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Genetics

マラリアのアノフェレスベクターにおける部位特異的φC31媒介集積分とカセット交換

Published: February 2, 2021 doi: 10.3791/62146
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3
1Vector Biology Department, Liverpool School of Tropical Medicine, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, 3Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California

Summary

このプロトコルは、φC31システムを使用してアノフェレスマラリア蚊のゲノムにおいて部位特異的修飾を達成する方法を記述している。記載される改変には、attP含有ドッキングラインのゲノムにおけるトランスジェニックカセットの統合および交換の両方が含まれる。

Abstract

マラリアの遺伝的制御のための機能的ゲノム解析および関連する戦略は、アノフェレス蚊のゲノムを正確に改変するための検証済みで再現可能な方法に依存しています。これらの方法の中でも、φC31システムは、導入遺伝子の正確で安定した部位特異的集積、またはリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)を介した集積トランスジェニックカセットの置換を可能にする。この方法は、ストレプトマイセスφC31バクテリオファージインテグラーゼの作用に依存して、attP(ファージ由来)およびattB(宿主細菌由来)と命名された2つの特定の付着部位間の組換えを触媒する。このシステムは、以前に蚊ゲノムに組み込まれた1つまたは2つのattPサイトと、ドナーテンプレートDNA中のattBサイトを使用する。ここでは、組み込みまたは交換テンプレートを保持するattBタグ付きドナーとφC31インテグラーゼをコードするヘルパープラスミドの2つのプラスミドを使用して、attP含有アノフェレスドッキングラインのゲノムを安定的に改変する方法を示します。我々は、φC31媒介部位特異的修飾の2つの代表的な結果、すなわち、An. stephensiにおけるトランスジェニックカセットの単一統合と、An. gambiae蚊におけるRMCEの2つの代表的な結果を報告している。φC31媒介ゲノム操作は、検証済みの適応度中立ゲノム部位からの再現性のある導入遺伝子発現の利点を提供し、表現型の比較定性的および定量的分析を可能にする。集積の部位特異的性質はまた、単一の挿入部位および嵌合スキームの検証を実質的に簡素化し、安定したトランスジェニックラインを得る。これらの特性および他の特性により、φC31システムは、マラリア蚊および他の昆虫ベクターのトランスジェニック操作のための遺伝的ツールキットの必須コンポーネントとなっている。

Introduction

病気の蚊ベクターのゲノムを確実かつ再現性よく改変する能力は、遺伝子の in vivo 機能検証を強化し、マラリアを媒介する アノフェレス 蚊を標的とするような、実現可能な遺伝子ベクター制御戦略への扉を開きました1。

初期の蚊のゲノム編集は、トランスポーザブルエレメント(TE)媒介形質転換にのみ依存しており、piggyBacはAnophelesで最も一般的に使用されているトランスポゾンでした2,3,4。しかし、TE統合のランダムな性質は、遺伝子ノックアウト(挿入突然変異誘発)や導入遺伝子発現に対する有意な位置効果などの望ましくない改変につながる可能性があります5、6、7、8。piggyBac5,9を使用する場合、複数の挿入も一般的に発生するため、単一の挿入によるトランスジェニックラインの検証と単離が面倒になります。他の欠点には、piggyBacトランスポザーゼ10,11,12の供給源を提供する際のAnopheles stephensiの生殖細胞系列で観察されるような潜在的な再動員、およびドナープラスミドのサイズの増加とともに形質転換効率が低下するDNA貨物のサイズ(長さ10〜15kb)が限られている13,14が含まれる。

これらの問題を回避するために、サイト指向の統合アプローチが導入されました。蚊における最も一般的な部位特異的ゲノム改変は、φC31系によって媒介されるものである(図1a)。これは、バクテリオファージφC31(attP)およびストレプトマイセス細菌宿主(attB)のゲノム中に天然に存在する2つのヘテロ特異的結合(att)部位間の組換えを触媒するウイルスインテグラーゼによって駆動される15。2つの部位の組換えは一方向であり、ハイブリッド部位(attLおよびattR)の形成をもたらす。このようなハイブリッド部位の組換え(DNA切除につながる)には、活性ウイルスインテグラーゼの存在だけでなく、ファージにコードされた別の組換え因子も必要となる16,17。したがって、潜在的な望ましくない再動員の問題を緩和する安定した統合サイトが生成されます15。さらに、このシステムは、大型貨物の統合(例えば、D. melanogaster18で報告された>100kb構築物の統合)を可能にし、運搬能力を有意に増加させる。統合は、単一の事前定義されたゲノム遺伝子座で起こり、安定したトランスジェニックラインを得るための挿入および交配スキームの検証を大幅に簡素化する。最後に、統合の部位特異的性質は、代替導入遺伝子が同じ遺伝子座に位置し、したがって同じ隣接するゲノムコンテキスト内で調節されるため、発現の正常化を可能にする。実際、この技術の主な用途の1つは、同一の遺伝子座への挿入後に異なる導入遺伝子によって付与される表現型の直接比較である。

φC31媒介性集積を達成するには、フェーズIはattP部位を運ぶトランスジェニックドッキングラインの作成であり、フェーズIIはドッキングラインのゲノムにおけるattB側面貨物の部位特異的統合である19。第I相ドッキングラインの作成は、attPタグ付きコンストラクトのTE媒介性ランダム統合に依存していたため、単一の統合事象を有するトランスジェニックラインを一意で転写活性で適応度中立のゲノム位置で単離および検証するために、初期の面倒なプロセス(単一女性の子孫に対するサザンブロットおよびインバースPCR分析を含む)が必要でした。それにもかかわらず、φC31媒介単一集積のためのいくつかのドッキングラインが、An. gambiae19,20,21,22およびAn. stephensi23,24,25において開発され、検証されている(表1)。これらの系統の各々は、ドッキング部位のゲノム位置および株特異的な遺伝的背景の点で異なり、それらから多種多様な新しいトランスジェニック系統を創り出すことができる。ドッキング ラインを製造するための TE を介した統合の複雑な検証は、CRISPR/Cas9 テクノロジによって回避できるようになりました26。しかし、これは標的となる中性遺伝子座とその周囲の配列に関する先験的な知識に依存している。

φC31媒介の統合は、モデル生物D. melanogaster27から、蚊Aedes aegypti13,28、Ae. albopictus29、An. gambiae19、およびAn. stephensi24、ならびに頭蓋炎capitata30およびBombyx mori31を含む他の昆虫への昆虫ゲノム編集に広く適用されている。

φC31媒介性組み込みの制限は、特にベクター制御のための潜在的な電界放出の観点から、抗生物質耐性遺伝子マーカーおよび細菌起源のプラスミド骨格成分などの望ましくない配列を含む、attB含有ドナープラスミド全体の蚊ゲノムへの組み込みである。これに対処するために、標準系の改変であるリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)が実施され、以前に統合されたトランスジェニックカセットを新しいドナーDNAで正確に置換することを可能にする(図1b)。これは、両端でドナーおよびレシピエントカセットに隣接する2つの反転att部位を使用することによって達成され、これは2つの独立した組換え事象を同時に起こし、プラスミド骨格の統合なしにカセット交換をもたらす。この改良された設計は、望ましくない配列の統合を回避し、例えば、以前に統合された蛍光マーカー32の損失をスクリーニングすることによって、マークされていないDNA貨物の統合を含むようにφC31システムの適用を拡大します。

RMCEは最初にD. melanogaster32で達成され、後にAn. gambiae9,26,33、Ae. aegypti34、Plutella xylostella34、およびB. mori35を含む非モデル昆虫に首尾よく適用された。RMCE用のいくつかのドッキングラインが開発され、An. gambiae5,9,26で検証されています(表1)。我々の知る限り、RMCEは他のアノフェレスベクター種ではまだ探索されていない。

今日まで、φC31システムは、抗マラリアエフェクター19,24,36、殺虫剤耐性研究のための遺伝子を過剰発現およびノックダウンするGAL4/UASシステムの構成要素9,33、調節要素、レポーター遺伝子5,21,37、および遺伝子駆動要素を含む様々な分子の導入および研究のために、アノフェレス蚊において広く使用されてきた26。,38.

このプロトコルは、1) attB側面貨物の部位指向統合および2)逆 attB 部位に挟まれた構築物のRMCEを Anopheles ドッキングラインのゲノムに組み込む方法を記述している。これは、目的の導入遺伝子を保持する ドナーattBタグ付きプラスミドと、 φC31 インテグラーゼを発現するヘルパープラスミドの2つのプラスミドを使用することによって達成される。主要なマラリアベクターであるAn. gambiae と An. stephensi が具体例として使用されていますが、これらのプロトコルは他の Anopheles 種にも適用可能です。

Figure 1
図1.部位特異的ゲノム改変は、単一組込みおよびリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)、φC31系を使用した。φC31インテグラーゼ(INT、灰色の二重矢印)は、ドナープラスミド中に存在するattBサイト(紫色の縞模様)と受容ドッキングラインに存在するattP部位(青色の縞模様)との間の組換えを触媒し、その結果、attLおよびattRのハイブリッド部位が形成される。A) 統合は、単一のattBおよびattPサイトが再結合し、2つの統合マーカー(青および赤)の存在をもたらすときに達成される。B) RMCEは、2つのattB/P部位が同時に再結合し、ドッキングラインのatt部位(青色マーカー)間のカセットがドナープラスミドによって運ばれる部位(赤色マーカー)と交換されるときに生じる。C) attP(青色)およびattB(紫色)の部分塩基配列、ならびにハイブリッド部位attL/R。組換えは、太字の黒で強調表示された「TT」コアシーケンス間で発生します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

メモ: 図示のプロトコルの概略ワークフローを 図 2 に示します。

1. φC31 attB タグプラスミドの設計(図3)

  1. 以下の必須成分を含む attB ドナープラスミドの作成
    1. 優性蛍光マーカー
      1. 蛍光マーカーの発現を駆動するプロモーターを選択します。
        注:アノフェレスのトランスジェネシスの場合、蛍光マーカーは通常、目および神経索における発現を促進する3xP3プロモーター39の調節下にある。あるいは、PUBcプロモーター5は、複数の組織での発現が望まれる場合に使用することができる。このプロトコルの例として使用されるドナープラスミドおよびドッキングラインは、3xP3プロモーターを使用してマークされる。
      2. 受信ドッキングラインの蛍光タンパク質(FP)と互換性のある蛍光タンパク質(FP)を選択して、容易に区別できるようにします。
        メモ: ドッキングラインに既に存在するマーカーと同じマーカーを使用しないでください。GFP(緑)/YFP(黄色)とGFP(緑)/CFP(シアン)は、確実に区別するのが非常に難しいため、同時に使用しないでください。このプロトコルの例として使用されるドナープラスミドは、CFPでマークされたドッキングラインに組み込まれるため、DsRedまたはYFPのいずれかでマークされています。
    2. attB 組換え部位
      1. トランスジェニックカセットの統合には単一のattBサイトを使用します(シングルattB設計)(図3A)。
      2. RMCE(ダブルattB設計)では、2つの反転attB部位を使用し、部位が互いに逆さまに置かれ、ドナーDNAテンプレートを囲む(図3B)。
        メモ: attB サイトの向きは、ドッキングラインに存在する attP サイトの向きと互換性がある必要があります。
    3. 希望する導入遺伝子貨物
      1. 実験の特定の目的に基づいて蚊ゲノムに組み込まれる他の所望の特徴を使用する。ここでは、アン・ ステファンシ のゲノムへの抗マラリアエフェクター分子の統合と、GAL4/UASシステムの構成要素の アン・ガンビア蚊 への統合について説明します。
    4. プラスミド骨格成分
      1. 細菌におけるプラスミド複製のための他の必須成分の中でも、インビトロでのプラスミド選択のためのマーカー(すなわち、 抗生物質耐性遺伝子)を含む。
        注:プラスミド骨格は、組み込みのためのシングルattB設計では蚊ゲノムに組み込まれますが(図3A)、RMCEのダブルattB設計では挿入されません(図3B)。

2. マイクロインジェクションミックス用プラスミドの調製

注:ここに示されているプロトコルは、目的の導入遺伝子を保持するattBタグ付きドナープラスミドと、ショウジョウバエHsp70プロモーター40の調節下でφC31インテグラーゼを発現するヘルパープラスミドの2つのプラスミドの使用を含む。

  1. エンドトキシンフリープラスミド精製キットを使用してドナープラスミドとヘルパープラスミドを精製します。
    注:注射に使用する最終プラスミド調製物を配列決定し、すべての成分の完全性を検証します。
  2. 2つのプラスミドを適量組み合わせて、注入バッファーに再懸濁したときにドナープラスミドの最終濃度350ng/μLおよびヘルパープラスミド150ng/μLの混合物を得る。
    注:ミックスの必要量を計算するときは、計画された注射の毎日に10〜15μLで十分であり、DNAを事前に調製し、-20°Cで保存できることを考慮してください。 インテグラーゼヘルパープラスミド濃度60~500 ng/μL、ドナープラスミド濃度85~200 ng/μLも報告されています21,22,26,41。
  3. 0.1倍量の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)と2.5倍量の氷冷100%EtOHおよびボルテックスを加えてDNAを沈殿させる。白い沈殿物がすぐに見えるはずです。高濃度の初期プラスミド調製物(すなわち、〜1μg/μL)を有すると、沈殿効率が向上する。
    注:停止点 - 沈殿物は-20°Cで一晩保存することができます。
  4. 15,000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを1mLの氷冷70%EtOHで洗浄した。
  5. ペレットを氷冷70%EtOH1mLで洗浄し、15,000 x g で室温で5分間遠心分離する。
  6. ペレットを乱さずに上澄み液を捨て、風乾する。
  7. ペレットを1x注射バッファー(0.1 mM Na3PO4、5 mM KCl、pH 7.2、0.22 μmフィルター滅菌)に再懸濁し、総最終濃度500 ng/μLに達する。
    注:沈殿プロセス中にいくつかのDNAが失われると仮定します。したがって、最初により少ない容量の注入バッファーを追加し、分光光度計(Nanodropなど)で濃度を確認してから、500ng/μLに達するように適切な残りの容量を追加します。
  8. DNAが完全に再懸濁されていることを確認し、それぞれ10〜15μLのアリコートを調製し、-20°Cで保存する。
  9. 注射当日、1つのアリコートと遠心分離機を15,000 x g で5分間解凍し、粒子状残留物を除去します。
    注:微粒子除去の代替方法は、0.22μmフィルターで溶液をろ過することです。胚マイクロインジェクション中に針が閉塞するため、インジェクションミックス中に微粒子残留物が存在することは避けてください。

3. アノフェレスド ッキングラインからの胚のマイクロインジェクション

  1. マイクロインジェクションの72時間前に所望のドッキングラインから生後4〜7日の蚊に血液を供給する(すなわち、月曜日および火曜日の注射のために前の金曜日に女性に餌を与え、木曜日および金曜日の注射のために同じ週の月曜日に女性に餌を与える)。
  2. 同じ日に野生型(WT)の蚊(すなわち、ドッキングラインの同じゲノム背景を有する蚊)に血液を供給する。これらは交差点に必要になります。
    注:血液ミールのサイズと質は卵の質に影響するため、常に新鮮な血液(つまり、過去7日以内に採取された血液) を使用することをお勧めします。腕の餌やりやマウスへの給餌は卵の質と量を増やすかもしれませんが、これらの方法は奨励されていません。ヒトおよび動物の使用には、特定の承認されたプロトコルが必要になります。
  3. 胚マイクロインジェクションの実施
    1. 25mM NaCl42でガンビア胚マイクロインジェクションを行い、胚の後極を45度の角度で標的とする。胚収集、アライメント、およびマイクロインジェクションのための詳細なプロトコルについては、Pondeville et al.43およびLobo et al.44を参照されたい。
    2. An. stephensi胚のマイクロインジェクションをハロカーボンオイル700:27(2:1)に、胚の後極を30度の角度で標的にして行う。胚収集、アライメント、およびマイクロインジェクションのための詳細なプロトコルは、Terenius et al.45およびLobo et al.44に見出すことができる。
    3. 注射直後の卵を滅菌蒸留水(pH 7.2)で満たされたペトリ皿に移し、昆虫の状態に戻す。
  4. 孵化したら、G0 幼虫を塩漬け蒸留水(0.1%強壮塩)を入れたトレイに移し、蛹に後方に移す。
  5. 孵化率を記録する(すなわち、 孵化した幼虫の数/注入された胚の数)。
    注:胚の動きは孵化を助けるので、穏やかな渦巻きが望ましいです。孵化は注射後〜48時間で開始する必要があります。注射はわずかな発育遅延を引き起こす可能性があるので、孵化後期幼虫を3〜4日間監視し続けることをお勧めします。

4. 形質転換個体の交配とスクリーニング

  1. [任意工程]スクリーニングG0 (注入)第 1齢または第 2齢幼虫(L1−L2)を蛍光マーカーの一過性発現のために。
    1. 細かい先端ガラスピペットを使用して、G0 L1-L2幼虫をウェル付きの顕微鏡スライドに移します。各井戸に1匹の幼虫を置きます。
    2. 適切なフィルターを備えた蛍光ステレオスコープを使用して、蛍光マーカーの一過性発現の存在をスクリーニングします。
      注:一過性発現のパターンは、使用されるプロモーターによって決定される。3xP3プロモーターを用いた場合、蛍光マーカーの一過性の発現が肛門乳頭において視認される(Pondeville et al.43の図6参照)。
    3. 後部G0陽性個体は 別々に。
  2. G0の蛹をステレオスコープの下で性別でソートする52。
  3. 男性を3〜5人のグループ(創始者家族)の別々のケージに出現させ、年齢が一致したWT女性の10倍を超えるものを追加します。
    注:男性は複数回交尾するため、各男性の交配可能性を最大化するために、過剰なWT女性を提供することが重要です。
  4. 雌を10〜15人のグループ(創始者家族)の別々のケージに出現させ、年齢が一致したWT男性を同数追加させる。
    注:昆虫のスペースが限られている場合、女性は1つのケージにすべて一緒に現れる可能性があります。女性対男性の比率は、1人の男性対3人の女性と同じくらい低くすることができます。
  5. 大人が4〜5日間交尾し、女性に血液の食事を提供するのを許可します。
    注:複数の淋栄養サイクルから形質転換体を得る可能性を最大限に高めるために、G0 雌から複数回採血および卵子を採取する。
  6. 血液は、交差のために同時にWT個体を供給する。
  7. 卵を集めて、次世代のG1を育てましょう。
  8. 適切な蛍光についてG1 L3−L4 幼虫をスクリーニングし、形質転換体を同定する。
    1. ろ紙を敷いたペトリ皿、または顕微鏡スライドとスクリーンに幼虫を採取し、 attBタグ付き貨物で導入されたマーカーの存在に適したフィルターを備えた蛍光ステレオスコープを使用します。
      注: 3xP3 プロモーターによって駆動される蛍光は、胚発生後のすべての段階で見え、スクリーニングは若い幼虫に対して行われ得るが、これらはより脆弱であり、比較的慎重に取り扱わなければならない。蛹もスクリーニングすることができます。
      1. 新規および既存のマーカーの存在のための統合画面のための単一attB 設計の場合;新しいカセットが元のカセットの隣に挿入されるため、両方とも存在するはずです(図3A、 図4)。
        メモ: 単一の attB デザインのスクリーニング例外: マーカーのないドッキングライン 22 を使用する場合は、新しいマーカーの存在のみをスクリーニングします。積分が既存のマーカー21の不活性化をもたらすドッキングラインを使用する場合、新しいマーカーの存在および既存のマーカーの喪失についてスクリーニングする。
      2. RMCEのダブルattB デザインでは、新しいマーカーの存在と既存のマーカーの喪失をスクリーニングし、新しいカセットが元のマーカーを置き換えるため、新しく導入されたマーカーのみが存在する必要があります(図3B、 図5)。
        注: RMCE 実験では、1 つの attP のみが再結合され、両方のマーカーが存在する RMCE 実験では、時折の統合イベントを回復できます。G1個体のスクリーニングは、同じ手順に従って蛹の段階でも行うことができる52。
  9. 形質転換されたG1 個体を幼虫トレイに移し、蛹に後方に移す。非蛍光個体および予期せぬマーカー発現パターンを有する個体を捨てる。
  10. G1の蛹を性別で分類し、性別の年齢が一致したWTの個体と一斉に交差させた。
  11. 大人が4〜5日間交尾し、血液食事を提供し、卵を集め、次世代のG2 子孫を育てることを可能にする。
    1. 単一の統合実験では、統合部位がすべての個体で同一であるため、 一括 十字から直接卵を収集します。
    2. RMCE実験では、単一の雌から卵子を収集し、2つの代替カセット配向の潜在的な存在のために分子評価が完了するまで、子孫を別々に維持する(図3B)。
  12. G2の子孫(幼虫または蛹の段階のいずれか)に蛍光マーカーの存在(個体の50%が陽性であると予想される)をスクリーニングし、非蛍光の子孫を捨てる。
  13. 分子分析のためにG2 陽性個体のサブセットを脇に置いておき、残りを成人期に戻します。
    注:すべてのG2 個体を生かさなければならない場合、分子分析は、シングルアダルトの脚46 または蛹症例DNA抽出(L. Grigorakiの個人的なコミュニケーション)に対して実施することができる。あるいは、すべてのG2 個体が産卵し、卵が孵化した後に分子分析を行うことができる。
  14. 成人の男性と女性が同じケージ内で交配して、新しいトランスジェニックラインを確立することを許可します。
    注:RMCE実験では、分子分析によって挿入の向きが決定されるまで、単一の女性に由来する兄弟間で成体の交配が起こらなければならない。

5. DNA増幅(PCR)による挿入部位の分子検証

  1. 形質転換後のドッキングラインのゲノムに予測された挿入部位のマップを作製する。
    1. 単一組み込み:予測された挿入部位が、元のドッキング構築物に加えて、2つのハイブリッド部位 attL および attR 間のドナープラスミドの全配列を含むことを確認します(図3A)。
    2. RMCE:予測された挿入部位が、ハイブリッド反転 attL 部位が元の反転atpp部位を置き換え、交換テンプレートがそれらの間に元々存在するカセットを置き換えるドッキングラインの 挿入部位と 同一であることを確認してください(図3B)。
  2. オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、集積遺伝子座の両側における挿入接合部を増幅する。
    1. 単一統合: attR および/または attL 部位にまたがるオリゴヌクレオチドプライマー対を設計する。一方のプライマーは、以前に組み込まれたドッキング構築物に結合しなければならず、他方のプライマーは、新たに組み込まれた導入遺伝子に結合しなければならない(図3A)。
    2. RMCE:カセット置換は、染色体(AおよびBと命名)に対して 2つの異なる向き で起こり得る。4つのオリゴヌクレオチドプライマーの代替組み合わせを設計して、一方の対が配向Aについて診断され、他方の対が配向Bについて診断される(図3B、 図6)という、一方の配向のみにおいて離散的な生成物を得る。
  3. G2陽性個体からゲノムDNAを抽出し、診断PCRおよびゲル電気泳動を実行して、予測された集積部位マップから予想される診断アンプリコンの存在を可視化する。
    注:DNAは、代わりに、シングルアダルトの脚46 または蛹の症例(L. Grigorakiの個人的なコミュニケーション)から抽出することができます。
  4. PCR産物を配列し、予想される配列を確認する。

Figure 2
図2.アノフェレス蚊における部位特異的φC31ゲノム改変のワークフロー図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3.φC31媒介単集積(A)およびRMCE(B)の分子基盤。 A) 単一のattP部位を有し、CFPでマークされた単一のattP遺伝子組み換えライン(上段)、DsRedでマークされたシングルattBデザインドナープラスミド(中央)、および組込みが成功した後に生じる予想される挿入部位(下段)におけるゲノム挿入の概略マップ。B)2つの逆attP部位およびCFPでマークされた2つの逆attP部位(上段)、YFPでマークされたダブルattBデザインドナープラスミド(中央)、およびRMCEが成功した後に生じる予想される挿入部位(下段)を運ぶ、アン・ガンビアエ・ドッキングライン(A11、表1)におけるゲノム挿入の概略マップ。波線:蚊のゲノム;縞模様の矢:ピギーバックトランスポゾンアーム;3xP3:蛍光マーカーのプロモーター;SV40:ウイルスターミネーター;オリ:複製の起源。AmpR:アンピシリン耐性遺伝子。交差線は、attP サイトと attB サイト間の再結合のサイトを表します。番号の付いた黒い矢印は、挿入遺伝子座の分子検証のためのプライマー結合部位を表す(プロトコールのステップ5)。完全に注釈が付けられたシングルおよびダブルattBタグ付きプラスミドは、要求に応じて著者らから入手可能である。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Representative Results

ここに示すプロトコルは、〜10週間で安定した アノフェレス トランスジェニックラインを生成することを可能にする(21日間の蚊のライフサイクルを仮定する)。

アン・ガンビア科の注射後幼虫の孵化率は、一般的にアン・ステファンシよりも低いと予想されているが、10〜50%の孵化率が報告されている9、20、24、26、33、43、47。適切な注入技術が与えられれば、≥20%の孵化率は、一般に形質転換体を収穫するのに十分である。胚によるDNA取り込みは、蛍光マーカーの一過性発現について若い幼虫をスクリーニングすることによって評価することができる。生存しているG0幼虫の最大50%までの3xP3プロモーターを用いたアン・ガンビアにおける成功したRMCE実験では、肛門乳頭におけるマーカーのエピソーム発現を示した48。

形質転換効率の一般化された推定値は、注入されたDNAの純度、濃度、サイズ、および潜在的な毒性、卵の品質、卵の注入前および注射後の取り扱い、蚊の飼育、そして最も重要なのはオペレーターの経験を含む変数の複雑な相互作用に依存するため、実験室間および実験間でも評価することは困難である。アン・ガンビアにおけるRMCEでは最大7%の形質転換率(G0個体全体における独立した形質転換事象の数として計算)が9、26、33、およびアン・ステファンシにおける統合では最大2.2%の形質転換率が得られている。我々は、少なくとも500個の胚を注入することを提案するが、これは少なくとも100個のG0幼虫の孵化および安定的に形質転換された子孫を得ることができる2〜7個のG0成体の創設者につながるはずである。G0幼虫における一過性発現をスクリーニングすれば、最大40匹の陽性幼虫が期待できる。

3xP3プロモーターによって調節される蛍光マーカーのスクリーニングを介した形質転換の表現型検証の例は、図4および 図5に報告されている。図4は、CFPでマークされたドッキングラインにDsRedマークカセットを挿入した新しいAn. stephensiライン(80.9、表1)を示し、その結果、G1子孫は、目で検出された赤色および青色蛍光によって示されるように両方のマーカーを発現する。

RMCEデザインは、代わりに、もともとドッキングラインに挿入されたマーカーをドナープラスミドのマーカーと交換する結果をもたらすことが期待される。図5Aおよび図Bは、CFPでマークされたアン・ガンビアエ・ドッキング・ライン(A11、表1)におけるこのマーカー交換を示しており、RMCEが成功した後、CFPマーカーは失われ、YFPマーカーが獲得され、黄色(青色ではない)の眼および 神経索蛍光33が生じる。時折、RMCEは、図5Cに例示されるように所望のトランスジェニックカセットの交換の代わりに単一の統合事象をもたらし得、そこでは、元のCFPマーカーおよび新しいYFPマーカーの両方でマークされた幼虫が示される。変換イベントの総数の最大 50% が単一積分であると報告されています9,33。

蛍光マーカーの存在をスクリーニングする場合、そのシグナルをバックグラウンド自家蛍光と区別することが重要です。これは、アノフェレス幼虫が天然の青色自己蛍光を示すようにCFPを使用する場合に特に重要である(図6A)。3xP3-CFPマーカーを使用して図6Bに示すように、蛍光がプロモーターによって駆動されると予想される組織および器官に焦点を合わせることが必要である。

個々の形質転換体は、最終的にPCRを介して分子的に評価され、予想される挿入部位を確認する。 図7は 、交換 アン・ガンビアエ 系統からの個体におけるPCRバリデーションを報告し、蚊ゲノムにおける挿入の2つの潜在的な向きを示す33。

Figure 4
図4.An. stephensi幼虫におけるφC31単一集積の検証(背側図)。A)ドッキングライン(80.9、表1)は、3xP3プロモーターの調節下で眼においてCFPを発現する。B)統合が成功すると、新たに取得したDsRedおよび元のCFPマーカーが眼に発現する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5.アン・ガンビア科幼虫におけるφC31 RMCEのバリデーション(腹側図)。A)ドッキングライン(A10、表1)は、眼(e)および神経索(nc)5における3xP3プロモーターの調節下でCFPを発現する。B)RMCEが成功すると、蛍光マーカーがCFPからYFP33に交換される。C)形質転換体幼虫がCFPマーカーおよびYFPマーカーの両方を発現するRMCE実験中に単一の統合事象が生じた。この幼虫は、YFPの広範な発現パターンを引き起こすGAL4 / UAS成分を運び、特に腹筋(am)に強い。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6. アン・ガンビア科 幼虫におけるCFP自家蛍光(背部図)。 A) CFPフィルターを用いたポジ型(CFP+)とネガ型(CFP-)L4 幼虫のサイドバイサイド画像。B)CFP+ 対 CFP-個体を明らかにする幼虫の目のクローズアップ画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7.φC31 RMCEによって作成された代表的なトランスジェニックアン・ガンビアエにおけるカセット挿入の配向の分子検証。トランスジェニックカセットは、挿入部位に対して2つの代替配向(AまたはB)のうちの1つに挿入することができる。各PCR反応(I−IV)は、概略プラスミドマップに示されるように各配向のための診断増幅断片を与えるように設計されたプライマー(5〜8)33の組み合わせを使用する。T1:挿入Aの代表的なトランスジェニック個体担持配向;T2:挿入Bの代表的なトランスジェニック個体担持配向;WT:野生型;DL:ドッキングライン;-:水を鋳型として用いた反応陰性対照。この図は、Adolfi et al. (2019)33から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

種 濾す 名前 attP(s) 染色体 プロモーターマーカー 原産地機関 参考
スティーブンシ インディアナ 26.10b 単 2R 3xP3-eCFP カリフォルニア大学アーバイン校 25
スティーブンシ インディアナ 44カビット 単 X 3xP3-eCFP カリフォルニア大学アーバイン校 23, 24
スティーブンシ インディアナ 80.9b 単 2L 3xP3-eCFP カリフォルニア大学アーバイン校 本研究
アン・ガンビア G3 · 113 単 2R 3xP3-eCFP カリフォルニア大学アーバイン校 本研究
アン・ガンビア キル ティッカー 単 3R 3xP3-eCFP キール大学 19, 43
アン・ガンビア G3 · ×1 · 単 2L マーカーなし ストラスブール大学 22
アン・ガンビア G3 · ティッカー 単 Y 3xP3-RFP インペリアル・カレッジ・ロンドン 21
アン・ガンビア G3 · A10b 複 2R 3xP3-eCFP リバプールスクールトロップメッド。 5
アン・ガンビア G3 · A11b 複 2R 3xP3-eCFP リバプールスクールトロップメッド。 9
ある。ジョンズ・ホプキンス大学(M・ジェイコブス・ロレナの贈り物)とカリフォルニア大学アーバイン校の文化で>20年間。
b.これらの行は、合理的な要求に応じて著者から入手できます。
c. この行は、MRA-1163 として www.beiresources.org BEI リポジトリで利用できます。

表 1. Anopheles attP ドッキングライン。

Discussion

選択したドッキングラインと互換性のあるattBタグ付きプラスミドの正確な設計は、実験の成功にとって最も重要です。形質転換体のスクリーニングに使用されるマーカーの選択には、ドッキングラインに既に存在するパターンの対象となる蛍光色およびその発現パターンを含め、慎重に考慮しなければならない。適切なマーカーの組み合わせには、RFP(赤)/CFP(シアン)、RFP(赤)/GFP(緑)、RFP(赤)/YFP(黄)、YFP(黄)/CFP(シアン)などがありますが、避けるべき組み合わせはYFP(黄)/GFP(緑)とCFP(シアン)/GFP(緑)です。3xP3プロモーター39は、眼および神経索に特異的であり、蚊のトランスジェネシスのための蛍光マーカーの発現を駆動するために最も頻繁に使用される。実際、現在利用可能なすべてのアノフェレスドッキングラインは、このプロモーターを利用しています。代替調節領域は、アン・ガンビアエ・ポリユビキチン遺伝子(PUBc)5またはウイルスプロモーターIE120の調節領域であり、複数の組織における発現を駆動する。3xP3と一緒に使用すると、これらのプロモーターは可能な色の組み合わせを拡大し、同じ蛍光色素分子の使用さえも拡大します。示されたプロモーターは、蚊のライフサイクル全体を通じて活性であり、すべてのライフステージでのスクリーニングおよび蛍光モニタリングを可能にする。プラスミド設計時のもう1つの考慮事項は、統合または交換する貨物のサイズです。φC31系は顕著な運搬能力18を有するが、ドナープラスミドのサイズは一般に形質転換効率と負の相関関係にあると考えるべきである22。

記載されたプロトコールにおいて、インテグラーゼの供給源は、酵素を遍在的に発現するヘルパープラスミドである40。インテグラーゼの遍在的な存在は、マイクロインジェクションが生殖細胞系列が形成される領域に正確に向けられていない場合、体細胞の形質転換につながる可能性がある。このような変換イベントは遺伝性ではないため失われますが、体細胞効果は注射された個人の適応度を低下させる可能性があります。これを回避し、形質転換効率を高めるために、インテグラーゼ発現を、例えば、vasaプロモーター22,26を使用することによって、生殖細胞系列に制限することができる。他のプロトコールは、φC31インテグラーゼ19、24、43の供給源としてのインビトロ転写メッセンジャーRNA(mRNA)の使用を記載している。しかし、これにはmRNAの煩雑な調製が含まれ、分解を避けるためにインジェクションミックスの慎重な取り扱いとRNaseフリー試薬の使用が必要です。インテグラーゼのプラスミド源は、An. gambiae9,21,22,26,33,37およびAn. stephensi(A.A .パーソナルコミュニケーション)の両方で信頼性が高く、効率的な形質転換につながることが実証されており、したがって、当社の好ましい選択肢です。インテグラーゼ送達のためのさらなる選択肢は、セルフドッキングヘルパーラインにおけるインビボ生産である。このような系統は、生殖細胞系列特異的プロモーターナノの調節下でφC31インテグラーゼを発現するアン・ガンビア科で作成され、生存および形質転換効率の向上につながることが見出された20。しかしながら、ヘルパーライン上のインテグラーゼ酵素のインビボ産生によって課される潜在的な適合負荷は考慮されなければならない。

他のトランスジェニック技術と同様に、形質転換体を回収する機会を最大化するために、注射された胚に由来する個体の飼育および交配に特別な注意が払われなければならない。導入遺伝子を安定に継承した個体は、まずG1子孫で回収することができる。しかしながら、潜在的な形質転換の早期徴候は、3xP3プロモーターを使用する場合、G0第1および第2齢幼虫の肛門乳頭および/または神経索における蛍光マーカーの一過性のエピソーム発現の存在によって評価することができる43。一過性蛍光の存在はプラスミド送達の成功を示唆するが、遺伝性生殖細胞系列形質転換を保証するものではない。同様に、一過性表現の欠如は、変換の成功を排除するものではない。それにもかかわらず、一過性陽性の個体は、一過性陰性の個体と比較してトランスジェニック子孫を産む可能性がより高いことが観察されている43,48。専門家の手では、陽性者のみの飼育と交配は、蚊の数を減らすための選択肢かもしれません。しかし、小さなG0幼虫の重要性と脆弱性を考えると、最小限の操作が依然として推奨され、すべてのG0個体の飼育が常に推奨される。

このプロトコルで報告される交配スキームは、交配の可能性を最大化し、独立した変換イベントを分離するように設計されています。しかし、昆虫のスペースや人員の可用性が問題である場合、十分な異性の個体が提供されていれば、G0の成人は単一のケージに性別によってプールすることができます。このような設定では、同じケージの個体で発生する複数の変換イベント間の識別は許可されません。実験セットアップに応じて、スクリーニングプロセス中に二重(単一統合)または単一(RMCE)マーカーの存在が予想される。単一の統合実験では、ドッキングラインからの元のマーカーの存在を検証することが重要であり、RMCEでは、以前に統合されたマーカーの損失を検証することが重要です。実際、RMCEの設計では、単一のattPサイトの組換えにより交換の代わりに単一の統合が生じた形質転換体を回収することは珍しくありません9,33。このような個体では、両方の蛍光マーカーが、ドナープラスミド骨格全体と同様に存在し、両方の蛍光マーカーについて徹底的なスクリーニングを実施することの重要性を強調する。

予想される蛍光パターンの存在は形質転換の成功を示すが、挿入部位の分子特性評価を行わなければならない。そのためには、ドッキングラインの隣接するゲノム領域を含む、予測された挿入遺伝子座の正確なマップの作成が、遺伝子増幅解析のための適切な診断用オリゴヌクレオチドプライマーの設計にとって極めて重要である。単一の組み込み事象は、新たに組み込まれたDNAと以前に挿入されたカセットとの間の接合部における attR および attL ハイブリッド部位の形成をもたらす。これらのサイトは、挿入サイトの検証の対象にすることができます。RMCE設計では、ドナーカセットの挿入はゲノム遺伝子座に対して2つの代替配向で起こり得るため、4つのプライマーを代替PCRの組み合わせで使用して、ラインがどの向きを運ぶかを検出することができます。カセット挿入の向きは導入遺伝子発現に影響を与える可能性があるため、比較遺伝子発現解析では同じ挿入方位を持つラインを使用することが重要です。

少数の形質転換体を扱う場合、分子分析のために個体全体を犠牲にすることは望ましくないかもしれません。これに対する選択肢は、単身成人の脚から抽出されたDNAの分子分析を行うことであり46、脚の損失は成人女性の交配能力および産卵能力に影響を及ぼさない49。しかし、脚の除去の過程で個人を損傷する危険性がある。廃棄された蛹の症例(L. Grigorakiの個人的なコミュニケーション)を使用して成功が得られましたが、最も安全なアプローチは、生存可能なG3子孫を得た後にG2の両親に分子分析を行うことです。

近年、CRISPR/Cas9は部位特異的ゲノム編集の方法に革命をもたらしました26,41,50,51。部位特異的RMCEとは異なり、CRISPR/Cas9媒介遺伝子組込み(ノックイン)は、ワンステップの形質転換イベントのみを必要とする、予め挿入された組換え部位の存在とは無関係である。それにもかかわらず、CRISPR/Cas9システムは、相同性指向性修復を成功させるために、所望の挿入部位に隣接する大きな既知のゲノム配列の存在、ならびにガイドRNAによって媒介される効率的な部位認識に依存する。これらの条件が常に満たされるとは限らず、トラブルシューティングに手間がかかる可能性があり、An. gambiaeとAn. stephensiの複数のドッキングラインとそれらから派生したラインが利用可能であることを考えると、φC31システムは、同じゲノム位置にある導入遺伝子間の直接表現型比較を実行するための非常に貴重なツールのままです。

Disclosures

著者らは開示するものは何もありません。

Acknowledgments

トランスジェニック のAn. stephensi 幼虫の画像を提供してくれたKiona Parker(UCI)と、トランスジェニック An. gambiae 幼虫を提供してくれたFraser Colman(LSTM)とBeth Poulton(LSTM)に感謝しています。ベス・ポールトン(LSTM)はまた、 アン・ガンビア科 の幼虫のイメージング中に貴重な支援を提供しました。この研究は、Tata Institute for Genetics and Society(TIGS)とLSTMのDirector Catalyst FundがA.A.(DCF2014AA)に授与した。A.A.J.はカリフォルニア大学アーバイン校のドナルド・ブレン教授です。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL eppendorf tubes
8-well microslides VWR MARI1216690
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade
Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm Leica 10446363
Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm Leica 10447079
Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII Omega Optical 500QM25, 500QM35
Halocarbon oil 27 Sigma H8773
Halocarbon oil 700 Sigma H8898
Petri dishes
Potassium chloride
Sodium Chloride
Sodium phosphate dibasic
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) R1181
Stable brush Size 0

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遺伝学 Anopheles φC31 部位指向 ドッキング インテグレーション カセット交換 蚊 トランスジェニック
マラリアの<em>アノフェレス</em>ベクターにおける部位特異的<em>φC31</em>媒介集積分とカセット交換
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