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Neuroscience

Un modèle de rat d’infection cérébrale EcoHIV

Published: January 21, 2021 doi: 10.3791/62137

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à établir un nouveau modèle d’infection active par le VIH chez les rats à l’aide du VIH chimérique (EcoHIV), qui est essentiel pour améliorer notre compréhension des réservoirs viraux du VIH-1 dans le cerveau et offrir un système pour étudier les troubles neurocognitifs associés au VIH et les comorbidités associées (c.-à-d. l’abus de drogues).

Abstract

Il a été bien étudié que le modèle murin infecté par EcoHIV est d’une grande utilité dans l’étude des complications neurologiques associées au VIH. L’établissement du modèle de rat infecté par le VIH ecoHIV pour les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs serait bénéfique dans l’étude des troubles neurocognitifs associés au VIH-1 et au VIH-1 . Dans la présente étude, nous démontrons la création réussie d’un modèle de rat d’infection active par le VIH à l’aide du VIH chimérique (EcoHIV). Tout d’abord, la construction lentivirale d’EcoHIV a été emballée dans des cellules cultivées de 293 FT pendant 48 heures. Ensuite, le milieu conditionnel a été concentré et titré. Ensuite, nous avons effectué des injections stéréotaxiques bilatérales de l’EcoHIV-EGFP dans le tissu cérébral du rat F344/N. Une semaine après l’infection, des signaux de fluorescence EGFP ont été détectés dans le tissu cérébral infecté, indiquant que EcoHIV induit avec succès une infection active par le VIH chez les rats. En outre, immunostaining pour le marqueur microglial de cellules, Iba1, a été exécuté. Les résultats ont indiqué que la microglie était le type prédominant de cellules hébergeant EcoHIV. En outre, les rats d’EcoHIV ont montré des changements du traitement temporel, un mécanisme neurobehavioral fondamental potentiel de main aussi bien que le dysfonctionnement synaptique huit semaines après infection. Collectivement, la présente étude étend le modèle EcoHIV de l’infection par le VIH-1 au rat offrant un système biologique précieux pour étudier les réservoirs viraux du VIH-1 dans le cerveau ainsi que la MAIN et les comorbidités associées telles que l’abus de drogues.

Introduction

Les systèmes biologiques ont amélioré notre compréhension des troubles neurocognitifs associés au VIH-1 (HAND) et de leurs mécanismes neuronaux sous-jacents2. La détermination du système biologique le plus approprié pour une étude donnée dépend souvent de la question d’intérêt2. La limitation de la gamme de modèles animaux hôtes remet en question les études sur le développement de la maladie du VIH-1. Pour étudier la réplication virale et la pathogenèse du VIH-1, Potash et coll.3 ont créé un modèle murin d’infection active par le VIH-1, remplaçant la région codante de la glycoprotéine de l’enveloppe de surface du VIH, gp120, par la MLV gp80 écotrope, ce qui a conduit à une réplication virale réussie chez la souris4. Après des injections dans les veines de la queue chez des souris chimériques séropositives (EcoHIV), de nombreuses caractéristiques ressemblant à celles des personnes séropositives du VIH-1 (p. ex. lymphocytes et macrophages infectés, ciblés pour les réponses immunitaires antivirales, et inflammation3,5,6).

Bien que les souris et les rats soient tous deux membres des Muridés, les différences fondamentales entre les espèces peuvent influencer leur aptitude à répondre à des questions expérimentales spécifiques7. Par conséquent, l’extension du modèle d’infection EcoHIV aux rats (couramment utilisé dans les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs) serait avantageuse dans l’étude du neuroHIV. Par exemple, leur plus grande taille rend l’implantation de cathéter jugulaire pour les procédures d’auto-administration de médicaments plus pratique8. Des techniques d’auto-administration de médicaments chez le rat ont été utilisées pour évaluer la motivation dans le VIH-19. En outre, de nombreuses tâches neurocognitives / comportementales ont été initialement conçues pour les rats10. Ici, nous rapportons l’utilisation des injections stereotaxic d’EcoHIV chez les rats pour prolonger le modèle d’infection d’EcoHIV et offrir une occasion clé d’adresser de nouvelles questions liées à neuroHIV et à HAND.

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Protocol

Tous les protocoles relatifs aux animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de la Caroline du Sud (numéro d’assurance fédéral : D16-00028). Six rats F344/N mâles adultes ont été logés dans un environnement contrôlé sous un cycle 12/12 clair: sombre avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Tous les animaux ont été pris en charge en utilisant les lignes directrices établies par les National Institutes of Health dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Emballage du virus dans 293 cellules FT

  1. Culture des 293 cellules FT (5×105/mL)dans des flacons enrobés de gélatine de 75 cm2 avec du DMEM plus 10% FBS11. Cultiver les cellules à 37 °C pour être 50 % confluentes à la transfection.
  2. Diluer 22,5 μL de réactif de transfection (p. ex. lipofectamine 3000) dans 750 μL de milieu (p. ex. Opti-MEM) dans un tube de micro-centrifugeuse et un vortex de 1,5 mL pendant 3 s.
  3. Diluer 20 μg d’ADN plasmidique EcoHIV dans 750 μL de milieu dans un tube micro-centrifugeuse de 1,5 mL et bien mélanger.
  4. Ajouter l’ADN dilué dans le tube du réactif de transfection dilué et mélanger doucement. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
  5. Ajouter le mélange à 10 mL de milieu DMEM prémulé dans une fiole de 75 cm2. Incuber les cellules pendant 2 jours à 37 °C.
  6. Récolter et combiner 24 mL de milieu conditionnel à partir des deux fioles qui comprennent le lentivirus emballé.
  7. Centrifuger tout 24 mL de milieu conditionnel à 500 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Transférer le surnageant clarifié dans un tube stérile de 50 mL.
  8. Combiner 8 mL de concentrateur Lenti-x avec 24 mL de surnageant clarifié (rapport 1:3). Mélanger par inversion douce. Incuber le mélange à 4 °C pendant deux jours.
  9. Mélange centrifuge à 1 500 x g pendant 45 minutes à 4 °C. Retirez soigneusement le surnageant.
  10. Suspendre doucement la pastille avec 100 μL de PBS de 100 mM.
  11. Concentration de virus de titre avec un kit ELISA p24.

2. Chirurgies stéréotaxiques du virus EcoHIV-EGFP

  1. Anesthésier les rats à l’aide de 3% de sévoflurane. Passez à l’étape 2.2 lorsque les rats ne réagissent pas aux stimuli nocifs et que les réflexes sont absents.
  2. Rasez les poils de la région du cerveau et stérilisez la peau deux fois avec de l’éthanol à 70% et un gommage à base de chlorhexidine. Fixez le rat en position couchée dans l’appareil stéréotaxique.
  3. Faites une incision (5-6 cm) à travers la peau le long de la ligne médiane du cuir chevelu.
  4. Marquer deux positions de forage à 0,8 mm latérale, 1,2 mm rostral à bregma. Percez un trou (diamètre 0,4 mm) dans chaque position du crâne.
  5. Remplissez la solution de lentivirus EcoHIV titré (1,04 × 106 TU/mL) dans une seringue d’injection de 10 μL. Fixez la seringue à l’appareil stéréotaxique.
  6. Descendez l’aiguille près de la surface du trou de forage. Mesurer et déplacer 2,5 mm de profondeur.
  7. Infuser 1 μL de solution virale à raison de 0,2 μL/min. Gardez l’aiguille à l’intérieur de la zone d’injection pendant 5 min. Déplacez lentement l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit à l’extérieur du crâne du rat.
  8. Suturer la peau avec un fil de soie 4-0.
  9. Stérilisez l’incision avec de l’éthanol à 70% une fois. Injecter par voie sous-cutanée du butorphénol (Dorolex, 0,1 mg/kg de poids corporel).
  10. Transférer le rat dans une chambre de récupération avec un coussin chauffant jusqu’à ce qu’il se réveille.

3. Visualisation des sections du cerveau

REMARQUE: Attendez une à huit semaines après la perfusion virale EcoHIV.

  1. Anesthésier le rat avec 5% de sévoflurane. Passez à l’étape 3.2 lorsque les rats ne réagissent pas aux stimuli nocifs et que les réflexes sont absents.
  2. Fixez le rat en décubitus dorsal à l’intérieur d’une hotte.
  3. Inciser la peau le long de la ligne médiane thoracique. Coupez le diaphragme et ouvrez la cavité thoracique.
  4. Insérez une aiguille de 20 G × de 25 mm dans le ventricule gauche.
  5. Ouvrez immédiatement l’oreillette droite avec des ciseaux.
  6. Perfuser 50 mL de PBS prechilled de 100 mM à raison de 5 mL/min.
  7. Perfuser 100 mL de paraformaldéhyde froid à 4 % à raison de 5 mL/min.
  8. Décapiter le rat, ouvrir le cuir chevelu et enlever le cerveau.
  9. Postfix pendant la nuit avec 4% de paraformaldéhyde.
  10. Transférer le cerveau à 40 mL de saccharose à 30% dans du PBS de 100 mM dans un tube de 50 mL jusqu’à ce que le cerveau flotte vers le bas (environ 3 jours).
  11. Snap congeler le cerveau dans le méthylbutanol pendant 2 min à - 80 °C.
  12. Fixez le tissu cérébral sur une plate-forme métallique à l’intérieur d’un cryostat à -20 °C.
  13. Couper des sections coronales de 50 μm d’épaisseur à l’aide du cryostat.
  14. Transférer les tranches de cerveau sur des lames de verre avec une brosse fine.
  15. Monter des sections dans 0,3 mL de milieu d’étouffement et couvrir avec des lamures de 22 mm 50 mm.
  16. Gardez les lames de verre dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit sec.
  17. Imagez les neurones ciblés avec un microscope confocal à l’aide de Z-stack basé sur les limites de la région du cerveau et les caractéristiques morphologiques des neurones.
    NOTA : Les réglages du microscope confocal utilisés étaient les suivants : grossissement de 60 X (A/1,4, huile) et intervalle du plan Z de 0,15 μm (taille du trou d’épingle de 30 μm; rayon de trou d’épingle rétro-projeté de 167 nm) en utilisant une longueur d’onde de 488 nm.

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Representative Results

Le milieu conditionné a été recueilli à partir du lentivirus des cellules 293FT infectées par EcoHIV-EGFP. Ensuite, il a été concentré et titré, puis injecté stéréotaxiquement dans le cerveau (région corticale) des rats F344/N. Sept jours après l’injection, des rats ont été sacrifiés et des images ont été prises des tranches coronales de cerveau s’étendant du bregma 5.64 millimètres au bregma -4.68 millimètres. Sur la figure 1A,il existe des signaux EcoHIV-EGFP significatifs dans tout le cerveau, en particulier dans le cortex et le gyrus denté de l’hippocampe. En outre, le double étiquetage avec les sondes Iba1 et EcoHIV-EGFP a fourni des preuves solides que la microglie était le type de cellule prédominant hébergeant l’expression EcoHIV dans le cerveau(Figure 1B). Notamment, le schéma de distribution de l’EcoHIV-EGFP est compatible avec les concentrations régionales relatives de microglie dans le cerveau du rat (c.-à-d. cortex et gyrus denté de l’hippocampe).

Dans une étude ultérieure, nous avons validé l’utilité de l’infection ecoHIV chez le rat pour modéliser les aspects clés de HAND. Utilisant le protocole détaillé ci-dessus, des rats de F344/N ont été stereotaxically injectés avec EcoHIV-EGFP ou solution saline. Tout d’abord, huit semaines après l’infection, traitement temporel, une dimension élémentaire potentielle de HAND12,a été évalué en utilisant l’inhibition de prepulse gap visuel (Figure 2). Les animaux EcoHIV ont montré une insensibilité relative à la manipulation de l’intervalle interstimulus (ISI), mise en évidence par une fonction ISI relativement plus plate par rapport aux contrôles salins. Plus précisément, des différences significatives dans la pente de la fonction ISI de l’ISI de 50 ms à l’ISI de 200 ms ont été observées (Semilog Line-X est Log, Y est Linéaire,R2s ≥ 0,99; F(1,2)=642,9, p≤0,001). Deuxièmement, l’étiquetage balistique a été utilisé pour étudier l’impact des injections d’EcoHIV-EGFP sur la morphologie des épines dendritiques dans les neurones épineux moyens (MSN) du noyau accumbens (NAc; Figure 3); paramètres qui peuvent être utilisés pour tirer des inférences sur la fonction synaptique13. Les rats EcoHIV ont montré des changements profonds dans la morphologie dendritique d’épine, mis en évidence par une fréquence relative accrue des épines dendritiques plus courtes (génotype x bin interaction, F (16, 218) = 4,3, p ≤ 0,001) avec un diamètre de tête accru (génotype x interaction bin, F (12, 96) = 18,7, p ≤ 0,001) et un diamètre de cou accru (génotype x interaction bin, F (15, 120) = 16,3, p ≤ 0,001) par rapport aux animaux témoins. La méthodologie détaillée pour l’évaluation du traitement temporel14 et de l’étiquetage balistique13 ont été précédemment rapportées.

Figure 1
Figure 1. Les cellules infectées EcoHIV-EGFP distribuées dans le cerveau du rat. (A) Les images confocales représentatives (20x) de l’expression EcoHIV-EGFP dans les régions de gyrus denté de l’hippocampe ou du cortex à 7 jours après l’injection. (B) Les images confocales représentatives (60X) de co-localisation d’Iba1 immunostaining avec les cellules infectées EcoHIV-EGFP à 7 jours après l’injection. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. L’infection d’EcoHIV a induit des déficits neurocognitives en avant dans le traitement temporel. L’inhibition visuelle de prepulse d’espace a été conduite pendant huit semaines après des injections stereotaxic d’EcoHIV ou de solution saline. L’infection d’EcoHIV a induit des changements en avant dans le traitement temporel mis en évidence par l’insensibilité relative à la manipulation de l’intervalle interstimulus par rapport aux rats de contrôle. Méthodologie détaillée décrite dans McLaurin et coll.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. L’infectiosité avec EcoHIV-EGFP a changé les paramètres morphologiques des épines dendritiques, soutenant le dysfonctionnement synaptique profond. Les rats EcoHIV ont montré des changements profonds dans la morphologie dendritique d’épine, démontrés par une fréquence relative accrue des épines dendritiques plus courtes(A)avec un diamètre de tête accru(B)et un diamètre de cou accru(C)par rapport aux animaux témoins. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Dans ce protocole, nous avons établi un modèle d’infection par le VIH induite par EcoHIV chez les rats. Plus précisément, nous avons décrit une injection stéréotaxique bilatérale d’EcoHIV dans le cortex qui a réussi à instituer l’infection active par le VIH dans le cerveau de rat 7 jours après l’injection. De plus, nous démontrons que l’infection à EcoHIV chez le rat pourrait être un bon système biologique pour étudier les aspects clés de la MAIN. Huit semaines après l’infection par le Virus eco-HIV, les rats présentaient des déficiences neurocognitives importantes, notamment les altérations du traitement temporel et le dysfonctionnement synaptique des RSM du NAc. Compte tenu de l’importance des modèles animaux pour l’étude du neuroVIHIV et du HAND2,le développement d’un nouveau système biologique peut être avantageux pour aborder de nouvelles questions dans le domaine. Potash et coll.3 ont d’abord signalé l’utilisation d’EcoHIV pour induire une infection active par le VIH-1 chez la souris. Plus précisément, des souris ont été inoculées avec une solution de 0,1 mL de virus EcoHIV par injections de veinescaudales 3. Six semaines après l’infection, l’ADN viral du VIH-1 a été détecté dans les cellules et les lymphocytes de la rate. De plus, une inoculation d’ecoHIV a suffi à induire une infection chez plus de 75 % des souris. L’utilisation des injections stéréotaxiques bilatérales, comme dans cette étude, a infecté avec succès 100% des rats (n = 6 ou n = 4, respectivement) mis en évidence par la détection d’EcoHIV-EGFP dans le cerveau sept jours après l’injection.

Des études antérieures ont montré que l’infection par EcoHIV chez la souris impliquait fortement que les microglies cérébrales sont très sensibles à l’infection par le virus EcoHIV3. Dans cette étude, combinée à l’immunomarquage d’Iba1 (un marqueur de cellules microgliales), on a observé une co-localisation significative du signal EGFP avec des cellules Iba1+, suggérant fortement que la microglie était le type de cellule principal pour l’infection d’EcoHIV dans le cerveau de rat. Les observations d’une infection significative par le VIH/VHIV dans les microglies concordent avec les données sur les souris infectées par le VHIV6, ainsi que sur les personnes séropositivesséropositives 15 et sur d’autres systèmes biologiques couramment utilisés pour modéliser le VIH16,17. Nous avons également exécuté l’injection rétro-orbitale d’EcoHIV-EGFP chez les rats de F344/N et les données ont également indiqué l’expression élevée d’EcoHIV-EGFP dans le cortex et le gyrus dentelé hippocampal après seulement sept jours (données non montrées). En revanche, l’injection d’I.P. d’EcoHIV chez les rats F344/N a mené à l’expression virale indétectable dans le cerveau de rat, en dépit des doses élevées de lentivirus d’EcoHIV.

En ce qui concerne ce protocole, les chercheurs devraient s’assurer que le milieu conditionné, y compris l’emballage du lentivirus EcoHIV dans 293 cellules FT, est concentré et titré avant d’être utilisé pour l’injection stéréotaxique. Ces étapes sont essentielles pour garantir des résultats cohérents et reproductibles dans toutes les expériences. En outre, nous avons également constaté que l’infection EcoHIV a été propagée de l’injection stéréotaxique dans le cerveau au tissu de rate à 8 semaines après l’injection. Pendant ce temps, les déficits de traitement temporel ont été observés chez les rats infectés par ecoHIV dès 14 jours et maintenus jusqu’à 8 semaines après l’infection (le temps terminal expérimental actuel, figure 2). Comparativement au modèle généralisé d’infection par ecoHIV chez la souris, l’injection stéréotaxique régionale plus spécifique d’EcoHIV a produit une infection efficace par le VIH dans les régions du cerveau et a produit un déficit de traitement temporel chez le rat, ce qui est essentiel pour l’étude du dysfonctionnement neurocognitif associé au VIH.

Les limites offrant d’autres possibilités pour le protocole actuel comprennent l’identification d’autres types de cellules telles que les neurones et les astrocytes, une étude dans le temps des changements dans l’expression EcoHIV-EGFP après l’infection pour indiquer la réplication virale et la latence dans le cerveau, une étude longitudinale pour aborder les impacts potentiels des déficits neurocognitifs associés au VIH, et l’évaluation de si l’injection stéréotaxique d’EcoHIV échappe au système immunitaire propage davantage l’expression virale dans l’ensemble de la b ody. De plus, cela devrait être testé sur d’autres souches de rats pour confirmer la généralisabilité de l’infection à EcoHIV chez les rats.

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Disclosures

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par les subventions des NIH HD043680, MH106392, DA013137 et NS100624.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293FT cells ThermoFisher Scientific R70007
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap Life Technologies 354488
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate Life Technologies 10013CV
Cover glass VWR 637-137
drill
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes Life Technologies 22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2 Med Vet International VCP422H
Hamilton syringe Hamilton 1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Life Technologies L3000015
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit Cell Biolabs, inc. VPK-107-5
Lenti-X Concentrator Takara PT4421-2
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 11058021
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Paraformaldehyde Sigma P6148
ProLong Gold Fisher Scientific P36930
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
stereotaxic apparatus Kopf Instruments Model 900
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154%
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. A Rat Model of EcoHIV Brain Infection. J. Vis. Exp. (167), e62137, doi:10.3791/62137 (2021).

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