Här presenteras ett protokoll för att isolera och transfektera primära iris och retinal pigment epitelial celler från olika däggdjur (möss, råtta, kanin, gris och nötkreatur). Metoden är idealisk för att studera okulära genterapimetoder i olika upplägg för ex vivo-analyser och in vivo-studier som kan överföras till människor.
Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är den vanligaste orsaken till blindhet hos patienter >60 år, vilket påverkar ~ 30 miljoner människor över hela världen. AMD är en multifaktoriell sjukdom som påverkas av miljömässiga och genetiska faktorer, som leder till funktionella nedskrivningar av näthinnan på grund av att retinal pigment epitelial (RPE) cell degeneration följt av photoreceptor nedbrytning. En idealisk behandling skulle omfatta transplantation av friska RPE celler utsöndrar neuroprotektiva faktorer för att förhindra RPE cell död och photoreceptor degeneration. På grund av funktionella och genetiska likheter och möjligheten till en mindre invasiv biopsi, föreslogs transplantation av iris pigment epitelial (IPE) celler som ersättning för de urartade RPE. Utsöndring av neuroprotektiva faktorer med ett lågt antal subretinally transplanterade celler kan uppnås genom Törnrosa (SB100X) transposonmedierad transfektion med gener som kodar för pigmentet epitel-härledd faktor (PEDF) och/eller granulocyt makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF). Vi etablerade isolering, kultur och SB100X-medieradtransfektion av RPE- och IPE-celler från olika arter inklusive gnagare, grisar och nötkreatur. Jordglober explanteras och hornhinnan och linsen avlägsnas för att komma åt iris och näthinnan. Med hjälp av en specialtillverkad spatel avlägsnas IPE-celler från den isolerade iris. För att skörda RPE-celler kan en trypsininkubation krävas, beroende på arten. Sedan, med hjälp av RPE-anpassad spatel, suspenderas cellerna i medium. Efter sådd övervakas cellerna två gånger i veckan och, efter att ha nått sammanflöde, transfected av elektroporation. Gen integration, uttryck, protein utsöndring och funktion bekräftades av qPCR, WB, ELISA, immunofluorescens och funktionella analyser. Beroende på arten kan 30 000-5 miljoner (RPE) och 10 000-1,5 miljoner (IPE) celler isoleras per öga. Genetiskt modifierade celler visar betydande PEDF/GM-CSF överuttryck med kapacitet att minska oxidativ stress och erbjuder ett flexibelt system för ex vivo-analyser och in vivo-studier som kan överföras till människor för att utveckla okulära genterapimetoder.
Vår grupp fokuserar på utveckling av regenerativa metoder för att behandla neuroretinal degeneration, det vill säga AMD, genom RPE- och IPE-baserad icke-viral genterapi. Den prekliniska etableringen av sådana terapier kräver in vitro-modeller som kan överföras till människor. Således är målet med studien som presenteras här att leverera protokoll för isolering, kultur och genteknik av primära RPE- och IPE-celler. Motiveringen för att fastställa isoleringen av PE-celler från flera arter är att på ett robust sätt bekräfta säkerheten och effektiviteten i tillvägagångssättet och öka dess reproducerbarhet och överförbarhet. Den tillgängliga humana RPE-cellinjen ARPE-19 skiljer sig från primärceller (t.ex. de är mindre pigmenterade) och är därför endast av begränsat värde för prekliniska analyser1. Dessutom kan icke-mänskliga däggdjursceller köpas för mindre kostnad och i större mängder; mänsklig donatorvävnad kan erhållas från olika eyebanks, men tillgängligheten är begränsad och dyr. Slutligen måste nya läkemedel för avancerad terapi (ATMP, dvs. cell-, vävnads- eller genterapiläkemedel) appliceras på minst två olika arter innan de testas på patienter och dessa in vivo-studier kräver att allogena celltransplantationer förbereds.
Retinal neurodegenerativa sjukdomar är den ledande orsaken till blindhet i industrialiserade länder, bestående av vanliga sjukdomar som AMD, liksom sällsynta sjukdomar som retinitis pigmentosa, där retinalcellens död så småningom leder till blindhet. RPE-celler, fotoreceptor och retinal ganglion celler (RGC) skador kan i vissa fall bromsas, men det finns för närvarande inga botande terapier tillgängliga. ATMPs erbjuder potential att korrigera gendefekter, integrera terapeutiska gener eller ersätta degenererade celler, vilket möjliggör utveckling av regenerativa och botande terapier för sjukdomar som AMD; 13 genterapier har redan fått godkännande för försäljning inklusive en behandling för att behandla RPE65 mutationsassocierad retinal degeneration2,3. Bland äldre vuxna (>60 år) påverkas ~ 30 miljoner människor över hela världen av antingen neovaskulära (nvAMD) eller avascular (aAMD) AMD4. Båda formerna framkallas av åldersrelaterade utlösare inklusive oxidativ skada, funktionsnedsättning och förlust av RPE-celler följt av fotoreceptornedbrytning, bland annat (t.ex. genetiska risk alleler, rökning, högt blodtryck)5,6. I nvAMD förvärras patogenesen av en obalans av angiogena och anti-angiogena faktorer till förmån för den angiogena vaskulär endotel tillväxtfaktorn (VEGF) som inducerar choroidal neovascularization (CNV). Hittills kan endast nvAMD behandlas med månatliga intravitreala injektioner av hämmare av VEGF-proteinet för att undertrycka CNV; ingen effektiv behandling ännu är tillgänglig för aAMD6,7.
Flera studier utvärderade cellbaserade terapier för att ersätta anti-VEGF-behandlingen: studier gjorda av Binder et al., där nyskördade autologa RPE-celler transplanterades till patienter med nAMD8,9,10, visade måttlig visuell förbättring, men endast en liten grupp patienter nådde en slutlig synskärpa tillräckligt hög för att möjliggöra läsning. Nyligen använde en klinisk fas I-studie ett embryonalt stamcellsbaserat RPE-plåster för att behandla AMD med lovande resultat; RPE-plåstrets effekt, stabilitet och säkerhet i upp till 12 månader hos 2 av de 10 behandlade patienterna11. Dessutom har flera grupper publicerat studier där autologa RPE-Bruchs membran-choroid fläckar skördades från den perifera näthinnan och transplanterades till makula12,13,14; och inducerad pluripotent stamcell (iPSC)-härledda RPE plåster genererades för transplantation15. För aAMD har antikroppar riktade mot komplementvägen testats i kliniska prövningar6,16 och en fas I-studie med en enda intravitreal injektion av en adenoassocierad virusvektor (AAV) som kodar genen för faktorn CD59 (AAVCAGsCD59) hos patienter med geografisk atrofi (GA) slutfördes17; fas II-studien har nyligen påbörjats och syftar till att rekrytera 132 patienter med avancerad aAMD och att utvärdera utfallet vid 2 år efter intervention18. Slutligen har FocuS-studiegruppen inlett en klinisk fas I/II-studie med multicenter som utvärderar säkerheten, dosresponsen och effekten hos en rekombinant icke-replikerande AAV-vektor som kodar för ett mänskligt komplementfaktor19.
I första hand är målet med en regenerativ AMD-terapi transplantation av funktionella RPE-celler, som skadades eller förlorades. IPE- och RPE-celler delar dock många funktionella och genetiska likheter (t.ex. fagocytos och retinolmetabolism), och eftersom IPE-celler är mer genomförbara skördade har de föreslagits som ett RPE-substitut20. Även om det tidigare har visats att IPE-celltransplantationen fördröjer fotoreceptordegeneration i djurmodeller21,22 och stabiliserar den visuella funktionen hos patienter med slutfas nvAMD, observerades ingen signifikant förbättring hos dessa patienter23. Bristen på effekt kan bero på det låga antalet transplanterade celler och/eller obalansen av neuroprotektiva näthinnefaktorer. Ett alternativt tillvägagångssätt skulle vara att transplantera transfected pigment epitelial celler som överuttryck neuroprotektiva faktorer för att återställa retinal homeostas, upprätthålla återstående RPE celler och skydda photoreceptors och RGCs från degeneration. Följaktligen föreslår vi en ny terapi som omfattar transplantation av funktionella RPE- eller IPE-celler som har genomgått genteknik för att utsöndra neuroprotektiva och anti-angiogena proteiner, såsom PEDF, GM-CSF eller insulinliknande tillväxtfaktorer (IGF). Fördelen med att utveckla och analysera detta tillvägagångssätt hos flera arter istället för att använda en cellinje, endast en art eller mänsklig vävnad är: 1) ökad reproducerbarhet och överförbarhet av resultaten som framgår av många studier som realiseras i oberoende laboratorier och olika arter1,24,25; 2) Gris- eller nötkreatursceller är möjliga engångsceller utan att ytterligare djur offras. 3) Tillgången till särskilt svin- och nötkreatursceller gör det möjligt för stora testserier att ge robusta resultat. 4) Kunskapen om att isolera, odla och genetiskt modifiera celler från de mest använda modellerna möjliggör in vivo-analyser hos flera arter24,25,26 och erbjuder därmed ett förbättrat risk-nyttoförhållande för de första behandlade patienterna. 5) Flexibiliteten i det protokoll som presenteras gör det möjligt att använda det i olika modeller och experimentella upplägg och för alla okulära cellbaserade terapier med och utan genteknik. Alternativa tekniker som cellinjer eller mänsklig vävnad är däremot endast av begränsad överförbarhet och/eller begränsad disposabilitet. Cellinjer som ARPE-19 är idealiska för preliminära experiment; Låg pigmentering och hög spridning skiljer sig dock avsevärt från primärcellerna1. RPE- och IPE-celler, som är isolerade från mänsklig donatorvävnad, erbjuder en värdefull källa för överförbara in vitro-experiment. Vi får dock mänsklig vävnad från en amerikansk-amerikansk ögonbank vilket innebär att vävnaden är minst två dagar gammal (efter enucleation) och kräver en lång och dyr transport, men lokal donatorvävnad är inte tillgänglig i tillräckliga mängder för en produktiv forskning. Fördelen med användning av primärceller bekräftas av flera studier från andra grupper27,28.
För utveckling av en cellbaserad icke-viral genterapi med hjälp av SB100X transposonsystem för transfektering av primära RPE- och IPE-celler med generna som kodar för PEDF och/eller GM-CSF för att behandla nvAMD respektive aAMD, respektive29,30,31,32,fastställde vi först transfektionen av ARPE-19 celler1 . Därefter fastställdes isolerings- och transfektion protokollen i lättillgängliga bovin och svin primära celler. Nu har isolering och transfektion av primära RPE- och IPE-celler från fem olika arter etablerats, från små (som mus) till stora däggdjur (som nötkreatur). Det bekräftades i primära RPE- och IPE-celler som härrör från mänskliga donatorögon30. Produktionen av god tillverkningssed (GMP) av ATMP validerades med hjälp av mänsklig donatorvävnad samt33. Slutligen bedömdes både säkerhet och effektivitet i tillvägagångssättet in vivo i tre olika arter för vilka protokollet har anpassats: mus, råtta och kanin. I den kliniska installationen kommer en irisbiopsi att skördas från patienten och IPE-celler kommer att isoleras och transfekteras i renrummet, innan cellerna transplanteras subretinally tillbaka till samma patient. Hela processen kommer att ske under en enda kirurgisk session som varar cirka 60 minuter. Utvecklingen av behandlingsmetoden och utvärderingen av dess effektivitet begärde utmärkta in vitro- och ex vivo-modeller för att implementera robusta och effektiva genleveransmetoder, analysera effektiviteten hos genleverans, terapeutisk proteinproduktion och neuroprotektiva effekter och för att producera celltransplantationer för att testa tillvägagångssättet in vivo1,24,25,29,30 . Det är värt att nämna att behandlingen har det etiska godkännandet för en klinisk fas Ib/ IIa-studie från den etiska kommissionen för forskning i kantonen Genève (nr 2019-00250) och för närvarande sista prekliniska data som begärts för godkännande av schweiziska tillsynsmyndigheter samlas in med hjälp av det presenterade protokollet. I detta avseende visade prekliniska in vivo-data en signifikant minskning av CNV och utmärkt säkerhet24,25,31.
Här beskrivs isoleringen och kulturen av RPE/IPE-celler från nötkreatur, gris, kanin, råtta och mus och användningen av det integrativa SB100X transposon-systemet i kombination med elektroporation som en effektiv genleveransmetod. Särskilt primära PE celler transfected för att överuttryck PEDF och GM-CSF. Insamlingen av dessa protokoll gör det möjligt att genomföra in vitro- och in vivo-studierna i alla prekliniska faser av ATMP-utveckling. Dessutom har upplägget potential att anpassas till andra gener av intresse och sjukdomar.
Att ha standardiserade metoder för att isolera och odla PE-celler är grundläggande för att utveckla nya terapimetoder för retinala degenerativa sjukdomar. Med de protokoll som presenteras här kan PE-celler framgångsrikt isoleras från olika arter och odlas under långa perioder (hittills har den längsta kulturen upprätthållits i 2 år1,38); typisk PE-cellmorfologi, pigmentering och funktion observerades (figur 1, <strong cl…
The authors have nothing to disclose.
Ett tack förtjänar till Gregg Sealy och Alain Conti för deras utmärkta tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av Europeiska kommissionen inom ramen för det sjunde ramprogrammet, Den schweiziska nationella vetenskapsstiftelsen och Schmieder-Bohrisch-stiftelsen. Z.I. fick finansiering från Europeiska forskningsrådet, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] och B.M.W. från ett Fulbright Research Grant och Swiss Government Excellence Scholarship.
12-well plates | Corning | 353043 | |
24-well plates | Corning | 353047 | |
48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
6-well plate | Greiner | 7657160 | |
Betadine | Mundipharma | ||
Bonn micro forceps flat | |||
Colibri forceps (sterile) | |||
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
Forceps (different size) (sterile) | |||
Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
pFAR4-PEDF | |||
pFAR4-SB100X | |||
pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
Vannas spring scissors curved (sterile) |