Summary
We presenteren een protocol voor het genereren van orthodontische tandbeweging bij muizen en methoden voor 3D-visualisatie van de collageenvezels en bloedvaten van parodontale ligament zonder sectioning.
Abstract
Orthodontische tandbeweging is een complex biologisch proces van veranderde hermodellering van zacht en hard weefsel als gevolg van externe krachten. Om deze complexe remodelleringsprocessen te begrijpen, is het van cruciaal belang om de tand- en parodontale weefsels binnen hun 3D-context te bestuderen en daarom eventuele doorsneden en weefselartefacten te minimaliseren. Muismodellen worden vaak gebruikt in ontwikkelings- en structurele biologie, evenals in biomechanica vanwege hun kleine formaat, hoge stofwisseling, genetica en gebruiksgemak. In principe maakt dit ze ook uitstekende modellen voor tandheelkundige studies. Een grote belemmering is echter hun kleine tandgrootte, met name de kiezen. Dit artikel is gericht op het bieden van een stapsgewijs protocol voor het genereren van orthodontische tandbeweging en twee methoden voor 3D-beeldvorming van de parodontale ligamentfibulaire component van een muismandibulaire kies. De eerste gepresenteerde methode is gebaseerd op een micro-CT-opstelling die faseverbetering van verse collageenweefsels mogelijk maakt. De tweede methode is een botopruimingsmethode met ethylcinnamaat die beeldvorming door het bot mogelijk maakt zonder doorsneden en endogene fluorescentie behoudt. Het combineren van deze clearing methode met reporter muizen zoals Flk1-Cre; TdTomato bood een eerste in zijn soort gelegenheid om de 3D vasculatuur in het PDL- en alveolaire bot in beeld te krijgen.
Introduction
Het fundamentele onderliggende biologische proces in orthodontische tandbeweging (OTM) is botremodellering. De trigger voor dit remodelleringsproces wordt toegeschreven aan veranderingen in de structuur van het parodontale ligament (PDL) zoals extracellulaire matrix (ECM) stress, necrose evenals bloedvatvernietiging en vorming1,2,3. Andere mogelijke triggers voor alveolaire botremodellering zijn gerelateerd aan krachtdetectie door osteocyten in het bot, evenals mechanische vervorming van het alveolaire bot zelf; hun rol in OTM is echter nog steeds niet volledig opgehelderd4,5.
Ondanks vele studies die gericht waren op het onthullen van structuur-functierelaties van de PDL tijdens OTM , moet nog een duidelijk functioneel mechanisme worden gedefinieerd6,7. De belangrijkste reden hiervoor is de uitdaging bij het ophalen van gegevens van een zacht weefsel (PDL) tussen twee harde weefsels (cementum en alveolaire bot). De geaccepteerde methoden voor het verzamelen van structurele informatie vereisen meestal fixatie en doorsneden die de PDL-structuur verstoren en wijzigen. Bovendien leveren de meeste van deze methoden 2D-gegevens op die, zelfs als ze niet vervormd zijn, slechts gedeeltelijke en gelokaliseerde informatie geven. Aangezien de PDL niet uniform is in zijn structuur en functie, is een aanpak die de intacte 3D-structuur van het hele tand-PDL-botcomplex aanpakt gerechtvaardigd.
Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van een OTM bij muizen en twee methoden die 3D-visualisatie van de collageenvezels in de PDL mogelijk maken zonder enige sectie van het monster.
Murinemodellen worden veel gebruikt voor in-vivo experimenten in de geneeskunde, ontwikkelingsbiologie, medicijnafgifte en structurele studies. Ze kunnen genetisch worden gemodificeerd om specifieke eiwitten en functies te elimineren of te verbeteren; ze zorgen voor snelle, herhaalbare en voorspelbare ontwikkelingscontrole; ze zijn ook gemakkelijk te beeld vanwege hun kleine formaat8. Ondanks hun vele voordelen worden muismodellen in tandheelkundig onderzoek niet vaak gebruikt, vooral wanneer klinische manipulaties gerechtvaardigd zijn, meestal vanwege de kleine tanden. Diermodellen zoals ratten9,10,11,honden12,13,varkens14,15,16 en apen17 worden vaker gebruikt dan muizen. Met de recente ontwikkeling van beeldvormingstechnieken met hoge resolutie zijn de voordelen van het gebruik van een muismodel om de ingewikkelde processen in OTM te ontcijferen talrijk. Dit artikel presenteert een methode om een mesiale beweging van de kiestand in de onderkaak te genereren met constante krachtniveaus die botremodellering veroorzaken. De meeste OTM-experimenten bij knaagdieren worden gedaan in de maxilla, omdat de mobiliteit van de onderkaak en de aanwezigheid van de tong een ander complexiteitsniveau toevoegen. De onderkaak heeft echter veel voordelen wanneer 3D structurele integriteit gewenst is. Het kan gemakkelijk worden ontleed als een heel bot; bij sommige soorten kan het worden gescheiden in twee hemi-kaken door de vezelige symfyse; het is compact, plat en bevat alleen de tanden zonder sinusruimten. De maxilla is daarentegen een deel van de schedel en nauw verwant aan andere organen en structuren, dus uitgebreide doorsneden zijn nodig om het alveolaire bot met de bijbehorende tanden te ontleden.
Met behulp van een interne vochtigheidskamer gekoppeld aan een laadsysteem in een micro-CT met hoge resolutie die faseverbetering mogelijk maakt, ontwikkelden we een methode om verse vezelige weefsels in 3D te visualiseren zoals eerder beschreven9,18,19,20,21,22,23. Verse weefsels worden onmiddellijk gescand nadat het dier is geofferd zonder enige kleuring of fixatie, wat weefselartefacten en veranderingen van biomechanische eigenschappen vermindert. Deze 3D-gegevens kunnen worden gebruikt voor distributie- en richtingsanalyses van de vezels zoals elders beschreven19.
De tweede 3D-methode voor beeldvorming van hele weefsels die hier wordt gepresenteerd, is gebaseerd op optische clearing van de onderkaak, waardoor de PDL-vezels door het bot kunnen worden gebeeldbeerd zonder enige doorsnede. Interessant is dat het ook visualisatie van de collageenvezels van het bot zelf mogelijk maakt, maar dit zal hier niet worden besproken. Over het algemeen zijn er twee methoden voor weefselopruiming. De eerste is waterige clearing waarbij het monster wordt ondergedompeld in een waterige oplossing met een brekingsindex groter dan 1,4, hetzij door een eenvoudige onderdompeling, hyperhydratatie of hydrogelinbedding. Deze methode is echter beperkt in het niveau van transparantie en de structurele conservering van het weefsel en vereist daarom fixatie van het weefsel. De tweede methode die zeer transparante monsters oplevert en geen fixatie vereist , is de clearingmethode op basis vanoplosmiddelen 24,25. We hebben een gemodificeerde clearingmethode op basis van oplosmiddelen gegenereerd op basis van ethyl-3-fenylprop-2-enoaat (ethylcinnamaat, ECi) voor de mandibulaire monsters. Deze methode heeft de voordelen van het gebruik van niet-toxische voedselkwaliteit clearing agent, minimale weefselkrimp, en behoud van fluorescerende eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de NIH voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de richtlijnen van de Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (Protocolnr. 01840).
1. Orthodontische tandbeweging
- Om een muisbed te genereren, gebruikt u een plat plastic platform met een wigvormige, 45° schuine hoofdsteun. De hoofdsteun kan worden gegenereerd door een plastic doos te snijden.
- Til het hoofdeinde van het platform op om een hoek van ongeveer 30° tussen de hoofdsteun en het tafelvlak te genereren. Bevestig een gebogen dikke paperclip (0,036" in diameter) aan het hoofdeinde om de bovenste snijtanden vast te houden.
- Aan het staarteinde genereert u een verhoogd oppervlak waaraan een orthodontische stroomketen kan worden bevestigd om de onderste snijtanden vast te houden. Zie figuur 1 voor een voorbeeldplatform.
- Verdoof de muis door intraperitoneale injectie van xylazine bij 10 mg/kg en ketamine 100mg/kg met behulp van een spuit van 1 ml en een naald van 27 gauge.
- Plaats de verdoofde muis op een op maat gemaakt platform en immobiliseer de bovenkaak door de bovenste snijtanden op de papercliplus te haken. Open de onderkaak van de muis met de orthodontische voedingsketting vastgehaakt aan de onderste snijtanden. Houd de wangen ingetrokken met het mini-colibri mond oprolmechanisme.
- Plaats het platform onder een chirurgische microscoop of een andere stereoscope die tot 5-6x vergroting kan reiken.
- Breng 50 μL zoutoplossing (ongeveer 1 druppel) aan op de ogen van de muis om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Vul zoutoplossing elke 20 minuten aan.
- Snijd een stuk aluminiumdraad (0,08 mm diameter) van 1 cm lang. Schuif de draad van de buccale zijde linguaal in het interproximale gebied en blaas het contactpunt tussen de eerste en tweede kies met behulp van een microchirurgische naaldhouder. Laat 2 mm vrije rand voor de eerste kies om in het veereinde te worden geschroefd.
- Snijd een stuk nikkel titanium (NiTi) spoel, ongeveer 7 tot 9 draden lang.
OPMERKING: De elastische eigenschappen van de spoel zorgen voor constante kracht voor orthodontische beweging. De totale ongeremde lengte van de spoel moet korter zijn dan de opening tussen de snijtuit en de kies. Houd er rekening mee dat er aan elk uiteinde 2 extra draden nodig zijn om de spoel aan de tand te verankeren. Aluminiumdraad wordt geselecteerd om scanartefacten zoals bundelverharding tijdens de micro-CT-scan te verminderen. - Plaats de NiTi-schroefveer (0,15 mm draaddiameter, 0,9 mm binnenspoeldiameter; levert een kracht van 10 g) tussen de onderste eerste kies en de onderste snijtoor. Gebruik de draadligatuur die rond de eerste kies in stap 1.6 is geplaatst, draai de draad stevig rond 2 draden van de schroefveer om de spoel aan de kieszijde te bevestigen.
- Gebruik precies 3 actieve draden tussen de eerste kies en de snijtand om een uniform krachtniveau te garanderen. Verwijder tijdelijk de voedingsketting van de snijtand en lus 2 tot 3 ongeremde draden over de snijtand om de spoel te verankeren. Schuif de draden naar beneden naar de snijtandvrije gingivale marge.
- Leg een laag doorstroombare composiethars op de snijrand van de spoel en hard deze uit met tanduithardingslicht. Vervang de stroomketen na het uitharden van de hars.
- Verwarm met hetzelfde uithardingslicht de NiTi-spoel gedurende 20 s. Dit zal de NiTi spoel aanhalen. De voltooide plaatsing wordt weergegeven figuur 1C.
- Laat de contralaterale zijde intact of steek een schijnvertoning zoals de draad tussen de eerste en tweede kies.
- Plaats de verdoofde muis onder een verwarmd licht om de muis warm te houden tot het herstel.
- Plaats de muis terug in een individuele kooi en controleer dagelijks. Er is geen dieetverandering nodig tijdens orthodontische beweging.
OPMERKING: OTM-apparaat aan de ene kant veroorzaakt enig ongemak, maar heeft geen invloed op de voeding. Het plaatsen van apparaten aan beide zijden wordt echter afgeraden vanwege de extra hoeveelheid ongemak. Pijnmedicatie is niet nodig tenzij uiterlijke tekenen van pijn worden gezien.
2. Micro-CT-scan van PDL-vezels in verse hemi-kaken
- Montage van de hemi-onderkaak (Figuur 2)
- Na de gewenste duur van orthodontische beweging offert u de muis op via cervicale dislocatie. Verwijder de onderkaak en scheid deze in hemi-kaken.
OPMERKING: Aangezien het monster niet wordt bevestigd, is het van cruciaal belang om de dissectie van de kaak en montage zo snel mogelijk uit te voeren, idealiter binnen 30 minuten. - Verwijder het omliggende zachte weefsel voorzichtig met een schoon pluisvrij doekje.
- Verwijder het orthodontische apparaat met een microchirurgische schaar en pincet onder een stereomicroscoop met een vergroting van ten minste 4x.
- Houd het monster vochtig in een microcentrifugebuis met een volume van 1,5 ml, samen met een stuk pluisvrij doekje bevochtigd met water.
- Plaats verpakte tandcomposiethars in de monstersleuf op het podium en plaats vervolgens de verse hemi-onderkaak in het composiet. Zorg er voor de montage voor dat het botoppervlak dat in contact komt met het tandcomposiet vrij is van zachte weefsels en droog is, anders zal tandcomposiet niet goed uitharden.
- Pas de positie van de hemi-onderkaak aan totdat de eerste kies gecentreerd is in de middellijngroef van het podium. Zorg ervoor dat het occlusale oppervlak horizontaal is. Hard het composiet uit wanneer u tevreden bent met de positionering.
OPMERKING: Extra kleine hoeveelheden tandcomposieten kunnen aan de zijkanten van de hemi-onderkaak en/of over de snijtand worden geplaatst om te helpen bij het stabiliseren van het monster. - Plaats gedempt pluisvrij vegen in de vochtigheidspools in de monsterfase. Plaats tandcomposiet op het occlusale oppervlak van de eerste kies. Voordat u de kamer sluit, moet u ervoor zorgen dat niets het röntgenpad op het niveau van het monster blokkeert.
- Breng de kamer aan in de micro-CT. Schroef de kamer in de micro-CT-monsterfase zodat beweging tijdens beeldvorming tot een minimum wordt beperkt.
- Zet de röntgenfoto's aan en maak 2D-beelden terwijl u het aambeeld verticaal laat zakken, totdat de punt van het aambeeld wordt omgeven door het composiet, maar er geen toename van de kracht wordt gedetecteerd.
- Zodra het aambeeld in het composiet is ingebed, sluit u de röntgenbron. Open vervolgens de micro-CT-kamer en hard het composiet uit door het heldere plexiglas venster.
- Na de gewenste duur van orthodontische beweging offert u de muis op via cervicale dislocatie. Verwijder de onderkaak en scheid deze in hemi-kaken.
- Micro-CT-instellingen
- Stel de bronspanning in op 40 kV en de stroom op 200 μA. Plaats het monster met behulp van een 10x vergrotingsdetector in het gezichtsveld. Gebruik binning van 2 voor de vastgelegde beelden.
OPMERKING: Omdat de PDL aanzienlijk minder dicht is dan het bot en de tand, vereist het visualiseren van de PDL een hoger vermogen en een hogere belichtingstijd. Dit protocol biedt instellingen voor het visualiseren van de PDL. - Stel de belichtingstijd van één afbeelding in op 25 s. Stel de rotatie van de monsterfase in op een bereik van 183 graden of meer. Stel de scan in voor 2500 projecties. Gebruik geen röntgenbronfilter, de resulterende scans hebben een voxelgrootte van 0,76 μm aan elke kant.
- Verzamel een referentiescan voor een goede reconstructie volgens de micro-CT richtlijnen. Gebruik 1/3 aantal referentiebeelden als totale projecties. Reconstrueer het volume zonder extra binning, met behulp van een filteralgoritme voor backprojectie.
- Stel de bronspanning in op 40 kV en de stroom op 200 μA. Plaats het monster met behulp van een 10x vergrotingsdetector in het gezichtsveld. Gebruik binning van 2 voor de vastgelegde beelden.
3. Clearingmethode (figuur 3)
- Bereid vijf microcentrifugebuizen van 1,5 ml voor.
- Bereid 1,4 ml van de volgende oplossingen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml: 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 50% ethanol (EtOH) in gedeï gedeï gedeïs gedeïopiseerd (DI) water, 70% EtOH in DI-water en twee buizen van 100% EtOH.
OPMERKING: PFA wordt gebruikt voor de fixatie van het monster. ECi-clearing werkt ook op niet-gerepareerde monsters. Als u niet-gerepareerde voorbeelden wilt wissen, slaat u gewoon de PFA-stap over. - Plaats de ontlede hemi-onderkaak in 4% PFA. Dek af met aluminiumfolie en plaats op de rocker op zachte stand bij kamertemperatuur gedurende 6 uur.
- Verplaats de hemi-onderkaak naar 50% EtOH. Plaats het op de rocker bedekt met licht gedurende 16 uur.
- Verplaats de hemi-onderkaak naar 70% EtOH. Plaats het op de rocker bedekt met licht gedurende 16 uur.
- Verplaats de hemi-onderkaak naar 100% EtOH. Plaats het op de rocker bedekt met licht gedurende 16 uur.
- Herhaal 3.6. in de tweede 100% EtOH buis.
- Bereid 5 ml ECi in een glazen of polypropyleen buis.
OPMERKING: ECi lost polystyreen op, maar geen polypropyleen. Ook, als niet met behulp van een weefsel met fluorescerende eiwitten het monster kan worden blootgesteld aan licht tijdens de clearing procedure. - Verplaats de hemi-onderkaak naar de ECi-buis. Bedek de buis met aluminiumfolie en plaats deze minimaal 12 uur op de rocker op een zachte stand.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken. Gedehydrateerd monster kan bij kamertemperatuur in ECi worden bewaard. Het vries- of smeltpunt van ECi is 6,5 tot 8,0 °C. Niet bewaren bij 4 °C. - De hemi-onderkaak is klaar voor beeldvorming met fluorescentiemicroscoop.
OPMERKING: Tijdens de beeldvorming moet het monster in de ECi worden ondergedompeld om optisch transparant te blijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit document presenteert een methode om OTM te produceren, evenals twee methoden voor 3D-beeldvorming van collageenvezels in de PDL zonder enige doorsnede. Voor dieronderzoek, wanneer uitlijning van de tanden niet nodig is, wordt een tandbeweging als orthodontisch beschouwd als het een remodellering van het alveolaire bot op alle wortelniveaus genereert. Constant krachtniveau dat op tanden wordt toegepast, is vereist om een betrouwbare OTM te genereren. Hier wordt een geactiveerde niti-spoel met vormgeheugen gebruikt om een consistente kracht van 10 g te genereren gedurende de experimentele tijd van 7 dagen en daarna indien gerechtvaardigd. De hier beschreven spoelactivering (figuur 1) genereert spanning in de NiTi-spoel binnen de martensitische fase en brengt de spoel in de hysteresetoestand, die constante spanning op de tand levert. Het verwarmen van de spoel met het uithardingslicht na het inbrengen van de spoel zal er ook voor zorgen dat de legering naar zijn austenitische vorm zal verschuiven en het vormgeheugeneffect zal plaatsvinden.
Hier tonen we representatieve resultaten van 9 weken oude, mannelijke muizen. De gemiddelde mesiodistalruimte tussen de kronen van de eerste en tweede kies na 7 dagen OTM is 40 μm zoals gemeten tussen de interproximale oppervlakken van de kiezen in de micro-CT met 1X vergroting (n=12, st.dev. = 15 μm) (figuur 1E). De gemiddelde ruimte van de PDL in de mesiodistalrichting is 80 μm voor en na 7 dagen OTM (figuur 4B). Dit bevestigt dat de eerste kies die mesially en 7 dagen wordt vertaald een voldoende tijd is voor het genereren van OTM in een muismodel terwijl processen van bothersorptie en appositie in de natuur worden gegenereerd (Figuur 4). Muizen kregen een standaard hard palletdieet. Er is geen dieetwijziging aangebracht na het inbrengen van het apparaat.
De eerste methode die wordt gepresenteerd om de veranderingen in het tand-PDL-botcomplex tijdens OTM te visualiseren , is gebaseerd op faseversterkte micro-CT-beeldvorming van verse weefsels (figuur 4) die eerder in detail werd beschreven9,18,19,20,22,23. Kortom, mits een faseverbeteringsvermogen van een micro-CT of een synchrotron, mechanische stabilisatie van het vezelige weefsel en bevochtigde omgeving, kunnen verse collageenvezels worden gevisualiseerd zonder enige fixatie of contrasterende middelen. In de PDL zijn de vezels die worden gezien die verbonden zijn met zowel de tand als het bot, voornamelijk type I collageen19. Deze unieke kans om in 3D een intacte PDL te visualiseren, maakt analyse van 3D-vezeldichtheid, vezeloriëntatie en de 3D-beweging van de tand mogelijk zoals eerder beschreven9,19. In het bijzonder presenteren we hier de visualisatie van het vezelige netwerk in de PDL. Op moment 0 kan fysiologische remodellering in zowel het bot als de PDL worden waargenomen. Remodellering vindt ook plaats in het cellulaire cementum; dit houdt echter niet rechtstreeks verband met de gepresenteerde methode en zal daarom niet worden uitgewerkt. De bone-PDL-interface is meestal glad, zowel in de dwarse (figuur 4A) als sagittale (figuur 4B) vlakken voorafgaand aan een krachttoepassing. In het coronale vlak (figuur 4C) is de bot-PDL-interface ruwer, vooral naar het apicale gebied, wat een indicatie kan zijn voor de remodelleringsbalans neigt naar resorptie. Na 3 dagen OTM(figuur 4D-F),waarop de eerste kies mesially wordt bewogen (richting wordt weergegeven door de onderbroken pijl), wordt de vezeldichtheid in de PDL verminderd (witte pijlpunten). De bot-PDL-interface is ruwer dan op 0 dagen als gevolg van de ontwikkeling van kraters in het botoppervlak die indicatief zijn voor osteoclastische activiteit en botresorptieprocessen geassocieerd met voornamelijk compressiekrachten in de PDL26, maar hier gezien in spanningsgebieden na 3 dagen. Weefselvernietiging in spanningsgebieden binnen de PDL werd gesuggereerd27,28 en is duidelijk te zien met behulp van deze methode. De ruwe rand wordt gezien op verschillende niveaus van de wortels (witte pijlen) en suggereert daarom dat de tandbeweging translationeel van aard is en niet alleen het kantelen van de kroon. Bij 7 dagen OTM(figuur 4G-I)worden botresorptietekens, zoals kraters in het bot, ruwe randen en uitzetting van de PDL-ruimte, bij alle vlakken waargenomen, maar de gemiddelde PDL-ruimte is smaller dan bij 3 dagen OTM (figuur 4D-F). In sommige gebieden is de bot-PDL-grens echter gladder geworden na 7 dagen OTM, deze gebieden bevinden zich op de distale oppervlakken van de wortels, wat hoogstwaarschijnlijk een indicatie is voor botappositie, zoals verwacht in OTM naar de mesial-richting.
Vanwege de lange micro-CT-beeldvormingstijd (~ 19 uur) en de rotatie van het podium, is montage van het monster essentieel om het monster stil te houden. Onstabiel monster zal resulteren in wazige scans. Figuur 5 geeft aan hoe de micro-CT-scan eruit ziet wanneer het monster tijdens de scan is verplaatst. De tand en het bot zijn wazig. Noch PDL-vezels, noch osteocyten worden waargenomen. Bij dergelijke incidenten is er een silhouet aanwezig rond de rand van een object. In figuur 5kunnen meerdere contouren van de tandkroon worden waargenomen (pijlen).
Afhankelijk van het onderzoeksdoel kan de resolutie en visualisatie van de PDL-vezels in de handel worden opgeofferd voor een kortere scantijd wanneer alleen informatie over de harde weefsels gewenst is.
Een aanvullende methode voor 3D-visualisatie van de PDL-vezels zonder enige doorsnede is via optische microscopie op optisch gewiste monsters met behulp van ECi (figuur 3). Deze methode kan worden gebruikt op een monster zonder fixatie en behoudt fluorescerende signalen die in het weefsel aanwezig zijn voordat het wordt gewist. Hemi-kaken voor en na de ECi-clearing zijn weergegeven in figuur 3B en 3C. Adequate monsteropruiming van de PDL kan worden bevestigd wanneer een rasterpapier door de ramus van de onderkaak kan worden gezien. De hoeveelheid clearing kan worden aangepast door het uitdrogingsproces te verlengen. Figuur 6 toont het tweede harmonische generatie (SHG) signaal van collageenvezels in zowel alveolaire bot als de PDL in een vrijgesproken onderkaak. Het in beeld brengen van de collageenvezels van het bot in 3D is een ingewikkeld proces, dat vaak gebruik maakt van elektronenmicroscopiemethoden zoals FIB/ SEM. Echter, met behulp van de ECi-gebaseerde clearing methode en SHG, de alveolaire botvezels zijn duidelijk te zien, vooral in de horizontale richting. Bij het vertalen door het monster diep in de PDL vanaf het botoppervlak, is de overgang naar het PDL-vezelniveau heel duidelijk omdat de vezels plotseling hun oriëntatie veranderen in een verticale.
Lightsheet microscopie kan ook worden gebruikt voor het in beeld brengen van fluorescerende eiwitten door het bot. In dit geval van een vrijgenomen monster van een transgene Flk1-cre; Tdtomato muis19,29,30, de fluorescerende endotheelcellen langs de bloedvaten worden duidelijk waargenomen ( figuur7A,B, C, E). Een goede clearing is de sleutel tot het genereren van verstaanbare beelden met lightsheet microscopie. Wanneer het bot niet volledig is ontruimd, werden de bloedvaten in de PDL niet waargenomen (figuur 7D, F).
Figuur 1: Inbrengen van orthodontische apparaten. A. Muisbed gemaakt van laboratorium-levering om het dier te ondersteunen en de mond open te houden. Kunststof platform (PP) voor het lichaam bevindt zich op een helling van 30° en de hoofdsteun (HR) bevindt zich in een hoek van 45° vanaf het oppervlak van PP. Een 2-traps buisstandaard (TS) wordt gebruikt om de eindkop van PP te verheffen. De papercliplus (zwarte pijl) verankert de bovenste snijtanden en de onderste orthodontische stroomketting (witte pijl) haakt op de onderste snijtanden. Inspectiespiegel met een diameter van 5 mm werd gebruikt voor visuele inspectie van de kiezen. B. Zijaanzicht van het muisbed. Hoeken tussen oppervlakken zijn gemarkeerd (groen en magenta). C. Representatief beeld van het correct geplaatste apparaat. D. Kiezen gezien door de inspectiespiegel voorafgaand aan de implantatie van het apparaat. E. Representatief beeld van kiezen na de orthodontische beweging. Stippellijnen volgen de omtrek van de eerste en tweede kies. F. Diagram van het apparaat en de plaatsing ervan. Rode lijn vertegenwoordigt de draadligatuur rond de eerste kies. Oranje lijn vertegenwoordigt doorstroombare composiethars die wordt gebruikt om de spoel te verankeren. NiTi spoel is blauw weergegeven en gelabeld. G. Ontleed hemi-onderkaak met het apparaat bevestigd na 7-daagse orthodontische beweging. Merk op dat de 3 spoeldraden nog steeds open zijn, wat aangeeft dat de spoel na 7 dagen nog steeds actief is. Schaalbalk = 1 mm in E en G. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Hemi-onderkaak gemonteerd in een op maat gemaakte kamer voor micro-CT beeldvorming. A. Volledige opstelling van de monsterkamer in de micro-CT machine. De röntgenbron is links te zien en de detector rechts. Rode rechthoek omlijnt de hemi-onderkaak gemonteerd in de kamer op het monsterstadium (SS). De hier getoonde voorbeeldkamer maakt deel uit van een mechanische testopstelling, inclusief motor (M), aambeeld (A, omlijnd door witte stippellijnen) en aambeeldas (AS) bovenop de kamer. De volledige opstelling wordt op het CT-podium geschroefd. De ingezette afbeelding toont close-up van het rode geschetste gebied, dat de vochtigheidskamer met monster binnen bevat. B. Bovenaanzicht van het monster dat op het monsterstadium is gemonteerd. Vochtigheidspools (grijze pijl) zijn ingebouwd op de omtrek om de vochtigheid tijdens beeldvorming te behouden. Op het ronde podium in het midden kan de hemi-onderkaak in de schuine diepe groef (zwarte pijl) worden gemonteerd. Een dunne groef (witte pijl) markeert de middellijn van het podium om het monster te oriënteren. C. Diagram van de cirkelvormige fase met de monstergroef. De schuine kant van de groef ondersteunt de onderkaak en maakt het mogelijk om de kiezen langs de verticale as van de wortels te monteren. D. Representatieve micro-CT 2D-plak in combinatie met een 3D-volumebeeld van het hemi-onderkaakmonster. De interproximale opening hier is 52 μm. Het monster wordt gemonteerd op het monsterstadium hieronder (niet afgebeeld) en het aambeeld (A) bovenop door tandcomposiet (DC). Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. ECi-gebaseerde clearingmethode voor ontlede muishemi-kaken. A. De ontleedbare hemi-onderkaak wordt achtereenvolgens ondergedompeld in 4% PFA, 50% EtOH, 70% EtOH en 100% EtOH. Na uitdroging wordt de hemi-onderkaak minimaal 12 uur in ECi bewaard tot beeldvorming. B. Hemi-onderkaak direct na dissectie. C. Hemi-onderkaak na voltooiing van de opruiming. Schaalbalken = 5 mm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Representatieve in-situ micro-CT scans van de PDL van een nieuw monster in de verschillende stadia van de orthodontische beweging. A-C, Geen orthodontische beweging. A. Micro-CT 2D-beeld in het dwarsvlak van de hemi-onderkaak met de mesial (M) en distale (D) wortels in het alveolaire bot, B-Buccale, L-Lingual zijden van het alveolaire bot. Tussen de tandwortels en het alveolaire bot worden de PDL-ruimte en de vezels erin duidelijk waargenomen. B. 2D-beeld in het sagittale vlak. C. 2D-beeld in het coronale vlak. D-E, 2D beelden na 3 dagen van OTM, pijlkoppenpunt bij gebieden in PDL met vermindering van collageenvezelsdichtheid, witte pijlenpunt bij gebieden van beenresorptie. G-I, 2D beelden na 7 dagen OTM, zwarte pijlen wijzen op gebieden van bot appositie. Schaalbalken = 150 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: 2D micro-CT beeld in het sagittale vlak, met wazige structuren van zowel tand als bot als gevolg van beweging van de tand tijdens de scan. Pijlen wijzen op meerdere bordlijnen van de tand, wat de beweging aangeeft. Schaalbalk 150 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: ECi ontruimde onderkaak met de eerste kies afgebeeld met tweede harmonische generatie (SHG). Witte pijlpunten op een gebied waar collageenvezels van de PDL worden gezien, let op de verticale oriëntatie, zwarte pijlen wijzen op een gebied waar zowel verticale vezels van de PDL als horizontale vezels van het alveolaire bot worden gezien. T-tand, F-furcation, AB-alveolaire bot, MR-mesial wortel, DR-Distal wortel, schaal bar 150 μm. Beelden werden verkregen met behulp van een 20X multi-immersielens voor oplossingen met RI van 1.33-1.56. Excitatie laser werd ingesteld op 860nm op 10% vermogen. Pixel woningtijd: 0.51μs; Scanmodus: frame; Middeling: 16; Detectortype: niet-gescande fotomultiplicatorbuisdetector; Detector Gain 800V. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7. Lightsheet microscoop afbeeldingen van ECi-gewist Flk1-Cre;tdTomato muis. A. Optimaal ontruimde controle hemi-onderkaak. Het netwerk van bloedvaten in het bot (pijlpunt) en PDL-ruimte (pijl) is zichtbaar. B. begin van het mesiolinguale gebied van de eerste kies (rood omlijnd in A) toont de bloedvaten. C. optimaal ontruimd 7-daagse OTM hemi-onderkaak en D. suboptimaal ontruimde hemi-onderkaak. E. 2D-afbeelding van paneel C in het sagittale vlak, de afbeelding toont goed gedefinieerde bloedvaten in bot (grijze pijl) en PDL-ruimte (witte pijlen). F. Tweedimensionale segmentafbeelding van paneel D, hetzelfde gebied als afbeeldingen in E, wat resulteert in een wazige afbeelding. Schaalbalken A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm Er zijn beelden gemaakt met een 5X-plandoelstelling, waarbij camera als detector werd gebruikt. Excitatielaser was 561 nm bij 4% vermogen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het genereren van OTM bij muizen is zeer gewenst vanwege de grootte, genetica en hanteringsvoordelen. Het gebruik van de onderkaak biedt een eenvoudige behandeling, zowel in termen van weefseldissectie als monstervoorbereiding en beeldvorming. Hier presenteerden we een methode om OTM te genereren met translationele beweging van de tand in het bot binnen 7 dagen na OTM. Met behulp van dit protocol kan de totale duur van de tandbeweging worden verlengd, omdat de geactiveerde spoel een constant krachtniveau levert voor beweging tot ongeveer 1 mm. De mesiale kant van de spoel is echter bevestigd aan de snijtaal, die constant uitbarst. Als gevolg hiervan zullen de krachtvectoren geleidelijk veranderen en extrusiekrachten beginnen te genereren. Dit kan worden vermeden als de aanpassing van het hechtingsniveau aan het mesial-uiteinde om de 7 dagen wordt uitgevoerd.
De PDL is de initiator voor OTM en daarom is het begrijpen van de structuur en functie ervan tijdens de verschillende stadia van de OTM van groot belang. De PDL is echter niet uniform in zowel zijn structuur als functie19,22,31,32. Om zinvolle gegevens op te halen, moet de PDL daarom in 3D worden bestudeerd en moeten weefseldoorsneden en manipulatie zoveel mogelijk worden vermeden. Toch maakt het onderzoeken van een zacht weefsel tussen twee harde weefsels dergelijke vereisten een uitdaging om te voldoen. Traditionele methoden voor het bestuderen van de PDL omvatten vaak het compromitteren van de 3D-structuur en het verwijderen van het weefsel uit zijn fysiologische omgeving, wat bijgevolg de structurele en biomechanische eigenschappen van PDL verandert. Zowel structurele als biomechanische eigenschappen ondergaan dynamische veranderingen tijdens OTM die het behoud van de weefsel 3D-context nog verder rechtvaardigen. Om dit te doen hebben we twee methoden beschreven die beeldvorming van hele weefsels mogelijk maken zonder doorsneden, die ook kunnen worden gebruikt op dezelfde steekproef die fluorescerende signalen, morfologische en mineralisatiegegevens colokaliseert.
De verstrekte methodologische beschrijving geeft de lezers de opdracht om de methoden toe te passen in hun vakgebied. De micro-CT-beeldvorming maakt 3D-visualisatie van pdl-vezelnetwerk mogelijk. Beelden kunnen worden geanalyseerd om directionaliteits- en dichtheidsanalyses te produceren en om veranderingen in de PDL tijdens OTM kwantitatief te onderzoeken. We hebben ook een clearingmethode beschreven die visualisatie mogelijk maakt met direct beschikbare optische microscopische methoden zoals lightsheetmicroscopie en confocale beeldvorming. Lightsheet microscopie heeft als voordeel dat het een 3D beeld produceert van grote exemplaren met een relatief hoge beeldsnelheid. Confocale microscopie maakt 3D-visualisatie met hoge resolutie mogelijk met behulp van SHG-signaal voor collageenvezels en fluorescerende tags. Deze methoden openen onafhankelijk of gecombineerd vele mogelijkheden voor 3D-structurele studies met minimale weefselvoorbereiding.
Verschillende uitdagende stappen in dit protocol vragen extra aandacht:
Ten eerste moet tijdens de plaatsing van de spoel de ligatuurdraad stevig tussen de eerste en tweede kies worden geplaatst. Dit proces is uitdagend vanwege de kleine afmetingen van de muistanden. We raden het gebruik van een stereomicroscoop van de tafeltop aan om de plaatsing te begeleiden. Kleine bewegingen tijdens de procedure kunnen echter de muis bewegen en ervoor zorgen dat het interessegebied uit het gezichtsveld gaat. Als alternatief raden we aan om 4-5x vergroot loupes te gebruiken die op de operator kunnen worden gedragen, wat kan helpen het gebied dynamischer te bekijken.
Ten tweede zijn de clearingresultaten afhankelijk van het uitdrogingsproces. Als het monster niet het gewenste transparantieniveau heeft bereikt, is onze suggestie om de uitdrogingstijd te verlengen. Meer specifiek is aangetoond dat een langere onderdompelingstijd in 100% EtOH de transparantie van het eindproduct verbetert. Er moet echter worden opgemerkt dat een verhoogd niveau van uitdroging de fluorescentieniveaus24,25drastisch kan verminderen . De gepresenteerde ECi-gebaseerde methode bleek fluorescerende signalen langer dan 2 weken te bewaren24.
Aspecten van dit protocol kunnen worden aangepast om een veelheid aan andere doeleinden te bestuderen. De kamer die we in de micro-CT hebben ontworpen, is gekoppeld aan een loadcel en een motor en heeft de mogelijkheid om spannings- / compressietests uit te voeren op de hemi-onderkaakmonsters. In combinatie met de visualisatie van de micro-CT kan deze opstelling veranderingen in de PDL in-situ met verschillende mechanische belastingen laten zien21. De beschreven clearingmethode kan ook worden geïmplementeerd op niet-gefixeerde monsters, wat een interessante combinatie van verschillende beeldvormingsmodaliteiten biedt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). We willen Harvard Center for Biological Imaging bedanken voor infrastructuur en ondersteuning. Alle cijfers worden gegenereerd met biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, suppl 1 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. dA., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
