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Genetics

साइट-निर्देशित ΠC31-मध्यस्थता एकीकरण और मलेरिया के Anopheles वैक्टर में कैसेट एक्सचेंज

Published: February 2, 2021 doi: 10.3791/62146
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3
1Vector Biology Department, Liverpool School of Tropical Medicine, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, 3Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California

Summary

प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि एनोफिलीज़ मलेरिया मच्छरों के जीनोम में साइट-निर्देशित संशोधनों को कैसे प्राप्त किया जाए, जो कि ΠC31 प्रणाली का उपयोग कर रहे हैं। वर्णित संशोधनों में एटीपी-असर डॉकिंग लाइनों के जीनोम में ट्रांसजेनिक कैसेट के एकीकरण और विनिमय दोनों शामिल हैं।

Abstract

मलेरिया के आनुवंशिक नियंत्रण के लिए कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण और संबंधित रणनीतियां एनोफिलीज मच्छरों के जीनोम को सही ढंग से संशोधित करने के लिए मान्य और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीकों पर निर्भर करती हैं। इन विधियों में से, πC31 प्रणाली सटीक और स्थिर साइट-निर्देशित ट्रांसजीन के एकीकरण, या पुनर्संयोजन-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (आरएमसीई) के माध्यम से एकीकृत ट्रांसजेनिक कैसेट्स के प्रतिस्थापन की अनुमति देती है। यह विधि दो विशिष्ट अनुलग्नक साइटों के बीच पुनर्संयोजन को उत्प्रेरित करने के लिए स्ट्रेप्टोमाइसेस की कार्रवाई पर निर्भर करती है, जो एटीटीपी (फेज से व्युत्पन्न) और एटीटीबी (मेजबान जीवाणु से व्युत्पन्न) नामित दो विशिष्ट अनुलग्नक साइटों के बीच पुनर्संयोजन को उत्प्रेरित करती है। सिस्टम एक या दो ATTP साइटों का उपयोग करता है जिन्हें पहले मच्छर जीनोम में एकीकृत किया गया है और दाता टेम्पलेट डीएनए में attB साइट (ओं) है। यहां हम बताते हैं कि दो प्लास्मिडों का उपयोग करके ATTP-असर Anopheles डॉकिंग लाइनों के जीनोम को स्थिर रूप से कैसे संशोधित किया जाए: एक attB-टैग किए गए दाता जो एकीकरण या विनिमय टेम्पलेट को ले जाते हैं और एक सहायक प्लास्मिड एन्कोडिंग को एन्कोडिंग करता है। हम दो प्रतिनिधि परिणामों की रिपोर्ट करते हैं, जो कि C31-मध्यस्थता साइट-निर्देशित संशोधन है: An. stephensi में एक ट्रांसजेनिक कैसेट का एकल एकीकरण और An. gambiae मच्छरों में RMCE। ΠC31-मध्यस्थता जीनोम हेरफेर मान्य, फिटनेस तटस्थ जीनोमिक साइटों से पुन: प्रस्तुत करने योग्य ट्रांसजीन अभिव्यक्ति का लाभ प्रदान करता है, जो फेनोटाइप के तुलनात्मक गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है। एकीकरण की साइट-निर्देशित प्रकृति भी एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन प्राप्त करने के लिए एकल सम्मिलन साइट और संभोग योजना के सत्यापन को काफी हद तक सरल बनाती है। ये और अन्य विशेषताएं मलेरिया मच्छरों और अन्य कीट वैक्टरों के ट्रांसजेनिक हेरफेर के लिए आनुवंशिक टूलकिट का एक आवश्यक घटक हैं।

Introduction

रोगों के मच्छर वैक्टर के जीनोम को मज़बूती से और पुनरुत्पादित रूप से संशोधित करने की क्षमता ने जीन के विवो कार्यात्मक सत्यापन में वृद्धि की है और वास्तविक आनुवंशिक वेक्टर नियंत्रण रणनीतियों के लिए दरवाजे खोल दिए हैं, जैसे कि एनोफिल्स मच्छरों को लक्षित करने वाले जो मलेरिया को प्रसारित करते हैं।

प्रारंभिक मच्छर जीनोम संपादन पूरी तरह से ट्रांसपोसेबल तत्व (टीई) -मध्यस्थता परिवर्तन पर निर्भर था, जिसमें पिग्गीबैक एनोफिल्स 2,3,4 में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला ट्रांसपोसन था। हालांकि, टीई एकीकरण की यादृच्छिक प्रकृति अवांछनीय संशोधनों को जन्म दे सकती है जैसे कि जीन नॉकआउट (सम्मिलन म्यूटाजेनेसिस) और ट्रांसजीन अभिव्यक्ति पर महत्वपूर्ण स्थिति प्रभाव5,6,7,8। कई सम्मिलन भी एक आम घटना है जब piggyBac5,9 का उपयोग कर रहे हैं, जो सत्यापन और एकल सम्मिलन श्रमसाध्य के साथ ट्रांसजेनिक लाइनों के अलगाव बनाता है. अन्य कमियों में उनके संभावित पुनरुत्थान शामिल हैं, जैसा कि एनोफिलीज़ स्टीफेंसी की जर्मलाइन में देखा गया है जब पिग्गीबैक ट्रांसपोसे 10,11,12 का स्रोत प्रदान किया जाता है, और डीएनए कार्गो के उनके सीमित आकार (लंबाई में 10-15 केबी) में परिवर्तन दक्षता दाता प्लास्मिड 13,14 के बढ़ते आकार के साथ गिरावट आई है।

इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए साइट-निर्देशित एकीकरण दृष्टिकोण पेश किए गए थे। मच्छरों में सबसे आम साइट-निर्देशित जीनोम संशोधन यह है कि πC31 प्रणाली (चित्रा 1a) द्वारा मध्यस्थता की जाती है। यह एक वायरल इंटीग्रेज़ द्वारा संचालित होता है जो दो हेटरोस्पेसिफिक अटैचमेंट (एटीटी) साइटों के बीच पुनर्संयोजन को उत्प्रेरित करता है जो स्वाभाविक रूप से बैक्टीरियोफेज के जीनोम में होता है, और स्ट्रेप्टोमाइसेस बैक्टीरिया होस्ट (एटीटीबी) 15 में स्वाभाविक रूप से होता है। दो साइटों का पुनर्संयोजन यूनिडायरेक्शनल है और इसके परिणामस्वरूप हाइब्रिड साइटों (attL और attR) का गठन होता है। इस तरह के हाइब्रिड साइटों के पुनर्संयोजन (डीएनए उच्छेदन के लिए अग्रणी) को न केवल एक सक्रिय वायरल इंटीग्रेज़ की उपस्थिति की आवश्यकता होगी, बल्कि एक और फेज-एन्कोडेड पुनर्संयोजन कारक 16,17 की भी आवश्यकता होगी। एक स्थिर एकीकरण साइट इस प्रकार उत्पन्न होती है जो संभावित अवांछित remobilization15 के मुद्दे को राहत देती है। इसके अलावा, सिस्टम बड़े कार्गो के एकीकरण की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, >100 केबी निर्माणों का एकीकरण डी मेलानोगास्टर 18 में रिपोर्ट किया गया था), काफी क्षमताओं को ले जाने की क्षमता में वृद्धि हुई है। एकीकरण एक एकल पूर्वनिर्धारित जीनोमिक लोकस में होता है जो एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन प्राप्त करने के लिए सम्मिलन और संभोग योजना के सत्यापन को बहुत सरल बनाता है। अंत में, एकीकरण की साइट-निर्देशित प्रकृति अभिव्यक्ति के सामान्यीकरण की अनुमति देती है क्योंकि वैकल्पिक ट्रांसजीन एक ही स्थान पर स्थित होते हैं और इसलिए एक ही पड़ोसी जीनोमिक संदर्भ में विनियमित होते हैं। दरअसल, तकनीक के मुख्य अनुप्रयोगों में से एक एक समान स्थान में सम्मिलन के बाद विभिन्न ट्रांसजीन द्वारा प्रदान किए गए फेनोटाइप की सीधी तुलना है।

ΠC31-मध्यस्थता एकीकरण को प्राप्त करने में दो चरण शामिल हैं: चरण I, एटीपी साइट (ओं) को ले जाने वाली ट्रांसजेनिक डॉकिंग लाइनों का निर्माण है, और चरण II डॉकिंग लाइन 19 के जीनोम में एक एटीटीबी-फ्लैंक्ड कार्गो का साइट-निर्देशित एकीकरण है। चरण I डॉकिंग लाइनों के निर्माण ने ATTP-टैग किए गए निर्माणों के TE-मध्यस्थता यादृच्छिक एकीकरण पर भरोसा किया है और इस प्रकार एक प्रारंभिक श्रमसाध्य प्रक्रिया (एकल-महिला संतानों पर दक्षिणी धब्बा और व्युत्क्रम पीसीआर विश्लेषण सहित) को अद्वितीय, ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय और फिटनेस तटस्थ जीनोमिक स्थानों में एक एकल एकीकरण घटना को ले जाने वाली ट्रांसजेनिक लाइनों को अलग और मान्य करने के लिए शामिल किया गया है। फिर भी, कई डॉकिंग लाइनों को विकसित किया गया है और An. C31-मध्यस्थता एकल एकीकरण के लिए An. gambiae19,20,21,22 और An. stephensi23,24,25 (तालिका 1) में मान्य किया गया है। इन लाइनों में से प्रत्येक डॉकिंग साइट के जीनोमिक स्थान और तनाव-विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि के संदर्भ में भिन्न होता है और उनसे नई ट्रांसजेनिक लाइनों की एक बड़ी विविधता बनाई जा सकती है। डॉकिंग लाइनों के उत्पादन के लिए TE-मध्यस्थता एकीकरण के जटिल सत्यापन को अब CRISPR / Cas9 technology26 द्वारा दरकिनार किया जा सकता है; हालांकि यह तटस्थ लोकी के एक प्राथमिकता ज्ञान पर निर्भर करता है लक्षित किया जा करने के लिए और उनके आसपास के अनुक्रमों.

मॉडल जीव डी. मेलानोगास्टर 27 से कीट जीनोम संपादन के लिए बड़े पैमाने पर लागू किया गया है, मच्छरों एडीज एजिप्टी 13,28, एई अल्बोपिक्टस 29, एन. गाम्बिया19, और एन।

विशेष रूप से वेक्टर नियंत्रण के लिए संभावित क्षेत्र रिलीज के मद्देनजर, विशेष रूप से वेक्टर नियंत्रण के लिए संभावित क्षेत्र रिलीज के मद्देनजर, पूरे एटीटीबी-असर दाता प्लास्मिड के मच्छर जीनोम में एकीकरण है, जिसमें अवांछनीय अनुक्रम जैसे एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन मार्कर और जीवाणु मूल के प्लास्मिड बैकबोन घटक शामिल हैं। इसे संबोधित करने के लिए, मानक प्रणाली का एक संशोधन, पुनर्संयोजन-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (आरएमसीई), को लागू किया गया था जो एक नए दाता डीएनए (चित्रा 1 बी) के साथ पहले से एकीकृत ट्रांसजेनिक कैसेट के सटीक प्रतिस्थापन की अनुमति देता है। यह प्रत्येक छोर पर दाता और प्राप्तकर्ता कैसेट को फ्लैंक करने वाली दो उलटी एटीटी साइटों का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, जो प्लास्मिड बैकबोन के एकीकरण के बिना कैसेट एक्सचेंज के परिणामस्वरूप दो स्वतंत्र पुनर्संयोजन घटनाओं को एक साथ होने के लिए प्रेरित करता है। यह बेहतर डिजाइन अवांछित अनुक्रमों के एकीकरण को दरकिनार करता है और उदाहरण के लिए पहले से एकीकृत फ्लोरोसेंट मार्कर 32 के नुकसान के लिए स्क्रीनिंग द्वारा अचिह्नित डीएनए कार्गो के एकीकरण को शामिल करने के लिए πC31 सिस्टम के आवेदन का विस्तार करता है।

आरएमसीई को पहले डी मेलानोगास्टर 32 के साथ प्राप्त किया गया था और बाद में गैर-मॉडल कीड़ों पर सफलतापूर्वक लागू किया गया था, जिसमें An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34, और B. mori35 शामिल हैं। RMCE के लिए कई डॉकिंग लाइनों को विकसित किया गया है और An. gambiae5,9,26 (तालिका 1) में मान्य किया गया है। हमारे ज्ञान के लिए, आरएमसीई को अभी तक अन्य एनोफिलीज़ वैक्टर प्रजातियों में खोजा जाना बाकी है।

आज तक, एनोफिलीज मच्छरों में व्यापक रूप से एनोफिलीज मच्छरों में एंटीमलेरिया प्रभावकों 19,24,36, GAL4 / UAS प्रणाली के घटकों सहित विभिन्न प्रकार के अणुओं को पेश करने और अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, कीटनाशक प्रतिरोध अध्ययन9,33, नियामक तत्व, रिपोर्टर जीन 5,21,37, और जीन-ड्राइव तत्व26 के लिए जीन को ओवरएक्सप्रेस और नॉकडाउन करने के लिए ,38।

यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि 1) एटीटीबी-फ्लैंक्ड कार्गो का साइट-निर्देशित एकीकरण कैसे किया जाए और 2) एनोफिलीज़ डॉकिंग लाइनों के जीनोम में उल्टे एटीबी साइटों द्वारा फ्लैंक किए गए निर्माण के आरएमसीई। यह दो प्लास्मिड का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है: एक दाता एटीटीबी-टैग किए गए प्लास्मिड ब्याज के ट्रांसजीन को ले जाते हैं, और एक सहायक प्लास्मिड जो πC31 integrase को व्यक्त करता है। प्रमुख मलेरिया वैक्टर An. gambiae और An. stephensi का उपयोग विशिष्ट उदाहरणों के रूप में किया जाता है, हालांकि ये प्रोटोकॉल अन्य एनोफिल्स प्रजातियों पर लागू होते हैं।

Figure 1
चित्र 1. साइट-निर्देशित जीनोम संशोधन, एकल एकीकरण और पुन: संयोजन-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (आरएमसीई), का उपयोग करके, πC31 प्रणाली का उपयोग करके। एक दाता प्लास्मिड में मौजूद एटीटीबी साइट (एस) (बैंगनी धारीदार) और एक प्राप्त डॉकिंग लाइन में मौजूद एटीपी साइट (ओं) (नीली धारीदार) के बीच पुनर्संयोजन को उत्प्रेरित करता है, जिसके परिणामस्वरूप हाइब्रिड साइटों एटीटीएल और एटीटीआर का गठन होता है। ए) एकीकरण तब प्राप्त किया जाता है जब एकल एटीटीबी और एटीटीपी साइटें फिर से संयोजित होती हैं और परिणामस्वरूप दो एकीकृत मार्करों (नीले और लाल) की उपस्थिति होती है। बी) आरएमसीई तब होता है जब दो एटीटीबी / पी साइटें एक साथ फिर से संयोजित होती हैं और इसके परिणामस्वरूप दाता प्लास्मिड (लाल मार्कर) द्वारा किए गए डॉकिंग लाइन (नीले मार्कर) की एटीटी साइटों के बीच कैसेट के प्रतिस्थापन में परिणाम होता है। C) ATTP (नीला) और ATTB (बैंगनी) के आंशिक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम और हाइब्रिड साइटों attL / R। पुनर्संयोजन बोल्ड ब्लैक में हाइलाइट किए गए 'टीटी' कोर अनुक्रमों के बीच होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

नोट:: सचित्र प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध वर्कफ़्लो चित्र 2 में दिखाया गया है।

1. के डिजाइन के πC31 attB -टैग की गईं plasmids (चित्रा 3)

  1. निम्नलिखित आवश्यक घटकों को ले जाने वाले ATTB दाता प्लास्मिड बनाएँ
    1. प्रमुख फ्लोरोसेंट मार्कर
      1. फ्लोरोसेंट मार्कर की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक प्रमोटर चुनें।
        नोट: एनोफिलीज़ ट्रांसजेनेसिस के लिए, फ्लोरोसेंट मार्कर आमतौर पर 3xP3 प्रमोटर 39 के विनियमन के तहत होते हैं, जो आंखों और तंत्रिका कॉर्ड में अभिव्यक्ति को चलाता है। वैकल्पिक रूप से, PUBc प्रमोटर 5 का उपयोग तब किया जा सकता है जब कई ऊतकों में अभिव्यक्ति वांछित हो। इस प्रोटोकॉल में उदाहरण के रूप में उपयोग किए जाने वाले दाता प्लास्मिड और डॉकिंग लाइनों को 3xP3 प्रमोटर का उपयोग करके चिह्नित किया गया है।
      2. एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) चुनें जो प्राप्त डॉकिंग लाइन के साथ संगत है ताकि वे आसानी से अलग हो सकें।
        नोट: डॉकिंग लाइन में पहले से मौजूद एक ही मार्कर का उपयोग न करें और जीएफपी (हरे)/ वाईएफपी (पीले) और जीएफपी (हरे) / सीएफपी (सियान) के एक साथ उपयोग से बचें क्योंकि वे मज़बूती से अंतर करना बहुत मुश्किल हैं। इस प्रोटोकॉल में उदाहरण के रूप में उपयोग किए जाने वाले दाता प्लास्मिड को या तो DsRed या YFP के साथ चिह्नित किया जाता है क्योंकि उन्हें CFP के साथ चिह्नित डॉकिंग लाइन में एकीकृत किया जाना है।
    2. attB पुनर्संयोजन साइट (ओं)
      1. एक ट्रांसजेनिक कैसेट (एकल-attB डिजाइन) (चित्रा 3A) के एकीकरण के लिए एक एकल attB साइट का उपयोग करें।
      2. RMCE (डबल-attB डिजाइन) के लिए दो उल्टे ATTB साइटों का उपयोग करें जहां साइटें एक दूसरे के संबंध में उल्टे रखी जाती हैं और दाता डीएनए टेम्पलेट (चित्रा 3 B) को संलग्न करती हैं।
        नोट:: attB साइट (ओं) का ओरिएंटेशन डॉकिंग लाइन में मौजूद attP साइट (ओं) के साथ संगत होना चाहिए।
    3. वांछित ट्रांसजीन कार्गो
      1. प्रयोग के विशिष्ट उद्देश्य के आधार पर मच्छर जीनोम में एकीकृत होने के लिए किसी भी अन्य वांछित सुविधाओं का उपयोग करें। यहां, हम An. stephensi के जीनोम में एक antimalarial effector अणु के एकीकरण और GAL4 / UAS प्रणाली के घटकों के एकीकरण का वर्णन करते हैं।
    4. प्लास्मिड बैकबोन घटक
      1. बैक्टीरिया में प्लास्मिड प्रतिकृति के लिए अन्य आवश्यक घटकों के बीच, विट्रो में प्लास्मिड चयन के लिए एक मार्कर (यानी, एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन) शामिल हैं।
        नोट: प्लास्मिड बैकबोन को एकीकरण (चित्रा 3 ए) के लिए एकल-एटीटीबी डिजाइन में मच्छर जीनोम में एकीकृत किया जाएगा, जबकि इसे आरएमसीई (चित्रा 3 बी) के लिए डबल-एटीटीबी डिजाइन में नहीं डाला जाएगा।

2. microinjection मिश्रण के लिए plasmids की तैयारी

नोट: यहां सचित्र प्रोटोकॉल में दो प्लास्मिड का उपयोग शामिल है: एक एटीटीबी-टैग किए गए दाता प्लास्मिड ब्याज के ट्रांसजीन को ले जाते हैं, और एक सहायक प्लास्मिड जो ड्रोसोफिला एचएसपी 70 प्रमोटर 40 के विनियमन के तहत πC31 इंटीग्रेज़ को व्यक्त करता है।

  1. एक एंडोटॉक्सिन मुक्त प्लास्मिड शुद्धिकरण किट का उपयोग करके दाता और सहायक प्लास्मिड को शुद्ध करें।
    नोट: सभी घटकों की अखंडता को सत्यापित करने के लिए इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली अंतिम प्लास्मिड तैयारी को अनुक्रमित करें।
  2. दो प्लास्मिड की उचित मात्रा को संयोजित करने के लिए दाता प्लास्मिड के 350 एनजी / μL की अंतिम एकाग्रता के साथ एक मिश्रण प्राप्त करने के लिए और सहायक प्लास्मिड के 150 एनजी / μL जब इंजेक्शन बफर में पुन: निलंबित किया जाता है।
    नोट: मिश्रण की आवश्यक मात्रा की गणना करते समय, विचार करें कि 10-15 μL नियोजित इंजेक्शन के प्रत्येक दिन के लिए पर्याप्त हैं और डीएनए को पहले से तैयार किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। 60-500 एनजी / μL की इंटीग्रेज़ हेल्पर प्लास्मिड सांद्रता और 85-200 एनजी / μL के दाता प्लास्मिड सांद्रता को भी 21,22,26,41 की सूचना दी गई है।
  3. 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) और बर्फ-ठंडे 100% ईटीओएच और भंवर के 2.5 संस्करणों के 0.1 वॉल्यूम जोड़कर डीएनए को अवक्षेपित करें। एक सफेद अवक्षेप तुरंत दिखाई देना चाहिए। अत्यधिक केंद्रित प्रारंभिक प्लास्मिड तैयारी (यानी, ~ 1 μg / μL) होने से वर्षा दक्षता में सुधार होता है।
    नोट: रोक बिंदु - अवक्षेप -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 15,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज, supernatant त्याग, और बर्फ के ठंडे 70% EtOH के 1 मिलीलीटर के साथ गोली धोना।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 15,000 x g पर बर्फ-ठंडा 70% EtOH और सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर के साथ गोली को धोएं।
  6. गोली और हवा सूखी परेशान किए बिना supernatant त्याग.
  7. 500 ng/ μL की कुल अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 1x इंजेक्शन बफर (0.1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7.2, 0.22 μm फ़िल्टर निष्फल) में गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट: मान लें कि वर्षा प्रक्रिया के दौरान कुछ डीएनए खो जाएगा; इसलिए, पहले इंजेक्शन बफर की एक छोटी मात्रा जोड़ें, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (जैसे, नैनोड्रॉप) पर एकाग्रता की जांच करें, और फिर 500 एनजी / μL तक पहुंचने के लिए एक उपयुक्त शेष मात्रा जोड़ें।
  8. सुनिश्चित करें कि डीएनए पूरी तरह से पुन: निलंबित है, प्रत्येक 10-15 μL के ऐलीकोट तैयार करें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
  9. इंजेक्शन के दिन, किसी भी कण अवशेष को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 15,000 x g पर एक ऐलीकोट और सेंट्रीफ्यूज को पिघलाएं।
    नोट:: कण हटाने के लिए एक वैकल्पिक विधि एक 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करने के लिए है। इंजेक्शन मिश्रण में कण अवशेषों की उपस्थिति से बचें क्योंकि वे भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के दौरान सुई रुकावट का कारण बनते हैं।

3. एक Anopheles डॉकिंग लाइन से भ्रूण के microinjection

  1. रक्त माइक्रोइंजेक्शन से पहले वांछित डॉकिंग लाइन से 4-7-दिन पुराने मच्छरों को खिलाता है (यानी, सोमवार और मंगलवार को इंजेक्शन के लिए पिछले शुक्रवार को मादाओं को खिलाते हैं; गुरुवार और शुक्रवार को इंजेक्शन के लिए उसी सप्ताह के सोमवार को मादाओं को खिलाते हैं)।
  2. रक्त एक ही दिन में जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) मच्छरों (यानी, डॉकिंग लाइन की एक ही जीनोमिक पृष्ठभूमि वाले मच्छरों) को खिलाते हैं; ये outcrossing के लिए आवश्यक हो जाएगा.
    नोट: रक्त भोजन का आकार और गुणवत्ता अंडे की गुणवत्ता को प्रभावित करती है, इसलिए हमेशा ताजा रक्त का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है (यानी, पिछले 7 दिनों के भीतर खींचा गया रक्त)। चूहों पर हाथ से खिलाने या खिलाने से अंडे की गुणवत्ता और मात्रा बढ़ सकती है, हालांकि इन तरीकों को प्रोत्साहित नहीं किया जाता है। मानव और पशु उपयोग के लिए विशिष्ट अनुमोदित प्रोटोकॉल आवश्यक होंगे।
  3. भ्रूण microinjections प्रदर्शन
    1. 45 डिग्री के कोण पर भ्रूण के पीछे के ध्रुव को लक्षित करके 25 mM NaCl42 में एक गाम्बिया भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन निष्पादित करें। भ्रूण संग्रह, संरेखण, और microinjection के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए Pondeville et al.43 और लोबो एट al.44 को देखें।
    2. एक 30 डिग्री कोण पर भ्रूण के पीछे ध्रुव को लक्षित करके हेलोकार्बन तेल 700: 27 (2: 1) में एक stephensi भ्रूण microinjections प्रदर्शन। भ्रूण संग्रह, संरेखण, और microinjection के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल Terenius et al.45 और लोबो एट अल.44 में पाया जा सकता है।
    3. बाँझ आसुत पानी (पीएच 7.2) से भरे पेट्री डिश में इंजेक्शन के तुरंत बाद अंडे स्थानांतरित करें और उन्हें कीटीय स्थितियों में वापस कर दें।
  4. हैचिंग पर, जी 0 लार्वा को नमकीन आसुत जल (0.1% टॉनिक नमक) के साथ एक ट्रे में दैनिक और पीछे प्यूपे में स्थानांतरित करें।
  5. रिकॉर्ड हैचिंग दर (यानी, हैच किए गए लार्वा की संख्या / इंजेक्ट किए गए भ्रूण की संख्या)।
    नोट: भ्रूण आंदोलन एड्स हैचिंग, तो कोमल घूमना वांछनीय है. इंजेक्शन के बाद हैचिंग ~ 48 घंटे शुरू होना चाहिए। चूंकि इंजेक्शन एक मामूली विकासात्मक देरी का कारण बन सकता है, इसलिए 3-4 दिनों के लिए देर से हैचिंग लार्वा के लिए निगरानी रखने की सलाह दी जाती है।

4. पार और परिवर्तित व्यक्तियों की स्क्रीनिंग

  1. [वैकल्पिक कदम] फ्लोरोसेंट मार्कर की क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीन G0 (इंजेक्टेड) 1 या 2 instar लार्वा (L1-L2)।
    1. कुओं के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड के लिए G0 L1-L2 लार्वा हस्तांतरण करने के लिए एक ठीक टिप ग्लास पिपेट का उपयोग करें। प्रत्येक कुएं में एक लार्वा रखें।
    2. फ्लोरोसेंट मार्कर की क्षणिक अभिव्यक्ति की उपस्थिति के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयुक्त फ़िल्टर के साथ एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोस्कोप का उपयोग करें।
      नोट:: क्षणिक अभिव्यक्ति का पैटर्न उपयोग किए गए प्रमोटर द्वारा निर्धारित किया जाता है। 3xP3 प्रमोटर का उपयोग करते समय, फ्लोरोसेंट मार्कर की क्षणिक अभिव्यक्ति गुदा पैपिले में दिखाई देती है (Pondeville et al.43 में चित्रा 6 देखें)
    3. रियर जी 0 सकारात्मक व्यक्तियों को अलग से।
  2. सॉर्ट G0 pupae एक stereoscope52 के तहत सेक्स द्वारा.
  3. पुरुषों को 3-5 (संस्थापक परिवारों) के समूहों में अलग-अलग पिंजरों में उभरने दें और उम्र से मेल खाने वाली डब्ल्यूटी मादाओं की 10 गुना अधिकता जोड़ें।
    नोट: चूंकि पुरुष कई बार संभोग करते हैं, इसलिए प्रत्येक पुरुष के संभोग की संभावनाओं को अधिकतम करने के लिए डब्ल्यूटी मादाओं की अधिकता प्रदान करना महत्वपूर्ण है।
  4. मादाओं को 10-15 (संस्थापक परिवारों) के समूहों में अलग-अलग पिंजरों में उभरने दें और समान संख्या में आयु-मिलान वाले डब्ल्यूटी पुरुषों को जोड़ें।
    नोट: यदि कीट में सीमित स्थान है, तो मादाएं एक ही पिंजरे में एक साथ उभर सकती हैं। मादा से पुरुष अनुपात 1 पुरुष से 3 महिलाओं के रूप में कम हो सकता है।
  5. वयस्कों को 4-5 दिनों के लिए संभोग करने की अनुमति दें और महिलाओं को रक्त भोजन प्रदान करें।
    नोट: रक्त फ़ीड और कई gonotrophic चक्र से transformants हो रही की संभावना को अधिकतम करने के लिए कई बार G0 मादाओं से अंडे इकट्ठा.
  6. आउटक्रॉसिंग के लिए एक ही समय में डब्ल्यूटी व्यक्तियों को रक्त फ़ीड करें।
  7. अंडे ले लीजिए और अगली पीढ़ी G1s उभरते हुए पीछे.
  8. ट्रांसफॉर्मेंट की पहचान करने के लिए उपयुक्त प्रतिदीप्ति के लिए स्क्रीन G1 L3-L4 लार्वा।
    1. फिल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध एक पेट्री डिश में लार्वा इकट्ठा करें या एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर और एटीटीबी-टैग किए गए कार्गो के साथ पेश किए गए मार्कर की उपस्थिति के लिए उपयुक्त फिल्टर के साथ एक फ्लोरोसेंट स्टीरियोस्कोप का उपयोग करके स्क्रीन।
      नोट: 3xP3 प्रमोटर द्वारा संचालित प्रतिदीप्ति सभी postembryonic चरणों में दिखाई देती है और स्क्रीनिंग युवा लार्वा पर की जा सकती है, हालांकि ये अधिक नाजुक हैं और अपेक्षाकृत सावधानी से संभाला जाना चाहिए। प्यूपे की भी स्क्रीनिंग की जा सकती है।
      1. नए और पहले से मौजूद मार्कर की उपस्थिति के लिए एकीकरण स्क्रीन के लिए एकल-एटीटीबी डिजाइन के लिए; वे दोनों मौजूद होना चाहिए क्योंकि नई कैसेट मूल एक के बगल में डाला गया है (चित्रा 3 ए, चित्रा 4)। 
        नोट:: एकल attB डिज़ाइन के लिए स्क्रीनिंग अपवाद: मार्कर-कम डॉकिंग lines22 का उपयोग करते समय, केवल नए मार्कर की उपस्थिति के लिए स्क्रीन। डॉकिंग लाइनों का उपयोग करते समय जहां एकीकरण के परिणामस्वरूप पहले से मौजूद मार्कर 21 की निष्क्रियता होती है, नए मार्कर की उपस्थिति और पहले से मौजूद एक के नुकसान के लिए स्क्रीन।
      2. RMCE के लिए डबल-attB डिजाइन के लिए, नए मार्कर की उपस्थिति और पहले से मौजूद एक के नुकसान के लिए स्क्रीन, केवल नए शुरू किए गए मार्कर मौजूद होने चाहिए क्योंकि नया कैसेट मूल एक (चित्रा 3 बी, चित्रा 5) को प्रतिस्थापित करता है।
        नोट: कभी-कभी एकीकरण घटनाओं को RMCE प्रयोगों में पुनर्प्राप्त किया जा सकता है जहां केवल एक ही ATTP पुन: संयोजित किया गया है और इस प्रकार दोनों मार्कर मौजूद होंगे। जी 1 व्यक्तियों की स्क्रीनिंग को उसी प्रक्रिया के बाद प्यूपा चरण में भी किया जा सकता है।
  9. स्थानांतरण ने G1 व्यक्तियों को एक लार्वा ट्रे में बदल दिया और पीछे pupae के लिए पीछे। एक अप्रत्याशित मार्कर अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ गैर-फ्लोरोसेंट व्यक्तियों और व्यक्तियों को छोड़ दें।
  10. सॉर्ट सेक्स द्वारा G1 pupae परिवर्तित और विपरीत लिंग आयु मिलान WT व्यक्तियों के साथ उन्हें बड़े पैमाने पर पार.
  11. वयस्कों को 4-5 दिनों के लिए संभोग करने की अनुमति दें, रक्त भोजन प्रदान करें, अंडे एकत्र करें, और अगली पीढ़ी के जी 2 संतानों को पीछे करें।
    1. एकल एकीकरण प्रयोगों के लिए, एन मास क्रॉस से सीधे अंडे एकत्र करें क्योंकि एकीकरण साइट सभी व्यक्तियों में समान है।
    2. आरएमसीई प्रयोगों के लिए, एकल मादाओं से अंडे एकत्र करें और दो वैकल्पिक कैसेट अभिविन्यास (चित्रा 3 बी) की संभावित उपस्थिति के कारण आणविक मूल्यांकन पूरा होने तक संतानों को अलग बनाए रखें।
  12. फ्लोरोसेंट मार्कर की उपस्थिति के लिए जी 2 संतानों (या तो लार्वा या प्यूपा चरण में) की स्क्रीन करें (50% व्यक्तियों को सकारात्मक होने की उम्मीद है), गैर-फ्लोरोसेंट संतानों को छोड़ दें।
  13. आणविक विश्लेषण के लिए जी 2 सकारात्मक व्यक्तियों के सबसेट को अलग रखें, बाकी को वयस्कता में पीछे करें।
    नोट: यदि सभी G2 व्यक्तियों को जीवित रखा जाना चाहिए, तो आणविक विश्लेषण एकल वयस्क के पैरों 46 या प्यूपल केस डीएनए निष्कर्षण (एल ग्रिगोरकी व्यक्तिगत संचार) पर आयोजित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, आणविक विश्लेषण सभी जी 2 व्यक्तियों के ओवीपोसिटेड होने और अंडे सेने के बाद किया जा सकता है।
  14. वयस्क पुरुषों और महिलाओं को नई ट्रांसजेनिक लाइन स्थापित करने के लिए एक ही पिंजरे में इंटरक्रॉस करने की अनुमति दें।
    नोट: RMCE प्रयोगों के लिए, वयस्क intercross एक एकल महिला से व्युत्पन्न भाई-बहनों के बीच होना चाहिए जब तक कि सम्मिलन का अभिविन्यास आणविक विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित नहीं किया जाता है।

5. डीएनए प्रवर्धन (पीसीआर) द्वारा सम्मिलन साइट के आणविक सत्यापन

  1. परिवर्तन के बाद डॉकिंग लाइन के जीनोम में अनुमानित सम्मिलन साइट का एक नक्शा तैयार करें।
    1. एकल एकीकरण: सुनिश्चित करें कि अनुमानित सम्मिलन साइट मूल डॉकिंग निर्माण के साथ-साथ दो हाइब्रिड साइटों एटीटीएल और एटीटीआर (चित्रा 3 ए) के बीच दाता प्लास्मिड के पूरे अनुक्रम को वहन करती है।
    2. RMCE: सुनिश्चित करें कि पूर्वानुमानित सम्मिलन साइट डॉकिंग लाइन के समान है जहां हाइब्रिड उल्टे attL साइटें मूल उल्टे ATTP साइटों को प्रतिस्थापित करती हैं और एक्सचेंज टेम्पलेट मूल रूप से उनके बीच मौजूद कैसेट को प्रतिस्थापित करता है (चित्रा 3 B)।
  2. डिजाइन oligonucleotide प्राइमर एकीकरण लोकस के दोनों ओर सम्मिलन जंक्शन को बढ़ाने के लिए.
    1. एकल एकीकरण: डिजाइन ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर जोड़े जो attR और / या attL साइटों पर फैले हुए हैं। एक प्राइमर को पहले से एकीकृत डॉकिंग निर्माण और दूसरे को नए एकीकृत ट्रांसजीन (चित्रा 3 ए) से बांधना चाहिए।
    2. आरएमसीई: कैसेट प्रतिस्थापन गुणसूत्र (नामित ए और बी) के संबंध में दो अलग-अलग झुकावों में हो सकता है। 4 ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरों के वैकल्पिक संयोजनों को डिजाइन करने के लिए केवल एक अभिविन्यास में एक असतत उत्पाद देने के लिए, एक जोड़ी अभिविन्यास ए के लिए नैदानिक है, और दूसरा अभिविन्यास बी (चित्रा 3 बी, चित्रा 6) के लिए।
  3. जी 2 सकारात्मक व्यक्तियों से जीनोमिक डीएनए निकालें और अनुमानित एकीकरण साइट मानचित्रों से अपेक्षित नैदानिक amplicons की उपस्थिति की कल्पना करने के लिए नैदानिक पीसीआर और जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन।
    नोट: डीएनए वैकल्पिक रूप से एकल वयस्क के पैरों 46 या प्यूपल मामलों (एल ग्रिगोरकी व्यक्तिगत संचार) से निकाला जा सकता है।
  4. अपेक्षित अनुक्रमों की पुष्टि करने के लिए अनुक्रम पीसीआर उत्पाद.

Figure 2
चित्र 2. एनोफिलीज़ मच्छरों में साइट-निर्देशित ΠC31 जीनोम संशोधन के लिए वर्कफ़्लो आरेख. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. ΠC31-मध्यस्थता एकल एकीकरण (A) और RMCE (B) का आणविक आधार। ए) एक An. stephensi डॉकिंग लाइन (80.9, तालिका 1) में जीनोमिक सम्मिलन के योजनाबद्ध नक्शे एक एकल ATTP साइट ले जा रहे हैं और CFP (शीर्ष) के साथ चिह्नित, एक एकल-attB डिजाइन दाता प्लास्मिड DsRed (मध्य) के साथ चिह्नित, और सफल एकीकरण (नीचे) के बाद परिणामी अपेक्षित सम्मिलन साइट। बी) एक An. gambiae डॉकिंग लाइन (A11, तालिका 1) में जीनोमिक सम्मिलन के योजनाबद्ध नक्शे दो उल्टे ATTP साइटों को ले जाते हैं और CFP (शीर्ष) के साथ चिह्नित होते हैं, एक डबल-attB डिज़ाइन दाता प्लास्मिड को YFP (मध्य) के साथ चिह्नित किया जाता है, और सफल RMCE (नीचे) के परिणामस्वरूप अपेक्षित सम्मिलन साइट होती है। लहरदार लाइन: मच्छर जीनोम; धारीदार तीर: पिग्गीबैक ट्रांसपोसन हथियार; 3xP3: फ्लोरोसेंट मार्कर के प्रमोटर; SV40: वायरल टर्मिनेटर; ओरी: प्रतिकृति की उत्पत्ति; AmpR: ampicillin प्रतिरोध जीन. क्रॉसिंग लाइनें attP और attB साइटों के बीच पुनर्संयोजन की साइट (ओं) का प्रतिनिधित्व करती हैं। गिने हुए काले तीर सम्मिलन लोकस (प्रोटोकॉल के चरण 5) के आणविक सत्यापन के लिए प्राइमर बाइंडिंग साइटों का प्रतिनिधित्व करते हैं। पूरी तरह से एनोटेट एकल और डबल एटीटीबी-टैग किए गए प्लास्मिड अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

यहां सचित्र प्रोटोकॉल ~ 10 सप्ताह में एक स्थिर एनोफिलीज़ ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न करने में सक्षम बनाता है (21-दिवसीय मच्छर जीवन चक्र मानते हुए)।

An. gambiae में पोस्ट-इंजेक्शन लार्वा हैचिंग दर आम तौर पर An. stephensi की तुलना में कम होने की उम्मीद है, हालांकि 10-50% के बीच हैचिंग दर 9,20,24,26,33,43,47 बताई गई है। उपयुक्त इंजेक्शन तकनीक को देखते हुए, ≥20% की हैचिंग दर आमतौर पर ट्रांसफॉर्मेंट उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त होती है। भ्रूण द्वारा डीएनए अपटेक का मूल्यांकन फ्लोरोसेंट मार्कर की क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए युवा लार्वा की स्क्रीनिंग करके किया जा सकता है। एक में सफल RMCE प्रयोगों में 3xP3 प्रमोटर जीवित G0 लार्वा के 50% तक का उपयोग कर gambiae गुदा papillae48 में मार्कर की episomal अभिव्यक्ति से पता चला.

परिवर्तन दक्षता के सामान्यीकृत अनुमानों का मूल्यांकन प्रयोगशालाओं के बीच और यहां तक कि प्रयोगों के बीच भी करना मुश्किल है क्योंकि परिवर्तन चर के एक जटिल इंटरप्ले पर निर्भर करता है जिसमें इंजेक्शन वाले डीएनए की शुद्धता, एकाग्रता, आकार और संभावित विषाक्तता, अंडे की गुणवत्ता, अंडे की गुणवत्ता, अंडे के पूर्व और बाद के इंजेक्शन हैंडलिंग, मच्छर पालन, और सबसे महत्वपूर्ण बात ऑपरेटर का अनुभव शामिल है। 7% तक की परिवर्तन दर RmCE के लिए An. gambiae में प्राप्त की गई है (कुल G0 व्यक्तियों में स्वतंत्र परिवर्तन घटनाओं की संख्या के रूप में गणना की गई) 9,26,33, और An. stephensi में एकीकरण के लिए 2.2% तक परिवर्तन दर। हम कम से कम 500 भ्रूण को इंजेक्ट करने का सुझाव देते हैं, जो कम से कम 100 जी 0 लार्वा और 2-7 जी 0 वयस्क संस्थापकों के हैचिंग का कारण बनना चाहिए, जिसमें से स्थिर रूप से परिवर्तित संतान प्राप्त की जा सकती है। यदि जी 0 लार्वा में क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीनिंग, तो 40 सकारात्मक लार्वा तक की उम्मीद की जा सकती है।

3xP3 प्रमोटर द्वारा विनियमित फ्लोरोसेंट मार्करों की स्क्रीनिंग के माध्यम से परिवर्तन के फेनोटाइपिक सत्यापन के उदाहरण ों को चित्र 4 और  फिगर 5 में बताया गया है। चित्रा 4 सीएफपी (80.9, तालिका 1) के साथ चिह्नित डॉकिंग लाइन में एक DsRed-चिह्नित कैसेट के सम्मिलन द्वारा प्राप्त एक नई An. stephensi रेखा को दर्शाता है, जिसके परिणामस्वरूप G1 संतति दोनों मार्करों को व्यक्त करती है जैसा कि आंखों में पाए गए लाल और नीले प्रतिदीप्ति द्वारा इंगित किया गया है।

आरएमसीई डिजाइनों के बजाय मार्कर के प्रतिस्थापन के परिणामस्वरूप मूल रूप से दाता प्लास्मिड के साथ डॉकिंग लाइन में डाला गया है। चित्रा 5A औरचित्र  B इस मार्कर विनिमय को CFP (A11, तालिका 1) के साथ चिह्नित एक An. gambiae डॉकिंग लाइन में चित्रित करते हैं, जहां सफल RMCE के बाद CFP मार्कर खो जाता है और YFP मार्कर का अधिग्रहण किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप पीला (लेकिन नीला नहीं) आंख और तंत्रिका कॉर्ड प्रतिदीप्ति 33 होता है। कभी-कभी, आरएमसीई वांछित ट्रांसजेनिक कैसेट के आदान-प्रदान के बजाय एक एकल एकीकरण घटना में परिणाम कर सकता है जैसा कि चित्रा 5 सी में चित्रित किया गया है, जहां मूल सीएफपी और नए वाईएफपी मार्करों दोनों के साथ चिह्नित एक लार्वा दिखाया गया है। यह बताया गया है कि परिवर्तन घटनाओं की कुल संख्या का 50% तक एकल एकीकरण 9,33 हैं।

फ्लोरोसेंट मार्कर की उपस्थिति के लिए स्क्रीनिंग करते समय संभावित पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस से इसके सिग्नल को अलग करना महत्वपूर्ण है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब एनोफिलीज़ लार्वा के रूप में सीएफपी का उपयोग करना प्राकृतिक नीले रंग के ऑटोफ्लोरेसेंस (चित्रा 6 ए) प्रदर्शित करता है। आवर्धन को बढ़ाना और ऊतकों और अंगों पर ध्यान केंद्रित करना जहां प्रतिदीप्ति को प्रमोटर द्वारा संचालित किए जाने की उम्मीद है, 3xP3-CFP मार्कर का उपयोग करके चित्रा 6B में सचित्र के रूप में सच्चे CFP-सकारात्मक व्यक्तियों की पहचान करने के लिए आवश्यक है।

व्यक्तिगत ट्रांसफॉर्मेंट को अंततः अपेक्षित सम्मिलन साइट की पुष्टि करने के लिए पीसीआर के माध्यम से आणविक रूप से मूल्यांकन किया जाता है। चित्रा 7 एक एक्सचेंज से व्यक्तियों में पीसीआर सत्यापन की रिपोर्ट करता है एक गाम्बिया लाइन मच्छर जीनोम 33 में सम्मिलन के दो संभावित झुकाव दिखा रही है।

Figure 4
चित्र 4. An. stephensi लार्वा (पृष्ठीय दृश्य) में πC31 एकल एकीकरण का सत्यापन। ए) डॉकिंग लाइन (80.9, तालिका 1) 3xP3 प्रमोटर के विनियमन के तहत आंखों में सीएफपी व्यक्त करती है। बी) सफल एकीकरण के परिणामस्वरूप नए अधिग्रहित DsRed की अभिव्यक्ति के साथ-साथ आंखों में मूल CFP मार्कर भी होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. An. gambiae लार्वा (ventral view) में πC31 RMCE का सत्यापन। ए) डॉकिंग लाइन (ए 10, तालिका 1) आंखों (ई) और तंत्रिका कॉर्ड (एनसी) 5 में 3xP3 प्रमोटर के विनियमन के तहत सीएफपी व्यक्त करती है। बी) सफल आरएमसीई परिणाम सीएफपी से वाईएफपी 33 तक फ्लोरोसेंट मार्कर की अदला-बदली में होता है। सी) एकल एकीकरण घटना आरएमसीई प्रयोग के दौरान हुई जहां ट्रांसफॉर्मेंट लार्वा सीएफपी और वाईएफपी मार्कर दोनों को व्यक्त करता है। यह लार्वा GAL4 / UAS घटकों को वहन करता है जो YFP के एक व्यापक अभिव्यक्ति पैटर्न का कारण बनता है, विशेष रूप से पेट की मांसपेशियों में मजबूत (am)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6. CFP autofluorescence in An. gambiae लार्वा (पृष्ठीय दृश्य). ए) सीएफपी फिल्टर का उपयोग करके एक सकारात्मक (सीएफपी +) और एक नकारात्मक (सीएफपी-) एल 4 लार्वा की साइड-बाय-साइड छवि। बी) लार्वा आंखों की क्लोज-अप छवि जो सीएफपी + बनाम सीएफपी-व्यक्ति को प्रकट करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7. प्रतिनिधि ट्रांसजेनिक में कैसेट सम्मिलन के अभिविन्यास का आणविक सत्यापन एक गाम्बिया द्वारा बनाया गया है, जो πC31 RMCE द्वारा बनाया गया है। ट्रांसजेनिक कैसेट सम्मिलन साइट के संबंध में दो वैकल्पिक अभिविन्यास (ए या बी) में से एक में डाला जा सकता है। प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया (I - IV) प्राइमरों (5-8) 33 के संयोजन का उपयोग करती है, जिसे प्रत्येक अभिविन्यास के लिए एक नैदानिक प्रवर्धन टुकड़ा देने के लिए डिज़ाइन किया गया है जैसा कि योजनाबद्ध प्लास्मिड मानचित्रों में इंगित किया गया है। T1: प्रतिनिधि ट्रांसजेनिक व्यक्ति सम्मिलन ए के अभिविन्यास ले जाने; T2: प्रतिनिधि ट्रांसजेनिक व्यक्ति सम्मिलन बी के अभिविन्यास ले जाने; डब्ल्यूटी: जंगली प्रकार; डीएल: डॉकिंग लाइन; -: प्रतिक्रिया नकारात्मक नियंत्रण जहां पानी टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इस आंकड़े को एडॉल्फी एट अल (2019)33 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रजातियां मोच नाम attP(s) क्रोमो-कुछ प्रवर्तक-मार्कर मूल संस्था संदर्भ
An. stephensi इंडियाना 26.10b अकेला 2R 3xP3-eCFP कैलिफ़ोर्निया इरविन विश्वविद्यालय 25
An. stephensi इंडियाना 44Cb अकेला X 3xP3-eCFP कैलिफ़ोर्निया इरविन विश्वविद्यालय 23, 24
An. stephensi इंडियाना 80.9b अकेला 2L 3xP3-eCFP कैलिफ़ोर्निया इरविन विश्वविद्यालय इस अध्ययन
An. गैम्बिया G3 113 अकेला 2R 3xP3-eCFP कैलिफ़ोर्निया इरविन विश्वविद्यालय इस अध्ययन
An. गैम्बिया KIL Ec अकेला 3R 3xP3-eCFP Keele Univ. 19, 43
An. गैम्बिया G3 X1 अकेला 2L कोई मार्कर नहीं स्ट्रासबर्ग का विश्वविद्यालय 22
An. गैम्बिया G3 YAttP अकेला Y 3xP3-RFP इंपीरियल कॉलेज लंदन 21
An. गैम्बिया G3 A10b दोगुना 2R 3xP3-eCFP लिवरपूल स्कूल ट्रोप. मेड। 5
An. गैम्बिया G3 A11b दोगुना 2R 3xP3-eCFP लिवरपूल स्कूल ट्रोप. मेड। 9
एक। जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय (एम जैकब्स-लोरेना का उपहार) से तनाव और >20 वर्षों के लिए कैलिफोर्निया इरविन विश्वविद्यालय में संस्कृति में।
b. ये पंक्तियां उचित अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध हैं।
c. यह लाइन MRA-1163 के रूप में www.beiresources.org बीईआई रिपॉजिटरी में उपलब्ध है।

तालिका 1. Anopheles attP डॉकिंग लाइनों.

Discussion

एटीटीबी-टैग किए गए प्लास्मिड का सटीक डिजाइन जो पसंद की डॉकिंग लाइन के साथ संगत है, प्रयोग की सफलता के लिए सर्वोपरि है। ट्रांसफॉर्मेंट की स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्कर की पसंद पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए, जिसमें प्रतिदीप्ति रंग और अभिव्यक्ति का पैटर्न शामिल है, जो डॉकिंग लाइन में पहले से मौजूद पैटर्न के अधीन होगा। फ्लोरोसेंट मार्करों का उपयोग करना आवश्यक है जो आसानी से अलग-अलग हैं: अच्छे मार्कर संयोजनों में आरएफपी (लाल)/ सीएफपी (सियान), आरएफपी (लाल)/ जीएफपी (हरा), आरएफपी (लाल)/ वाईएफपी (पीला), और वाईएफपी (पीला)/ सीएफपी (सियान) शामिल हैं, जबकि बचने के लिए संयोजन वाईएफपी (पीला)/ जीएफपी (हरा) और सीएफपी (सियान) / जीएफपी (हरा) हैं। 3xP3 प्रमोटर 39, आंखों और तंत्रिका कॉर्ड के लिए विशिष्ट, मच्छर ट्रांसजेनेसिस के लिए फ्लोरोसेंट मार्करों की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए सबसे अधिक बार उपयोग किया जाता है। दरअसल, वर्तमान में उपलब्ध सभी एनोफिलीज़ डॉकिंग लाइनें इस प्रमोटर का उपयोग करती हैं। वैकल्पिक नियामक क्षेत्र An. gambiae polyubiquitin जीन (PUBc)5 या वायरल प्रमोटर IE120 के हैं, जो कई ऊतकों में अभिव्यक्ति को चलाते हैं। जब 3xP3 के साथ उपयोग किया जाता है, तो ये प्रमोटर संभावित रंग संयोजनों और यहां तक कि एक ही फ्लोरोफोर के उपयोग का विस्तार करेंगे। संकेतित प्रमोटर मच्छर जीवन चक्र के दौरान सक्रिय होते हैं जो सभी जीवन चरणों में स्क्रीनिंग और प्रतिदीप्ति निगरानी की अनुमति देते हैं। प्लास्मिड डिजाइन के दौरान एक अतिरिक्त विचार एकीकृत या आदान-प्रदान किए जाने वाले कार्गो का आकार है। जबकि πC31 प्रणाली में उल्लेखनीय वहन क्षमता 18 है, यह माना जाना चाहिए कि दाता प्लास्मिड का आकार आम तौर पर परिवर्तन दक्षता 22 के साथ नकारात्मक रूप से संबंधित है।

वर्णित प्रोटोकॉल में इंटीग्रेज़ का स्रोत एक सहायक प्लास्मिड है जो एंजाइम को सर्वव्यापी रूप से व्यक्त करता है। इंटीग्रेज़ की सर्वव्यापी उपस्थिति दैहिक कोशिकाओं के परिवर्तन का कारण बन सकती है यदि माइक्रोइंजेक्शन को ठीक से उस क्षेत्र में निर्देशित नहीं किया जाता है जहां जर्मलाइन बनता है। जबकि इस तरह की परिवर्तन घटनाएं खो जाएंगी क्योंकि वे वंशानुगत नहीं हैं, दैहिक प्रभाव इंजेक्ट किए गए व्यक्तियों की फिटनेस को कम कर सकते हैं। इससे बचने और परिवर्तन दक्षता बढ़ाने के लिए, इंटीग्रेज़ अभिव्यक्ति को जर्मलाइन तक सीमित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए वासा प्रमोटर 22,26 का उपयोग करके। अन्य प्रोटोकॉल इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) के उपयोग का वर्णन करते हैं, जो 19,24,43 के स्रोत के रूप में है। हालांकि, इसमें एमआरएनए की श्रमसाध्य तैयारी शामिल है और इसमें इंजेक्शन मिश्रण की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग और गिरावट से बचने के लिए आरनेस मुक्त अभिकर्मकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। इंटीग्रेज़ के प्लास्मिड स्रोतों को An. gambiae9,21,22,26,33,37 और An. stephensi (A.A. व्यक्तिगत संचार) दोनों में विश्वसनीय होने और कुशल परिवर्तन के लिए नेतृत्व करने के लिए प्रदर्शित किया गया है, और इस प्रकार हमारे पसंदीदा विकल्प हैं। इंटीग्रेज़ डिलीवरी के लिए एक और विकल्प स्व-डॉकिंग हेल्पर लाइनों में विवो उत्पादन में है। इस तरह की लाइनें An. gambiae में बनाई गई थीं जो जर्मलाइन-विशिष्ट प्रमोटर नैनो के विनियमन के तहत πC31 integrase को व्यक्त करती हैं और एक बेहतर अस्तित्व और परिवर्तन दक्षता 20 का नेतृत्व करने के लिए पाई गई थीं। हालांकि, सहायक लाइन पर इंटीग्रेज़ एंजाइम के इन विवो उत्पादन द्वारा लगाए गए संभावित फिटनेस लोड पर विचार किया जाना चाहिए।

अन्य ट्रांसजेनिक तकनीकों के साथ, विशेष देखभाल को इंजेक्ट किए गए भ्रूण से प्राप्त होने वाले व्यक्तियों के पालन और क्रॉसिंग के लिए आरक्षित किया जाना चाहिए ताकि ट्रांसफॉर्मेंट को पुनर्प्राप्त करने की संभावनाओं को अधिकतम किया जा सके। जिन व्यक्तियों को ट्रांसजीन विरासत में मिला है, उन्हें सबसे पहले जी 1 संतानों पर पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, संभावित परिवर्तन के शुरुआती संकेतों का मूल्यांकन 3xP3 प्रमोटर 43 का उपयोग करते समय गुदा पैपिले और / या जी 0 पहले और दूसरे इंस्टार लार्वा के तंत्रिका कॉर्ड में फ्लोरोसेंट मार्कर की क्षणिक एपिसोमल अभिव्यक्ति की उपस्थिति से किया जा सकता है। जबकि क्षणिक प्रतिदीप्ति की उपस्थिति सफल प्लास्मिड वितरण का सुझाव देती है, यह वंशानुगत जर्मलाइन परिवर्तन की गारंटी नहीं देती है। इसी तरह, क्षणिक अभिव्यक्ति की कमी सफल परिवर्तन को बाहर नहीं करती है। फिर भी, यह देखा गया है कि क्षणिक रूप से सकारात्मक व्यक्तियों को क्षणिक रूप से नकारात्मक लोगों की तुलना में ट्रांसजेनिक संतान उत्पन्न करने की अधिक संभावना है43,48। विशेषज्ञ हाथों में, केवल सकारात्मक व्यक्तियों का पालन और पार करना मच्छरों की संख्या को कम करने का एक विकल्प हो सकता है। हालांकि, छोटे जी 0 लार्वा के महत्व और नाजुकता को देखते हुए, हेरफेर की कम से कम मात्रा अभी भी उचित है और सभी जी 0 व्यक्तियों के पालन की हमेशा सिफारिश की जाती है।

इस प्रोटोकॉल में रिपोर्ट की गई संभोग योजना को संभोग की संभावना को अधिकतम करने और स्वतंत्र परिवर्तन की घटनाओं को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हालांकि, यदि कीटकारी स्थान या कर्मियों की उपलब्धता एक मुद्दा है, तो जी 0 वयस्कों को एकल पिंजरों में सेक्स द्वारा पूल किया जा सकता है यदि पर्याप्त विपरीत-लिंग वाले व्यक्ति प्रदान किए जाते हैं। इस तरह का सेटअप एक ही पिंजरे से व्यक्तियों में होने वाली कई परिवर्तन घटनाओं के बीच भेदभाव की अनुमति नहीं देगा। प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर, स्क्रीनिंग प्रक्रिया के दौरान एक डबल (एकल एकीकरण) या एकल (आरएमसीई) मार्कर की उपस्थिति की उम्मीद की जाती है। एकल एकीकरण प्रयोगों में डॉकिंग लाइन से मूल मार्कर की उपस्थिति को सत्यापित करना महत्वपूर्ण है, जबकि आरएमसीई में पहले से एकीकृत मार्कर के नुकसान को सत्यापित करना महत्वपूर्ण है। दरअसल, आरएमसीई डिजाइनों में ट्रांसफॉर्मेंट को पुनर्प्राप्त करने के लिए असामान्य नहीं है जिसमें विनिमय के बजाय एकल एकीकरण एक एकल attP साइट 9,33 के पुनर्संयोजन के कारण हुआ था। ऐसे व्यक्तियों में दोनों फ्लोरोसेंट मार्कर मौजूद हैं और साथ ही पूरे दाता प्लास्मिड बैकबोन दोनों फ्लोरोसेंट मार्करों के लिए पूरी तरह से स्क्रीनिंग करने के महत्व को उजागर करते हैं।

जबकि अपेक्षित प्रतिदीप्ति पैटर्न की उपस्थिति सफल परिवर्तन को इंगित करती है, सम्मिलन साइट के आणविक लक्षण वर्णन को किया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, डॉकिंग लाइन के फ्लैंकिंग जीनोमिक क्षेत्रों सहित अनुमानित सम्मिलन लोकस के सटीक मानचित्रों की तैयारी, जीन प्रवर्धन विश्लेषण के लिए पर्याप्त नैदानिक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरों के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है। एकल एकीकरण की घटनाओं के परिणामस्वरूप नए एकीकृत डीएनए और पहले से सम्मिलित कैसेट के बीच जंक्शन पर attR और attL हाइब्रिड साइटों का गठन होता है। इन साइटों को सम्मिलन साइट मान्यता के लिए लक्षित किया जा सकता है. आरएमसीई डिजाइनों में, दाता कैसेट का सम्मिलन जीनोमिक लोकस के संबंध में दो वैकल्पिक अभिविन्यासों में हो सकता है, इस प्रकार चार प्राइमरों का उपयोग वैकल्पिक पीसीआर संयोजनों में यह पता लगाने के लिए किया जा सकता है कि लाइन किस अभिविन्यास को वहन करती है। जैसा कि कैसेट सम्मिलन का अभिविन्यास ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है, तुलनात्मक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में सम्मिलन के समान अभिविन्यास को ले जाने वाली लाइनों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।

ट्रांसफॉर्मेंट की कम संख्या के साथ काम करते समय आणविक विश्लेषण के लिए पूरे व्यक्तियों का बलिदान करना वांछनीय नहीं हो सकता है। इसका एक विकल्प एकल वयस्क के पैरों से निकाले गए डीएनए पर आणविक विश्लेषण कर रहा है46 क्योंकि पैर की हानि एक वयस्क महिला को संभोग करने की क्षमता को प्रभावित नहीं करती है और ओवीपोसिट 49। हालांकि, पैर हटाने की प्रक्रिया में व्यक्ति को नुकसान पहुंचाने का खतरा है। सफलता को छोड़े गए प्यूपल मामलों (एल ग्रिगोराकी व्यक्तिगत संचार) का उपयोग करके प्राप्त किया गया है, हालांकि सबसे सुरक्षित दृष्टिकोण व्यवहार्य जी 3 संतानों को प्राप्त करने के बाद जी 2 माता-पिता पर आणविक विश्लेषण करना है।

हाल के वर्षों में, CRISPR / Cas9 ने साइट-विशिष्ट जीनोम संपादन 26,41,50,51 करने के तरीके में क्रांति ला दी है। साइट-निर्देशित आरएमसीई के विपरीत, CRISPR / Cas9-मध्यस्थता जीन एकीकरण (नॉक-इन्स) केवल एक-चरणीय परिवर्तन घटना की आवश्यकता के साथ पूर्व-सम्मिलित पुनर्संयोजन साइटों की उपस्थिति से स्वतंत्र हैं। फिर भी, CRISPR / Cas9 प्रणाली सफल होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत के लिए वांछित सम्मिलन साइट के साथ-साथ गाइड आरएनए द्वारा मध्यस्थता की गई कुशल साइट मान्यता पर बड़े ज्ञात जीनोमिक अनुक्रमों की उपस्थिति पर निर्भर करती है। इन शर्तों को हमेशा पूरा नहीं किया जा सकता है या समस्या निवारण के लिए श्रमसाध्य हो सकता है और, An. gambiae और An. stephensi में कई डॉकिंग लाइनों की उपलब्धता और उनसे व्युत्पन्न लाइनों को देखते हुए, एक ही जीनोमिक स्थानों पर ट्रांसजीन के बीच प्रत्यक्ष फेनोटाइपिक तुलना करने के लिए एक बहुत ही मूल्यवान उपकरण बना हुआ है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम ट्रांसजेनिक An. stephensi लार्वा की छवियों को प्रदान करने के लिए Kiona Parker (UCI) के लिए आभारी हैं, और फ्रेजर Colman (LSTM) और बेथ Poulton (LSTM) के लिए ट्रांसजेनिक An. gambiae लार्वा प्रदान करने के लिए। बेथ पॉल्टन (एलएसटीएम) ने एएन गाम्बिया लार्वा की इमेजिंग के दौरान कीमती सहायता भी प्रदान की। इस काम को टाटा इंस्टीट्यूट फॉर जेनेटिक्स एंड सोसाइटी (TIGS) और LSTM के निदेशक उत्प्रेरक कोष द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जिसे ए.ए. (DCF2014AA) से सम्मानित किया गया था। ए.ए.जे. कैलिफ़ोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन में एक डोनाल्ड ब्रेन प्रोफेसर हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL eppendorf tubes
8-well microslides VWR MARI1216690
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade
Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm Leica 10446363
Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm Leica 10447079
Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII Omega Optical 500QM25, 500QM35
Halocarbon oil 27 Sigma H8773
Halocarbon oil 700 Sigma H8898
Petri dishes
Potassium chloride
Sodium Chloride
Sodium phosphate dibasic
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) R1181
Stable brush Size 0

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References

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आनुवांशिकी अंक 168 Anopheles πC31 साइट निर्देशित डॉकिंग एकीकरण कैसेट विनिमय मच्छरों ट्रांसजेनिक
साइट-निर्देशित <em>ΠC31-मध्यस्थता</em> एकीकरण और मलेरिया के <em>Anopheles</em> वैक्टर में कैसेट एक्सचेंज
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Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J., … More

Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J., James, A. A. Site-Directed φC31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria. J. Vis. Exp. (168), e62146, doi:10.3791/62146 (2021).

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