Summary

Isolering, kultur och genteknik av däggdjurs primära pigment epitelceller för icke-viral genterapi

Published: February 26, 2021
doi:

Summary

Här presenteras ett protokoll för att isolera och transfektera primära iris och retinal pigment epitelial celler från olika däggdjur (möss, råtta, kanin, gris och nötkreatur). Metoden är idealisk för att studera okulära genterapimetoder i olika upplägg för ex vivo-analyser och in vivo-studier som kan överföras till människor.

Abstract

Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är den vanligaste orsaken till blindhet hos patienter >60 år, vilket påverkar ~ 30 miljoner människor över hela världen. AMD är en multifaktoriell sjukdom som påverkas av miljömässiga och genetiska faktorer, som leder till funktionella nedskrivningar av näthinnan på grund av att retinal pigment epitelial (RPE) cell degeneration följt av photoreceptor nedbrytning. En idealisk behandling skulle omfatta transplantation av friska RPE celler utsöndrar neuroprotektiva faktorer för att förhindra RPE cell död och photoreceptor degeneration. På grund av funktionella och genetiska likheter och möjligheten till en mindre invasiv biopsi, föreslogs transplantation av iris pigment epitelial (IPE) celler som ersättning för de urartade RPE. Utsöndring av neuroprotektiva faktorer med ett lågt antal subretinally transplanterade celler kan uppnås genom Törnrosa (SB100X) transposonmedierad transfektion med gener som kodar för pigmentet epitel-härledd faktor (PEDF) och/eller granulocyt makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF). Vi etablerade isolering, kultur och SB100X-medieradtransfektion av RPE- och IPE-celler från olika arter inklusive gnagare, grisar och nötkreatur. Jordglober explanteras och hornhinnan och linsen avlägsnas för att komma åt iris och näthinnan. Med hjälp av en specialtillverkad spatel avlägsnas IPE-celler från den isolerade iris. För att skörda RPE-celler kan en trypsininkubation krävas, beroende på arten. Sedan, med hjälp av RPE-anpassad spatel, suspenderas cellerna i medium. Efter sådd övervakas cellerna två gånger i veckan och, efter att ha nått sammanflöde, transfected av elektroporation. Gen integration, uttryck, protein utsöndring och funktion bekräftades av qPCR, WB, ELISA, immunofluorescens och funktionella analyser. Beroende på arten kan 30 000-5 miljoner (RPE) och 10 000-1,5 miljoner (IPE) celler isoleras per öga. Genetiskt modifierade celler visar betydande PEDF/GM-CSF överuttryck med kapacitet att minska oxidativ stress och erbjuder ett flexibelt system för ex vivo-analyser och in vivo-studier som kan överföras till människor för att utveckla okulära genterapimetoder.

Introduction

Vår grupp fokuserar på utveckling av regenerativa metoder för att behandla neuroretinal degeneration, det vill säga AMD, genom RPE- och IPE-baserad icke-viral genterapi. Den prekliniska etableringen av sådana terapier kräver in vitro-modeller som kan överföras till människor. Således är målet med studien som presenteras här att leverera protokoll för isolering, kultur och genteknik av primära RPE- och IPE-celler. Motiveringen för att fastställa isoleringen av PE-celler från flera arter är att på ett robust sätt bekräfta säkerheten och effektiviteten i tillvägagångssättet och öka dess reproducerbarhet och överförbarhet. Den tillgängliga humana RPE-cellinjen ARPE-19 skiljer sig från primärceller (t.ex. de är mindre pigmenterade) och är därför endast av begränsat värde för prekliniska analyser1. Dessutom kan icke-mänskliga däggdjursceller köpas för mindre kostnad och i större mängder; mänsklig donatorvävnad kan erhållas från olika eyebanks, men tillgängligheten är begränsad och dyr. Slutligen måste nya läkemedel för avancerad terapi (ATMP, dvs. cell-, vävnads- eller genterapiläkemedel) appliceras på minst två olika arter innan de testas på patienter och dessa in vivo-studier kräver att allogena celltransplantationer förbereds.

Retinal neurodegenerativa sjukdomar är den ledande orsaken till blindhet i industrialiserade länder, bestående av vanliga sjukdomar som AMD, liksom sällsynta sjukdomar som retinitis pigmentosa, där retinalcellens död så småningom leder till blindhet. RPE-celler, fotoreceptor och retinal ganglion celler (RGC) skador kan i vissa fall bromsas, men det finns för närvarande inga botande terapier tillgängliga. ATMPs erbjuder potential att korrigera gendefekter, integrera terapeutiska gener eller ersätta degenererade celler, vilket möjliggör utveckling av regenerativa och botande terapier för sjukdomar som AMD; 13 genterapier har redan fått godkännande för försäljning inklusive en behandling för att behandla RPE65 mutationsassocierad retinal degeneration2,3. Bland äldre vuxna (>60 år) påverkas ~ 30 miljoner människor över hela världen av antingen neovaskulära (nvAMD) eller avascular (aAMD) AMD4. Båda formerna framkallas av åldersrelaterade utlösare inklusive oxidativ skada, funktionsnedsättning och förlust av RPE-celler följt av fotoreceptornedbrytning, bland annat (t.ex. genetiska risk alleler, rökning, högt blodtryck)5,6. I nvAMD förvärras patogenesen av en obalans av angiogena och anti-angiogena faktorer till förmån för den angiogena vaskulär endotel tillväxtfaktorn (VEGF) som inducerar choroidal neovascularization (CNV). Hittills kan endast nvAMD behandlas med månatliga intravitreala injektioner av hämmare av VEGF-proteinet för att undertrycka CNV; ingen effektiv behandling ännu är tillgänglig för aAMD6,7.

Flera studier utvärderade cellbaserade terapier för att ersätta anti-VEGF-behandlingen: studier gjorda av Binder et al., där nyskördade autologa RPE-celler transplanterades till patienter med nAMD8,9,10, visade måttlig visuell förbättring, men endast en liten grupp patienter nådde en slutlig synskärpa tillräckligt hög för att möjliggöra läsning. Nyligen använde en klinisk fas I-studie ett embryonalt stamcellsbaserat RPE-plåster för att behandla AMD med lovande resultat; RPE-plåstrets effekt, stabilitet och säkerhet i upp till 12 månader hos 2 av de 10 behandlade patienterna11. Dessutom har flera grupper publicerat studier där autologa RPE-Bruchs membran-choroid fläckar skördades från den perifera näthinnan och transplanterades till makula12,13,14; och inducerad pluripotent stamcell (iPSC)-härledda RPE plåster genererades för transplantation15. För aAMD har antikroppar riktade mot komplementvägen testats i kliniska prövningar6,16 och en fas I-studie med en enda intravitreal injektion av en adenoassocierad virusvektor (AAV) som kodar genen för faktorn CD59 (AAVCAGsCD59) hos patienter med geografisk atrofi (GA) slutfördes17; fas II-studien har nyligen påbörjats och syftar till att rekrytera 132 patienter med avancerad aAMD och att utvärdera utfallet vid 2 år efter intervention18. Slutligen har FocuS-studiegruppen inlett en klinisk fas I/II-studie med multicenter som utvärderar säkerheten, dosresponsen och effekten hos en rekombinant icke-replikerande AAV-vektor som kodar för ett mänskligt komplementfaktor19.

I första hand är målet med en regenerativ AMD-terapi transplantation av funktionella RPE-celler, som skadades eller förlorades. IPE- och RPE-celler delar dock många funktionella och genetiska likheter (t.ex. fagocytos och retinolmetabolism), och eftersom IPE-celler är mer genomförbara skördade har de föreslagits som ett RPE-substitut20. Även om det tidigare har visats att IPE-celltransplantationen fördröjer fotoreceptordegeneration i djurmodeller21,22 och stabiliserar den visuella funktionen hos patienter med slutfas nvAMD, observerades ingen signifikant förbättring hos dessa patienter23. Bristen på effekt kan bero på det låga antalet transplanterade celler och/eller obalansen av neuroprotektiva näthinnefaktorer. Ett alternativt tillvägagångssätt skulle vara att transplantera transfected pigment epitelial celler som överuttryck neuroprotektiva faktorer för att återställa retinal homeostas, upprätthålla återstående RPE celler och skydda photoreceptors och RGCs från degeneration. Följaktligen föreslår vi en ny terapi som omfattar transplantation av funktionella RPE- eller IPE-celler som har genomgått genteknik för att utsöndra neuroprotektiva och anti-angiogena proteiner, såsom PEDF, GM-CSF eller insulinliknande tillväxtfaktorer (IGF). Fördelen med att utveckla och analysera detta tillvägagångssätt hos flera arter istället för att använda en cellinje, endast en art eller mänsklig vävnad är: 1) ökad reproducerbarhet och överförbarhet av resultaten som framgår av många studier som realiseras i oberoende laboratorier och olika arter1,24,25; 2) Gris- eller nötkreatursceller är möjliga engångsceller utan att ytterligare djur offras. 3) Tillgången till särskilt svin- och nötkreatursceller gör det möjligt för stora testserier att ge robusta resultat. 4) Kunskapen om att isolera, odla och genetiskt modifiera celler från de mest använda modellerna möjliggör in vivo-analyser hos flera arter24,25,26 och erbjuder därmed ett förbättrat risk-nyttoförhållande för de första behandlade patienterna. 5) Flexibiliteten i det protokoll som presenteras gör det möjligt att använda det i olika modeller och experimentella upplägg och för alla okulära cellbaserade terapier med och utan genteknik. Alternativa tekniker som cellinjer eller mänsklig vävnad är däremot endast av begränsad överförbarhet och/eller begränsad disposabilitet. Cellinjer som ARPE-19 är idealiska för preliminära experiment; Låg pigmentering och hög spridning skiljer sig dock avsevärt från primärcellerna1. RPE- och IPE-celler, som är isolerade från mänsklig donatorvävnad, erbjuder en värdefull källa för överförbara in vitro-experiment. Vi får dock mänsklig vävnad från en amerikansk-amerikansk ögonbank vilket innebär att vävnaden är minst två dagar gammal (efter enucleation) och kräver en lång och dyr transport, men lokal donatorvävnad är inte tillgänglig i tillräckliga mängder för en produktiv forskning. Fördelen med användning av primärceller bekräftas av flera studier från andra grupper27,28.

För utveckling av en cellbaserad icke-viral genterapi med hjälp av SB100X transposonsystem för transfektering av primära RPE- och IPE-celler med generna som kodar för PEDF och/eller GM-CSF för att behandla nvAMD respektive aAMD, respektive29,30,31,32,fastställde vi först transfektionen av ARPE-19 celler1 . Därefter fastställdes isolerings- och transfektion protokollen i lättillgängliga bovin och svin primära celler. Nu har isolering och transfektion av primära RPE- och IPE-celler från fem olika arter etablerats, från små (som mus) till stora däggdjur (som nötkreatur). Det bekräftades i primära RPE- och IPE-celler som härrör från mänskliga donatorögon30. Produktionen av god tillverkningssed (GMP) av ATMP validerades med hjälp av mänsklig donatorvävnad samt33. Slutligen bedömdes både säkerhet och effektivitet i tillvägagångssättet in vivo i tre olika arter för vilka protokollet har anpassats: mus, råtta och kanin. I den kliniska installationen kommer en irisbiopsi att skördas från patienten och IPE-celler kommer att isoleras och transfekteras i renrummet, innan cellerna transplanteras subretinally tillbaka till samma patient. Hela processen kommer att ske under en enda kirurgisk session som varar cirka 60 minuter. Utvecklingen av behandlingsmetoden och utvärderingen av dess effektivitet begärde utmärkta in vitro- och ex vivo-modeller för att implementera robusta och effektiva genleveransmetoder, analysera effektiviteten hos genleverans, terapeutisk proteinproduktion och neuroprotektiva effekter och för att producera celltransplantationer för att testa tillvägagångssättet in vivo1,24,25,29,30 . Det är värt att nämna att behandlingen har det etiska godkännandet för en klinisk fas Ib/ IIa-studie från den etiska kommissionen för forskning i kantonen Genève (nr 2019-00250) och för närvarande sista prekliniska data som begärts för godkännande av schweiziska tillsynsmyndigheter samlas in med hjälp av det presenterade protokollet. I detta avseende visade prekliniska in vivo-data en signifikant minskning av CNV och utmärkt säkerhet24,25,31.

Här beskrivs isoleringen och kulturen av RPE/IPE-celler från nötkreatur, gris, kanin, råtta och mus och användningen av det integrativa SB100X transposon-systemet i kombination med elektroporation som en effektiv genleveransmetod. Särskilt primära PE celler transfected för att överuttryck PEDF och GM-CSF. Insamlingen av dessa protokoll gör det möjligt att genomföra in vitro- och in vivo-studierna i alla prekliniska faser av ATMP-utveckling. Dessutom har upplägget potential att anpassas till andra gener av intresse och sjukdomar.

Protocol

De protokoll i vilka djur var inblandade utfördes av certifierad personal och efter godkännande av det kantonala Département de la sécurité, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale i Genève, Schweiz, och enligt ARVO-uttalandet om användning av djur i oftalmisk forskning och visionsforskning (godkännande nr. GE/94/17). Vuxna friska bruna norge råttor, C57BL/6 möss och Nya Zeeland vita kaniner avlivades genom en överdos av Pentobarbital (150 mg/kg) utspädd i 0,9% NaCl injiceras…

Representative Results

PE isolering från olika däggdjursarterMed hjälp av ovannämnda protokoll isolerades IPE- och RPE-celler framgångsrikt från fem olika arter. Antalet celler som erhålls från varje förfarande beror på ögats art och storlek(tabell 1). Som visas i figur 1visar cellerna typisk PE-cellmorfologi och pigmentering (med undantag för kaninceller som visas, härledda från albino Nya Zeelands vita (NZW) kaniner). Vid 21 dagar efter isoleringen är cellerna…

Discussion

Att ha standardiserade metoder för att isolera och odla PE-celler är grundläggande för att utveckla nya terapimetoder för retinala degenerativa sjukdomar. Med de protokoll som presenteras här kan PE-celler framgångsrikt isoleras från olika arter och odlas under långa perioder (hittills har den längsta kulturen upprätthållits i 2 år1,38); typisk PE-cellmorfologi, pigmentering och funktion observerades (figur 1, <strong cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ett tack förtjänar till Gregg Sealy och Alain Conti för deras utmärkta tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av Europeiska kommissionen inom ramen för det sjunde ramprogrammet, Den schweiziska nationella vetenskapsstiftelsen och Schmieder-Bohrisch-stiftelsen. Z.I. fick finansiering från Europeiska forskningsrådet, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] och B.M.W. från ett Fulbright Research Grant och Swiss Government Excellence Scholarship.

Materials

12-well plates Corning 353043
24-well plates Corning 353047
48-well plates ThermoFisher Scientific 150687
6-well plate Greiner 7657160
Betadine Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay Promega G9291
DMEM/Ham`s F12 Sigma-Aldrich D8062
Drape (sterile) Mölnlycke Health Care 800530
Electroporation buffer 3P.14 3P Pharmaceutical
FBS Brunschwig P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress PROMEDICAL AG 25403
NaCl (0.9%) Laboratorium Dr. Bichsel AG 1000090
Needle (18G)  Terumo TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL ThermoFisher Scientific MPK1096
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000S
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Pasteur pipette (fire-polish) Witeg 4100150
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa) Ospedalia AG 31408025
Petri dish ThermoFisher Scientific 150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Pastor et al., 2018
scarpel no. 10 Swann-Morton 501
scarpel no. 11 Swann-Morton 503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) 
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer ThermoFisher Scientific T10796
Trypsin 0.25%  ThermoFisher Scientific 25050014
Trypsin 5%/EDTA 2% Sigma-Aldrich T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)

References

  1. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  2. Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
  3. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  4. Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020)
  5. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  6. Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
  7. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  8. Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
  9. Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
  10. Binder, S. . The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , 7985-7987 (2004).
  11. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
  12. Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
  13. Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
  14. Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
  15. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  16. Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
  17. Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , (2019).
  18. , . Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , (2020).
  19. Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , (2019).
  20. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
  21. Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
  22. Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
  23. Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
  24. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  25. Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
  26. Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , (2020).
  27. Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
  28. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  29. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  30. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
  31. Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
  32. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  33. Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
  34. . Marienfeld Technical information Neubauer-improved Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020)
  35. . Neubauer Haemocytometry Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020)
  36. Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  37. Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957 (2020).
  38. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
  39. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
  40. Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
  41. Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
  42. Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
  43. Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
  44. Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch’s membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
  45. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch’s membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  46. Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch’s membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
  47. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch’s membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).

Play Video

Cite This Article
Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Wong, B. M., Johnen, S., Izsvák, Z., Thumann, G. Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy. J. Vis. Exp. (168), e62145, doi:10.3791/62145 (2021).

View Video