Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att etablera en ny råttmodell av aktiv HIV-infektion med hjälp av chimerisk HIV (EcoHIV), vilket är avgörande för att öka vår förståelse av HIV-1-virusreservoarer i hjärnan och erbjuda ett system för att studera HIV-associerade neurokognitiva störningar och tillhörande komorbiditet (dvs. drogmissbruk).
Abstract
Det har studerats väl att ecoHIV infekterade mus modell är av betydande nytta för att undersöka HIV associerade neurologiska komplikationer. Upprättandet av EcoHIV infekterad råtta modell för studier av narkotikamissbruk och neurokognitiva störningar, skulle vara fördelaktigt i studien av neuroHIV och HIV-1 associerade neurokognitiva störningar (HAND). I den aktuella studien visar vi att en råttmodell av aktiv HIV-infektion med hjälp av chimerisk HIV (EcoHIV) har skapats framgångsrikt. Först förpackades den lentivirala konstruktionen av EcoHIV i odlade 293 FT-celler i 48 timmar. Sedan koncentrerades det villkorliga mediet och titererades. Därefter utförde vi bilaterala stereotaxic injektioner av EcoHIV-EGFP i F344/N råtta hjärnvävnad. En vecka efter infektion upptäcktes EGFP fluorescenssignaler i den infekterade hjärnvävnaden, vilket indikerar att EcoHIV framgångsrikt inducerar en aktiv HIV-infektion hos råttor. Dessutom utfördes immunostaining för microglial cell markör, Iba1. Resultaten visade att mikroglia var den dominerande celltypen som hyser EcoHIV. Dessutom uppvisade EcoHIV råttor förändringar i tidsmässiga bearbetning, en potentiell underliggande neurobehavioral mekanism av HAND samt synaptisk dysfunktion åtta veckor efter infektion. Sammantaget utvidgar den nuvarande studien EcoHIV-modellen av HIV-1-infektion till att erbjuda ett värdefullt biologiskt system för att studera HIV-1-virusreservoarer i hjärnan samt HAND och tillhörande komorbiditeter som drogmissbruk.
Introduction
Biologiska system har förbättrat vår förståelse av HIV-1 associerade neurokognitiva störningar (HAND) och deras underliggande neurala mekanismer2. Att avgöra vilket biologiskt system som är lämpligast för en viss studie beror ofta på frågan om intresse2. Begränsningen av utbudet av värddjursmodeller utmanar studier av hiv-1-sjukdomsutveckling. För att undersöka HIV-1 viral replikering och patogenes skapade Potash et al.3 en musmodell av aktiv HIV-1-infektion, som ersatte kodningsregionen för HIV-ytkuvertglykoprotein, gp120, med ekotropisk MLV gp80, vilket ledde till framgångsrik viral replikering hos möss4. Efter svansven injektioner i chimeric HIV (EcoHIV) möss observerades många egenskaper som liknar hiv-1 seropositiva individer (t.ex. infekterade lymfocyter och makrofager, riktade mot antivirala immunsvar och inflammation3,5,6).
Även om möss och råttor båda är medlemmar i Muridae, kan fundamentala artskillnader påverka deras lämplighet för specifika experimentella frågor7. Därför skulle förlängningen av EcoHIV-infektionsmodellen till råttor (som vanligtvis används i studier av narkotikamissbruk och neurokognitiva störningar) vara fördelaktig i studien av neuroHIV. Till exempel gör deras större storlek halsterkateterimplantation för drog självadministration förfaranden mer praktiska8. Drog självadministration tekniker hos råttor har använts för att utvärderamotivation i HIV-19 . Dessutom var många neurokognitiva / beteendemässiga uppgifter ursprungligen utformade för råttor10. Här rapporterar vi användningen av stereotaxiska injektioner av EcoHIV hos råttor för att utöka EcoHIV-infektionsmodellen och ge en viktig möjlighet att ta itu med nya frågor relaterade till neuroHIV och HAND.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprotokoll granskades och godkändes av Animal Care and Use Committee vid University of South Carolina (federalt försäkringsnummer: D16-00028). Sex vuxna manliga F344/N råtta parades i en kontrollerad miljö under en 12/12 ljus: mörk cykel med ad libitum tillgång till mat och vatten. Alla djur togs om hand med hjälp av riktlinjer som fastställts av National Institutes of Health i guiden för vård och användning av laboratoriedjur.
1. Virusförpackning i 293 FT-celler
- Kultur de 293 FT-cellerna (5×105/ml) i gelatinbelagda 75 cm2 flaskor med DMEM plus 10% FBS11. Odla celler vid 37 °C för att vara 50% konfluenta vid transfection.
- Späd 22,5 μL transfection reagens (t.ex. Lipofectamine 3000) i 750 μL medium (t.ex. Opti-MEM) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och virvel i 3 s.
- Späd 20 μg EcoHIV-plasmid-DNA i 750 μL medium i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och blanda väl.
- Tillsätt utspädd DNA i röret av utspädd transfection reagens och blanda försiktigt. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt blandningen till 10 ml förvärmt DMEM-medium i 75 cm2 kolv. Inkubera celler i 2 dagar vid 37 °C.
- Skörda och kombinera 24 ml villkorligt medium från de två flaskorna som innehåller det förpackade lentiviruset.
- Centrifugera alla 24 ml villkorligt medium vid 500 x g i 10 minuter vid 4 °C. Överför den klarlagda supernaten till ett sterilt 50 ml-rör.
- Kombinera 8 ml Lenti-x-koncentrator med 24 ml klarnat supernatant (1:3-förhållande). Blanda genom mild inversion. Inkubera blandningen vid 4 °C i två dagar.
- Centrifugblandning vid 1 500 x g i 45 minuter vid 4 °C. Ta försiktigt bort supernaten.
- Suspendera försiktigt upp pelleten försiktigt med 100 μL 100 mM PBS.
- Titer viruskoncentration med ett p24 ELISA-kit.
2. EcoHIV-EGFP virus stereotaxiska operationer
- Bedöva råttor med 3% sevofluran. Fortsätt till steg 2.2 när råttorna inte reagerar på skadliga stimuli och reflexer saknas.
- Raka håren från hjärnregionen och sterilisera huden två gånger med 70% etanol och en klorhexidinbaserad skrubb. Säkra råttan i ett utsatt läge i stereotaxiska apparaten.
- Gör ett snitt (5-6 cm) genom huden längs hårbottens mittlinje.
- Markera två borrlägen vid 0,8 mm sidoläge, 1,2 mm rostralt till knät. Borra ett hål (diameter 0,4 mm) i varje skalleläge.
- Fyll titererad EcoHIV-lentiviruslösning (1,04 × 106 TU/ml) i en 10 μL injektionsspruta. Fäst sprutan på stereotaxiska apparaten.
- Flytta ner nålen nära borrhålet. Mät och flytta 2,5 mm på djupet.
- Ingjut 1 μL viruslösning med en hastighet av 0,2 μL/min. Håll nålen inuti injektionsområdet i 5 minuter. Flytta långsamt nålen uppåt tills den är utanför råttskalle.
- Suturera huden med en 4-0 silketråd.
- Sterilisera snittet med 70% etanol en gång. Subkutant injicera butorfenol (Dorolex, 0,1 mg/kg kroppsvikt).
- Överför råttan till en återvinningskammare med en värmedyna tills den vaknar.
3. Visualisering av hjärnsektioner
OBS: Vänta en till åtta veckor efter EcoHIV viral infusion.
- Söv råttan med 5% sevofluran. Fortsätt att steg 3.2 när råttorna inte reagerar på skadliga stimuli och reflexer saknas.
- Fäst råttan i ett smidigt läge inuti en rökhuva.
- Lutar huden längs bröstens mittlinje. Skär membranet och öppna brösthålan.
- Sätt in en 20 G × 25 mm nål i vänster kammare.
- Öppna omedelbart rätt atrium med sax.
- Granska 50 ml förförda 100 mM PBS med en hastighet av 5 ml/min.
- Granska 100 ml kall 4% paraformaldehyd med en hastighet av 5 ml/min.
- Halshugg råttan, öppna hårbotten och ta bort hjärnan.
- Postfix över natten med 4% paraformaldehyd.
- Överför hjärnan till 40 ml 30% sackaros i 100 mM PBS i 50 ml rör tills hjärnan flyter ner till botten (ca 3 dagar).
- Snap frysa hjärnan i metylbutanol i 2 min vid - 80 °C.
- Säkra hjärnvävnaden på en metallplattform inuti en -20 °C kryostat.
- Skär 50 μm tjocka koronarsektioner med kryostaten.
- Överför hjärnskivorna till glasrutschbanor med en fin borste.
- Montera sektioner i 0,3 ml antifade medium och täck med 22 mm 50 mm täcken.
- Håll glasrutschbanorna i mörker vid rumstemperatur tills de är torra.
- Avbilda de riktade nervcellerna med ett konfokalt mikroskop med Z-stack baserat på hjärnregiongränser och morfologiska egenskaper hos nervceller.
OBS: De konfokala mikroskopinställningarna som användes var: förstoring av 60 X (A/1,4, olja) och ett Z-planintervall på 0,15 μm (pinhole storlek 30 μm; back-projected pinhole radius 167 nm) med en våglängd på 488 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det konditionerade mediet samlades in från lentivirus av EcoHIV-EGFP infekterade 293FT celler. Därefter koncentrerades och titererades det, sedan stereotaxiskt injiceras i hjärnan (när regionen) av F344/N råttor. Sju dagar efter injektion offrades råttor och bilder togs från koronar hjärnskivor som sträcker sig från bregma 5,64 mm till bregma -4,68 mm. I figur 1Afinns det signifikanta EcoHIV-EGFP-signaler i hela hjärnan, särskilt i cortex och hippocampal dentate gyrus. Dessutom gav dubbelmärkning med Iba1- och EcoHIV-EGFP-sonder starka bevis för att mikroglia var den dominerande celltypen som hyste EcoHIV-uttryck i hjärnan (figur 1B). Särskilt fördelningsmönstret för EcoHIV-EGFP överensstämmer med de relativa regionala koncentrationerna av mikroglia i råtthjärnan (dvs. cortex och dentate gyrus av hippocampus).
I en efterföljande studie validerade vi nyttan av EcoHIV-infektion hos råttor för att modellera viktiga aspekter av HAND. Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan injicerades F344/N råttor stereotaxiskt med antingen EcoHIV-EGFP eller saltlösning. Först utvärderades åtta veckor efter infektion, tidsbehandling, en potentiell elementär dimension av HAND12, med hjälp av visuell gap prepulse hämning (Figur 2). EcoHIV djur uppvisade en relativ okänslighet för manipulering av interstimulus intervall (ISI), framgår av en relativt plattare ISI funktion jämfört med saltlösning kontroller. Specifikt observerades betydande skillnader i ISI-funktionens lutning från 50 ms ISI till 200 ms ISI (Semilog Line-X is Log, Y is Linear, R2s ≥ 0,99; F(1,2)=642,9, p≤0,001). För det andra användes ballistisk märkning för att undersöka effekten av EcoHIV-EGFP injektioner på morfologin av dendritiska ryggraden i medelstora spiny nervceller (MSN) av kärnan accumbens (NAc; Figur 3). parametrar som kan användas för att dra slutsatser om synaptisk funktion13. EcoHIV råttor uppvisade djupgående förändringar i dendritisk ryggrad morfologi, vilket framgår av en ökad relativ frekvens av kortare dendritiska ryggrader (Genotyp x Bin Interaktion, F(16, 218) = 4.3, p ≤ 0,001) med ökad huvuddiameter (Genotyp x Bin Interaction, F(12, 96) = 18,7, p ≤ 0,001) och ökad halsdiameter (Genotyp x Bin Interaction, F(15, 120) = 16,3, s. ≤ 0,001) i förhållande till kontrolldjur. Detaljerad metod för bedömning av tidsbehandling14 och ballistisk märkning13 har tidigare rapporterats.
Figur 1. EcoHIV-EGFP infekterade celler fördelade i råtta hjärnan. (A) De representativa confocal bilder (20x) av EcoHIV-EGFP uttryck i hippocampal dentate gyrus eller cortex regioner 7 dagar efter injektion. (B) De representativa confocal bilder (60X) av samlokalisering av Iba1 immunostaining med EcoHIV-EGFP infekterade celler 7 dagar efter injektion. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. EcoHIV infektion inducerad framstående neurokognitiva underskott i tidsmässiga bearbetning. Visuell gap prepulse hämning genomfördes åtta veckor efter stereotaxic injektioner av antingen EcoHIV eller saltlösning. EcoHIV infektion inducerad framträdande förändringar i tidsmässiga bearbetning framgår av den relativa okänslighet för manipulering av interstimulus intervall i förhållande till kontroll råttor. Detaljerad metodik beskriven i McLaurin et al.13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3. Smittsamhet med EcoHIV-EGFP förändrade morfologiska parametrar för dendritiska ryggraden, stödja djupgående synaptisk dysfunktion. EcoHIV råttor uppvisade djupgående förändringar i dendritiska ryggrad morfologi, framgår av en ökad relativ frekvens av kortare dendritiska ryggrader(A) med en ökad huvuddiameter (B) och ökad halsdiameter (C) i förhållande till kontrolldjur. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll etablerade vi en EcoHIV-inducerad HIV-infektionsmodell hos råttor. Specifikt beskrev vi en bilateral stereotaxic injektion av EcoHIV i cortex som framgångsrikt inducerad aktiv HIV-infektion i råtta hjärnan 7 dagar efter injektion. Dessutom visar vi att EcoHIV-infektion hos råttor kan vara ett bra biologiskt system för att studera viktiga aspekter av HAND. Åtta veckor efter EcoHIV infektion uppvisade råttor betydande neurokognitiv försämringar, som inkluderade ändringarna i tidsbehandling och synaptisk dysfunktion i MSN av NAc. Med tanke på betydelsen av djurmodeller för studier av neuroHIV och HAND2kan utvecklingen av ett nytt biologiskt system vara fördelaktigt för att ta itu med nya frågor inom området. Potash et al.3 rapporterade först användningen av EcoHIV för att inducera aktiv HIV- 1-infektion hos möss. Specifikt var möss inokuleras med en 0,1 ml lösning av EcoHIV-virus genom svansvetinjektioner3. Sex veckor efter infektion upptäcktes HIV-1 viral DNA i mjälteceller och lymfocyter. Dessutom var en inokulering av EcoHIV injektion tillräcklig för att inducera infektion hos mer än 75% av mössen. Användning av bilaterala stereotaxiska injektioner, som i denna studie, framgångsrikt infekterade 100% av råttorna (n = 6 eller n = 4, respektive) framgår av upptäckten av EcoHIV-EGFP i hjärnan sju dagar efter injektion.
Tidigare studier har visat att infektion av EcoHIV i musen starkt inblandad att hjärnan microglia är mycket mottagliga för EcoHIV virusinfektion3. I denna studie, i kombination med Iba1 (en mikrogliaal cell markör) immunostaining, observerades en betydande samlokalisering av EGFP signal med Iba1 + celler, starkt tyder på att microglia var den viktigaste celltypen för EcoHIV infektion i råtta hjärnan. Observationer av signifikant EcoHIV-infektion i mikroglia överensstämmer med data i EcoHIV infekterade möss6, liksom HIV-1 seropositiva individer15 och andra biologiska system som vanligtvis används för att modellera HIV16,17. Vi utförde också retro-orbital injektion av EcoHIV-EGFP i F344/N råttor och data anges också högt uttryck för EcoHIV-EGFP i både cortex och hippocampal dentate gyrus efter endast sju dagar (data visas inte). Däremot ledde I.P. injektion av EcoHIV hos F344/N råttor till oidentifierbara virala uttryck i råtta hjärnan, infällning av höga doser av EcoHIV lentivirus.
När det gäller detta protokoll bör forskare se till att det konditionerade mediet, inklusive EcoHIV-lentivirusförpackningen i 293 FT-celler, koncentreras och titreras innan det används för stereotaxisk injektion. Dessa steg är avgörande för att säkerställa konsekventa och replikerbara resultat i olika experiment. Dessutom fann vi också att EcoHIV infektion förökades från stereotaxic injektion i hjärnan till mjälte vävnad 8 veckor efter injektion. Under tiden observerades de tidsmässiga bearbetningsunderskotten hos EcoHIV-infekterade råttor så tidigt som 14 dagar och bibehölls under 8 veckor efter infektion (den nuvarande experimentella terminaltiden, figur 2). Jämfört med den generaliserade EcoHIV-infektionsmodellen hos möss producerade den mer specifika regionala stereotaxiska injektionen av EcoHIV effektiv HIV-infektion i hjärnområden och producerade ett tidsbehandlingsunderskott hos råttor, vilket är nyckeln till studier av HIV-associerad neurokognitiv dysfunktion.
Begränsningar som ger ytterligare möjligheter för det nuvarande protokollet inkluderar identifiering av andra celltyper som nervceller och astrocyter, en tidsstudie av förändringar i EcoHIV-EGFP-uttryck efter infektion för att indikera virusreplikation och latens i hjärnan, en longitudinell studie för att ta itu med de potentiella effekterna av HIV-associerade neurokognitiva underskott och utvärdera om stereotaxisk injektion av EcoHIV undviker immunsystemet ytterligare sprida viralt uttryck i hela b ody. Dessutom bör detta testas på andra råttstammar för att bekräfta generaliserbarheten av EcoHIV-infektion hos råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av NIH-bidrag HD043680, MH106392, DA013137 och NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT cells | ThermoFisher Scientific | R70007 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap | Life Technologies | 354488 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Life Technologies | 10013CV | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| drill | |||
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes | Life Technologies | 22600028 | |
| Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2 | Med Vet International | VCP422H | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 1701 | |
| Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technologies | L3000015 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit | Cell Biolabs, inc. | VPK-107-5 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf Instruments | Model 900 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Illenberger, J. M., et al. HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).
- Joseph, S. B., Swanstrom, R. The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells. Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).
- Potash, M. J., et al. A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).
- Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection. Cell. 57, 659-666 (1989).
- Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).
- Gu, C. J., et al. EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment. PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061 (2018).
- Ellenbroek, B., Youn, J. Rodent models in neuroscience research: is it a rat race. Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).
- Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. Novel apparatus and method for drug reinforcement. Journal of Visualized Experiments. (42), e1998 (2010).
- Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Scientific Reports. 8 (1), 7869 (2018).
- McGaughy, J., Sarter, M. Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands. Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Scientific Reports. 9 (1), 827 (2019).
- McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (146), e58659 (2019).
- Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).
- Ko, A., et al. Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).
- Sopper, S., et al. The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey. Virology. 220 (2), 320-329 (1996).
- Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency. Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).
