Summary
Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un nuovo modello di ratto di infezione attiva da HIV utilizzando l'HIV chimerico (EcoHIV), che è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dei serbatoi virali dell'HIV-1 nel cervello e offrire un sistema per studiare i disturbi neurocognitivi associati all'HIV e le comorbilità associate (cioè l'abuso di droghe).
Abstract
È stato ben studiato che il modello di topo infetto EcoHIV è di notevole utilità nello studio delle complicanze neurologiche associate all'HIV. L'istituzione del modello di ratto infetto EcoHIV per studi sull'abuso di droghe e sui disturbi neurocognitivi sarebbe utile nello studio dei disturbi neurocognitivi associati al neuroHIV e all'HIV-1 (HAND). Nel presente studio, dimostriamo la creazione di successo di un modello di ratto di infezione attiva da HIV utilizzando l'HIV chimerico (EcoHIV). In primo luogo, il costrutto lentivirale di EcoHIV è stato confezionato in celle colturate da 293 FT per 48 ore. Quindi, il mezzo condizionale è stato concentrato e piastrellato. Successivamente, abbiamo eseguito iniezioni stereotassiche bilaterali dell'EcoHIV-EGFP nel tessuto cerebrale del ratto F344/ N. Una settimana dopo l'infezione, sono stati rilevati segnali di fluorescenza EGFP nel tessuto cerebrale infetto, indicando che EcoHIV induce con successo un'infezione attiva da HIV nei ratti. Inoltre, è stata eseguita l'immunostaining per il marcatore cellulare microgliale, Iba1. I risultati indicavano che le microglia erano il tipo di cellula predominante che ospitava EcoHIV. Inoltre, i ratti EcoHIV hanno mostrato alterazioni nell'elaborazione temporale, un potenziale meccanismo neurocomportamentale sottostante della MANO e disfunzione sinaptica otto settimane dopo l'infezione. Collettivamente, il presente studio estende il modello EcoHIV dell'infezione da HIV-1 al ratto offrendo un prezioso sistema biologico per studiare i serbatoi virali dell'HIV-1 nel cervello, nonché la MANO e le comorbilità associate come l'abuso di droghe.
Introduction
I sistemi biologici hanno migliorato la nostra comprensione dei disturbi neurocognitivi associati all'HIV-1 (HAND) e dei loro meccanismi neurali sottostanti2. La determinazione del sistema biologico più appropriato per un dato studio dipende spesso dalla questione dell'interesse2. La limitazione della gamma di modelli animali ospiti sfida gli studi sullo sviluppo della malattia dell'HIV-1. Per indagare la replicazione virale e la patogenesi dell'HIV-1, Potash etal. Dopo iniezioni di vene della coda nei topi dell'HIV chimerico (EcoHIV), sono state osservate molte caratteristiche simili a quelle degli individui sieropositivi HIV-1 (ad esempio linfociti infetti e macrofagi, mirati per risposte immunitarie antivirali einfiammazione 3,5,6).
Sebbene topi e ratti siano entrambi membri dei Muridae, le differenze fondamentali delle specie possono influenzare la loro idoneità per specifiche domande sperimentali7. Pertanto, l'estensione del modello di infezione EcoHIV ai ratti (comunemente usato negli studi sull'abuso di droghe e sui disturbi neurocognitivi) sarebbe vantaggiosa nello studio del neuroHIV. Ad esempio, le loro dimensioni maggiori rendono più pratico l'impianto giugulare del catetere per le procedure di auto-somministrazionedei farmaci 8. Le tecniche di auto-somministrazione dei farmaci nei ratti sono state utilizzate per valutare la motivazione nell'HIV-19. Inoltre, molti compiti neurocognitivi / comportamentali sono stati inizialmente progettati per i ratti10. Qui, segnalamo l'utilizzo di iniezioni stereotassiche di EcoHIV nei ratti per estendere il modello di infezione EcoHIV e offrire un'opportunità chiave per affrontare nuove domande relative al neuroHIV e alla MANO.
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Protocol
Tutti i protocolli sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della Carolina del Sud (numero di garanzia federale: D16-00028). Sei ratti adulti F344/N maschi sono stati alloggiati in un ambiente controllato sotto una luce 12/12: ciclo scuro con accesso ad libitum a cibo e acqua. Tutti gli animali sono stati curati utilizzando le linee guida stabilite dagli Istituti Nazionali di Sanità nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Confezionamento di virus in 293 cellule FT
- Coltura delle 293 celle FT (5×105/mL) in gelatina rivestita 75 cm2 fiasche con DMEM più 10% FBS11. Far crescere le cellule a 37 °C per essere confluenti al 50% alla trasfezione.
- Diluire 22,5 μL di reagente di trasfezione (ad esempio Lipofectamina 3000) in 750 μL di mezzo (ad esempio Opti-MEM) in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 ml e vortice per 3 s.
- Diluire 20 μg di DNA plasmide EcoHIV in 750 μL di mezzo in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 ml e mescolare bene.
- Aggiungere il DNA diluito nel tubo del reagente di trasfezione diluito e mescolare delicatamente. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere la miscela a 10 ml di mezzo DMEM prebellico in pallone da 75 cm2. Incubare le cellule per 2 giorni a 37 °C.
- Raccogliere e combinare 24 mL di mezzo condizionale dai due contenitori che includono il lentivirus confezionato.
- Centrifuga tutti i 24 mL di mezzo condizionale a 500 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il supernatante chiarificato in un tubo sterile da 50 ml.
- Unire 8 mL di concentratore Lenti-x con 24 mL di supernatante chiarificato (rapporto 1:3). Mescolare con un'inversione delicata. Incubare la miscela a 4 °C per due giorni.
- Miscela di centrifuga a 1.500 x g per 45 minuti a 4 °C. Rimuovere con cura il supernatante.
- Sospendere delicatamente il pellet con 100 μL di PBS da 100 mM.
- Concentrazione di virus titer con un kit ELISA p24.
2. Interventi stereotassici del virus EcoHIV-EGFP
- Anestetizzare i ratti usando il 3% di sevoflurane. Procedere al passaggio 2.2 quando i ratti non rispondono a stimoli e riflessi noxious sono assenti.
- Radere i peli dalla regione cerebrale e sterilizzare la pelle due volte con il 70% di etanolo e uno scrub a base di clorexidina. Fissare il ratto in una posizione soggetta all'apparato stereotassico.
- Fare un'incisione (5-6 cm) attraverso la pelle lungo la linea mediana del cuoio capelluto.
- Contrassegnare due posizioni di foratura a 0,8 mm lateralmente, 1,2 mm da rostrale a bregma. Praticare un foro (diametro 0,4 mm) in ogni posizione del cranio.
- Riempire la soluzione di lentivirus EcoHIV titered (1,04 × 106 TU/mL) in una siringa per iniezione da 10 μL. Fissare la siringa all'apparato stereotassico.
- Spostare verso il basso l'ago vicino alla superficie del foro di perforazione. Misurare e spostare 2,5 mm di profondità.
- Infondere 1 μL di soluzione virale ad una velocità di 0,2 μL/min. Tenere l'ago all'interno dell'area di iniezione per 5 minuti. Spostare lentamente l'ago verso l'alto fino a quando non è al di fuori del cranio del topo.
- Sutura la pelle con un filo di seta 4-0.
- Sterilizzare l'incisione con il 70% di etanolo una volta. Iniettare per via sottocutanea butorfenolo (Dorolex, 0,1 mg/kg di peso corporeo).
- Trasferire il topo in una camera di recupero con una pastiglia riscaldante fino a quando non si sveglia.
3. Visualizzazione delle sezioni cerebrali
NOTA: Attendere da una a otto settimane dopo l'infusione virale ecoHIV.
- Anestetizzare il topo con il 5% di sevoflurane. Continuare al passaggio 3.2 quando i ratti non rispondono a stimoli e riflessi noxious sono assenti.
- Fissare il topo in posizione supina all'interno di una cappa aspirante.
- Incidere la pelle lungo la linea mediana toracica. Tagliare il diaframma e aprire la cavità toracica.
- Inserire un ago da 20 G × da 25 mm nel ventricolo sinistro.
- Aprire immediatamente l'atrio destro con le forbici.
- Perfondere 50 mL di PBS prechilled da 100 mM ad una velocità di 5 mL/min.
- Perfondere 100 mL di paraformaldeide fredda al 4% ad una velocità di 5 mL/min.
- Decapitare il topo, aprire il cuoio capelluto e rimuovere il cervello.
- Postfisso durante la notte con paraformaldeide al 4%.
- Trasferire il cervello a 40 ml di saccarosio al 30% in PBS da 100 mM in tubo da 50 ml fino a quando il cervello galleggia verso il basso (circa 3 giorni).
- Snap congelare il cervello nel metilbutanolo per 2 minuti a - 80 °C.
- Fissare il tessuto cerebrale su una piattaforma metallica all'interno di un criostato a -20 °C.
- Tagliare sezioni coronali spesse 50 μm usando il criostato.
- Trasferire le fette cerebrali su vetrini con un pennello fine.
- Sezioni di montaggio in 0,3 mL di mezzo antifadio e coperchio con copripasci da 22 mm e 50 mm.
- Tenere gli scivoli di vetro al buio a temperatura ambiente fino ad asciugare.
- Immagini i neuroni mirati con un microscopio confocale usando z-stack basato sui confini della regione cerebrale e sulle caratteristiche morfologiche dei neuroni.
NOTA: Le impostazioni del microscopio confocale utilizzate erano: ingrandimento di 60 X (A/1.4, olio) e un intervallo piano Z di 0,15 μm (dimensione del foro stenopeico 30 μm; raggio del foro stenopeico retroprodato di 167 nm) utilizzando una lunghezza d'onda di 488 nm.
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Representative Results
Il mezzo condizionato è stato raccolto dal lentivirus delle cellule 293FT infettate da EcoHIV-EGFP. Successivamente, è stato concentrato e titerato, quindi iniettato stereotassicamente nel cervello (regione corticale) dei ratti F344 / N. Sette giorni dopo l'iniezione, i ratti sono stati sacrificati e le immagini sono state prese da fette cerebrali coronali che vanno dal bregma 5,64 mm al bregma -4,68 mm. Nella figura 1A, ci sono significativi segnali EcoHIV-EGFP in tutto il cervello, specialmente nella corteccia e nel giro dentato ippocampale. Inoltre, la doppia etichettatura con sonde Iba1 ed EcoHIV-EGFP ha fornito una forte prova del fatto che le microglia erano il tipo di cellula predominante che ospitava l'espressione EcoHIV nel cervello (Figura 1B). In particolare, il modello di distribuzione di EcoHIV-EGFP è coerente con le relative concentrazioni regionali di microglia nel cervello del ratto (cioè corteccia e giro dentato dell'ippocampo).
In uno studio successivo, abbiamo convalidato l'utilità dell'infezione da EcoHIV nei ratti per modellare gli aspetti chiave della MANO. Utilizzando il protocollo sopra descritto, i ratti F344/N sono stati iniettati stereotassicamente con EcoHIV-EGFP o soluzione salina. In primo luogo, otto settimane dopo l'infezione, l'elaborazione temporale, una potenziale dimensione elementale di HAND12, è stata valutata utilizzando l'inibizione prepopolare del gap visivo (Figura 2). Gli animali EcoHIV mostravano una relativa insensibilità alla manipolazione dell'intervallo interstimolo (ISI), evidenziato da una funzione ISI relativamente più piatta rispetto ai controlli salini. In particolare, sono state osservate differenze significative nella pendenza della funzione ISI dall'ISI da 50 ms all'ISI da 200 ms (Semilog Line-X is Log, Y is Linear, R2s ≥ 0.99; F(1,2)=642,9, p≤0,001). In secondo luogo, l'etichettatura balistica è stata utilizzata per studiare l'impatto delle iniezioni ecoHIV-EGFP sulla morfologia delle spine dendritiche nei neuroni spinosi medi (MSN) del nucleus accumbens (NAc; Figura 3; parametri che possono essere utilizzati per disegnare deduzioni sulla funzione sinaptica13. I ratti EcoHIV mostravano profonde alterazioni nella morfologia dendritica della colonna vertebrale, evidenziate da una maggiore frequenza relativa di spine dendritiche più corte (Genotipo x Interazione bin, F(16, 218) = 4,3, p ≤ 0,001) con un diametro della testa aumentato (Genotipo x Interazione bidone, F(12, 96) = 18,7, p ≤ 0,001) e un aumento del diametro del collo (Genotipo x Interazione del contenitore, F(15, 120) = 16,3, p ≤ 0,001) rispetto agli animali di controllo. In precedenza sono state riportate modalità dettagliate per lavalutazione dell'elaborazione temporale 14 edell'etichettatura balistica 13.
Figura 1. Le cellule infettate EcoHIV-EGFP distribuite nel cervello del ratto. (A) Le immagini confocali rappresentative (20x) dell'espressione EcoHIV-EGFP nelle regioni del giro dentato ippocampale o della corteccia a 7 giorni dall'iniezione. (B) Le immagini confocali rappresentative (60%) della co-localizzazione dell'immunosocienza Iba1 con cellule infette da EcoHIV-EGFP a 7 giorni dall'iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. L'infezione da EcoHIV ha indotto deficit neurocognitivi prominenti nell'elaborazione temporale. L'inibizione prepopolare del gap visivo è stata condotta otto settimane dopo iniezioni stereotassiche di EcoHIV o salina. L'infezione da EcoHIV ha indotto alterazioni prominenti nell'elaborazione temporale evidenziate dalla relativa insensibilità alla manipolazione dell'intervallo interstimolo rispetto ai ratti di controllo. Metodologia dettagliata descritta nella sottochiamina McLaurin etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. L'infettività con EcoHIV-EGFP ha alterato i parametri morfologici delle spine dendritiche, supportando una profonda disfunzione sinaptica. I ratti EcoHIV hanno mostrato profonde alterazioni nella morfologia dendritica della colonna vertebrale, evidenziate da una maggiore frequenza relativa di spine dendritiche più corte (A) con un aumento del diametro della testa (B) e un aumento del diametro del collo(C) rispetto agli animali di controllo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo protocollo, abbiamo stabilito un modello di infezione da HIV indotto da EcoHIV nei ratti. In particolare, abbiamo descritto un'iniezione stereotassica bilaterale di EcoHIV nella corteccia che ha indotto con successo l'infezione attiva da HIV nel cervello del ratto 7 giorni dopo l'iniezione. Inoltre, dimostriamo che l'infezione da EcoHIV nei ratti potrebbe essere un buon sistema biologico per studiare gli aspetti chiave della MANO. Otto settimane dopo l'infezione da EcoHIV, i ratti hanno mostrato significativi deficit neurocognitivi, che includevano le alterazioni nell'elaborazione temporale e disfunzione sinaptica nelle MSN della NAc. Data l'importanza dei modelli animali per lo studio del neuroHIV e della HAND2, lo sviluppo di un nuovo sistema biologico può essere vantaggioso per affrontare nuove questioni all'interno del campo. 3 ha riferito per la prima volta l'uso di EcoHIV per indurre un'infezione attiva da HIV-1 nei topi. In particolare, i topi sono stati inoculati con una soluzione di 0,1 mL di soluzione del virus EcoHIV attraverso iniezioni di venedella coda 3. Sei settimane dopo l'infezione, il DNA virale dell'HIV-1 è stato rilevato nelle cellule di milza e nei linfociti. Inoltre, un'inoculazione dell'iniezione EcoHIV è stata sufficiente a indurre l'infezione in oltre il 75% dei topi. L'utilizzo di iniezioni stereotassiche bilaterali, come in questo studio, ha infettato con successo il 100% dei ratti (n = 6 o n = 4, rispettivamente) evidenziato dal rilevamento di EcoHIV-EGFP nel cervello sette giorni dopo l'iniezione.
Studi precedenti hanno dimostrato che l'infezione da EcoHIV nel topo implicava fortemente che le microglia cerebrali sono altamente suscettibili all'infezione da virus EcoHIV3. In questo studio, combinato con l'immunosocienza Iba1 (un marcatore di cellule microgliali), è stata osservata una significativa co-localizzazione del segnale EGFP con cellule Iba1+, suggerendo fortemente che le microglia fossero il principale tipo di cellula per l'infezione da EcoHIV nel cervello del ratto. Le osservazioni di significativa infezione da EcoHIV nelle microglia sono coerenti con i dati nei topi infetti ecoHIV6, così come gli individui sieropositivi HIV-115 e altri sistemi biologici comunemente utilizzati per il modello HIV16,17. Abbiamo anche eseguito l'iniezione retro-orbitale di EcoHIV-EGFP nei ratti F344 / N e i dati hanno anche indicato un'alta espressione di EcoHIV-EGFP sia nella corteccia che nel giro dentato ippocampale dopo soli sette giorni (dati non mostrati). Al contrario, l'iniezione di I.P. di EcoHIV nei ratti F344/N ha portato a un'espressione virale non rilevabile nel cervello del ratto, nonostante alte dosi di lentivirus EcoHIV.
Per quanto riguarda questo protocollo, i ricercatori dovrebbero garantire che il mezzo condizionato, incluso l'imballaggio del lentivirus EcoHIV in 293 cellule FT, sia concentrato e piastrellato prima dell'uso per l'iniezione stereotassica. Questi passaggi sono fondamentali per garantire risultati coerenti e replicabili tra gli esperimenti. Inoltre, abbiamo anche scoperto che l'infezione da EcoHIV è stata propagata dall'iniezione stereotassica nel cervello al tessuto di milza a 8 settimane dopo l'iniezione. Nel frattempo, i deficit di elaborazione temporale sono stati osservati nei ratti infetti da EcoHIV già 14 giorni e mantenuti attraverso 8 settimane dopo l'infezione (l'attuale tempo terminale sperimentale, figura 2). Rispetto al modello di infezione ecohiv generalizzato nei topi, l'iniezione stereotassica regionale più specifica di EcoHIV ha prodotto un'infezione da HIV efficiente nelle aree cerebrali e ha prodotto un deficit di elaborazione temporale nei ratti, che è fondamentale per lo studio della disfunzione neurocognitiva associata all'HIV.
Le limitazioni che offrono ulteriori opportunità per l'attuale protocollo includono l'identificazione di altri tipi di cellule come neuroni e astrociti, uno studio a tempo dei cambiamenti nell'espressione EcoHIV-EGFP dopo l'infezione per indicare la replicazione virale e la latenza nel cervello, uno studio longitudinale per affrontare i potenziali impatti dei deficit neurocognitivi associati all'HIV e la valutazione se l'iniezione stereotassica di EcoHIV sfugge al sistema immunitario diffondendo ulteriormente l'espressione virale in tutto il b La commissione per la Inoltre, questo dovrebbe essere testato su altri ceppi di ratto per confermare la generalizzabilità dell'infezione da EcoHIV nei ratti.
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Disclosures
Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT cells | ThermoFisher Scientific | R70007 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap | Life Technologies | 354488 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Life Technologies | 10013CV | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| drill | |||
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes | Life Technologies | 22600028 | |
| Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2 | Med Vet International | VCP422H | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 1701 | |
| Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technologies | L3000015 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit | Cell Biolabs, inc. | VPK-107-5 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf Instruments | Model 900 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
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