Summary
Detaljerade instruktioner ges för att bygga en öppen källkod, modulär fluorimeter som är kompatibel med många billiga värmare för att utföra kvantitativ isotermisk nukleinsyraförstärkning i realtid.
Abstract
Traditionella metoder för att upptäcka och kvantifiera nukleinsyror förlitar sig på polymeraskedjereaktion (PCR) och kräver användning av dyra termocyklister med integrerad fluorescensdetektering av ampliconer. Isotermisk nukleinsyraförstärkningsteknik eliminerar behovet av termisk cykling; Fluorescensbaserad detektion av produkter krävs dock fortfarande för kvantitativa resultat i realtid. Flera bärbara isotermiska värmare med integrerad fluorescensdetektering är nu kommersiellt tillgängliga; Kostnaden för dessa enheter är dock fortfarande ett betydande hinder för utbredd användning i resursbegränsade inställningar. Beskrivs här är ett protokoll för design och montering av en modulär, billig fluorimeter tillverkad av färdiga komponenter. Fluorimetern är innesluten i ett kompakt 3D-printat hölje och är utformad för att placeras ovanpå ett kommersiellt tillgängligt värmeblock som håller ett PCR-rör. Fluorimetern som beskrivs här var optimerad för att upptäcka fluorescein isothiocyanate (FITC) färgämne, men systemet kan modifieras för användning med färgämnen som ofta används som reportrar i realtid nukleinsyraförstärkningsreaktioner. Systemets kliniska tillämplighet visas genom att utföra realtids nukleinsyradetektering med två isotermiska förstärkningstekniker: rekombinaspolymerasförstärkning (RPA) för påvisande av dna för positiv kontroll som tillhandahålls i ett kommersiellt kit och omvänd transkriptionsslinga-medierad isotermisk förstärkning (RT-LAMP) för påvisande av kliniskt meningsfulla nivåer av SARS-CoV-2 RNA.
Introduction
Isotermisk förstärkningsteknik används ofta för detektion av nukleinsyror. Jämfört med traditionella PCR-metoder som kräver termocykling tillåter isotermisk förstärkning nukleinsyraförstärkning vid en enda temperatur, vilket möjliggör snabbare tid till resultat och bättre tolerans för hämmare1,2. En annan viktig fördel med isotermisk förstärkning är den minskade instrumenteringskomplexiteten. De flesta isotermiska förstärkningsreaktioner kräver endast ett värmeblock och en detekteringsmodalitet - antingen realtidsdetektering via fluorescensövervakning eller slutpunktsdetektering, till exempel genom sidoflöde eller gelelektrofores3,4. Fluorescensdetektering i realtid utförs genom detektion av fluorescens som produceras av interkalerande färgämnen som aktiveras i närvaro av dubbelsträngat DNA eller släckta fluorescerande sonder som aktiveras i närvaro av specifika dubbelsträngade DNA-sekvenser.
Medan kommersiellt tillgängliga bänktop isotermiska fluorimetrar finns, saknar många anpassning för analysimplementering. Många enheter kräver till exempel specifika eller företagsbaserade förbrukningsvaror, rekommenderar önskade leverantörer eller använder proprietär programvara för att få annonserade resultat. De flesta av dessa system kostar över $ 5,000 USD, vilket utgör ett betydande hinder för utbredd användning i resursbegränsade inställningar. Dessutom står användare i lågresursinställningar inför utmaningar att underhålla utrustning som är utformad för högresursinställningar på grund av hårda miljöförhållanden, svaga leveranskedjor för reservdelar och specialiserade verktyg som krävs för underhåll och reparation5. För att möta detta behov, som beskrivs här är utformningen och monteringen av en modulär och billig fluorimeter tillverkad av färdiga komponenter inneslutna i ett kompakt 3D-tryckt hus (Figur 1A-C) med två valfria konfigurationer. Den första konfigurationen av den här enheten använder kommersiellt tillgängliga glasfilter och en tärande spegel för att blockera överflödigt bakgrundsljus och har en total monteringskostnad på $ 830 USD. Medan dessa filter ofta används i fluorescensbaserade bildsystem, har byte av dyra högkvalitativa optiska filterfolier tidigare visat sig möjliggöra detektering av nukleinsyra6. Den andra konfigurationen av fluorimetern innehåller dessa billiga filter och ersätter de tärande speglarna med φ1/2" balkdelare, vilket minskar den totala kostnaden för systemet från $ 830 till $ 450 USD.
Representativa bilder av sammansättningen visas för den första konfigurationen i figur 1 och figur 2, men analoga bilder för den andra konfigurationen finns i kompletterande fil 6. För att undvika behovet av specialiserad optisk inriktning har det optiska systemet utsedda områden för att placera varje optisk komponent och kan göras med en relativt låg 3D-skrivare, vilket möjliggör utbredd användning av designen. De enda skillnaderna i konstruktion och montering för de två konfigurationerna är de filer som används för 3D-utskrift och de optiska komponenterna som placeras i höljet. De yttre dimensionerna på det 3D-utskrivna höljet för båda systemen är desamma. En kostnadsjämförelse av de två systemen visas i tabell 1.
Som visas i figur 1A, för att bibehålla en liten formfaktor, består fluorimetern av Φ1/2" (~ 12,5 mm) optik, tillsammans med kompakt belysning och detektion som placeras för att mäta signal genom toppen av PCR-röret. Systemet i figur 1 är utformat för att detektera färgämnen med toppexcitation och emissionsvåglängder nära 490 nm respektive 525 nm, inklusive FITC och närbesläktade färgämnen som SYBR och SYTO-9, som ofta används som reportrar i realtid nukleinsyraförstärkningsreaktioner7,8. Excitationskällan, optiska filter och detektor kan lätt ersätta komponenter som är kompatibla med olika fluorescerande färgämnen efter önskemål. Nukleinsyraförstärkningsreaktioner utförs vanligtvis i PCR-rör, och fluorimetern är utformad för att placeras ovanpå alla kommersiellt tillgängliga värmeblock som håller PCR-rör (Figur 1D) vilket möjliggör realtidsövervakning av isotermiska reaktioner. Lämpliga värmeblock finns i de flesta biomedicinska laboratorier och kan köpas för mindre än $ 500 USD.
Användningen av enkortsdatorer för att tillhandahålla ett lågkostnadsalternativ för styrning av bildteknik har tidigarevisats 9. Genom att bygga vidare på det arbetet används i detta protokoll ett enkortsdatordrivet grafiskt användargränssnitt (figur 1D) för att underlätta dataloggning i realtid och visning av resultat vid vårdpunkten, vilket eliminerar behovet av att en bärbar dator bearbetar eller visualiserar data. Fluorescensmätningar överfördes genom I2C-protokoll från ljussensorerna till en mikrokontroller och gjordes sedan tillgängliga för enkortsdatorn genom seriell kommunikation. Elektriska anslutningar för belysning och dataöverföring tillhandahölls genom förenklade ledningar och lödning på miniatyriserade brödskivor, vilket förnekade behovet av specialiserade kretskort .Electrical connections for illumination and data transfer provided through simplified wiring and lödning on miniaturized breadboards, negating the need for specialized printed circuit boards (PCB). Programvaran som krävs för att köra fluorimetern är tillgänglig via programvaruramverk med öppen källkod och koden som krävs för att köra enheten tillhandahålls i de kompletterande kodningsfilerna. Den kompletta fluorimetern kan monteras för mellan $ 450 till $ 830 USD, och resultaten visar att det ger exakta och tillförlitliga fluorescensmätningar för att övervaka isotermisk förstärkning i realtid av nukleinsyror.
Protocol
1. Förberedelsesteg: 3D-utskrift och lödning
OBS: Det optiska systemet som beskrivs i detta protokoll är konstruerat för en vanlig torrblocksvärmare.
- För att skapa den första konfigurationen skriver 3D ut CAD-filerna som tillhandahålls som kompletterande filer 1, 2 respektive 3:
- För att skapa den andra konfigurationen skriver 3D ut CAD-filerna som tillhandahålls som kompletterande filer 3, 4 respektive 5:
OBS: Dessa delar är utformade för att skrivas ut med stöd. I denna guide används en svart polykarbonatglödtråd som kan bibehålla sin form efter att ha utsatts för temperaturer upp till 110 °C. I allmänhet kan alla material som kan värmas upp till temperaturen av önskad isotermisk reaktion utan betydande deformation användas. För att minimera effekten av inre reflektioner och störningar i omgivningsljuset rekommenderas ett material som är svart eller en annan mörk färg. - Förbered de två ljus-till-digitala sensorutvärderingsmodulerna för parallell övervakning av två prover. På ett av sensortestbrädorna tar du bort R4-motståndet och löder en bygelkabel från R4-områdets högra dyna på kretskortet till den övre dynan i R1-området på kretskortskortet. Detta kommer att ändra sensorns I2C-adress, vilket möjliggör samtidig mätning av båda sensorerna.
OBS: Sensorn som används består av två PCB: ett USB-adapterkort och ett sensortestkort som innehåller ljussensorn; endast sensortestkortet behövs för denna enhet. - Lödtrådar till var och en av de två lysdioderna (lysdioder). Anslut en röd kabel (positiv) till dynan märkt "1" på lysdioden och en svart kabel (negativ) på dynan märkt "2" på lysdioden. Applicera ett tunt lager termiskt lim på baksidan av lysdioden, placera lysdioden på toppen av ett ändlock och vänta tills det termiska limet härdar. På andra sidan ändlocket, tillsätt en kylfläns.
OBS: När du testar lysdioderna innan de förseglas i höljet, se till att bära ett ordentligt blått ljus som blockerar ögonskyddet. - För att skapa den andra konfigurationen skär du två cirklar med 1/4 tums diameter från ett blått excitationsfolieark och fyra 1/4-tums diametercirklar från en gul emissionsfolieplåt med sax eller rakblad.
- Tryck in ett M2.5-sexkantsformat skär i vart och ett av de fyra hålen på den sneda delen av LCD_Screen_Holder.stl-delen.
2. Optisk montering
- Placera en 3/16 tum lång 4-40 gängad insats i hålet på toppen av "Optics_Enclosure_Bottom.stl"-delen. Placera ett 1/4 tum långt 4-40 gängat skär i alla andra hål i den 3D-utskrivna delen enligt figur 2A.
- Sätt in sensortestbrädan i höljets övre hålighet, med de fem stiften vända mot toppen och närmast enhetens mittaxel. Säkra med en 3/16 tum lång 4-40 skruv genom hålet på sensorns testbräda (Figur 2B).
- Placera ett av 20 mm brännviddslinserna i avsnittet under sensortestbrädan med konvexsidan vänd mot enhetens botten och bort från provningsbrädan(figur 2C).
- Om du vill skapa den första konfigurationen placerar du det långa passfiltret i nästa avsnitt under 20 mm brännviddslinsen (Figur 2D) placerad i föregående steg. För att skapa den andra konfigurationen, placera två gula emissionsfilterfolier i avsnittet under objektivet.
- Om du vill skapa den första konfigurationen placerar du den tärande spegeln i den diagonala delen nära mitten av omslutningen samtidigt som du observerar den filterorientering som anges av tillverkaren (figur 2E). Om du vill skapa den andra konfigurationen placerar du stråldelaren i den diagonala delen. Ingen specifik orientering behövs för balkdelaren.
- Placera en andra 20 mm brännviddslins i sektionen under den tärande spegeln (eller balkdelaren, beroende på konfiguration) med konvexsidan riktad mot enhetens överkant (figur 2F).
- Om du vill skapa den första konfigurationen placerar du excitationsfiltret i avsnittet till höger om den tärande spegeln och ser till att pilen pekar mot den tärande spegeln (figur 2G). För att skapa den andra konfigurationen, placera en blå excitation filter folie i avsnittet till höger om balkdelaren.
- Placera 15 mm brännviddslinsen till höger om excitationsfiltret med konvexsidan vänd mot den tärande spegeln(bild 2H).
- Placera en lysdiod i den återstående delen av utskriften, med lysdioden vänd mot den tärande spegeln (eller stråldelaren, beroende på konfiguration). Se till att de två kablarna som leder från lysdioden sätts in i de infällda kanalerna så att utskriften stängs tätt.
- Upprepa steg 2.3-2.9 för den andra sidan av den 3D-utskrivna delen (Bild 2I).
- Stäng den tomma sidan av utskriften ovanpå utskriften med de optiska komponenterna genom att placera de extruderade delarna av den övre halvan av inneslutningen i de infällda spåren på den nedre halvan av omslutningen. Fäst de två tryckta delarna tillsammans med 3/8 tum långa 4-40 skruvar (Bild 2J).
OBS: Om de två tryckta delarna inte är helt stängda kan herrelöst excitationsljus komma ut ur det optiska höljet. Se till att rätt blåljusblockerande ögonskydd bärs tills en ordentlig tätning har uppnåtts. Återförslut höljet tills inget överskott av ljus kommer ut.
3. Elektronik och pekskärmsmontering
- Anslut de två minibrödskivorna och placera sedan mikrokontrollern på en av brödskivorna. Se till att mikroUSB-porten på mikrokontrollern är vänd utåt.
- För att ansluta LED-modulering, anslut CTL-stiftet på LED-drivrutinen (+) till en digital stift av mikrokontrollern och LED-stiftet (-) på LED-drivrutinen till en GND-stift på mikrokontrollern.
- Ta bort plastkåporna på baksidan av brödskivorna. Tryck brödskivorna på den 3D-printade delen för att fästa de kombinerade brödskivorna på insidan av den bakre delen av den tryckta delen "LCD_Screen_Holder.stl".
- Fäst LCD-skärmhållaren (Liquid Crystal Display) med de monterade brödskivorna inuti till det optiska höljet monterat i avsnitt 2 med 4-40 skruvar.
- Anslut LED-drivrutinens LED-stift (+) till den positiva kabeln på den första lysdioden för att ansluta LED-strömförsörjningen. Anslut den negativa kabeln på den första lysdioden till den positiva kabeln på den andra lysdioden på brödbrädan. Anslut den negativa kabeln på den andra lysdioden till LED-drivrutinens LED-stift(-).
OBS: Ordningen på första eller andra lysdioden är godtycklig. - För att ansluta LED-förarens strömförsörjning, anslut de positiva och negativa kablarna i 10 V-strömförsörjningen till VIN+ respektive VIN-stiften på LED-drivrutinen. (Ett piputtag till tvåstiftsadapter användes.)
- Anslut sensortestkortets strömförsörjning och dataöverföring. Endast fyra stift på sensortestkortet används: SCK, SDA, VDUT och GND. Ta en 4-stifts hona till manlig bygeltråd och anslut stiften på de lätta till digitala sensortestbrädorna till minibrödbrädan genom gapet längst upp till höger på LCD Holder-utskriften.
- På brödskivan ska du se till att det finns kopplingar mellan följande: mikrokontrollerens 3,3 V-stift och VDUT-stiftet på båda provningsskivorna; Mikrokontrollerens GND-stift och GND-stiftet på båda testbrädorna. Mikrokontrollerns analoga stift 4 (A4) och båda testkortens SDA-stift. och mikrokontrollerns analoga 5 (A5) stift och SCK-stiftet på båda testbrädorna.
OBS: Eftersom I2C-kommunikation används för ljussensorerna kan båda sensorernas SCK- och SDA-stift dirigeras till samma stift på mikrokontrollern. - Fäst enkortsdatorn på LCD-skärmhållaren med fyra M2.5-skruvar. Se till att HDMI- och strömadapterportarna på enkortsdatorn är vända uppåt och att enkortsdatorn är centrerad på den 3D-utskrivna delen.
- Anslut pekskärmsskärmen till enkortsdatorn enligt pekskärmsanvisningarna och anslut sedan HDMI-porten på enkortsdatorn till pekskärmens HDMI-port.
4. Programvaruinstallation
- Installera och använd webbredigeraren för att ladda upp den anpassade skissen "MiniFluorimeter_2Diode.ino" som finns i Kompletterande kodningsfil 1 till mikrokontrollern. Kontrollera att biblioteket "ClosedCube OPT3002" är installerat med bibliotekshanteraren.
- Ändra variabeln led_A_pin till numret på den digitala stift som används i steg 3.3 (elektronik och monteringssektion för pekskärm).
- Justera antalet millisekunder som lysdioden är på när fluorescensmätningar förvärvas genom att värdet på variabeln ExposureTime ändras. Justera antalet millisekunder mellan LED-exponeringar genom att ändra värdet på variabeln led_A_Interval.
- Ändra variabeln led_Power till ett tal mellan noll och ett för att justera ljusstyrkan på lysdioderna under exponeringar. Noll ger maximal ljusstyrka och en ger den lägsta ljusstyrkan.
- Aktivera möjligheten att styra bildskärmen via pekskärmen genom att följa tillverkarens instruktioner som medföljer 3,5-tumsskärmen.
Obs: Om så önskas kan 3,5-tumsskärmen användas som bildskärm utan pekskärmsfunktioner, och ett tangentbord och en mus kan anslutas till USB-portarna på enkortsdatorn för kontroll av enkortsdatorn. - Ladda ner filen "MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py" från Kompletterande kodningsfil 2 till önskad plats på enkortsdatorn.
- Kontrollera att en fungerande version av Python är installerad på enkortsdatorn . Python 3.7 användes i den medföljande Python-modulen, men alla stabila Python-versioner kunde användas med lämpliga ändringar av det angivna skriptet. Installera de bibliotek som behövs för Python-programmet på enkortsdatorn.
- Ändra variabeln measurement_time till den tid som önskas för att göra mätningar. Programmet avslutar förvärvet och avslutas efter att önskad tid har förflutet. Gui-gränssnittet gör det också möjligt att avsluta förvärvet via en knapp i användargränssnittet.
- Ändra variabeln serialPort till serieadressen för den anslutna mikrokontrollern.
5. Registrera fluorescensdata i realtid
- Slå på det kommersiella värmeblocket och låt det nå önskad temperatur.
- Strömförse enkortsdatorn med en standard 5 V-strömförsörjning som är försedd med de flesta enkortsdatorköp. Anslut enkortsdatorn till mikrokontrollern med en microUSB till USB-kabel.
- Öppna det medföljande Python-skriptet med hjälp av pekskärmen. Ändra measurement_time och serialPort-variablerna till önskade värden. Ändra variabelutmatningenFilepath till namnet på den datafil som genereras i programmet. Se till att filnamnet slutar i ".xlsx".
- Placera två PCR-rör som innehåller de reaktioner som ska övervakas i värmeblocket. Se till att placeringen av PCR-rören överensstämmer med fluorimeterns optiska kanaler när den har placerats på värmeblocket.
- Placera fluorimetern ovanpå värmeblocket med PCR-rören centrerade mellan de fyra pinnarna som extruderas från varje optisk kanal på fluorimetern. För optimala mätningar, se till att den 3D-utskrivna fluorimetern är ordentligt fastsatt i värmeblockens brunnar.
- Fäst fluorimetern ordentligt, anslut nätadaptern till lysdioderna.
- Använd pekskärmen för att starta Python-programmet. Ett grafiskt användargränssnitt (GUI) visas på LCD-skärmen och mäter fluorescensen i realtid.
- Observera fluorescensmätningarna i realtid över tid för båda PCR-rören som visas för användaren på gui.Observe the realtid fluorescence measurements over time for both PCR tubes that are shown to the user on the GUI.
- När den experimenttid som användaren har fastställt har förflutnat upphör förvärvet. Visa måtten i utdatafilen som sparats på den användardefinierade platsen. För att avsluta mätningarna tidigt klickar du på knappen märkt "Stoppa förvärv" på användargränssnittet.
Representative Results
När fluorimeterprestandan har monterats kan den valideras genom att fluorescensen mäts från en utspädningsserie av FITC-färgämne. I figur 3Avisas mätningar av FITC-färgämne vid koncentrationer på 0, 20, 40, 60 och 80 pg/μL beredda i 1x PBS på båda kanalerna i fluorimeterns första konfiguration. Varje prov mättes tre gånger med en LED-exponering på 1,5 s med 20 s intervall. Båda kanalerna på fluorimetern visar ett linjärt svar över önskat intervall.
Klinisk tillämplighet av fluorimetern visades vidare genom att använda systemet tillsammans med ett kommersiellt tillgängligt torr värmeblock för att utföra förstärkning med två isotermiska förstärkningstekniker: RPA och RT-LAMP.
Figur 3B visar den subtraherade tidsföringskursen för fluorescens som uppmätts under 39 °C-förstärkning av 50 μL RPA-positiva och negativa kontrollreaktioner i realtid för kitpositivt kontroll-DNA som tillhandahålls i ett kommersiellt standardkit och bereds enligt tillverkarens instruktioner. RPA-reaktioner, som ger en relativt låg fluorescensnivå, mättes med hjälp av fluorimeterns första konfiguration som uppnår bättre undertryckande av excitationsljus.
Figur 3C visar tidskursmätningen av en anpassad RT-LAMP-analys vid 65 °C med hjälp av N2-, E1- och As1e-primeruppsättningarna som beskrivs av Zhang et al10och Rabe och Cepko11. RT-LAMP reaktioner producerar en större mängd fluorescens och mättes med hjälp av den andra, billigare fluorimeter konfigurationen. Oligonukleotider köptes och återanvändes i 2x TE-buffert vid en koncentration på 1 mM. Framåt inre primer (FIP) och bakåt inre primer (BIP) oligos beställdes med högpresterande flytande kromatografi rening. Varje primeruppsättning (N2, E1 och As1e) kombinerades för att göra 1000 μL av en 25x blandning enligt följande: 40 μL FIP, 40 μL BIP, 5 μL F3, 5 μL B3, 10 μL LF, 10 μL LB och 890 μL 1x TE-buffert. För att montera varje RT-LAMP-reaktion tillsattes 1 μL av varje primeruppsättning till 0,5 μL 50x fluorescerande färgämne och 12,5 μL 2x huvudblandning och reaktionsvolymen togs upp till 20 μL med nukleasfritt vatten enligt tillverkarens instruktioner. SARS-CoV-2 RNA Control späddes seriellt i nukleasfritt vatten till koncentrationer på 10, 100 eller 1 000 kopior per μL och 5 μL tillsattes för en total reaktionsvolym på 25 μL. Den no target control (NTC) som användes i alla experiment var nukleasfritt vatten. RT-LAMP reaktioner var överlägg med 25 μL molekylärbiologi-grade mineralolja.
RPA och RT-LAMP reaktioner monterades i två brunnar av en 0,2 mL lågprofil 8-rör PCR remsa och kapsejsade med ultraclear flat caps. Varje RPA- och RT-LAMP-reaktion hölls i tre exemplar. I alla tester kvantifierade mini-fluorimetern framgångsrikt den temporala ökningen av fluorescensnivåer i samband med DNA-förstärkning.
Bild 1:Optiskt hölje och monterad miniatyrfluorimeter ovanpå värmeblocket. (A) Diagram över optiskt hölje som visar optiska komponenter placerade i en detektionskanal. B)Diagram över miniatyrfluorimeterns första konfiguration efter montering. C)Fotografi av det optiska höljet med optiska komponenter placerade i en detektionskanal. D)Fotografi av monterad miniatyrfluorimeter placerad ovanpå ett kommersiellt tillgängligt värmeblock. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Monterings- och elektriskt kontrolldiagram över miniatyrfluorimetern. A-J) Steg-för-steg-placering av de optiska komponenterna i det 3D-utskrivna optiska höljet för den första systemkonfigurationen. (K) Elektriskt diagram över miniatyrfluorimetern för båda konfigurationerna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Representativa mätningar som erhållits med miniatyrfluorimetern( A) Uppmätt fluorescens kontra FITC-färgkoncentration i båda kanalerna visar linjär respons över önskat dynamiskt omfång. (B) Realtidsfluorescens vs tid för isotermisk förstärkning av positiva och negativa kontroller av ett kommersiellt tillgängligt kit. Förstärkning sker som förväntat för den positiva kontrollen. (C) Realtidsfluorescens vs tid för isotermisk förstärkning av 50, 500 och 5000 kopior av SARS-CoV-2 RNA och ett NTC-prov från en anpassad RT-LAMP-analys. Förstärkning sker som förväntat nära detektionsgränsen för analysen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| System 1 | System 2 | |||
| sak | kvantitet | Totalt pris (USD) | kvantitet | Totalt pris (USD) |
| Optiska komponenter | ||||
| Linser | 6 | 158.14 | 6 | 158.14 |
| Speglar | 2 | 244.56 | 2 | 60 |
| Optiska filter | 4 | 200 | 6 | 5 |
| delsumma | 602.7 | delsumma | 223.14 | |
| Belysning och detektion | ||||
| lysdioder | 2 | 72.62 | 2 | 72.62 |
| LED-drivrutin | 1 | 11.49 | 1 | 11.49 |
| fotodiod | 2 | 50 | 2 | 50 |
| delsumma | 134.11 | delsumma | 134.11 | |
| Elektronik och display | ||||
| Arduino Nano | 1 | 20.7 | 1 | 20.7 |
| Hallon Pi | 1 | 35 | 1 | 35 |
| LCD-skärm | 1 | 25 | 1 | 25 |
| Mini brödbräda | 1 | 4 | 1 | 4 |
| 10V strömförsörjning | 1 | 8.6 | 1 | 8.6 |
| delsumma | 93.3 | delsumma | 93.3 | |
| Total kostnad (USD) | 830.11 | 450.55 | ||
Tabell 1: Kostnadsjämförelse av miniatyrfluorimeterns två konfigurationer.
Kompletterande fil 1: System1_Optics_Enclosure_Top.stl Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl, och klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: LCD_Screen_Holder.stl Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 4: System2_Optics_Enclosure_Top.stl Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 5: System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl, och klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 6: System2_BuildInstructions.pdf Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodning fil 1: MiniFluorimeter_2Diode.ino Klicka här för att ladda ner denna kodningsfil.
Kompletterande kodning fil 2: MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py Klicka här för att ladda ner denna kodningsfil.
Discussion
Beskrivs här är en öppen källkod, låg kostnad, modulär, bärbar fluorimeter för kvantitativ fluorescensdetektering av isotermiska förstärkningsreaktioner. Projekt med öppen källkod underlättar snabbt och billigt underhåll med lätt tillgängliga reservdelar och ger användarna flexibiliteten att anpassa systemet till sina behov baserat på modulär design. Detta protokoll beskriver processen för montering av mekaniska, optiska och elektriska komponenter och validering av optisk prestanda. Dessutom visades fluorimeterns flexibilitet att övervaka två olika typer av isotermiska förstärkningsanalyser med betydligt olika temperatur-, volym- och fluorescenskrav, RPA exo och RT-LAMP. RPA utförs vid 39 °C i 50 μL-reaktioner som använder en sekvensspecifik FAM-märkt sond för fluorescensgenerering, medan RT-LAMP utförs vid 65 °C i en reaktionsvolym på 25 μL och använder ett intercalating färgämne för att rapportera förekomsten av det förstärkta DNA. Eftersom fluorescensmätningar görs genom toppen av PCR-rör med platta lock, kan fluorimetern upptäcka fluorescens från båda analysvolymerna, och värmekraven begränsas endast av det valda kommersiella värmeblocket. Dessutom är fluorescensintensiteten som produceras i RT-LAMP nästan i storleksordning större än den som produceras i RPA, på grund av de färg- kontra sondbaserade metoderna för fluorescenssignalgenerering. Det dynamiska området hos den valda optiska sensorn kan dock detektera och kvantifiera både signalerna, och subtraktionsalgoritmer vid baslinjen tar hänsyn till dessa skillnader för att producera tillförlitliga fluorescensavläsningar.
För att underlätta teknikspridning och minimera potentiella underhållskostnader användes en modulär design som är kompatibel med värmare som är allmänt tillgängliga i olika miljöer. I det nuvarande protokollet användes en vanlig torrblockvärmare. Samma optiska och elektriska design kan enkelt anpassas för andra kommersiellt tillgängliga värmare. Om en annan torrblocksvärmare ska användas krävs minimala förändringar i 3D-höljets konstruktion. Specifikt måste de nedre pinnarna i de optiska STL-filerna modifieras för att säkerställa korrekt anpassning till brunnarna i andra kommersiella värmeblock. Även om kapslingarna som visas i exemplen trycktes på en relativt lågsluts 3D-skrivare (se Materialförteckning),bör man se till att skrivarupplösningen och/eller utskriftstoleranserna är tillräckliga för att rymma de optiska komponenterna och gängade skären. I de stl filer som tillhandahålls, en tolerans på 0,01-0,02 tum lades till på vardera sidan av de optiska komponenterna i radiella och axiella riktningar baserat på de dimensioner som anges av tillverkaren. Detta säkerställer att alla optiska komponenter passar säkert i utskriften och att höljet helt blockerar överflödigt ljus från att komma in eller ut. För att säkerställa en korrekt presspassning för de gängade skären subtraherades en liknande tolerans på 0,01-0,02 tum från den medföljande diametern i CAD-filen.
RPA reaktioner övervakades framgångsrikt med hjälp av den första fluorimeter konfigurationen, medan RT-LAMP reaktioner kunde övervakas med någon av konfigurationerna. Förbättrad herrelös ljusavstötning av den första konfigurationen var nödvändigt för att övervaka de låga nivåerna av fluorescens som produceras av fluorogen sond i RPA reaktioner. RT-LAMP använder däremot ett intercalating färgämne för signalgenerering, vilket resulterar i en högre fluorescensintensitet som är kompatibel med det lägre dynamiska intervallet för den andra konfigurationen med hjälp av fotografiska filterfolier. Användare bör välja den fluorimeterkonfiguration som matchar fluorescenssignalen som genererar element-intercalating färgämne eller fluorogen sond-av deras analys.
En begränsning av detta system är att uppvärmning tillhandahålls av ett kommersiellt tillgängligt värmeblock som drivs genom ett standard vägguttag. Detta system skulle kunna vidareutvecklas för användning i områden som saknar tillförlitlig tillgång till el genom att inkorporera bärbara och uppladdningsbara batteripaket enligt andra grupper12. En annan begränsning är systemets relativt låga genomströmning, vilket möjliggör samtidig fluorescensmätning av endast två prover åt gången. Flera utskrifter av höljet kan placeras ovanpå samma värmeblock för att öka dataflödet; Den ljussensor som används har dock bara fyra unika I2C-adresser. Detta begränsar det maximala antalet prover som kan mätas samtidigt till fyra. En annan ljussensor med ett större antal unika I2C-adresser behövs för att ytterligare öka dataflödet.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Särskilt tack till Chelsey Smith, Megan Chang, Emilie Newsham, Sai Paul och Christopher Goh för deras hjälp med provberedning. Författarna tackar Caroline Noxon för manuskriptrevisionen. Finansiering för detta arbete tillhandahölls från det amerikanska folket av USAID genom ett IAVI-forskningsanslag CCID 9204 under tilldelning AID-OAA-A16-00032 mellan IAVI och USAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
| 15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
| 1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
| 20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
| 3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
| 3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| 3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
| 3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
| 3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
| 8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
| barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different filters. |
| Blue LED - 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
| Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
| Microcontroller | Arduino | Nano | |
| Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
| Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM - Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
| Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
| Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
References
- Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).
- Yan, L., et al. Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA. Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).
- Giuffrida, M. C., Spoto, G. Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances. Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).
- Gill, P., Ghaemi, A. Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).
- Richards-Kortum, R., Oden, M. Devices for Low-Resource Health Care. Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).
- Katzmeier, F., et al. A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a. PLOS One. 14 (12), e0220091 (2019).
- Safavieh, M., et al. Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).
- Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis. Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).
- Parra, S., et al. Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer. IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).
- Zhang, Y., et al. Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
- Rabe, B. A., Cepko, C. SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).
- Snodgrass, R., et al. A Portable Device for Nucleic Acid Quantification Powered by Sunlight, a Flame or Electricity. Nature Biomedical Engineering. 2 (9), 657-665 (2018).
