Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Använda GAL4-UAS-systemet för funktionell genetik i Anopheles gambiae

Published: April 15, 2021 doi: 10.3791/62131
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Vector Biology, Liverpool School of Tropical Medicine, 2IMBB FORTH, 3Department of Biology, University of Crete

Summary

Tvåpartssystemet GAL4-UAS är ett mångsidigt verktyg för modifiering av genuttryck på ett kontrollerat spatiotemporalt sätt som tillåter funktionell genetisk analys i Anopheles gambiae. De förfaranden som beskrivs för att använda detta system är en halvstandardiserad kloningsstrategi, sexning och screening av puppar för fluorescerande proteinmarkörer och embryofixering.

Abstract

Tvåpartssystemet GAL4-UAS är ett mångsidigt och kraftfullt verktyg för funktionell genetisk analys. Kärnan i systemet är att korsa transgena "förarlinjer" som uttrycker jäst transkriptionsfaktorn GAL4 på ett vävnadsspecifikt sätt, med transgena "responder" linjer som bär en kandidat gen / RNA interferens konstruktion vars uttryck styrs av Uppströms aktiveringssekvenser (UAS) som binder GAL4. I den efterföljande avkomman uttrycks genen eller ljuddävarekonstruktionen således på ett föreskrivet spatiotemporalt sätt, vilket gör det möjligt att analysera de resulterande fenotyperna och genfunktionen härledas. Det binära systemet möjliggör flexibilitet i experimentella metoder för att screen fenotyper genereras av transgene uttryck i flera vävnad-specifika mönster, även om allvarliga fitness kostnader induceras. Vi har anpassat detta system för Anopheles gambiae, den viktigaste malariavektorn i Afrika.

I den här artikeln tillhandahåller vi några av de vanliga procedurer som används under GAL4-UAS-analysen. Vi beskriver An. gambiae GAL4-UAS linjer som redan genereras, liksom kloning av nya responder konstruktioner för upregulation och RNAi knockdown. Vi anger en steg för steg guide för sexing av myggpuppar för att upprätta genetiska kors, som också inkluderar screening avkomma för att följa arv av fluorescerande genmarkörer som taggar föraren och responder insättningar. Vi presenterar också ett protokoll för att rensa An. gambiae embryon för att studera embryonal utveckling. Slutligen introducerar vi potentiella anpassningar av metoden för att generera förarlinjer genom CRISPR/Cas9 införande av GAL4 nedströms målgener.

Introduction

Bipartite GAL4-UAS-systemet är arbetshästen för funktionell karakterisering av gener i insektsmodellorganismen Drosophila melanogaster1,2,3. För att använda GAL4-UAS-systemet korsas transgena förarlinjer, som uttrycker jäst transkriptionsfaktorn GAL4 under kontroll av en reglerande sekvens, med responderlinjer som bär en gen av intresse eller RNA-interferens (RNAi) konstruktion som styrs av en uppströms aktiveringssekvens (UAS) som erkänns av GAL4. Avkomman till detta kors uttrycker det transgene av intresse i ett spatiotemporal mönster dikteras av promotorn som kontrollerar GAL4 uttryck (figur 1). Fenotyper som visas av avkomman av förar-responder kors kan bedömas för att klargöra funktionen av kandidat gener. Även om D. melanogaster har använts för att undersöka gener från andra organismer4,5,6,7, har GAL4-UAS-systemet nu anpassats för användning i insekter av medicinsk och jordbruks betydelse för att ge direkt analys av arten av intresse 8,9,10,11,12,13,14.

I den afrikanska malariamyggan, Anopheles gambiae, testades GAL4-UAS-systemet först av cellinjen co-transfection9. Flera konstruktioner analyserades för effektivitet i olika parvisa kombinationer och fann att 14 tandem upprepade UAS kompletteras med en liten konstgjord intron (UAS-14i) visade det bredaste utbudet av aktiveringspotential när den används med en panel av GAL4 förare. För att demonstrera in vivo-funktionalitet användes dessa konstruktioner sedan för att skapa två separata transgena An. gambiae-linjer genom PiggyBac transformation8: en förarlinje som bär GAL4 som drivs av en midgutspecifik promotor och en responderlinje som innehåller både luciferas och förbättrade gula fluorescerande proteingener (eYFP) under reglering av UAS-sekvenser. Gut specifika luciferas aktivitet och fluorescens i avkomman anges att systemet var effektivt i Anopheles. Sedan dess har förarlinjer skapats som uttrycker transgener i andra vävnader som är viktiga för vektorkapacitet och insekticidbeständighet, inklusive äggocyter15 och hemocyter16, och i ett nära allestädes närvarande mönster10. Många UAS linjer har också genererats för att analysera gener som tros vara inblandade i metabolism och bindning medierad insekticid resistens, cuticular kolväte syntes och att fluorescerande märka olika cell- och vävnadstyper (tabell 1). För responderlinjerna utförs platsstyrd integration av transgenen nu av ΦC31 katalyserad rekombinationskassettutbyte17,18 för att fixa det genomiska sammanhanget för de UAS-reglerade generna. På detta sätt normaliseras transgene uttryck när det gäller genomisk insättning plats, vilket möjliggör mer exakt jämförelse av de fenotypiska effekterna av olika kandidat gener.

De svarande linjer som skapats hittills är utformade för att antingen uttrycka transgen antingen på förhöjda nivåer eller för att minska genuttrycket genom RNA-interferens (RNAi). Vanligtvis cDNA kloner smälts till UAS sekvensen för att generera lämpliga uttryck plasmider, men full genomiska sekvenser är också genomförbara förutsatt att de inte är för stora för kloning. För att generera ljuddämpningskonstruktioner har vi använt tre olika metoder för att få lämpliga tandem inverterade sekvenser som bildar hårnålsdsRNA som stimulerar RNAi. Dessa har inkluderat fusion PCR, asymmetrisk PCR och kommersiell syntes av hårnål konstruktioner. Gemensamt för varje metod är införandet av en intronsekvens mellan de inverterade sekvenserna för att ge kloningsstabilitet. Responderplasmider i vilka en gen av intresse/RNAi konstruktion kan sättas in har utvecklats15. Dessa plasmider bär också de nödvändiga ΦC31 attB-platserna för RMCE (beskrivs i Adolfi medföljande JoVE-papper som beskriver RCME-tekniken i detalj). Protokoll som täcker de viktiga steg som krävs vid val av sekvens för införande i en av dessa plasmider för överuttryck ingår i detta manuskript. Dessutom beskrivs och illustreras två protokoll för RNAi hårnål konstruktion skapande.

När man skapar nya linjer är identifiering av sällsynta transgena individer avgörande att odla från för att etablera och upprätthålla transgena kolonier. Viktigast av allt för GAL4-UAS-systemet är det nödvändigt att skilja responder- och förarlinjerna för att upprätta kors och identifiera enskilda avkomlingar som bär båda transgenerna. Detta uppnås genom att använda olika dominerande valbara markörgener kopplade till drivrutins- och svarande kassetter. Oftast är dessa fluorescerande markörgener som är tydligt urskiljbara med optiska filter (t.ex. eYFP, eCFP, dsRed). Det är viktigt att markörer uttrycks i ett känt och tillförlitligt spatiotemporal mönster eftersom detta gör identifiering av avvikelser och förorening lättare. Fluorescerande markör genuttryck regleras rutinmässigt av den syntetiska 3xP3 promotorn, vilket orsakar öga och ventrala ganglier specifika uttryck i alla stadier av An. gambiae utveckling19. Fluorescerande markörer som styrs av 3xP3 ingår i alla omvandlingsplasmider som beskrivs i denna artikel. Ett protokoll som beskriver de vanliga metoderna som används för att screena fluorescerande An. gambiae pupae GAL4-UAS linjer ingår här.

En av de viktigaste delarna i GAL4-UAS-systemet är behovet av att korsa de differentiellt markerade förar- och svarandelinjerna. För att göra detta måste hane och kvinnor från varje linje separeras före parning. Vuxna kan dock lätt urskiljas genom syn, men för att upprätta genetiska kors är det klokt att separera könen före vuxenuppkomsten för att säkerställa att parning inte har skett. Den allmänna storleksskillnaden mellan manligt och kvinnligt An. gambiae pupae är för varierande för att vara en effektiv och pålitlig metod för könsbestämning20. Istället ger tydliga morfologiska skillnader i de yttre könsorganen en tillförlitlig grund för sexing i An. gambiae. I den här artikeln beskriver vi en pålitlig metod för sexing An. gambiae pupae för att ställa in lämpliga kors.

Figure 1
Figur 1 - Diagrammatisk framställning av processen för användning av tvåparts-GAL4-UAS-systemet i Anopheles gambiae. (A) Huvudkomponenterna i en exempelvektor (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]) avbildas och beskriver tillgängliga begränsningsplatser (EcoRI, NheI, XhoI och NcoI) inom de flera kloningsplatser som är lämpliga för användning för att sätta in hårnålskonstruktionen eller kodningssekvensen för den av intressegenen. Dockningslinjens struktur avbildas också. (B) Gränssteget illustreras som anger användningen av hanar från förarlinjen (som transporterar GAL4-föraren av en initiativtagare av intresse och eCFP som drivs av 3xP3-promotorn) och kvinnor från den svarande linjen (som bär den gen av intresse eller hårnålskonstruktion som kontrolleras av en UAS-promotor och en eYFP-markör som kontrolleras av 3xP3-promotorn). C) En diagrammatisk framställning av GAL4 drivande uttryck av genen av intresse för avkomman av korset i B och en lista över några av de typiska fenotyper som bedöms. Förkortningar: Multiple Cloning Site (MCS), Recombinase medierat kassettutbyte (RMCE), Upstream Activator Sequence (UAS), förbättrat gult fluorescerande protein (eYFP), förbättrat cyan fluorescerande protein (eCFP). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Det är användningen av kors som ger GAL4-UAS-systemets tvåpartskaraktär, som har tydliga fördelar jämfört med mer linjära metoder. Till exempel kan många fler kombinationer av förar- och svarande linjer bedömas än vad som skulle vara möjligt om en ny transgen linje måste genereras och bibehållas för varje promotor/genkombination. Ännu viktigare är att det tillåter analys av gener som producerar dödliga eller sterila fenotyper när deras uttryck är stört som är svåra att skapa /underhålla i ett linjärt system. Sådana dödliga fenotyper kan manifestera sig i alla utvecklingsstadier, beroende på genfunktionen och spatiotemporal uttryck, men observeras oftast under embryonal utveckling. Visualisering av myggembryonutveckling kräver att man rensar den ogenomskinliga chorion som täcker äggen. Efter metoder som beskrivs i Trpiš (1970)21 och Kaiser et al. (2014)22 beskriver vi de protokoll vi använder för att fixa embryon, samtidigt som den strukturella integriteten upprätthålls och blekning för att rensa endochorion som möjliggör mikroskopisk visualisering och avbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Konstruktion och konstruktion av UAS-konstruktioner

  1. Design och montering av vektorer för kandidatgenuttryck
    1. Bestäm sekvensen som ska användas för uppreglering av kandidatgenen.
      1. Sekvens cDNA/gDNA från intressebelastningen och jämför den med den publicerade sekvensen för att verifiera dess identitet och identifiera potentiella SNPs och begränsningsplatser för diagnostisk sammandrag.
      2. Se till att den främre primern som används för genförstärkning täcker den ursprungliga Kozak-sekvensen och startar kodon, där så är lämpligt. En primer med ~10 bp bindning uppströms start kodon kommer att omfatta Kozak sekvensen.
      3. Inkludera stop codon i fragmentet som förstärks från den omvända primern under de flesta omständigheter. Använd 3' termineringssekvenser som tillhandahålls i de beskrivna plasmidvektorerna, eller förstärka från kandidatgenens genomiska sekvenser.
      4. Beställ kommersiella sekvenser med specifik kodonbias om så önskas.
    2. Använd standardprocedurer för subkloning för att föra in genkassetter i UAS-plasmidvektorer, t.ex. pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15 (figur 1) för både upregulation och RNAi-konstruktioner.
    3. Producera transgena myggor skapade med hjälp av ΦC31 rekombination medierad kassettutbyte10,17,18,23.
  2. Skapande av RNAi hårnålskonstruktioner: enstegsförstärkning med asymmetrisk PCR15,24
    1. Extrahera genomiskt DNA (gDNA) från vuxen hona An. gambiae som bär den önskade kandidatgenen med livakmetoden25.
      1. Designa den främre primern för att binda till målexon vid 5' av det önskade fragmentet riktat mot den närliggande intronen. Designa 3' änden av en broprimer för att binda till slutet av föregående exon för att förstärka intronen. 5' änden är ett komplement till ett litet fragment av målexon omedelbart efter intronen.
    2. Kör en asymmetrisk PCR-reaktion som beskrivs i Xiao (2006)24 (figur 2).
    3. Klona den renade PCR-produkten till en lämplig vektor som bär UAS-promotorn (t.ex. pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15).
      OBS: Enzymer inom det flerfaldiga kloningsstället som är lämpliga för pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] kloning15 och nästa steg som krävs anges i figur 1. En enzymsammandrag är viktigt eftersom endast en begränsningsplats tillsätts. Defosforylering av plasmiden kommer att förbättra kloningseffektiviteten.
  3. Konstruktion av RNAi hårnål konstruktioner: Fusion PCR av cDNA och gDNA15
    1. Extrahera genomiskt DNA (gDNA) från vuxen hona An. gambiae som bär den önskade kandidatgenen med livakmetoden25.
      1. Inkludera gDNA i en PCR-reaktion för att förstärka målområdet för exon- och intronsekvenserna tillsammans (figur 2).
      2. Designa 3' änden av den främre primern för att binda till den omvända mål exon-sekvensen för att förstärka mot målintronsekvensen och 5' änden för att bära en begränsningsplats för att underlätta kloning.
      3. Design omvänd primer (1) för att binda till 5' änden av intronen och 5' ändöverhänget bär de första baserna i den främre sekvensen av den närliggande exon. Detta överhäng används i fusion PCR.
      4. Rena önskad reaktionsprodukt.
    2. Extrahera RNA, ta bort DNA med DNases och förbereda cDNA från vuxna kvinnliga An. gambiae bär önskad kandidat gen enligt tillverkarens protokoll.
    3. Använd cDNA i en PCR-reaktion för att förstärka exons målområde (figur 2).
      1. Designa framåt primer (2) så att 3' änden binder i 3' slutet av den kompletterande mål exon sekvensen och 5 ' slutet av primern bär en begränsningsplats för användning vid kloning.
        OBS: Den främre primern från 1.3.1.2 kan användas igen i denna andra reaktion. Detta kommer dock att innebära att en enda enzymsammandrag är nödvändig. Att använda en andra främre primer med en annan begränsningsplats möjliggör dubbel sammandrag vilket kan öka kloningseffektiviteten.
      2. Design omvänd primer (2) - 3' änden binder till 5' änden av den närliggande exon som förstärker målexon. 5'-änden binder till 3' änden av intronernas främre sträng. Detta överhäng används i fusion PCR.
      3. Rena önskad reaktionsprodukt.
    4. Inkludera produkterna i steg 1.3.1 och 1.3.2 som mallar för en fusion PCR-reaktion med standardkoncentrationer med Framåt primers 1 och 2. Rena önskad produkt.
    5. Smält den renade produkten för att generera överhängen för kloning. Klona till en lämplig vektor nedströms UAS-promotorn. Lämpliga enzymer för pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] kloning15 och nästa steg som krävs anges i figur 1.

Figure 2
Figur 2 - Diagrammatisk representation av skapandet av RNAi konstruktioner för införande i pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] med två metoder: (A) Ettsteg asymmetrisk PCR (anpassad från Xiao. Y H et al (2006) och (B) flerstegs fusion PCR. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

2. En screening av gambisk puppar

  1. Samling av puppar för mikroskopisk karakterisering
    OBS: Genom dessa protokoll avser vatten destillerat vatten kompletterat med 0,01% dammsalt.
    1. Bakre An. gambiae myggor som använder standardprotokoll (t.ex. MR426) till pupalstadiet.
      VARNING: Var försiktig så att du inte skadar puppar under hela denna process.
    2. Samla puppar på en klar platt skål som är lämplig för användning med ett stereomikroskop (t.ex. en 100 x 15 mm petriskål av plast, undvik kanterna).
      OBS: För att samla puppar använder vi en 3 ml plast Pasteur pipetter med ca 10 mm skuren från slutet för att bredda änden och förhindra skador på myggorna. Screening och sexing kan slutföras på individer, men det är mycket långsamt. Det rekommenderas att utföra screening och sexing på grupper på 50-200 puppar (storleken på den möjliga gruppen begränsas av storleken på den maträtt som används och är föremål för personliga preferenser). Om ett stort antal screenas kan effektiviteten ökas genom att först justera puppar ca 4 till 5 djupt i linjer och flytta målpuppar ut ur denna linje.
    3. Använd en Pasteur-pipett och ta försiktigt bort nästan allt vatten från runt poppen. Lämna precis tillräckligt med vatten runt puppar så att de är effektivt immotila men kan enkelt flyttas med en fin borste. Om de blir svåra att flytta, tillsätt mer vatten.
      OBS: När tillräckligt med vatten avlägsnas kommer popparna att ligga på deras sida, vilket möjliggör visualisering av ögon för fluorescensdetektering och identifiering av dimorfa könsorgan (figur 4DE).
      VARNING: Se till att puppar inte torkas. Om endast en mycket liten volym vatten lämnas kan det minska ytterligare med värmen från mikroskopets lampa och när den delas mellan pooler av poppar. Ytterligare vatten måste ibland tillsättas under processen med hjälp av en 3 ml Pasteur-pipett till önskad grupp(er).
  2. Identifiering av fluorescerande markörer i puppar
    OBS: Användningen av ett stereoskop med låg förstoring möjliggör bred fältscreening, sortering kan göras på ett inverterat sammansatt mikroskop, men måste göras individuellt.
    1. Vid screening för en fluorescerande markör är det först avgörande att känna till de förväntade mönster av uttryck och arv. Tänk på följande:
      1. Färg:vilka filter som ska visualiseras.
      2. Spatiotemporal uttrycksmönster: Förstå var och i vilket livsstadium du förväntar dig att se uttryck.
      3. Förhållande mellan olika fenotyper: fastställa vilken procentandel av befolkningen som ska bära markörer av intresse.
    2. Utför fluorescerande screening i mörker, eftersom även lågt ljus kan störa fluorescensupplösningen. Använd dock en lampa bredvid stereoskopet när ljus krävs för andra manipuleringar.
      VARNING: Se till att arbetsytan runt det fluorescerande stereoskopet är klar innan du släcker lamporna.
    3. Slå på fluorescerande glödlampa och låt värmas upp under tillverkarens rekommenderade period (Normalt 10-15 min). Välj önskat filter på det fluorescerande stereoskopet och kontrollera att det finns en färgad ljusstråle som riktas mot mitten av scenplattan. Om detta inte är synligt eller är mycket svagt kanske lysrören inte har värmts helt, slutaren är stängd eller mikroskopoptiken är inte väl anpassad.
    4. Använd vitt ljus, centrera popparna i synfältet och få dem i fokus. Denna förstoring kan behöva ändras vid växling mellan olika filter beroende på fluorescensintensiteten.
    5. Använd en fin detaljerande pensel för att säkerställa att den undersökta puppar inte överlappar varandra.
    6. Stäng av stereoskopets vita ljus och använd det fina fokuset för att sätta området av poppen som bär fenotypen av intresse i fokus. Det fluorescerande mönstret ska vara synligt. Exempel på 3xP3 promotorstyrd fluorescens finns i figur 3.
      1. Använd den lägsta förstoringen vid vilken den förväntade fluorescerande fenotypen på ett tillförlitligt sätt kan särskiljas från individer utan fluorescen.
      2. För stammar med ljus fluorescens använd ett lågintensivt ljusfältsljus även vid screening, om den fluorescerande signalen fortfarande är tydligt identifierbar.
      3. När den primära screeningen är klar ska du snabbt skanna populationer under andra filter för att upptäcka potentiell kontaminering.
        VARNING: Se till att det finns ett tydligt avstånd mellan grupperna av sorterade puppar för att förhindra kontaminering genom popparrörelse. Var medveten om att storleken på grupperna kommer att förändras när puppar är könsbestämmade och att avstånden kan se större ut när man tittar under förstoring. Var särskilt försiktig när poolerna inte är inom synfältet.

Figure 3
Figur 3 - Anopheles gambiae pupae som uttrycker fluorescerande markörer som drivs av 3xP3-promotorn (A) eYFP, B) dsRed och (C) eCFP. Förstoring: A=16X, B,C=20X.

  1. Sexing Pupae
    1. Samla puppar. Ta bort överflödigt vatten, men ge tillräckligt så att analpaddlarna skiljs något från könsorganen för att underlätta visualisering och morfologisk karakterisering (figur 4D,E).
    2. Om någon pupa/e inte är på sin sida, använd en fin detaljerande pensel för att försiktigt vrida poppan och flytta analpaddlarna så att yttre könsorgan kan identifieras.
    3. Separera puppar baserat på distinkta yttre könsorgan; hanar har ett långt rör som extruderar från det slutliga dorsala segmentet ungefär hälften av analpaddlarnas längd (figur 4B). De yttre könsorganen hos honavalpar är betydligt kortare och bifurcate (figur 4A).
      OBS: Ibland, om den 4: e instar larval exoskelett förblir fastsatt eller de yttre könsorganen är skadade (figur 4C), är säker identifiering av könet svårare. När en pupas kön inte är klart är det bästa praxis att kassera det. Om individen ska hållas, bör poppan tillåtas dyka upp isolerat och dess kön bestäms med hjälp av vuxna morfologiska egenskaper. Det är troligt att om dess könsorgan skadas kan individen inte kompisera framgångsrikt.
    4. Gör en pool för varje kön i motsatt ände av skålen till den osexade poolen, flytta identifierad puppar över skålen med en fin detaljerande pensel. Märk undersidan av skålen där de två poolerna kommer att samlas för att identifiera dem senare.
    5. När både sexning och fluorescerande screening krävs, utför fluorescerande screening först, eftersom det är den snabbare processen av de två.

Figure 4
Figur 4 - Sexing Anopheles gambiae puppar. Enskilda puppar som anger de yttre könsorganen hos (A) en hona (B) en hane och C) en individ som inte lätt kan identifieras på grund av ofullständig avskildhet av larvexoskelettet. Förstorade bilder nedan som belyser de yttre könsorganen. Puppar med ♀ (hona) och ♂ (hane) som indikerar de yttre könsorganen hos puppar med (D) ~ 50% av poppan nedsänkt i vatten och med (E) allt vatten borttaget som belyser skillnaden i enkel visualisering av de yttre könsorganen. Förstoring: A,B,C=40x, D,E=30x. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

  1. Sexbekräftelse som vuxna
    1. Tills en mycket låg felfrekvens har visats, bekräfta pupae sexing av vuxna morfologi efter uppkomsten. Separera könsbestämmade puppar i grupper om 10 eller mindre i ett klart 20 ml-rör med några ml vatten, försegla med en boll bomullsull, märkt med det förväntade könet och låt dyka upp över natten.
      OBS: Eftersom vuxna överförs följande morgon är det inte nödvändigt att förse nya vuxna med mat.
    2. Bekräfta könet på uppkomna vuxna med morfologiska funktioner följande dag.
    3. Om några män finns i kvinnliga samlingar, kassera kvinnorna, om parning redan har inträffat.
    4. Om några honor finns i manlig samling, ta bort honan/honan/honan och håll hanarna för korsning.
  2. Konfigurera GAL4-UAS-systemkors
    1. Aspirera önskat antal manliga och kvinnliga vuxna från rören i steg 2.4 i en bur eller liten hink som ställts in på standard sätt för An. gambiae uppfödning.
      OBS: Var försiktig så att inte de vuxna skadas under denna överföring.
    2. Använd cirka 50 honor med lika många män, när ~ 2000 vuxna krävs från avkomman.
      OBS: Där ett kors ska matas flera gånger för att generera flera partier upp till 200 av varje kön kan ställas in i 30 cm x 30 cm x 30 cm burar. När endast ett litet antal kvinnor (<20) är tillgängliga för korset lägger vi till ~ 4x antalet män för att öka sannolikheten för framgångsrik parning.
    3. Blod matar de korsade honorna och bakre avkomman till lämpligt stadium, enligt standardprotokoll26, för att utföra fenotypisk bedömning (t.ex. insekticidbeständighet, vektorkapacitet och fitnesskostnadsanalyser).
    4. Om moderns effekt av transgene uttryck är sannolikt, inrätta ömsesidiga kors av föraren och responder linjer och analys förväntas fenotyp.
      OBS: Kors med hjälp av "heterozygous" eller blandade populationer av förar- och svarande linjer, producerar avkomma med var och en av 4 möjliga genotyper. Detta ger vild typ, endast UAS och GAL4 endast kontroller, liksom transheterozygotes GAL4-UAS för att analysera fenotyp. Om homozygous populationer korsas, inrätta ytterligare kors för att tillhandahålla lämpliga kontroller för att jämföra fenotyper. Avkomman bör screenas ovan och separera avkomman som bär både eller endast endera markören, liksom negativ, för fenotypisk bedömning.
  3. Upprättande av homozygous populationer från linjer som genereras genom RCME med alternativa fluorescerande markörer
    OBS: Det är viktigt att fluorescerande markör för båda linjerna finns på samma genomiska plats och de är helt urskiljbara.
    1. Sätt upp ett föräldrakors på cirka 200 vuxna med lika många differentialmärkta män av en linje och kvinnor i den andra linjen efter screening för att välja individer som visar korrekt fluorescens och kön, som beskrivits ovan. Ungefär en vecka senare matar blodet korset med hjälp av etablerade protokoll26.
      1. Upp F1-avkomman till puppar med hjälp av standardprotokoll och samla in puppar enligt beskrivningen tidigare.
    2. Skärm för fluorescens som väljer de som bär båda föräldramarkörerna (transheterozygous). Sätt upp en F1-intercross med dessa puppar.
    3. En vecka senare matar blodet F1-honorna och bakre avkomman till pupalstadiet enligt standardprotokoll.
    4. Screena F2-puppar och välj de som bara visar en av markörerna. Dessa kommer att vara homozygous för införandet. Endast 25% av avkomman kommer att vara homozygous för varje insättning, så se till att tillräckligt med avkomma föds upp för att ge en lagerbur (400-500).
      OBS: Valet av transheterozygous avkomma måste vara helt rigoröst annars blir processen förorenad, och fullständig homozygositet kan inte uppnås. Dubbelkolla alla avkomtecken som valts för F1-intercrossen.

3. Ett protokoll för clearing av gambiska embryon

  1. Blodmatning och underhåll
    1. Bakre An. gambiae myggor till vuxna enligt standardprotokoll (t.ex. MR4).
    2. Blodfoder 5-7 dagar gamla kvinnliga vuxna, vilket säkerställer att de flesta är helt engorged.
      VARNING: Genom hela detta protokoll arbetar snabbt för att säkerställa att ägg inte får torka.
  2. Inducerad äggläggning
    1. 3 dagar efter blodmatning samla ägg genom inducerad läggning.
    2. Montera ovipositionskammaren.
      1. Fyll ovipositionsgrytan med vatten till ett djup av ca 5 mm. Fäst potten i ena änden av ett 50 ml polypropylenrör, tidigare skuren med en hacksåg så att båda ändarna är öppna. (Vi använder en plastskiva för en kruka (bild 5); men det ursprungliga locket på röret kan användas istället).
      2. Täck den andra änden av det skurna polypropylenröret med material (slang/strumpbyxor) eller delar av latexhandsken säkrade med ett elastiskt band, så att vuxna kan introduceras men inte kan fly (figur 5). Andra alternativa ovipositionskammare finns och kan användas26.
    3. Introducera försiktigt 10-15 honor (blod som matas i steg 3.1.2) till ovipositionskammaren. Täck ovipositionskammaren för att producera mörker och lämna i 20 minuter.
      VARNING: Undvik att flytta ovipositionsgrytan när ägg har lagts för att förhindra strandning och uttorkning av ägg.
    4. Ta försiktigt loss 50 ml polypropylenrör från ovipositionsgrytan, samtidigt som man säkerställer att myggorna inte frigörs. Vita ägg ska vara synliga. Kontrollera att tillräckligt har lagts för förbjudet ändamål. Upprepa om det behövs.
    5. Täck potten (för dammskydd) och låt ägg mogna till utvecklingsstadiet av intresse.
    6. Använd en fin detaljerande pensel för att plocka upp ägg från potten och placera dem på vatten i ett 40 mm2 utgrävt glasblock.

Figure 5
Figur 5 - Exempel på en Ovipositionskammare (A) demonterad för att markera komponenterna och (B) monterade. Klicka här för att se en större version av den här figuren. 

  1. Embryofixering
    VARNING: Utför alla fäststeg (steg 3.3) i en rökhuv på grund av användning av formaldehyd.
    1. Förbered FAA-lösningen enligt beskrivningen i Kaiser et al. (2014)22. FAA består av 3,6 M formaldehyd, 0,87 M ättiksyra och 8,5 M absolut etanol som består av volym med destillerat vatten (dH2O).
      1. För 10 ml FAA kombinera 2,68 ml 13,42 M formaldehyd, 4,96 ml 17,14 M etanol och 0,5 ml 17,4 M ättiksyra med 1,86 ml destillerad H2O. Fixativ kan förvaras i minst 3 månader i en tätt förseglad glasbehållare, förvarad i en särskild kemikalieskåp.
    2. Ta försiktigt bort vattnet från glasblocket med en mikropipette och täck ägg i 500 μL FAA och sväng försiktigt (~ 25 RPM) på en orbital shaker vid rumstemperatur i 30 minuter. Ingen färgförändring visas just nu.
    3. Skölj ägg noggrant med destillerat vatten. Utför sköljning 15 gånger för att ta bort alla spår av formaldehyd. Använd en 1000 μL mikropipette, tillsätt och ta sedan bort 1 ml dH2O åt gången och se till att äggen inte skadas när du gör det.
    4. Förvara avloppsvatten från sköljningar i en angiven behållare för kasserande av formaldehyd för bortskaffande enligt säkerhetsriktlinjerna.
    5. Vid denna tidpunkt kan fasta ägg lagras vid 4 °C över natten i vatten för att hålla dem hydratiserade.
  2. Embryoblekning
    VARNING: Utför alla blekningssteg (steg 4) i en rökhuv på grund av den potentiella frisättningen av klorgas när natriumhypoklorit och ättiksyra kombineras.
    1. Förbered blekningslösning (Trpišlösning - beskriven i Trpiš (1970)21 och modifierad enligt Kaiser et al. (2014)22). Trpiš lösning är 0,59 M natriumhypoklorit och 0,35 M ättiksyra upplöst i destillerad H2O.
      1. För en 10 mL ovolume Trpiš lösning, kombinera 2,68 ml 2,2 M natriumhypoklorit och 0,2 ml 17,4 M ättiksyra med 7,12 ml destillerad H2O.
        OBS: Trpiš lösning kan förvaras i minst 3 månader i en tätt förseglad glasbehållare och förvaras i ett säkert kemiskt skåp. Lösningen kan behöva virvlas efter lagring och bör alltid öppnas i en rökhuv vid utsläpp av klorgas.
    2. Täck fasta ägg med 1 ml Trpiš-lösning och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter. Ägg kommer att börja utveckla bleka fläckar efter cirka 5 minuters inkubation, så småningom når en mjölkvit färg när den har rensats.
    3. Skölj ägg enligt steg 3.3.3 för att avlägsna Trpiš lösning.
    4. Förvara avloppsvatten i en angiven avfallsbehållare och kasta med överflödigt vatten i avloppet.
  3. Lagring
    1. Förvara i 500 μL dH2O och håll mellan 2-8 °C i några dagar. Ta bort det mesta av vattnet noggrant före visning och avbildning på massa men undvik uttorkning av äggen genom att lämna en liten mängd vatten i klockglaset. Detta kommer inte att störa fotograferingen av äggen. Enskilda ägg kan placeras på mikroskopbild för högre förstoringsavbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3xP3 uttryck av eYFP, dsRed och eCFP ger tillförlitlig, lätt urskiljbar identifiering av individer som har markörgener som producerar uttryck i ögon och ventrala ganglier i An. gambiae pupae (figur 3). Den differentialmorfologi som observerats i manliga och kvinnliga yttre könsorgan som används för sexing och ett exempel på en oidentifierbar puppar markeras i figur 4. Avlägsnande av allt vatten från poppar ökar könssvårigheterna eftersom analpaddlar döljer visualisering av könsorgan (figur 4D, E). Bipartite GAL4-UAS-systemet tillåter modifiering av genuttryck på ett kontrollerat spatio-temporalt sätt som kan visualiseras genom att korsa de allestädes närvarande (figur 6A, C) och oenocytdrivrutinen (figur 6B,D) linjer med responderlinjen UAS-mCD8:mCherry10. De morfologiska egenskaper som observerats i olika stadier av embryonal utveckling vid 12, 24 och 36 h efter läggning är tydliga efter det att protokollnummer 3 har slutförts (figur 7).

Figure 6
Figur 6 - Vävnadsspecifik uttrycksvisualisering. (A, B) Larver och (C, D) vuxna som uttrycker mCherry som drivs av (A, C) allestädes närvarande och (B, D) oenocytspecifika förarlinjer. Förstoring: A,B=32X, C=25X, D=40X. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7 - Exempelresultat för embryorening. Bilder av embryon enligt det beskrivna protokollet (A) 12, (B) 24 och (C) 36 timmar efter ovipositionen och (D) ett misslyckat försök med hushållsblekmedel där överblekning orsakade missfärgning och sprängning av embryon. Förstoring: 50x. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Typ Linje Innehåll 3xP3-markör Beskrivning Källa
Svarare mCherry UAS-mCD8:mCherry eCFP, eYFP Uttrycker mCherry-kodningssekvensen när den korsas med en drivrutinslinje Adolfi. A et al (2018)
16i UAS-RNAi cyp4g16 eYFP Innehåller en RNAi hårnål konstruktion som riktar sig till cyp4g16 som uttrycks och orsakar knockdown av cyp4g16 när den korsas med en förarlinje Lynd. A et al (2020)
17i UAS-RNAi cyp4g17 eYFP Innehåller en RNAi hårnål konstruktion som riktar sig till cyp4g17 som uttrycks och orsakar knockdown av cyp4g17 när den korsas med en förarlinje Lynd. A et al (2020)
M2 UAS-cyp6m2 eYFP Uttrycker cyp6m2 när den korsas med en förarlinje Adolfi. A et al (2019)
P3 UAS-cyp6p3 eYFP Uttrycker cyp6p3 när den korsas med en förarlinje Adolfi. A et al (2019)
e2 UAS-GSTe2 eYFP Uttrycker GSTe2 när den korsas med en förarlinje Adolfi. A et al (2019)
SAP2 UAS-Sap2 eYFP Uttrycker Sap2 när den korsas med en förarlinje Ingham. V et al (2019)
FAS1899i UAS-RNAi FAS1899 eYFP Innehåller en RNAi hårnål konstruktion som riktar fas1899 som uttrycks och orsakar knockdown av FAS1899 när den korsas med en förarlinje Grigoraki. L et al (2020)
3050i UAS-RNAi Desat3050 eYFP Innehåller en RNAi hårnål konstruktion som riktar sig till Desat3050 som uttrycks och orsakar knockdown av Desat3050 när korsas med en förarlinje Grigoraki. L et al (2020)
Wnd UAS-eYFPnls-luc eCFP När eYFP korsas med en GAL4-linje uttrycks den. Genereras med piggybac (MR4-kod: MRA-1165) Lynd. A et al (2011)
Mbl UAS-eYFPnls-luc eCFP När eYFP korsas med en GAL4-linje uttrycks den. Genereras med piggybac (MR4-kod: MRA-1164) Lynd. A et al (2011)
Dockning A11 VG-LRIM1 eCFP Transport av erforderliga dockningsplatser som krävs för ΦC31-medierat kassettutbyte Lynd.A et al (2019)
Drivrutin + dockning A10 Ubi-A10 GAL4 eCFP Innehåller transkriptionsfaktorn GAL4 kodningssekvens som styrs av genen An. gambiae Polyubiquitin-c (PUBc). Har även de attP-dockningsplatser som krävs för ΦC31-medierat kassettutbyte Adolfi. A et al (2018)
Chaufför Gareth Oenocytförstärkare-GAL4 dsRed Uttrycker GAL4 som kontrolleras av en oenocytspecifik förstärkare Lynd. A et al (2012)
hml- GAL4 hml-GAL4-hml- GAL80 eYFP-nls Uttrycker GAL4 och GAL80 drivna av en hemocytspecifik promotor Pondeville. E et al (2020)
F karboxypeptidaspromotor - GFY-GAL4 dsRed Uttrycker GAL4 i midgut och när det korsas med en UAS-linje kommer att uttrycka YFP. Genereras med piggybac (MR4-kod: MRA-1167) Lynd. A et al (2011)
Dgl karboxypeptidaspromotor - GFY-GAL4 dsRed Uttrycker GAL4 i midgut och när det korsas med en UAS-linje kommer att uttrycka YFP. Genereras med piggybac (MR4-kod: MRA-1166) Lynd. A et al (2011)

Tabell 1 - Publicerade rader med tabelllista, korta beskrivningar och referensen för skapandemetoden beskrivs. Katalognumren för rader som för närvarande lagras i MR4-databasen anges i beskrivningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Att förstå mygggenfunktionen är avgörande för att utveckla nya metoder för att kontrollera Anopheles och påverka malariaöverföringen. GAL4-UAS-systemet som beskrivs är ett mångsidigt och kraftfullt system för funktionell analys av kandidatgener och hittills har vi använt systemet för att undersöka den genetiska grunden för insekticidresistens17 och cuticular kolväteproduktion15,23, samt för att fluorescerande märka olika myggcellspopulationer8 . Hittills har svarskonstruktioner genererats genom begränsningsenzymkloning i en plasmid, som bär en flera kloningsplats nedströms UAS (figur 1, tabell 1). Men på grund av den modulära karaktären hos konstruktionerna som bär flera element (attB-platser, 3xP3-YFP och zigenarisolatorsekvenser) är mer moderna tekniker möjliga för att konstruera nya responderplasmider. Vanligtvis kan sekvenser för överuttryck förstärkas från cDNA eller gDNA med PCR, men kommersiell syntes kan ibland minska arbetet och tiden som är involverad i att generera nya konstruktioner. Det är viktigt att sekvensera målgenerna när de har förstärkts från respektive mallar för att validera identitet och identifiera potentiella SNPs. Detta är särskilt relevant när man kommersiellt syntetiserar DNA eftersom det inte rekommenderas att enbart förlita sig på databaskommentarer.

Att generera sekvenser för RNAi-konstruktioner är ofta mer komplext på grund av kravet att klona en inneboende instabil inverterad upprepning av målsekvensen för dsRNA-bildandet av hårnålsprodukten. Denna kloning uppnås ofta genom att inkludera en intronsekvens mellan repetitionerna för att möjliggöra stabil replikering i Escherichia coli och effektiv splitsning i myggan27. Förstärkning av hårnålskonstruktioner med asymmetrisk PCR är effektiv på grund av enstegsnaturen. I tidiga cykler av asymmetrisk PCR förstärks strängen som förstärks av den främre primern företrädesvis eftersom denna primer levereras till reaktionen i överskott (2x koncentration av broprimer). Denna produkt ackumuleras som enstaka strängar. Den 3' änden av dessa strängar kompletterar början av målexon. I mitten av fascyklerna bildas en slinga som de kompletterande 3' endglödlorna till början av målexon. När detta inträffar förstärks målexons kompletterande sekvens från 3' änden som genererar en produkt [inverterad exon: intron: exon]. I sena cykler förstärks denna slutprodukt av den främre primern och kan lätt isoleras och klonas. En liknande inverterad upprepad konstruktion kan framställas genom fusion PCR28 enligt figur 2. För båda metoderna måste dock en lämplig målplats som uppfyller de egenskaper som krävs för RNAi24 ligga i direkt anslutning till en intron av lämplig storlek för kloning. När ett lämpligt mål inte är tillgängligt kan en modifierad fusion PCR eller kommersiell syntes användas där de inverterade sekvenserna smälts samman med en intronsekvens som tre separata fragment i en PCR-reaktion respektive i silico. Vi har framgångsrikt använt den 4: e intronen av Drosophila vit genen som en klyvning spacer sekvens23. I det här fallet krävde företaget en distans (intron) med minst lika lång längd som målrepetitionssekvenserna för att möjliggöra effektiv syntes. Eftersom kostnaden för kommersiell syntes ökar med fragmentets storlek och komplexitet, syntetiseras vanligtvis endast hårnålen eller genfragmentet och klonas sedan till önskad vektor i motsats till syntes av hela plasmiden. När du använder kommersiell syntes för att generera konstruktioner för transgenes är det viktigt att komma ihåg att den förväntade sekvenskommentationen kan ha skillnader, såsom SNPs, jämfört med sekvenser som finns i labbstammar. Dessutom är det viktigt att överväga effekten av Kozak-sekvenser och se till att de ingår i den slutliga konstruktionen där det behövs29.

Som beskrivits ovan utökar separationen av GAL4- och UAS-komponenterna potentialen hos varje rad som tillåter utvärdering i kombinationer och analys av dödliga eller skadliga fenotyper. Till exempel observerades mycket olika resistensfenotyper när man uttryckte metaboliska enzymer allestädes närvarande, snarare än i tarmen eller äggcellerna, som tidigare troddes vara några av de viktigaste vävnaderna som ger insekticidresistens17. Dessutom har vävnadsspecifika uttryck/knockdown av gener som är involverade i produktion av kolväten belyst oenocyternas roll i larvutveckling och vuxen eclosion15,23. Framöver kan genereringen av förarlinjer med alternativa rumslig-temporala vävnadsspecifika GAL4-uttryck mycket väl förenklas med CRISPR-Cas-teknik. Tidigare förarlinjer genererades med begränsad kunskap om promotorsekvenser för att reglera uttryck och var ofta "hit and miss" i sin aktivitet, som ofta förvärras av positionseffekter. Detta kan övervinnas genom riktad insättning av GAL4 med en självklyvning peptid (såsom T2A)30 nedströms en målgen som bör producera uttryck för GAL4 på spatiotemporal sätt av den riktade genen31. Denna strategi har använts effektivt i D. melanogaster32, inklusive generering av ett bibliotek med lager som uttrycker GAL4 under kontroll av olika endogena promotorer33. Även om det inte testats i stor utsträckning i myggor ännu, och det finns anekdotiska frågor kring effektiviteten i co-expression, är mångsidigheten och anpassningsförmågan hos detta riktade tillvägagångssätt spännande.

Även när man använder sådana metoder för förarproduktion är sexning och screening av puppar på ett effektivt och tillförlitligt sätt grundläggande för användningen av GAL4-UAS-systemet i myggor. Protokollen som beskrivs här är robusta metoder för småskalig analys. När högre myggnummer krävs blir det mycket tidskrävande att manuellt screena för genotyp. Detta kan övervinnas genom att korsa homozygous förare och responder linjer så att alla avkomligheter kommer att vara transheterozygous, och därför inte kräver rigorös screening och separation. Det är ofta möjligt att skilja homozygous myggor baserat på intensiteten av markörfluorescens och därmed att korsa dessa för att producera stabila homozygous linjer. Effekten av denna metod är dock något beroende av användarens förtrogenhet med uttrycksmönster. Dessutom har vissa rader inte konsekventa, otvetydiga skillnader i uttryck när det gäller markörkopieringsnummer. Ett enklare sätt att generera homozygous linjer beskrivs i protokoll 2.6 och är tillämpligt när två linjer har genererats med olika fluorescerande markörer i samma genomiska locus (t.ex. genomΦC31  plats riktad omvandling till samma dockningslinje). Antingen eller båda linjerna kan på ett tillförlitligt sätt göras homozygous genom enkel korsning och screening. Metoden bygger på att kunna skilja mellan de olika fluorescerande markörerna och av de vanligaste markörerna kan eCFP, eYFP och dsRED entydigt diskrimineras med hjälp av lämpliga filteruppsättningar. Tyvärr överlappar utsläppsspektrat för eGFP avsevärt med eCFP och eYFP och kan i allmänhet inte användas tillsammans med dessa markörer, även om dsRED och eGFP gör en lämplig parning.

Högre genomströmning av analys kan också uppnås genom automatisk sortering av fluorescerande märkta larver. Detta har beskrivits med complex object parametrisk analysator och sorter (COPAS) maskin34, som fungerar på liknande sätt som en fluorescensaktiverad cellsorterare för att gate enskilda myggor baserat på deras marköruttryck. Metoden har också använts för att isolera differentiellt märkta hanar och honor34. På grund av storlek har större steg som puppar ännu inte framgångsrikt screenats med COPAS-systemet. Automatiserad sexsortering för vuxna med hjälp av video- och maskininlärningsalgoritmer har också utvecklats för storskaliga fältutgåvor35, men detta är ännu inte kostnadseffektivt för den skala som GAL4-UAS-systemtransgener vanligtvis används. Differentiellt märkta kön är ännu inte tillgängliga för GAL4-UAS myggor och därför manuell sexning som puppar är fortfarande nödvändigt för att utföra specifika kors. Metoden som beskrivs här för sexing pupae baserat på morfologiska skillnader i yttre könsorgan är robust. Det är dock föremål för operatörsfel och för praktikanter är det god praxis att bekräfta riktigheten av sex genom att observera om rätt vuxensex har isolerats. När du är säker på 100% noggrannhet kan popparna placeras direkt i parningsburen för att spara tid.

Vi beskriver också en anpassad metod för analys av embryoutveckling genom fixering och förtydligande av ägg efter exakt tidsinsamling. Våra tidigare försök att rensa embryon med hushållsblekmedel enligt beskrivningen i Goltsev, Rezende, et al.36, Rezende, Martins, et al.37, Vargas, Farnesi, et al.38 och Chang, Liu, et al.39, orsakade förbränning av embryona enligt figur 7D. Klorkoncentrationen i hushållsblekmedel kan variera avsevärt, så vi valde att använda högkvalitativa kemikalier. Vi har använt denna metod för att observera omfattningen av embryoutveckling efter genetisk modifiering av hormonell aktivering. Genom observation av det utvecklande embryot blev det tydligt att frånvaron av larvkläckning berodde på utvecklingsförändringar snarare än fertilitetsproblem hos vuxna. Liknande tekniker har använts för immuno-histochemistry och RNA hybridisering som beskrivs av Clemons, Flannery, et al.40 respektive Juhn och James 41. Som vi har visat har GAL4-UAS-systemet i An. gambiae visat sig vara ovärderligt för att undersöka särskilda aspekter av myggbiologi och utveckling, och de grundläggande protokollen som beskrivs för transgenedesign, fluorescerande screening, manuell pupparsexning och embryorening krävs för ett effektivt utnyttjande av detta viktiga system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi erkänner tacksamt finansiering från LSTM och IVCC (Adriana Adolfi), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (doktorandtjänst till BCP:MR/P016197/1), Wellcome (Sir Henry Wellcome Postdoktoral gemenskap till LG: 215894/Z/19/Z) som har införlivat Gal4UAS-analysen i förslagen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 x 15 mm plastic Petri dish SLS 2175546 Pack of 10
1000 µL Gilson Pipette Gilson F144059P
20/25 mL Universal Tubes Starlab E1412-3020 Pack of 400
3 mL Pasteur Pipettes SLS G612398 Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped
50 mL Falcon Tubes Fisher Scientific 11512303
Absolute Ethanol Fisher Scientific BP2818-500 500 mL
Acetic Acid SLS 45726-1L-F 1 L
Cages SLS E6099 30x30x30 with screen port
Fine Paint Brushes Amazon UKDPB66 KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)
Fish food Amazon Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L 
Formaldehyde Solution Sigma Aldrich F8775
Mouth Aspirator John Hock 612
Pond Salt Amazon Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L 
Pupae Pots Cater4you SP8OZ 250 pots with lids
Small Plastic Buckets Amazon 2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10) 
Sodium Hypochlorite Fisher Scientific S25552

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, A. H., Perimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Duffy, J. B. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Journal of Genetics and Development. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  3. Dow, J. A. ELS. , John WIley & Sons, Ltd. (2012).
  4. Edi, C. V., et al. CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Genetics. 10 (3), 1004236 (2014).
  5. Daborn, P. J., et al. Using Drosophila melanogaster to validate metabolism-based insecticide resistance from insect pests. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (12), 918-924 (2012).
  6. Riveron, J. M., et al. Genome-wide transcription and functional analyses reveal heterogeneous molecular mechanisms driving pyrethroids resistance in the major malaria vector Anopheles funestus across Africa. Genes Genomes Genetics. 7 (6), 1819-1832 (2017).
  7. Riveron, J. M., et al. A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector. Genome Biology. 15 (2), (2014).
  8. Lynd, A., Lycett, G. J. Development of the Bi-Partite Gal4-UAS System in the African Malaria Mosquito, Anopheles gambiae. PLoS ONE. 7 (2), 31552 (2012).
  9. Lynd, A., Lycett, G. J. Optimization of the Gal4-UAS system in an Anopheles gambiae cell line. Insect Molecular Biology. 20 (5), 599-608 (2011).
  10. Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).
  11. Kokoza, V. A., Raikhel, A. A. Targeted gene expression in the transgenic Aedes aegypti using the binary Gal4-UAS system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 41, 637-644 (2011).
  12. O'Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. Gal4-based Enhancer-Trapping in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi. Genes Genomes Genetics. 2, 21305-21315 (2012).
  13. Zhao, B., et al. Regulation of the Gut-Specific Carboxypeptidase: A Study Using the Binary Gal4/UAS System in the Mosquito Aedes Aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 54, 1-10 (2014).
  14. Imamura, M., et al. Targeted Gene Expression Using the GAL4/UAS System in the Silkworm Bombyx mori. Genetics. 165 (3), 1329-1340 (2003).
  15. Lynd, A., et al. Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: application to cuticular hydrocarbon synthesis. bioRxiv. , (2019).
  16. Pondeville, E., et al. Hemocyte-targeted gene expression in the female malaria mosquito using the hemolectin promoter from Drosophila. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103339 (2020).
  17. Adolfi, A., et al. Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).
  18. Pondeville, E., et al. Efficient integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae. Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).
  19. Horn, C., Schmid, B. G. M., Pogoda, F. S., Wimmer, E. A. Fluorescent transformation markers for insect transgenesis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 32, 1221-1235 (2002).
  20. Clements, A. A. Biology of Mosquitoes, Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. 1, CABI Publishing. (1992).
  21. Trpiš, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Canadian Journal of Zoology. 48, 892-893 (1970).
  22. Kaiser, M. L., Duncan, F. D., Brooke, B. D. Embryonic Development and Rates of Metabolic Activity in Early and Late Hatching Eggs of the Major Malaria Vector Anopheles gambiae. PLoS ONE. 9 (12), 114381 (2014).
  23. Grigoraki, L., Grau-Bové, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. Isolation and transcriptomic analysis of Anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis. eLife. 9, 58019 (2020).
  24. Xiao, Y. -H., Yin, M. -H., Hou, L., Pei, Y. Direct amplification of intron-containing hairpin RNA construct from genomic DNA. BioTechniques. 41 (5), 548-552 (2006).
  25. Livak, K. J. Organization and Mapping of a Sequence on the Drosophila melanogaster X and Y Chromosomes That Is Transcribed during Spermatogenesis. Genetics. 107 (4), 611-634 (1984).
  26. MR4, CDC, NEI & beiResources. The MR4 Methods in Anopheles Research Laboratory Manual. 5th Edition. , (2015).
  27. Sik Lee, Y., Carthew, R. W. Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers. Methods. 30 (4), 322-329 (2003).
  28. Cha-aim, K., Hoshida, H., Fukunaga, T., Akada, R. Gene Synthesis: Methods and Protocols. Peccoud, J. , Humana Press. 97-110 (2012).
  29. Cavener, D. R. Comparison of the consensus sequence flanking translational start sites in Drosophila and vertebrates. Nucleic Acids Research. 15 (4), 1353-1361 (1987).
  30. Wang, Y., Wang, F., Wang, R., Zhao, P., Xia, Q. 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. Scientific Reports. 5, (2015).
  31. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5, 3977 (2014).
  32. Kondo, S., et al. Neurochemical organisation of the Drosophila Brain Visualised by Endogenously Tagged Neurotransmitter Receptors. Cell Reports. 30 (1), 284-297 (2020).
  33. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, 35574 (2018).
  34. Marois, E., et al. High-throughput sorting of mosquito larvae for laboratory studies and for future vector control interventions. Malaria Journal. 11, 302 (2012).
  35. Crawford, J. E., et al. Efficient production of male Wolbachia-infected Aedes aegypti mosquitoes enables large-scale suppression of wild populations. Nature Biotechnology. 38 (4), 482-492 (2020).
  36. Goltsev, Y., et al. Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo. Developmental Biology. 330 (2), 462-470 (2009).
  37. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized Serosal Cuticle. BMC Developmental Biology. 8 (1), 82 (2008).
  38. Vargas, H. C. M., Farnesi, L. C., Martins, A. J., Valle, D., Rezende, G. L. Serosal cuticle formation and distinct degrees of desiccation resistance in embryos of the mosquito vectors Aedes aegypti, Anopheles aquasalis and Culex quinquefasciatus. Journal of Insect Physiology. 62, 54-60 (2014).
  39. Chang, C. -H., et al. The non-canonical Notch signaling is essential for the control of fertility in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 12 (3), 0006307 (2018).
  40. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical Analysis of Protein Expression during Aedes aegypti Development. Spring Harbor Protocols. 10, 1-4 (2010).
  41. Juhn, J., James, A. A. Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries and Embryos of Vector Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. , e3709 (2012).

Tags

Genetik nummer 170 3xP3 lokalisering endogent uttryck RNAi Knockdown mikroskopi bipartit insekticidresistens vektorkapacitet.
Använda GAL4-UAS-systemet för funktionell genetik i <em>Anopheles gambiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poulton, B. C., Colman, F.,… More

Poulton, B. C., Colman, F., Anthousi, A., Grigoraki, L., Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J. Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (170), e62131, doi:10.3791/62131 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter