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Genetics

Usando o sistema GAL4-UAS para genética funcional em Anopheles gambiae

Published: April 15, 2021 doi: 10.3791/62131
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Vector Biology, Liverpool School of Tropical Medicine, 2IMBB FORTH, 3Department of Biology, University of Crete

Summary

O sistema bipartite GAL4-UAS é uma ferramenta versátil para modificação da expressão genética de forma espástica controlada que permite a análise genética funcional em Anopheles gambiae. Os procedimentos descritos para o uso deste sistema são uma estratégia de clonagem semi-padronizada, sexagem e triagem de pupas para marcadores de proteína fluorescente e fixação de embriões.

Abstract

O sistema bipartite GAL4-UAS é uma ferramenta versátil e poderosa para análise genética funcional. A essência do sistema é cruzar linhas transgênicas de "driver" que expressam o fator de transcrição de leveduras GAL4 de forma específica do tecido, com linhas transgênicas de "responder" carregando uma construção de interferência genética/RNA candidata cuja expressão é controlada por Sequências de Ativação Upstream (UAS) que ligam GAL4. Na prole resultante, o gene ou a construção silenciante é, portanto, expressa de forma espesso prescrita, permitindo que os fenótipos resultantes sejam avaliados e a função genética inferida. O sistema binário permite flexibilidade em abordagens experimentais para tela fenótipos gerados pela expressão transgênica em múltiplos padrões específicos do tecido, mesmo que os custos severos de aptidão sejam induzidos. Adaptamos este sistema para Anopheles gambiae, o principal vetor de malária na África.

Neste artigo, fornecemos alguns dos procedimentos comuns utilizados durante a análise GAL4-UAS. Descrevemos as linhas An. gambiae GAL4-UAS já geradas, bem como a clonagem de novas construções de respondente para a regulação e o knockdown rnai. Especificamos um guia passo a passo para o sexing de pupas de mosquito para estabelecer cruzes genéticas, que também inclui a prole de triagem para seguir a herança de marcadores genéticos fluorescentes que marcam as inserções do motorista e do respondente. Também apresentamos um protocolo para limpar embriões de An. gambiae para estudar o desenvolvimento embrionário. Finalmente, introduzimos possíveis adaptações do método para gerar linhas de driver através da inserção CRISPR/Cas9 de genes alvo.

Introduction

O sistema bipartite GAL4-UAS é o cavalo de trabalho da caracterização funcional de genes no organismo modelo de insetos Drosophila melanogaster1,2,3. Para usar o sistema GAL4-UAS, as linhas de driver transgênicas, expressando o fator de transcrição da levedura GAL4 sob controle de uma sequência regulatória, são cruzadas com linhas de resposta carregando um gene de interesse ou interferência de RNA (RNAi) construída controlada por uma Sequência de Ativação Upstream (UAS) reconhecida pela GAL4. A descendência dessa cruz expressa o transgene de interesse em um padrão espítetempo ditado pelo promotor que controla a expressão GAL4 (Figura 1). Fenótipos exibidos por descendentes de cruzes de respondente condutor podem ser avaliados para elucidar a função dos genes candidatos. Embora d. melanogaster tenha sido usado para examinar genes de outros organismos4,5,6,7, o sistema GAL4-UAS foi agora adaptado para uso em insetos de importância médica e agrícola para fornecer análise direta nas espécies de interesse 8,9,10,11,12,13,14.

No mosquito africano da malária, Anopheles gambiae, o sistema GAL4-UAS foi testado pela primeira vez pela co-transfecção da linha celular9. Construções múltiplas foram avaliadas para eficiência em diferentes combinações de pairwise e descobriram que 14 UAS repetidas com um pequeno intron artificial (UAS-14i) exibiam a maior gama de potencial de ativação quando usado com um painel de drivers GAL4. Para demonstrar a funcionalidade in vivo, essas construções foram então usadas para criar duas linhas transgênicas de An. gambiae separadas pela Transformação PiggyBac8: uma linha de driver que transporta GAL4 conduzida por um promotor específico midgut, e uma linha de resposta contendo tanto a luciferase quanto os genes de proteína fluorescente amarela aprimorada (eYFP) sob regulação das sequências UAS. A atividade de luciferase específica intestinal e a fluorescência na prole indicaram que o sistema era eficiente em Anopheles. Desde então, foram criadas linhas de condutores expressando transgenes em outros tecidos importantes para a capacidade vetorial e resistência a inseticidas, incluindo oenocitos15 e hemócitos16, e em um padrão próximo ao onipresente10. Numerosas linhas de UAS também foram geradas para avaliar genes considerados envolvidos no metabolismo e sequestração mediada resistência a inseticidas, síntese de hidrocarbonetos cuticulares e para marcar fluorescente diferentes tipos de células e tecidos (Tabela 1). Para as linhas de resposta, a integração direcionada ao local do transgene é agora realizada pelo ΦC31 catalisado troca de cassete17,18 para corrigir o contexto genômico dos genes regulados pela UAS. Dessa forma, a expressão transgênica é normalizada em relação à localização de inserção genômica, permitindo uma comparação mais precisa dos efeitos fenotípicos de diferentes genes candidatos.

As linhas de respondente criadas até o momento são projetadas para expressar o transgene em níveis elevados ou reduzir a expressão genética através da interferência de RNA (RNAi). Normalmente, os clones cDNA são fundidos à sequência UAS para gerar plasmídeos de expressão adequados, porém sequências genômicas completas também são viáveis assumindo que eles não são muito grandes para clonagem. Para gerar construções de silenciamento, utilizamos três métodos diferentes para obter sequências invertidas tandem adequadas que formam o dsRNA que estimula o RNAi. Estes incluíram PCR de fusão, PCR assimétrico e síntese comercial de construções de grampos de cabelo. Comum a cada método é a inclusão de uma sequência intron entre as sequências invertidas para fornecer estabilidade de clonagem. Plasmids de resposta nos quais um gene de interesse/construção RNAi pode ser inserido foram desenvolvidos15. Esses plasmídeos também carregam os locais de attB ΦC31 necessários para rmce (descrito em Adolfi acompanhando o artigo jove que descreve a técnica RCME em detalhes). Protocolos que abrangem as etapas importantes necessárias ao selecionar a sequência para inserção em um desses plasmídeos para superexpressão estão incluídos neste manuscrito. Além disso, dois protocolos para criação de construção de grampos rnai são descritos e ilustrados.

Ao criar novas linhas, a identificação de indivíduos transgênicos raros é crucial para procriar para estabelecer e manter colônias transgênicas. Mais importante para o sistema GAL4-UAS, é necessário distinguir as linhas de respondente e motorista para estabelecer cruzes e identificar descendentes individuais que carregam ambos transgenes. Isso é conseguido usando diferentes genes de marcadores selecionáveis dominantes ligados às fitas do motorista e do respondente. Mais comumente estes são genes marcadores fluorescentes que são claramente distinguíveis usando filtros ópticos (por exemplo, eYFP, eCFP, dsRed). É importante que os marcadores sejam expressos em um padrão espíte conhecido e confiável, pois isso facilita a identificação de anormalidades e contaminação. A expressão genética do marcador fluorescente é rotineiramente regulada pelo promotor 3xP3 sintético, que causa expressão específica de gânglios oculares e ventral em todas as etapas do desenvolvimento de An. gambiae19. Marcadores fluorescentes controlados por 3xP3 estão incluídos em todos os plasmídeos de transformação descritos neste artigo. Um protocolo detalhando os métodos comuns usados para tela fluorescente Uma. gambiae pupae GAL4-UAS está incluído aqui.

Um dos elementos-chave do sistema GAL4-UAS é a necessidade de cruzar as linhas de driver e responder marcadas diferencialmente. Para fazer este macho e fêmeas de cada linha deve ser separado antes do acasalamento. Os adultos são facilmente distinguíveis pela visão, no entanto, para estabelecer cruzes genéticas é sensato separar os sexos antes do surgimento de adultos para garantir que o acasalamento não tenha ocorrido. A diferença geral de tamanho entre macho e fêmea An. gambiae pupae é muito variável para ser um método eficiente e confiável de determinação sexual20. Em vez disso, diferenças morfológicas claras na genitália externa fornecem uma base confiável para o sexing em An. gambiae. Neste artigo, descrevemos um método confiável para sexar An. gambiae pupae para configurar cruzes apropriadas.

Figure 1
Figura 1 - Representação diagramática do processo para o uso do sistema bipartite GAL4-UAS em Anopheles gambiae. (A) Os principais componentes de um vetor de exemplo (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]) são retratados, detalhando os locais de restrição disponíveis (EcoRI, NheI, XhoI e NcoI) dentro dos múltiplos locais de clonagem que são adequados para uso para inserir a construção de grampos ou sequência de codificação para o interesse genético. A estrutura da linha de acoplamento também é retratada. (B) A etapa de travessia é ilustrada indicando o uso de machos da linha de motorista (transportando condutor gal4 por um promotor de interesse e eCFP conduzido pelo promotor 3xP3) e fêmeas da linha de resposta (carregando o gene de interesse ou construção de grampos controlado por um promotor da UAS e um marcador eYFP controlado pelo promotor 3xP3). (C) Uma representação diagramática da expressão de condução GAL4 do gene de interesse na prole da cruz em B e uma lista de alguns dos fenótipos típicos que são avaliados. Abreviaturas: Multiple Cloning Site (MCS), Recombinase mediated cassette exchange (RMCE), Upstream Activator Sequence (UAS), proteína fluorescente amarela aprimorada (eYFP), proteína fluorescente ciano aprimorada (eCFP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

É o uso de cruzes que fornece a natureza bipartite do sistema GAL4-UAS, que tem vantagens distintas sobre abordagens mais lineares. Por exemplo, muitas mais combinações de linhas de driver e respondente podem ser avaliadas do que seria viável se uma nova linha transgênica tivesse que ser gerada e mantida para cada combinação promotor/gene. Mais importante, permite a análise de genes que produzem fenótipos letais ou estéreis quando sua expressão é perturbada, que são difíceis de criar/manter em um sistema linear. Tais fenótipos letais podem se manifestar em todos os estágios de desenvolvimento, dependendo da função genética e expressão espacial, mas são mais frequentemente observados durante o desenvolvimento embrionário. Visualizar o desenvolvimento de embriões de mosquitos requer a limpeza da chorão opaca que reveste os ovos. Seguindo os métodos descritos em Trpiš (1970)21 e Kaiser et al. (2014)22, descrevemos os protocolos que usamos para corrigir embriões, mantendo a integridade estrutural e o branqueamento para limpar a endochorion que permite visualização e imagem microscópicas.

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Protocol

1. Projeto e construção de construções da UAS

  1. Projeto e montagem de vetores para expressão genética do candidato
    1. Determine a sequência a ser usada para a regulação genética do candidato.
      1. Sequencifique o cDNA/gDNA da tensão de interesse e compare-o com a sequência publicada para verificar sua identidade e identificar possíveis SNPs e locais de restrição para digestão diagnóstica.
      2. Certifique-se de que o primer dianteiro usado para amplificação genética cobre a sequência nativa de Kozak e iniciar o códon, quando apropriado. Um primer com ~10 bp ligando upstream do códon inicial englobará a sequência Kozak.
      3. Inclua o códon de parada no fragmento amplificado a partir do primer reverso na maioria das circunstâncias. Use sequências de terminação de 3' fornecidas nos vetores plasmídeos descritos ou amplie a partir de sequências genômicas genéticas do candidato.
      4. Ordene sequências comerciais com viés específico de codon, se desejar.
    2. Use procedimentos de subcloamento padrão para inserir genéticos em vetores plasmídeos da UAS, por exemplo, pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15 (Figura 1) tanto para a regulação quanto para construções RNAi.
    3. Produzir mosquitos transgênicos criados usando o câmbio mediado de recombinação ΦC31110,17,18,23.
  2. Criação de construções de grampos RNAi: amplificação de etapa única utilizando PCR15,24 assimétrica
    1. Extrair DNA genômico (gDNA) da fêmea adulta An. gambiae carregando o gene candidato desejado usando o método Livak25.
      1. Projete o primer para a frente para ligar ao exon alvo aos 5' do fragmento desejado direcionado para o intron vizinho. Projete a extremidade de 3' de uma primer de ponte para ligar ao final do exon anterior para amplificar o intron. O final de 5' é complementar a um pequeno fragmento do exon alvo imediatamente após o intron.
    2. Execute uma reação assimétrica de PCR como está descrito em Xiao (2006)24 (Figura 2).
    3. Clone o produto PCR purificado em um vetor adequado que carrega o promotor da UAS (por exemplo, pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15).
      NOTA: Enzimas dentro do local de clonagem múltipla que são apropriadas para pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] clonagem15 e os próximos passos necessários estão indicados na Figura 1. O digestor de enzima única é essencial, pois apenas um local de restrição é adicionado. A desfosforilação do plasmídeo melhorará a eficiência da clonagem.
  3. Construção de construções de grampos RNAi: Fusion PCR de cDNA e gDNA15
    1. Extrair DNA genômico (gDNA) da fêmea adulta An. gambiae carregando o gene candidato desejado usando o método Livak25.
      1. Inclua gDNA em uma reação pcr para amplificar a área alvo das sequências exon e intron juntos (Figura 2).
      2. Projete a extremidade de 3' do primer dianteiro para vincular à sequência de exon de alvo reverso para amplificar em direção à sequência intron alvo e o final de 5' para carregar um local de restrição para facilitar a clonagem.
      3. O primer reverso de design (1) para ligar ao final de 5' do intron e a saliência final de 5' carrega as primeiras bases da sequência dianteira do exon vizinho. Esta saliência é usada na fusão PCR.
      4. Purifique o produto de reação desejado.
    2. Extrair RNA, remover DNA usando DNase e preparar cDNA de fêmea adulta An. gambiae carregando o gene candidato desejado seguindo os protocolos do fabricante.
    3. Use cDNA em uma reação pcr para amplificar a área alvo apenas do exon (Figura 2).
      1. Projete primer para a frente (2) para que a extremidade de 3' se ligue no final de 3' da sequência de exon alvo complementar e a extremidade de 5' do primer carrega um local de restrição para uso na clonagem.
        NOTA: O primer dianteiro de 1.3.1.2 pode ser usado novamente nesta segunda reação. No entanto, isso significará que um único digestor enzimádido é essencial. O uso de um segundo primer para a frente com um local de restrição diferente permitirá uma digestão dupla, o que pode aumentar a eficiência da clonagem.
      2. Projeto primer reverso (2) - a extremidade de 3' se liga ao final de 5' do exon vizinho amplificando o exon alvo. A extremidade de 5' se liga ao final de 3' da vertente introns para a frente. Esta saliência é usada na fusão PCR.
      3. Purifique o produto de reação desejado.
    4. Inclua os produtos da etapa 1.3.1 e 1.3.2 como modelos para uma reação de FUSÃO PCR usando concentrações padrão com primers Forward 1 e 2. Purificar o produto desejado.
    5. Digerir o produto purificado para gerar as saliências para clonagem. Clone em um vetor adequado a jusante do promotor da UAS. Enzimas apropriadas para pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] clonagem15 e os próximos passos necessários estão indicados na Figura 1.

Figure 2
Figura 2 - Representação diagramática da criação de construtos RNAi para inserção em pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] por dois métodos: (A) PcR assimétrico de passo único (adaptado de Xiao. Y H et al (2006) e (B) fusão de múltiplos passos PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. An. gambiae pupae screening

  1. Coleção de pupas para caracterização microscópica
    NOTA: Ao longo desses protocolos, a água refere-se à água destilada suplementada com 0,01% de sal da lagoa.
    1. Áris de árdoos mosquitos usando protocolos padrão (por exemplo, MR426) para estágio pupal.
      ATENÇÃO: Tome cuidado para não ferir pupas durante todo esse processo.
    2. Colete pupas em uma placa plana clara adequada para uso com um estereomicroscope (por exemplo, uma placa de Petri de plástico de 100 x 15 mm, evitando as bordas).
      NOTA: Para coletar pupas, usamos uma pipeta Pasteur de plástico de 3 mL com cerca de 10 mm cortadas da extremidade para ampliar a extremidade e evitar lesões aos mosquitos. A triagem e o sexing podem ser concluídos em indivíduos, no entanto, isso é muito lento. Recomenda-se realizar triagem e sexagem em grupos de 50-200 pupas (o tamanho do grupo possível é limitado pelo tamanho do prato utilizado e está sujeito à preferência pessoal). Se um grande número estiver sendo rastreado, a eficiência pode ser aumentada alinhando primeiro pupas de 4 a 5 profundas em linhas, e movendo o alvo pupae para fora desta linha.
    3. Usando uma pipeta Pasteur, remova cuidadosamente quase toda a água ao redor da pupa. Deixe água suficiente ao redor de pupas para que eles sejam efetivamente immotile, mas podem ser movidos facilmente com uma escova fina. Se eles se tornam difíceis de mover, então adicione mais água.
      NOTA: Quando a água suficiente é removida, a pupae deita-se ao seu lado, permitindo a visualização dos olhos para detecção de fluorescência e identificação de genitálias dimórficas (Figura 4DE).
      ATENÇÃO: Certifique-se de que a pupae não desfilcate. Se apenas um volume muito pequeno de água for deixado, ele pode reduzir ainda mais com o calor da lâmpada do microscópio e quando dividido entre piscinas de pupas. Água adicional às vezes deve ser adicionada durante o processo usando uma pipeta Pasteur de 3 mL para o grupo desejado(s).
  2. Identificação de marcadores fluorescentes em pupas
    NOTA: O uso de um estereoscópio de baixa ampliação permite uma triagem de campo amplo, a classificação pode ser feita em um microscópio composto invertido, mas tem que ser feita individualmente.
    1. Ao procurar um marcador fluorescente é primeiro crucial conhecer os padrões esperados de expressão e herança. Considere o seguinte:
      1. Cor(s): determinar qual filtro(s) visualizar a expressão.
      2. Padrão de expressão espacial: Entenda onde e em que estágio da vida você espera ver a expressão.
      3. Razão de diferentes fenótipos: estabelecer qual percentual da população deve carregar os marcadores de interesse.
    2. Realizar triagem fluorescente na escuridão, pois mesmo a baixa luz pode interferir na resolução da fluorescência. No entanto, use uma lâmpada ao lado do estereoscópio quando a luz for necessária para outras manipulações.
      ATENÇÃO: Certifique-se de que o espaço de trabalho ao redor do estereoscópio fluorescente esteja limpo antes de desligar as luzes.
    3. Ligue a lâmpada fluorescente e deixe aquecer para o período recomendado pelo fabricante (Normalmente 10-15 min). Selecione o filtro necessário no estereóscópio fluorescente e verifique se há um feixe de luz colorido visível que é direcionado para o centro da placa de palco. Se isso não for visível ou for muito fraco, a lâmpada fluorescente pode não ter aquecido totalmente, o obturador está fechado ou a óptica do microscópio não está bem alinhada.
    4. Usando luz branca, centralize a pupa no campo de visão e leve-as ao foco. Esta ampliação pode precisar ser alterada ao alternar entre diferentes filtros, dependendo da intensidade da fluorescência.
    5. O uso de um pincel de detalhamento fino garante que a pupa examinada não se sobreponha.
    6. Desligue a luz branca do estereóscópio e use o foco fino para colocar a área da pupae carregando o fenótipo de interesse em foco. O padrão fluorescente deve ser visível. Exemplos de fluorescência controlada pelo promotor 3xP3 são fornecidos na Figura 3.
      1. Use a menor ampliação na qual o fenótipo fluorescente esperado pode ser distinguido de forma confiável de indivíduos sem fluoresceno.
      2. Para cepas com fluorescência brilhante use uma luz de campo brilhante de baixa intensidade também durante a triagem, se o sinal fluorescente ainda estiver claramente identificável.
      3. Quando concluído a triagem primária, escaneie rapidamente populações sob outros filtros para detectar contaminação potencial.
        ATENÇÃO: Certifique-se de que há uma distância clara entre os grupos de pupas classificadas para evitar a contaminação pelo movimento pupa. Esteja ciente de que o tamanho dos grupos mudará à medida que as pupas são sexadas e que as distâncias podem parecer maiores quando se olha sob ampliação. Tome cuidado especial quando as piscinas não estiverem dentro do campo de visão.

Figure 3
Figura 3 - Anopheles gambiae pupae expressando marcadores fluorescentes impulsionados pelo promotor 3xP3 (A) eYFP, (B) dsRed e (C) eCFP. Ampliação: A=16X, B,C=20X.

  1. Sexing Pupae
    1. Colete pupae. Remova o excesso de água, mas forneça o suficiente para que as pás anais se partam ligeiramente da genitália para auxiliar na visualização e caracterização morfológica (Figura 4D,E).
    2. Se alguma pupa/e não estiver do seu lado, use um pincel de pintura de detalhamento fino para girar suavemente a pupa e mover as pás anais para que a genitália externa possa ser identificada.
    3. Pupas separadas à base de genitália externa distinta; os machos têm um tubo longo que extrudes do segmento dorsal final aproximadamente metade do comprimento das pás anais (Figura 4B). Os genitais externos da pupa fêmea são consideravelmente mais curtos e bifurcados (Figura 4A).
      NOTA: Na ocasião, se o 4º exoesqueleto larval instar permanecer ligado ou a genitália externa estiver danificada (Figura 4C), a identificação confiante do sexo é mais difícil. Quando o sexo de uma pupa não é claro, é melhor descartá-lo. Se o indivíduo deve ser mantido, a pupa deve ser permitida a emergir isoladamente e seu sexo determinado usando características morfológicas adultas. É provável que, se sua genitália estiver danificada, o indivíduo pode não acasalar com sucesso.
    4. Faça uma piscina para cada sexo na extremidade oposta do prato para a piscina nãoexada, movendo pupas identificadas através do prato usando um pincel de pintura de detalhe fino. Rotule a parte inferior do prato onde as duas piscinas estarão reunidas para identificá-las mais tarde.
    5. Quando o sexing e a triagem fluorescente são necessários, realize a triagem fluorescente primeiro, já que é o processo mais rápido dos dois.

Figure 4
Figura 4 - Sexing Anopheles gambiae pupae. Pupas individuais indicando a genitália externa de (A) uma fêmea (B) um macho e (C) um indivíduo que não pode ser facilmente identificado devido ao descolamento incompleto do exoesqueleto larval. Imagens ampliadas abaixo destacando a genitália externa. Pupae com ♀ (fêmea) e ♂ (macho) indicando a genitália externa da pupa com (D) ~50% da pupa submersa em água e com (E) toda a água removida destacando a diferença na facilidade de visualização da genitália externa. Ampliação: A,B,C=40x, D,E=30x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Confirmação sexual como adultos
    1. Até que uma taxa de erro muito baixa tenha sido demonstrada, confirme o sexo de pupas por morfologia adulta após o surgimento. Separado pupas sexadas em grupos de 10 ou menos em um tubo claro de 20 mL com alguns mL de água, selando com uma bola de algodão de lã, rotulada com o sexo esperado e permitem emergir durante a noite.
      NOTA: Como os adultos são transferidos na manhã seguinte, não é necessário fornecer alimentos a adultos emergentes.
    2. Confirme o sexo de adultos emergiu usando características morfológicas no dia seguinte.
    3. Se algum macho estiver presente nas coleções femininas, descarte as fêmeas, caso o acasalamento já tenha ocorrido.
    4. Se alguma fêmea estiver presente na coleção masculina, remova as fêmeas e mantenha os machos para travessia.
  2. Configuração de cruzamentos do sistema GAL4-UAS
    1. Aspire o número desejado de adultos do sexo masculino e feminino dos tubos na etapa 2.4 em uma gaiola ou balde pequeno configurado da maneira padrão para a criação de An. gambiae.
      NOTA: Tome cuidado para não danificar os adultos durante esta transferência.
    2. Use aproximadamente 50 fêmeas com um número igual de machos, quando ~2000 adultos são necessários da prole.
      NOTA: Quando uma cruz deve ser alimentada várias vezes para gerar vários lotes até 200 de cada sexo pode ser configurado em gaiolas de 30cm x 30cm x 30cm. Quando apenas um pequeno número de fêmeas (<20) estão disponíveis para a cruz, adicionamos ~4x o número de machos para aumentar a probabilidade de acasalamento bem sucedido.
    3. Alimentam as fêmeas cruzadas e a prole traseira para o estágio apropriado, seguindo os protocolos padrão26, para realizar avaliação fenotípica (por exemplo, resistência a inseticidas, capacidade vetorial e ensaios de custo fitness).
    4. Quando o efeito materno da expressão transgênica é provável, configurar cruzes recíprocas das linhas de motorista e respondente e avaliar o fenótipo esperado.
      NOTA: Cruzes utilizando populações 'heterozigous' ou mistas de linhas de motorista e respondente, produzem progênero com cada um dos 4 genótipos possíveis. Isso fornece controles selvagens, somente uas e GAL4, bem como as transheterozygotes GAL4-UAS com as quais analisar o fenótipo. Se populações homozigas forem cruzadas, configure cruzes adicionais para fornecer controles apropriados para comparar fenótipos. A prole deve ser examinada como acima separando progêneres que carregam tanto ou apenas marcador, bem como negativos, para avaliação fenotípica.
  3. Estabelecendo populações homozigiosas a partir de linhas geradas através do RCME carregando marcadores fluorescentes alternativos
    NOTA: É essencial que o marcador fluorescente de ambas as linhas esteja presente no mesmo local genômico e eles sejam completamente distinguíveis.
    1. Estabeleceu uma cruz parental de aproximadamente 200 adultos com número igual de machos de uma linha e fêmeas de uma linha após a triagem para selecionar indivíduos que exibem fluorescência correta e sexo, como descrito acima. Cerca de uma semana depois, o sangue alimenta a cruz usando protocolos estabelecidos26.
      1. Crie a prole F1 para pupas usando protocolos padrão e colete pupas como descrito anteriormente.
    2. Tela para fluorescência selecionando aqueles que carregam ambos os marcadores parentais (transheterozigous). Montar um intercross de F1 com essas pupas.
    3. Uma semana depois, o sangue alimenta as fêmeas da F-1 e a prole traseira para o estágio pupal seguindo protocolos padrão.
    4. Trie o pupae F2 selecionando aqueles que exibem APENAS um dos marcadores. Estes serão homozigosos para a inserção. Apenas 25% da prole será homozigosa para cada inserção, de modo a garantir que descendentes suficientes sejam criados para fornecer uma gaiola de estoque (400-500).
      NOTA: A seleção da prole transheterozigous deve ser totalmente rigorosa caso contrário, o processo se torna contaminado, e a homozigosidade completa pode não ser alcançada. Verifique duas vezes todas as progêneres selecionadas para o intercross de F1.

3. Um. Protocolo de limpeza de embriões de gambiae

  1. Alimentação e manutenção de sangue
    1. Rear An. gâmbias para adultos seguindo protocolos padrão (por exemplo, MR4).
    2. Ração sanguínea de 5 a 7 dias de idade mulheres adultas, garantindo que a maioria esteja totalmente engorgada.
      ATENÇÃO: Ao longo deste protocolo, trabalhar rapidamente é essencial para garantir que os ovos não sejam permitidos a dessecar.
  2. Colocação de ovos induzidos
    1. 3 dias após a alimentação sanguínea coletar ovos através de colocação induzida.
    2. Reúna a câmara de oviposition.
      1. Encha o pote de oviposição com água a uma profundidade de aproximadamente 5 mm. Conecte a panela a uma extremidade de um tubo de polipropileno de 50 mL, previamente cortado com uma serra de corte para que ambas as extremidades estejam abertas. (Usamos um disco plástico para uma panela (Figura 5); no entanto, a tampa original do tubo pode ser usada em seu lugar).
      2. Cubra a outra extremidade do tubo de polipropileno cortado com material (mangueira/meia) ou seções de luva de látex presas com uma faixa elástica, para que os adultos possam ser introduzidos, mas não podem escapar (Figura 5). Outros projetos alternativos de câmara de oviposição existem e podem ser usados26.
    3. Introduza cuidadosamente 10-15 fêmeas (sangue alimentado na etapa 3.1.2) à câmara de oviposição. Cubra a câmara de oviposição para produzir escuridão e deixe por 20 minutos.
      ATENÇÃO: Evite mover o pote de oviposition uma vez que os ovos tenham sido colocados para evitar encalhe e dessecação de ovos.
    4. Retire cuidadosamente o tubo de polipropileno de 50 mL da panela de oviposição, garantindo não liberar os mosquitos. Ovos brancos devem ser visíveis. Verifique se foram suficientes para fins proscritos. Repita se necessário.
    5. Cubra a panela (para proteção da poeira) e deixe os ovos amadurecerem até o estágio de desenvolvimento de interesse.
    6. Use um pincel de tinta de detalhamento fino para pegar ovos da panela e colocá-los na água em um bloco de vidro escavado de 40 mm2.

Figure 5
Figura 5 - Exemplo de câmara de oviposition (A) desmontada para destacar os componentes e (B) montados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

  1. Fixação de embriões
    ATENÇÃO: Realize todas as etapas de fixação (etapa 3.3) em um capô de fumaça devido ao uso de formaldeído.
    1. Prepare a solução da FAA conforme descrito em Kaiser et al. (2014)22. A FAA compreende 3,6 M de formaldeído, 0,87 M de ácido acético e 8,5 M de etanol absoluto feito até volume com água destilada (dH2O).
      1. Para 10 mL de FAA combine 2,68 mL de 13,42 M formaldeído, 4,96 mL de 17,14 M de etanol e 0,5 mL de ácido acético de 17,4 M com 1,86 mL de H2O destilado. Fixative pode ser mantido por pelo menos 3 meses em um recipiente de vidro bem selado, mantido em um armário químico designado.
    2. Remova cuidadosamente a água do bloco de vidro com uma micropipette e cubra os ovos em 500 μL de FAA e oscile suavemente (~25 RPM) em um agitador orbital à temperatura ambiente por 30 minutos. Nenhuma mudança de cor é visível neste momento.
    3. Enxágüe bem os ovos com água destilada. Realize a lavagem 15 vezes para remover todos os traços de formaldeído. Usando uma micropipette de 1000 μL, adicione e remova 1 mL de dH2O de cada vez, garantindo não danificar os ovos ao fazê-lo.
    4. Armazene águas residuais de enxágues em um recipiente designado para descarte de formaldeído para descarte de acordo com as diretrizes de segurança.
    5. Neste ponto, os ovos fixos podem ser armazenados a 4 °C durante a noite em água para mantê-los hidratados.
  2. Branqueamento de embriões
    ATENÇÃO: Realize todas as etapas de branqueamento (passo 4) em um capô de fumaça devido à possível liberação de gás cloro quando hipoclorito de sódio e ácido acético forem combinados.
    1. Prepare a solução de branqueamento (solução Trpiš - descrita em Trpiš (1970)21 e modificada de acordo com Kaiser et al. (2014)22). A solução trpiš é hipoclorito de sódio de 0,59 M e ácido acético de 0,35 M dissolvido em H2O destilado.
      1. Para um ovolume de 10 mL de solução Trpiš, combine 2,68 mL de hipoclorito de sódio de 2,2 M e 0,2 mL de ácido acético de 17,4 M com 7,12 mL de H2O destilado.
        NOTA:A solução Trpiš pode ser armazenada por pelo menos 3 meses em um recipiente de vidro bem selado e mantida em um armário químico seguro. A solução pode precisar ser vórtice após o armazenamento e deve ser sempre aberta em um capô de fumaça em caso de liberação de gás cloro.
    2. Cubra os ovos fixos com 1 mL de solução Trpiš e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Os ovos começarão a desenvolver manchas pálidas após cerca de 5 minutos de incubação, chegando eventualmente a uma cor branca leitosa uma vez limpa.
    3. Enxágüe os ovos como na etapa 3.3.3 para remover a solução Trpiš.
    4. Armazene águas residuais em um recipiente de resíduos designado e descarte com excesso de água pelo ralo.
  3. Armazenamento
    1. Armazene em 500 μL de dH2O e mantenha entre 2-8 °C por alguns dias. Remova a maior parte da água cuidadosamente antes da visualização e imagem em massa, mas evite a dessecação dos ovos deixando um pequeno volume de água no vidro do relógio. Isso não vai interromper a fotografia dos ovos. Ovos individuais podem ser colocados no slide do microscópio para imagens de ampliação mais altas.

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Representative Results

A expressão 3xP3 de eYFP, dsRed e eCFP fornece identificação confiável e facilmente distintiva de indivíduos que possuem os genes marcadores que produzem expressão nos olhos e gúlia ventral de An. gambiae pupae (Figura 3). A morfologia diferencial observada na genitália externa masculina e feminina utilizada para o sexo e um exemplo de pupae não identificável são destacadas na Figura 4. A remoção de toda a água da pupae aumenta a dificuldade de sexing, pois as pás anais obscurecem a visualização da genitália (Figura 4D,E). O sistema bipartite GAL4-UAS permite modificação da expressão genética de forma controlada esceuralista que pode ser visualizada cruzando as linhas onipresente (Figura 6A,C) e driver oenocito (Figura 6B,D) com a linha de resposta UAS-mCD8:mCherry10. As características morfológicas observadas em diferentes estágios de desenvolvimento embrionário em 12, 24 e 36 h postagem são claras após a conclusão do protocolo número 3 (Figura 7).

Figure 6
Figura 6 - Visualização de Expressão Específica do Tecido. (A, B) Larvas e (C, D) adultos expressando mCherry conduzido por (A, C) onipresente e (B, D) linhas específicas de motorista. Ampliação: A,B=32X, C=25X, D=40X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 - Resultados do exemplo de compensação de embriões. Imagens de embriões seguindo o protocolo descrito (A) 12, (B) 24 e (C) 36 horas pós oviposição e (D) uma tentativa mal sucedida usando alvejante doméstico onde o branqueamento causado por descoloração e estouro de embriões. Ampliação: 50x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tipo Linha Conteúdo Marcador 3xP3 Descrição Fonte
Respondedor mCherry UAS-mCD8:mCherry eCFP, eYFP Expressa a sequência de codificação mCherry quando atravessada com uma linha de driver Adolfi, o que está aqui? A et al (2018)
16i UAS-RNAi cyp4g16 eYFP Contém uma construção de grampo de cabelo RNAi que tem como alvo cyp4g16 que é expressa e causa knockdown de cyp4g16 quando atravessado com uma linha de motorista Lynd. A et al (2020)
17i UAS-RNAi cyp4g17 eYFP Contém uma construção de grampo de cabelo RNAi que tem como alvo cyp4g17 que é expressa e causa knockdown de cyp4g17 quando atravessado com uma linha de motorista Lynd. A et al (2020)
M2 UAS-cyp6m2 eYFP Expressa cyp6m2 quando atravessado com uma linha de motorista Adolfi, o que está aqui? A et al (2019)
P3 UAS-cyp6p3 eYFP Expressa cyp6p3 quando atravessado com uma linha de motorista Adolfi, o que está aqui? A et al (2019)
e2 UAS-GSTe2 eYFP Expressa GSTe2 quando atravessado com uma linha de motorista Adolfi, o que está aqui? A et al (2019)
SAP2 UAS-Sap2 eYFP Expressa Sap2 quando atravessado com uma linha de motorista Ingham. V et al (2019)
FAS1899i UAS-RNAi FAS1899 eYFP Contém uma construção de grampo de cabelo RNAi que tem como alvo o FAS1899 que é expresso e causa o knockdown do FAS1899 quando atravessado com uma linha de motorista O Grigoraki. L et al (2020)
3050i UAS-RNAi Desat3050 eYFP Contém uma construção de grampo de cabelo RNAi que tem como alvo Desat3050 que é expressa e causa o knockdown de Desat3050 quando atravessado com uma linha de motorista O Grigoraki. L et al (2020)
Rio Wnd UAS-eYFPnls-luc eCFP Quando atravessado com uma linha GAL4 eYFP é expresso. Gerado usando piggybac (código MR4: MRA-1165) Lynd. A et al (2011)
MBL UAS-eYFPnls-luc eCFP Quando atravessado com uma linha GAL4 eYFP é expresso. Gerado usando piggybac (código MR4: MRA-1164) Lynd. A et al (2011)
Encaixe A11 VG-LRIM1 eCFP Carregando os locais de acoplamento attP necessários para a troca de mediadas ΦC31 Lynd.A et al (2019)
Motorista + Acoplamento A10 Ubi-A10 GAL4 eCFP Contém a sequência de codificação do fator de transcrição GAL4 controlada pelo gene An. gambiae Polyubiquitin-c (PUBc). Também carrega os sites de acoplamento attP necessários para a troca de mediados ΦC31 Adolfi, o que está aqui? A et al (2018)
Motorista Gareth Oenocito enhancer-GAL4 dsRed Expressa GAL4 controlado por um intensificador específico de oenocito Lynd. A et al (2012)
HML- GAL4 HML-GAL4-hml- GAL80 eYFP-nls Expressa GAL4 e GAL80 impulsionados por um promotor específico de hemocito Em Pondeville. E et al (2020)
F promotor carboxypeptidase - GFY-GAL4 dsRed Expressa GAL4 no midgut e quando atravessado com uma linha UAS expressará YFP. Gerado usando piggybac (código MR4: MRA-1167) Lynd. A et al (2011)
Dgl promotor carboxypeptidase - GFY-GAL4 dsRed Expressa GAL4 no midgut e quando atravessado com uma linha UAS expressará YFP. Gerado usando piggybac (código MR4: MRA-1166) Lynd. A et al (2011)

Tabela 1 - Lista de tabelas linhas publicadas, descrições curtas e a referência em que a metodologia de criação é descrita. Os números do catálogo das linhas atualmente armazenadas no repositório MR4 são anotados na descrição.

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Discussion

Entender a função genética do mosquito é vital para desenvolver novas abordagens para controlar anofelinos e impactar a transmissão da malária. O sistema GAL4-UAS descrito é um sistema versátil e poderoso para análise funcional de genes candidatos e até hoje usamos o sistema para examinar a base genética da resistência a inseticidas17 e produção de hidrocarbonetos cuticulares15,23, bem como para marcar fluorescentemente diferentes populações de células do mosquito8 . Até agora, as construções de respondentes foram geradas através da clonagem de enzimas de restrição em um plasmídeo, carregando um local de clonagem múltipla a jusante do UAS (Figura 1, Tabela 1). No entanto, devido à natureza modular dos construtos que carregam múltiplos elementos (sítios attB, sequências de isoladores 3xP3-YFP e cigana), técnicas mais contemporâneas são viáveis para a construção de novos plasmídeos de resposta. Normalmente, sequências para superexpressão podem ser amplificadas a partir de cDNA ou gDNA usando PCR, mas a síntese comercial às vezes pode reduzir o trabalho e o tempo envolvidos na geração de novas construções. É importante sequenciar os genes-alvo uma vez amplificados a partir de respectivos modelos para validar a identidade e identificar possíveis SNPs. Isso é particularmente relevante quando sintetiza o DNA comercialmente, pois não é recomendado confiar apenas em anotações de banco de dados.

A geração de sequências para construções RNAi é muitas vezes mais complexa devido à exigência de clonar uma repetição invertida inerentemente instável da sequência de destino para a formação de dsRNA do produto hairpin. Esta clonagem é frequentemente alcançada incluindo uma sequência intron entre as repetições para permitir a replicação estável em Escherichia coli, e emenda eficiente no mosquito27. A amplificação de construções de grampos de cabelo usando PCR assimétrico é eficiente devido à natureza de um passo único. Nos primeiros ciclos de PCR assimétrico, o fio amplificado pelo primer dianteiro é preferencialmente amplificado à medida que este primer é fornecido à reação em excesso (concentração de 2x de primer de ponte). Este produto se acumula como fios únicos. A extremidade 3' dessas vertentes é complementar ao início do exon alvo. Nos ciclos de fase média, um loop se forma como o final complementar de 3' anneals para o início do exon alvo. Quando isso ocorre, a sequência complementar do exon alvo é amplificada a partir da extremidade 3 gerando um produto [exon invertido: intron: exon]. Em ciclos tardios este produto final é amplificado pelo primer dianteiro e pode ser prontamente isolado e clonado. Uma construção de repetição invertida semelhante pode ser produzida por fusion PCR28, conforme indicado na Figura 2. No entanto, para ambos os métodos, um local de destino adequado que cumpra as propriedades necessárias para RNAi24 deve ser diretamente adjacente a um intron de tamanho apropriado para clonagem. Quando um alvo adequado não está disponível, um PCR de fusão modificado ou síntese comercial pode ser usado onde as sequências invertidas são fundidas com uma sequência intron como três fragmentos separados em uma reação PCR ou em silico, respectivamente. Usamos com sucesso o 4º intron do gene branco Drosophila como uma sequência espaçada 23. Neste caso, a empresa exigiu um espaçador (intron) de pelo menos igual comprimento às sequências de repetição de alvo para permitir uma síntese eficiente. À medida que o custo da síntese comercial aumenta com o tamanho e a complexidade do fragmento, tipicamente apenas o grampo de cabelo ou fragmento genético é sintetizado e clonado no vetor desejado em oposição à síntese de todo o plasmídeo. Ao usar a síntese comercial para gerar construções para transgênese, é importante ter em mente que a anotação de sequência esperada pode ter diferenças, como SNPs, em comparação com sequências presentes em cepas de laboratório. Além disso, é importante considerar o impacto das sequências de Kozak e garantir que elas sejam incluídas na construção final, quando necessário29.

Como descrito acima, a separação dos componentes GAL4 e UAS expande o potencial de cada linha permitindo avaliação em combinações e análise de fenótipos letais ou prejudiciais. Por exemplo, fenótipos de resistência muito diferentes foram observados ao expressar enzimas metabólicas de forma onipresente, em vez de no intestino ou oenócitos, que antes se pensava ser alguns dos principais tecidos que conferem resistência a inseticidas17. Além disso, a expressão específica do tecido/knockdown dos genes envolvidos na produção de hidrocarbonetos cuticulares tem destacado o papel dos oenócitos no desenvolvimento larval e na eclosão adulta15,23. Seguindo em frente, a geração de linhas de driver com expressão alternativa de tecido espacial-temporal específico GAL4 pode muito bem ser simplificada pela tecnologia CRISPR-Cas. As linhas de driver anteriores eram geradas com conhecimento limitado de sequências de promotores para regular a expressão e muitas vezes eram "hit and miss" em sua atividade, que muitas vezes é agravada por efeitos de posição. Isso pode ser superado pela inserção direcionada de GAL4 com um peptídeo auto-fissado (como T2A)30 a jusante de um gene alvo que deve produzir expressão de GAL4 na forma espesso do gene alvo31. Esta estratégia tem sido efetivamente utilizada em D. melanogaster32, incluindo a geração de uma biblioteca de ações expressando GAL4 sob controle de diferentes promotores endógenos33. Embora ainda não tenha sido testado extensivamente em mosquitos, e há questões anedóticas em torno da eficiência da co-expressão, a versatilidade e adaptabilidade dessa abordagem direcionada é emocionante.

Mesmo ao utilizar tais métodos para produção de condutores, sexing e rastreamento de pupas de forma eficiente e confiável é fundamental para o uso do sistema GAL4-UAS em mosquitos. Os protocolos descritos aqui são métodos robustos para análise em pequena escala. Quando são necessários maiores números de mosquitos, torna-se altamente demorado para tela manual para genótipo. Isso pode ser superado cruzando linhas homozigos de motorista e respondente para que toda progênua seja transheterozigous, e por isso não requerem triagem e separação rigorosas. Muitas vezes é possível distinguir mosquitos homozigos com base na intensidade da fluorescência marcadora e, assim, intercruzá-los para produzir linhas homozigos estáveis. No entanto, a eficácia deste método depende um pouco da familiaridade do usuário com padrões de expressão. Além disso, algumas linhas não possuem diferenças consistentes e inequívocas na expressão em relação ao número da cópia marcadora. Uma maneira mais fácil de gerar linhas homozigos é descrita no protocolo 2.6, e é aplicável quando duas linhas foram geradas com diferentes marcadores fluorescentes no mesmo lócus genômico (por exemplo, através  do siteΦC31 direcionado transformação na mesma linha de acoplamento). Ou ambas as linhas podem ser tornadas homozygous de forma confiável através de simples cruzamentos e triagem. O método se baseia em ser capaz de distinguir entre os diferentes marcadores fluorescentes, e dos marcadores mais comumente usados, eCFP, eYFP e dsRED podem ser inequivocamente discriminados usando conjuntos de filtros apropriados. Infelizmente, o espectro de emissões do eGFP se sobrepõe consideravelmente com o eCFP e o eYFP e geralmente não pode ser usado em conjunto com esses marcadores, embora dsRED e eGFP façam um emparelhamento apropriado.

Maior rendimento de análise também pode ser alcançado através da classificação automática de larvas fluorescentes marcadas. Isso foi descrito com a máquina Complexa Analisador Paramétrico e Sorter (COPAS)34, que opera de forma semelhante a um classificador celular ativado por fluorescência para portar mosquitos individuais com base em sua expressão marcador. O método também tem sido utilizado para isolar machos e fêmeas com marca diferencial34. Devido ao tamanho, estágios maiores, como pupas, ainda não foram rastreados com sucesso usando o sistema COPAS. A classificação sexual automatizada para adultos usando algoritmos de vídeo e aprendizado de máquina também foi desenvolvida para lançamentos em campo em larga escala35, no entanto, isso ainda não é econômico para a escala na qual transgênicos do sistema GAL4-UAS são normalmente usados. Os sexos marcados diferencialmente ainda não estão disponíveis para mosquitos GAL4-UAS e, portanto, o sexing manual como pupae ainda é necessário para realizar cruzes específicas. O método descrito aqui para sexing pupae baseado em diferenças morfológicas na genitália externa é robusto. No entanto, está sujeito a erro do operador e para os estagiários é uma boa prática confirmar a precisão do sexing observando se o sexo adulto correto foi isolado. Uma vez confiante de 100% de precisão, a pupa pode ser colocada diretamente na gaiola de acasalamento para economizar tempo.

Descrevemos também um método adaptado para análise do desenvolvimento de embriões através da fixação e esclarecimento dos ovos após a coleta precisamente cronometrada. Nossas tentativas anteriores de limpar embriões usando alvejante doméstico como descrito em Goltsev, Rezende, et al.36, Rezende, Martins, et al.37, Vargas, Farnesi, et al.38 e Chang, Liu, et al.39, causaram a queima dos embriões conforme indicado na Figura 7D. A concentração de cloro no alvejante doméstico pode variar substancialmente, por isso optamos por usar produtos químicos de alta qualidade. Utilizamos este método para observar a extensão do desenvolvimento de embriões após modificação genética da ativação hormonal. Através da observação do embrião em desenvolvimento ficou claro que a ausência de eclosão larval se deveu a mudanças no desenvolvimento e não problemas de fertilidade nos adultos. Técnicas semelhantes têm sido usadas para a imuno-histoquímica e hibridização do RNA, como descrito por Clemons, Flannery, et al.40 e Juhn e James 41, respectivamente. Como mostramos, o sistema GAL4-UAS em An. gambiae tem se mostrado inestimável para examinar aspectos particulares da biologia e desenvolvimento de mosquitos, e os protocolos básicos descritos para o projeto transgene, triagem fluorescente, sexo manual de pupas e limpeza de embriões são necessários para a utilização eficiente deste importante sistema.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos o financiamento do LSTM e IVCC (Adriana Adolfi), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (doutorado em BCP:MR/P016197/1), Wellcome (Bolsa de Pós-Doutorado Sir Henry Wellcome à LG: 215894/Z/19/Z) que incorporaram a análise da Gal4UAS nas propostas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 x 15 mm plastic Petri dish SLS 2175546 Pack of 10
1000 µL Gilson Pipette Gilson F144059P
20/25 mL Universal Tubes Starlab E1412-3020 Pack of 400
3 mL Pasteur Pipettes SLS G612398 Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped
50 mL Falcon Tubes Fisher Scientific 11512303
Absolute Ethanol Fisher Scientific BP2818-500 500 mL
Acetic Acid SLS 45726-1L-F 1 L
Cages SLS E6099 30x30x30 with screen port
Fine Paint Brushes Amazon UKDPB66 KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)
Fish food Amazon Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L 
Formaldehyde Solution Sigma Aldrich F8775
Mouth Aspirator John Hock 612
Pond Salt Amazon Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L 
Pupae Pots Cater4you SP8OZ 250 pots with lids
Small Plastic Buckets Amazon 2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10) 
Sodium Hypochlorite Fisher Scientific S25552

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Genética Questão 170 3xP3 Localização Expressão Endógena Nocaute DE RNAi Microscopia bipartido Resistência a Inseticidas capacidade vetorial.
Usando o sistema GAL4-UAS para genética funcional em <em>Anopheles gambiae</em>
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Poulton, B. C., Colman, F.,… More

Poulton, B. C., Colman, F., Anthousi, A., Grigoraki, L., Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J. Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (170), e62131, doi:10.3791/62131 (2021).

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