J. M., et al. A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector. Genome Biology. 15 (2), (2014).
  8. Lynd, A., Lycett, G. J. Development of the Bi-Partite Gal4-UAS System in the African Malaria Mosquito, Anopheles gambiae. PLoS ONE. 7 (2), 31552 (2012).
  9. Lynd, A., Lycett, G. J. Optimization of the Gal4-UAS system in an Anopheles gambiae cell line. Insect Molecular Biology. 20 (5), 599-608 (2011).
  10. Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).
  11. Kokoza, V. A., Raikhel, A. A. Targeted gene expression in the transgenic Aedes aegypti using the binary Gal4-UAS system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 41, 637-644 (2011).
  12. O'Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. Gal4-based Enhancer-Trapping in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi. Genes Genomes Genetics. 2, 21305-21315 (2012).
  13. Zhao, B., et al. Regulation of the Gut-Specific Carboxypeptidase: A Study Using the Binary Gal4/UAS System in the Mosquito Aedes Aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 54, 1-10 (2014).
  14. Imamura, M., et al. Targeted Gene Expression Using the GAL4/UAS System in the Silkworm Bombyx mori. Genetics. 165 (3), 1329-1340 (2003).
  15. Lynd, A., et al. Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: application to cuticular hydrocarbon synthesis. bioRxiv. , (2019).
  16. Pondeville, E., et al. Hemocyte-targeted gene expression in the female malaria mosquito using the hemolectin promoter from Drosophila. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103339 (2020).
  17. Adolfi, A., et al. Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).
  18. Pondeville, E., et al. Efficient integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae. Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).
  19. Horn, C., Schmid, B. G. M., Pogoda, F. S., Wimmer, E. A. Fluorescent transformation markers for insect transgenesis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 32, 1221-1235 (2002).
  20. Clements, A. A. Biology of Mosquitoes, Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. 1, CABI Publishing. (1992).
  21. Trpiš, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Canadian Journal of Zoology. 48, 892-893 (1970).
  22. Kaiser, M. L., Duncan, F. D., Brooke, B. D. Embryonic Development and Rates of Metabolic Activity in Early and Late Hatching Eggs of the Major Malaria Vector Anopheles gambiae. PLoS ONE. 9 (12), 114381 (2014).
  23. Grigoraki, L., Grau-Bové, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. Isolation and transcriptomic analysis of Anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis. eLife. 9, 58019 (2020).
  24. Xiao, Y. -H., Yin, M. -H., Hou, L., Pei, Y. Direct amplification of intron-containing hairpin RNA construct from genomic DNA. BioTechniques. 41 (5), 548-552 (2006).
  25. Livak, K. J. Organization and Mapping of a Sequence on the Drosophila melanogaster X and Y Chromosomes That Is Transcribed during Spermatogenesis. Genetics. 107 (4), 611-634 (1984).
  26. MR4, CDC, NEI & beiResources. The MR4 Methods in Anopheles Research Laboratory Manual. 5th Edition. , (2015).
  27. Sik Lee, Y., Carthew, R. W. Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers. Methods. 30 (4), 322-329 (2003).
  28. Cha-aim, K., Hoshida, H., Fukunaga, T., Akada, R. Gene Synthesis: Methods and Protocols. Peccoud, J. , Humana Press. 97-110 (2012).
  29. Cavener, D. R. Comparison of the consensus sequence flanking translational start sites in Drosophila and vertebrates. Nucleic Acids Research. 15 (4), 1353-1361 (1987).
  30. Wang, Y., Wang, F., Wang, R., Zhao, P., Xia, Q. 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. Scientific Reports. 5, (2015).
  31. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5, 3977 (2014).
  32. Kondo, S., et al. Neurochemical organisation of the Drosophila Brain Visualised by Endogenously Tagged Neurotransmitter Receptors. Cell Reports. 30 (1), 284-297 (2020).
  33. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, 35574 (2018).
  34. Marois, E., et al. High-throughput sorting of mosquito larvae for laboratory studies and for future vector control interventions. Malaria Journal. 11, 302 (2012).
  35. Crawford, J. E., et al. Efficient production of male Wolbachia-infected Aedes aegypti mosquitoes enables large-scale suppression of wild populations. Nature Biotechnology. 38 (4), 482-492 (2020).
  36. Goltsev, Y., et al. Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo. Developmental Biology. 330 (2), 462-470 (2009).
  37. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized Serosal Cuticle. BMC Developmental Biology. 8 (1), 82 (2008).
  38. Vargas, H. C. M., Farnesi, L. C., Martins, A. J., Valle, D., Rezende, G. L. Serosal cuticle formation and distinct degrees of desiccation resistance in embryos of the mosquito vectors Aedes aegypti, Anopheles aquasalis and Culex quinquefasciatus. Journal of Insect Physiology. 62, 54-60 (2014).
  39. Chang, C. -H., et al. The non-canonical Notch signaling is essential for the control of fertility in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 12 (3), 0006307 (2018).
  40. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical Analysis of Protein Expression during Aedes aegypti Development. Spring Harbor Protocols. 10, 1-4 (2010).
  41. Juhn, J., James, A. A. Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries and Embryos of Vector Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. , e3709 (2012).

Tags

Genetikk Utgave 170 3xP3 Lokalisering Endogene uttrykk RNAi Knockdown Mikroskopi bipartikkel Insektmiddelresistens vektorkapasitet.
Bruke GAL4-UAS-systemet for funksjonell genetikk i <em>Anopheles gambiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poulton, B. C., Colman, F.,… More

Poulton, B. C., Colman, F., Anthousi, A., Grigoraki, L., Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J. Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (170), e62131, doi:10.3791/62131 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter