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Imagerie 3D des fibres de collagène PDL pendant le mouvement orthodontique des dents dans le modèle murin mandibulaire

Published: April 15, 2021 doi: 10.3791/62149
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Oral Medicine, Infection and Immunity, School of Dental Medicine, Harvard University

Summary

Nous présentons un protocole pour générer le mouvement orthodontique de dent chez les souris et des méthodes pour la visualisation 3D des fibres de collagène et des vaisseaux sanguins du ligament parodontal sans sectionnement.

Abstract

Le mouvement orthodontique des dents est un processus biologique complexe de remodelage des tissus mous et durs altérés à la suite de forces externes. Afin de comprendre ces processus de remodelage complexes, il est essentiel d’étudier la dent et les tissus parodontals dans leur contexte 3D et donc de minimiser les sectionnements et les artefacts tissulaires. Les modèles murins sont souvent utilisés en biologie du développement et de la structure, ainsi qu’en biomécanique en raison de leur petite taille, de leur taux métabolique élevé, de leur génétique et de leur facilité de manipulation. En principe, cela en fait également d’excellents modèles pour les études dentaires. Cependant, un obstacle majeur est leur petite taille de dent, les molaires en particulier. Ce document vise à fournir un protocole étape par étape pour générer le mouvement orthodontique de dent et deux méthodes pour la formation image 3D du composant fibreux périodontique de ligament d’une molaire mandibulaire de souris. La première méthode présentée est basée sur une installation de micro-CT permettant l’imagerie d’amélioration de phase des tissus frais de collagène. La deuxième méthode est une méthode de nettoyage osseux utilisant du cinnamate d’éthyle qui permet l’imagerie à travers l’os sans sectionnement et préserve la fluorescence endogène. Combinant cette méthode de compensation avec des souris reporters comme Flk1-Cre; TdTomato a fourni une première occasion du genre d’imager la vascularisation 3D dans le PDL et l’os alvéolaire.

Introduction

Le processus biologique sous-jacent de base dans le mouvement orthodontique des dents (OTM) est le remodelage osseux. Le déclencheur de ce processus de remodelage est attribué à des changements dans la structure du ligament parodontal (PDL) tels que le stress de la matrice extracellulaire (ECM), la nécrose ainsi que la destruction et la formation des vaisseaux sanguins1,2,3. D’autres déclencheurs possibles pour le remodelage alvéolaire d’os sont liés à la détection de force par les ostéocytes dans l’os, ainsi qu’à la déformation mécanique de l’os alvéolaire lui-même; cependant leur rôle dans OTM n’est pas encore entièrement élucidé4,5.

Malgré de nombreuses études visant à révéler les relations structure-fonction du PDL au cours de l’OTM, un mécanisme fonctionnel clair doit encore être défini6,7. La raison principale en est le défi de récupérer les données d’un tissu mou (PDL) situé entre deux tissus durs (cénume et os alvéolaire). Les méthodes acceptées pour recueillir des informations structurelles nécessitent généralement une fixation et un sectionnement qui perturbent et modifient la structure PDL. De plus, la plupart de ces méthodes produisent des données 2D qui, même si elles ne sont pas déformées, ne donnent que des informations partielles et localisées. Puisque le PDL n’est pas uniforme dans sa structure et fonction, une approche qui adresse la structure 3D intacte du complexe entier de dent-PDL-os est justifiée.

Cet article décrira une méthode pour générer un OTM chez la souris et deux méthodes qui permettent la visualisation 3D des fibres de collagène dans le PDL sans aucune section de l’échantillon.

Les modèles murins sont largement utilisés pour les expériences in vivo en médecine, en biologie du développement, en administration de médicaments et en études structurelles. Ils peuvent être génétiquement modifiés pour éliminer ou améliorer des protéines et des fonctions spécifiques; ils fournissent un contrôle du développement rapide, reproductible et prévisible; ils sont également faciles à imager en raison de leur petite taille8. Malgré leurs nombreux avantages, les modèles murins dans la recherche dentaire ne sont pas utilisés fréquemment, en particulier lorsque des manipulations cliniques sont justifiées, principalement en raison des dents de petite taille. Des modèles animaux tels que les rats9,10,11,les chiens12,13,les porcs14,15,16 et les singes17 sont utilisés plus souvent que les souris. Avec le développement récent de techniques d’imagerie haute résolution, les avantages de l’utilisation d’un modèle murin pour déchiffrer les processus alambiqués dans OTM sont nombreux. Ce document présente une méthode pour générer un mouvement mesial de la dent molaire dans la mâchoire inférieure avec les niveaux constants de force qui déclenchent la retouche d’os. La plupart des expériences OTM chez les rongeurs sont faites dans le maxillaire supérieur, puisque la mobilité de la mandibule et la présence de la langue ajoutent un autre niveau de complexité. Cependant, la mandibule présente de nombreux avantages lorsque l’intégrité structurelle 3D est souhaitée. Il peut être facilement disséqué comme un os entier; chez certaines espèces, il peut être séparé en deux hémi-mandibules par la symphyse fibreuse; il est compact, plat et ne contient que les dents sans aucun espace sinusal. En revanche, le maxillaire supérieur fait partie du crâne et est étroitement lié à d’autres organes et structures, donc une section étendue est nécessaire afin de disséquer l’os alvéolaire avec les dents associées.

En utilisant une chambre d’humidité interne couplée à un système de chargement à l’intérieur d’un micro-CT haute résolution qui permet une amélioration de phase, nous avons développé une méthode pour visualiser les tissus fibreux frais en 3D comme décrit précédemment9,18,19,20,21,22,23. Les tissus frais sont scannés immédiatement après le sacrifice de l’animal sans aucune coloration ou fixation, ce qui réduit les artefacts tissulaires ainsi que les altérations des propriétés biomécaniques. Ces données 3D peuvent être utilisées pour la distribution et les analyses de direction des fibres comme décrit ailleurs19.

La deuxième méthode d’imagerie tissulaire entier 3D présentée ici est basée sur la clairance optique de la mandibule qui permet l’imagerie des fibres PDL à travers l’os sans aucune section. Fait intéressant, il permet également la visualisation des fibres de collagène de l’os lui-même, mais cela ne sera pas discuté ici. En général, il existe deux méthodes pour la clairance tissulaire. Le premier est le déblaiement à base aqueuse où l’échantillon est immergé dans une solution aqueuse avec un indice de réfraction supérieur à 1,4 soit par une simple immersion, hyperhydratation ou incorporation d’hydrogel. Cependant, cette méthode est limitée dans le niveau de transparence ainsi que la préservation structurelle du tissu et nécessite donc la fixation du tissu. La seconde méthode qui donne des échantillons très transparents et ne nécessite pas de fixation est la méthode de compensation à base de solvant24,25. Nous avons généré une méthode de compensation modifiée à base de solvant basée sur le 3-phénylprop-2-énoate d’éthyle (cinnamate d’éthyle, ECi) pour les échantillons mandibulaires. Cette méthode présente les avantages d’utiliser un agent de compensation de qualité alimentaire non toxique, un rétrécissement minimal des tissus et la conservation des protéines fluorescentes.

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Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux Lignes directrices des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux lignes directrices du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Harvard (Protocole no 01840).

1. Mouvement orthodontique des dents

  1. Pour générer un lit de souris, utilisez une plate-forme en plastique plat avec un appui-tête incliné de 45 ° en forme de coin. L’appui-tête peut être généré en coupant une boîte en plastique.
    1. Surélevez la tête de la plate-forme pour générer un angle d’environ 30° entre l’appuie-tête et le plan de la table. Fixez un trombone épais plié (0,036 po de diamètre) à l’extrémité de la tête pour maintenir les incisives supérieures.
    2. À l’extrémité de la queue, générez une surface surélevée à laquelle une chaîne de puissance orthodontique peut être attachée pour maintenir les incisives inférieures. Consultez la figure 1 pour obtenir un exemple de plateforme.
  2. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de xylazine à 10 mg/kg et de kétamine à 100 mg/kg à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de calibre 27.
  3. Placez la souris anesthésiée sur une plate-forme sur mesure et immobilisez la mâchoire supérieure en accrochant les incisives supérieures sur la boucle du trombone. Ouvrez la mâchoire inférieure de la souris avec la chaîne de puissance orthodontique accrochée aux incisives inférieures. Gardez les joues rétractées avec le rétracteur de bouche mini-colibri.
  4. Placez la plate-forme sous un microscope chirurgical ou tout autre stéréoscope pouvant atteindre un grossissement de 5 à 6x.
  5. Appliquer 50 μL de solution saline (environ 1 goutte) sur les yeux de la souris pour prévenir la déshydratation cornéenne. Réapprovisionnez la solution saline toutes les 20 minutes.
  6. Couper un morceau de fil d’aluminium (0,08 mm de diamètre) de 1 cm de longueur. Faites glisser le fil du côté buccal lingualement dans la zone interproximale ci-dessous le point de contact entre les première et deuxième molaires à l’aide d’un support d’aiguille microchirurgical. Laisser un bord libre de 2 mm devant la première molaire afin d’être enfilé dans l’extrémité du ressort.
  7. Coupez un morceau de bobine de nickel titane (NiTi), d’environ 7 à 9 fils de longueur.
    REMARQUE: Les propriétés élastiques de la bobine fourniront une force constante pour le mouvement orthodontique. La longueur totale non entraînée de la bobine doit être plus courte que l’espace entre l’inciseur et la molaire. Gardez à l’esprit que 2 fils supplémentaires sont nécessaires à chaque extrémité pour ancrer la bobine à la dent. Le fil d’aluminium est sélectionné afin de réduire les artefacts de balayage tels que le durcissement du faisceau pendant le micro-CT scan.
  8. Insérez un ressort hélicoïdal NiTi (diamètre de fil de 0,15 mm, diamètre de bobine interne de 0,9 mm; délivre une force de 10 g) entre la première molaire inférieure et l’incisive inférieure. Utilisez la ligature du fil insérée autour de la première molaire à l’étape 1.6, tournez le fil étroitement autour de 2 fils du ressort hélicoïdal pour fixer la bobine sur le côté molaire.
  9. Pour assurer un niveau de force uniforme, utilisez exactement 3 fils actifs entre la première molaire et l’incisive. Retirez temporairement la chaîne d’alimentation de l’inciseur et bouclez 2 à 3 fils non entraînés sur l’inciseur pour ancrer la bobine. Faites glisser les fils vers le bas jusqu’à la marge gingivale libre de l’incisive.
  10. Placez une couche de résine composite fluide sur la bordure incisive de la bobine et durcissez-la avec une lumière de durcissement dentaire. Remplacez la chaîne d’alimentation après avoir durci la résine.
  11. En utilisant la même lumière de durcissement, chauffez la bobine NiTi pendant 20 s. Cela resserrera la bobine NiTi. Le placement fini est illustré à la figure 1C.
  12. Laissez le côté controlatéral intact ou insérez une imposture telle que le fil entre les première et deuxième molaires.
  13. Placez la souris anesthésiée sous une lumière chauffée pour la garder au chaud jusqu’à la récupération.
  14. Replacez la souris dans une cage individuelle et surveillez-la quotidiennement. Aucun changement de régime alimentaire n’est nécessaire pendant le mouvement orthodontique.
    REMARQUE: Le dispositif OTM d’un côté provoque une certaine gêne, mais ne nuit pas à l’alimentation. Cependant, les dispositifs d’insertion des deux côtés ne sont pas conseillés en raison de la quantité supplémentaire d’inconfort. Les médicaments contre la douleur ne sont pas nécessaires à moins que des signes extérieurs de douleur ne soient observés.

2. Micro-CT scan des fibres de PDL dans les hémi-mandibules fraîches

  1. Montage de l’hémi-mandibule (Figure 2)
    1. Après la durée souhaitée du mouvement orthodontique, sacrifiez la souris via la luxation cervicale. Retirez la mandibule et séparez-la en hémi-mandibules.
      REMARQUE: Puisque l’échantillon ne sera pas fixé, il est essentiel d’effectuer la dissection de la mâchoire et le montage dès que possible, idéalement dans les 30 minutes.
    2. Retirez doucement les tissus mous environnants avec une lingette propre et non pelucheux.
    3. Retirez l’appareil orthodontique à l’aide de ciseaux microchirurgicaux et d’une pince à épiler sous un stéréomicroscope avec un grossissement d’au moins 4x.
    4. Conservez l’échantillon humide dans un tube de micro-centrifugeuse d’un volume de 1,5 mL avec un morceau de lingette pelucheuse humidifié avec de l’eau.
    5. Placez la résine composite dentaire emballable dans la fente d’échantillon sur la scène, puis placez l’hémi-mandibule fraîche dans le composite. Avant le montage, assurez-vous que la surface osseuse en contact avec le composite dentaire est exempte de tout tissu mou et sèche, sinon le composite dentaire ne durcira pas correctement.
    6. Ajustez la position de l’hémi-mandibule jusqu’à ce que la première molaire soit centrée au niveau de la rainure médiane de la scène. Assurez-vous que la surface occlusale est horizontale. Durcir le composite lorsqu’il est satisfait du positionnement.
      REMARQUE: De petites quantités supplémentaires de composites dentaires peuvent être placées sur les côtés de l’hémi-mandibule et / ou à travers l’inciseur pour aider à stabiliser l’échantillon.
    7. Placez la lingette non pelucheuse humidée à l’intérieur des bassins d’humidité au stade de l’échantillon. Placer le composite dentaire sur la surface occlusale de la première molaire. Avant de fermer la chambre, assurez-vous que rien ne bloque le chemin des rayons X au niveau de l’échantillon.
    8. Fixez la chambre dans le micro-CT. Vissez la chambre dans l’étape d’échantillonnage micro-CT afin que le mouvement pendant l’imagerie soit minimisé.
    9. Allumez les rayons X et prenez des images 2D tout en abaissant l’enclume verticalement, jusqu’à ce que la pointe de l’enclume soit entourée par le composite mais qu’aucune augmentation de la force ne soit détectée.
    10. Une fois que l’enclume est intégrée dans le composite, fermez la source de rayons X. Ensuite, ouvrez la chambre micro-CT et durcissez le composite à travers la fenêtre en plexiglas claire.
  2. Paramètres de micro-TDM
    1. Réglez la tension source sur 40 kV et le courant sur 200 μA. À l’aide d’un détecteur à grossissement 10x, placez l’échantillon dans le cadre de la vue. Utilisez le binning de 2 pour les images capturées.
      REMARQUE: Étant donné que la LDO est significativement moins dense que l’os et la dent, la visualisation de la LDO nécessite une puissance et un temps d’exposition plus élevés. Ce protocole fournira des paramètres pour visualiser le PDL.
    2. Définissez le temps d’exposition d’une seule image sur 25 s. Définissez la rotation de l’étage d’échantillonnage sur une plage de 183 degrés ou plus. Définissez l’analyse pour 2500 projections. N’utilisez aucun filtre source de rayons X, les scans résultants ont une taille de voxel de 0,76 μm de chaque côté.
    3. Recueillir un balayage de référence pour une reconstruction appropriée selon les directives de micro-CT. Utilisez 1/3 de nombre d’images de référence comme projections totales. Reconstruisez le volume sans binning supplémentaire, à l’aide d’un algorithme filtré par rétroprojection.

3. Méthode de compensation (Figure 3)

  1. Préparer cinq tubes à micro-centrifugeuses de 1,5 mL.
  2. Préparer 1,4 mL des solutions suivantes dans des tubes micro-centrifugeuses de 1,5 mL : 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 50 % d’éthanol (EtOH) dans de l’eau désionisée (DI), 70 % d’EtOH dans de l’eau DI et deux tubes à 100 % d’EtOH.
    REMARQUE: Le PFA est utilisé pour la fixation de l’échantillon. L’effacement ECi fonctionnera également sur des échantillons non fixes. Pour effacer les échantillons non corrigés, ignorez simplement l’étape PFA.
  3. Placez l’hémi-mâchoire inférieure disséquée dans 4% PFA. Couvrir avec du papier d’aluminium et placer sur la bascule sur un réglage doux à température ambiante pendant 6 h.
  4. Déplacez l’hémi-mandibule à 50% EtOH. Placez-le sur la bascule recouverte de lumière pendant 16 h.
  5. Déplacez l’hémi-mandibule à 70% EtOH. Placez-le sur la bascule recouverte de lumière pendant 16 h.
  6. Déplacez l’hémi-mandibule à 100% EtOH. Placez-le sur la bascule recouverte de lumière pendant 16 h.
  7. Répétez 3.6. dans le deuxième tube 100% EtOH.
  8. Préparer 5 mL d’ECi dans un tube en verre ou en polypropylène.
    NOTA : L’ECi dissout le polystyrène, mais pas le polypropylène. En outre, si vous n’utilisez pas un tissu avec des protéines fluorescentes, l’échantillon peut être exposé à la lumière pendant la procédure de nettoyage.
  9. Déplacez l’hémi-mandibule vers le tube ECi. Couvrir le tube avec du papier d’aluminium et placer sur la bascule sur un réglage doux pour un minimum de 12 h.
    Remarque : le protocole peut être suspendu ici. L’échantillon déshydraté peut être stocké dans eCi à température ambiante. Le point de congélation ou de fusion de l’ECi est de 6,5 à 8,0 °C. Ne pas conserver à 4 °C.
  10. L’hémi-mandibule est prête pour l’imagerie avec microscope à fluorescence.
    REMARQUE: Pendant l’imagerie, l’échantillon doit être immergé dans l’ECi pour rester optiquement transparent.

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Representative Results

Ce document présente une méthode pour produire OTM aussi bien que deux méthodes pour la formation image 3D des fibres de collagène à l’intérieur du PDL sans n’importe quelle sectionnement. À des fins de recherche sur les animaux, lorsque l’alignement des dents n’est pas nécessaire, un mouvement dentaire est considéré comme orthodontique s’il génère un remodelage de l’os alvéolaire à tous les niveaux racinaires. Un niveau de force constant appliqué sur les dents est nécessaire afin de générer un OTM fiable. Ici, une bobine NiTi à mémoire de forme activée est utilisée pour générer une force constante de 10 g tout au long du temps expérimental de 7 jours et au-delà si cela est justifié. L’activation de la bobine décrite ici(Figure 1)génère une contrainte dans la bobine NiTi dans la phase martensitique et amène la bobine à l’état d’hystérésis, ce qui délivre une contrainte constante sur la dent. Le réchauffement de la bobine avec la lumière de durcissement après l’insertion de la bobine permettra également de s’assurer que l’alliage passera à sa forme austénite et que l’effet de mémoire de forme aura lieu.

Ici, nous montrons des résultats représentatifs de souris mâles âgées de 9 semaines. L’espace mésodistal moyen entre les couronnes des première et deuxième molaires après 7 jours d’OTM est de 40 μm mesuré entre les surfaces interproxiales des molaires dans le micro-CT avec un grossissement de 1X (n = 12, st.dev. = 15 μm)(figure 1E). L’espace moyen de la PDL dans la direction mésodistale est de 80 μm avant et après 7 jours d’OTM(figure 4B). Cela confirme que la première molaire traduite mésialement et 7 jours est un temps adéquat pour générer OTM dans un modèle murin tout en générant des processus de résorption osseuse et d’apposition dans la nature (Figure 4). Des souris ont été alimentées un régime dur standard de palette. Aucun changement de régime n’a été fait après l’insertion de dispositif.

La première méthode présentée pour visualiser les changements dans le complexe dent-PDL-os au cours de l’OTM est basée sur l’imagerie micro-CT améliorée de phase des tissus frais(Figure 4)qui a été décrite en détail précédemment9,18,19,20,22,23. En bref, fourni une capacité d’amélioration de phase d’un micro-CT ou d’un synchrotron, la stabilisation mécanique du tissu fibreux et l’environnement humidifié, des fibres collagènes fraîches peuvent être visualisées sans n’importe quelle fixation ou agents contrastants. Dans le PDL, les fibres qui sont vues sont celles qui sont connectées à la fois à la dent et à l’os, principalement le collagène de type I19. Cette occasion unique de visualiser en 3D un PDL intact permet d’analyser la densité des fibres 3D, l’orientation des fibres ainsi que le mouvement 3D de la dent comme décrit précédemment9,19. Plus précisément, nous présentons ici la visualisation du réseau fibreux dans le PDL. Au temps 0, on peut observer un remodelage physiologique dans l’os et le PDL. Le remodelage se produit également dans le cénume cellulaire; toutefois, cela n’est pas directement lié à la méthode présentée et ne sera donc pas précisé. L’interface os-PDL est généralement lisse à la fois dans les plans transversaux(figure 4A)et sagittal(figure 4B)avant toute application de force. Dans le plan coronal(figure 4C),l’interface os-PDL est plus rugueuse en particulier vers la région apicale qui pourrait être indicative de l’équilibre remodelant tend vers la résorption. A 3 jours d’OTM(figure 4D-F),sur lesquels la première molaire est déplacée mésialement (la direction est représentée par la flèche pointillée), la densité des fibres dans la PDL est réduite (têtes de flèche blanches). L’interface os-PDL est plus rugueuse qu’à 0 jours en raison du développement de cratères dans la surface osseuse qui sont indicatifs de l’activité ostéoclastique et des processus de résorption osseuse associés principalement à des forces de compression dans le PDL26,mais ici vu dans les zones de tension à 3 jours. La destruction de tissu dans des secteurs de tension dans le PDL a été suggérée27,28 et peut être clairement vue utilisant cette méthode. La bordure rugueuse est vue à différents niveaux des racines (flèches blanches) et suggère donc que le mouvement de la dent est de nature translationnelle et pas seulement le basculement de la couronne. À 7 jours d’OTM(figure 4G-I),des signes de résorption osseuse, tels que des cratères dans l’os, des bordures rugueuses et l’expansion de l’espace PDL, sont observés sur tous les plans, mais l’espace PDL moyenné est plus étroit qu’à 3 jours d’OTM(figure 4D-F). Dans quelques secteurs cependant, la frontière d’os-PDL est devenue plus lisse après 7 jours d’OTM ces secteurs sont situés aux surfaces distales des racines, qui est très probablement une indication pour l’apposition d’os, comme prévu dans OTM à la direction mésiale.

En raison du long temps d’imagerie micro-CT (~ 19 h) et de la rotation de l’étage, le montage de l’échantillon est essentiel pour garder l’échantillon immobile. Unstable sample entraîne des balayages flous. La figure 5 présente l’apparence de la micro-tomodensitométrie lorsque l’échantillon s’est déplacé pendant l’analyse. La dent et l’os sont flous. On n’observe ni fibres de PDL ni osteocytes. Dans de tels incidents, il y a une silhouette présente autour de la marge d’un objet. Sur la figure 5,on peut observer plusieurs contours de la couronne dentaire (flèches).

Selon l’objectif de la recherche, la résolution et la visualisation des fibres PDL peuvent être sacrifiées dans le commerce pour un temps de balayage plus court lorsque seules des informations sur les tissus durs sont souhaitées.

Une méthode complémentaire pour la visualisation 3D des fibres PDL sans sectionnement consiste à utiliser la microscopie optique sur des échantillons effacés optiquement à l’aide d’ECi(Figure 3). Cette méthode peut être utilisée sur un échantillon sans fixation et préserve les signaux fluorescents qui existent dans le tissu avant le nettoyage. Les hémi-mandibules avant et après la clairance de l’ECi sont représentées sur les figures 3B et 3C. Un nettoyage adéquat de l’échantillon du PDL peut être confirmé lorsqu’un papier de grille peut être vu à travers le ramus de la mâchoire inférieure. La quantité de compensation peut être ajustée en allongeant le processus de déshydratation. La figure 6 montre le signal de deuxième génération harmonique (SHG) des fibres de collagène dans l’os alvéolaire et le PDL dans une mandibule dégagée. L’imagerie des fibres de collagène de l’os en 3D est un processus compliqué, qui utilise souvent des méthodes de microscopie électronique telles que FIB / SEM. Cependant, utilisant la méthode de compensation basée sur ECi et SHG, les fibres osseuses alvéolaires sont clairement visibles, en particulier dans la direction horizontale. Lors de la traduction à travers l’échantillon profondément dans le PDL à partir de la surface osseuse, la transition vers le niveau de fibre PDL est très claire car les fibres changent soudainement d’orientation en une orientation verticale.

La microscopie à feuille de lumière peut également être utilisée pour l’imagerie des protéines fluorescentes à travers l’os. Dans ce cas d’un échantillon nettoyé à partir d’un Flk1-cretransgénique ; Souris Tdtomato19,29,30,les cellules endothéliales fluorescentes tapissant les vaisseaux sanguins sont clairement observées(figure 7A,B, C, E). Un nettoyage approprié est essentiel pour générer des images intelligibles avec la microscopie à feuille de lumière. Lorsque l’os n’est pas complètement dégagé, les vaisseaux sanguins à l’intérieur de la LDO n’ont pas été observés (Figure 7D, F).

Figure 1
Figure 1: Configuration de l’insertion d’appareils orthodontiques. A. Lit de souris fabriqué à partir de fournitures de laboratoire pour soutenir l’animal et garder la bouche ouverte. La plate-forme en plastique (PP) pour le corps est sur une inclinaison de 30 ° et l’appui-tête (HR) est sur un angle de 45 ° par rapport à la surface de PP. Un support de tube à 2 niveaux (TS) est utilisé pour élever la tête d’extrémité de PP. La boucle de trombone (flèche noire) ancre les incisives supérieures et la chaîne d’alimentation orthodontique inférieure (flèche blanche) s’accroche aux incisives inférieures. Un rétroviseur d’inspection de 5 mm de diamètre a été utilisé pour l’inspection visuelle des molaires. B. Vue latérale du lit de la souris. Les angles entre les surfaces sont marqués (vert et magenta). C. Image représentative de l’appareil correctement placé. D. Molaires visibles à travers le miroir d’inspection avant l’implantation de l’appareil. E. Image représentative des molaires après le mouvement orthodontique. Les lignes pointillées tracent le contour des première et deuxième molaires. F. Schéma de l’appareil et de son emplacement. La ligne rouge représente la ligature du fil autour de la première molaire. La ligne orange représente la résine composite fluide utilisée pour ancrer la bobine. La bobine NiTi est indiquée en bleu et étiquetée. G. Hemi-mâchoire inférieure disséquée avec le dispositif attaché après mouvement orthodontique de 7 jours. Notez comment les 3 fils de bobine sont toujours ouverts, indiquant que la bobine est toujours active après 7 jours. Barre d’échelle = 1 mm en E et G. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Hémi-mandibule montée dans une chambre sur mesure pour l’imagerie micro-CT. A. Configuration complète de la chambre d’échantillonnage dans la machine micro-CT. La source de rayons X est visible à gauche et le détecteur à droite. Le rectangle rouge décrit l’hémi-mandibule montée dans la chambre sur l’étage d’échantillonnage (SS). L’exemple de chambre illustré ici fait partie d’une configuration d’essai mécanique, y compris le moteur (M), l’enclume (A, délimitée par des lignes pointillées blanches) et l’arbre d’enclume (AS) au sommet de la chambre. La configuration complète est vissée sur l’étage CT. L’image en médaillon montre un gros plan de la région délimitée en rouge, contenant la chambre d’humidité avec l’échantillon à l’intérieur. B. Vue de dessus de l’échantillon monté sur l’étage d’échantillonnage. Les bassins d’humidité (flèche grise) sont intégrés sur le périmètre pour maintenir l’humidité pendant l’imagerie. Sur la scène circulaire au milieu, l’hémi-mandibule peut être montée dans la rainure profonde inclinée (flèche noire). Une fine rainure (flèche blanche) marque la ligne médiane de la scène pour aider à orienter l’échantillon. C. Schéma de l’étage circulaire avec la rainure de l’échantillon. L’inclinaison de la rainure soutient la mandibule et permet de monter les molaires le long de l’axe vertical des racines. D. Tranche 2D micro-CT représentative combinée à une image de volume 3D de l’échantillon hémi-mandibule. L’écart interproximal ici est de 52 μm. L’échantillon est monté sur l’étage d’échantillonnage ci-dessous (non représenté) et l’enclume (A) sur le dessus par un composite dentaire (DC). Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. méthode de dégagement basée sur ECi pour les hémi-mâchoires disséquées de souris. A. L’hémi-mâchoire inférieure disséquée est immergée dans 4% PFA, 50% EtOH, 70% EtOH, et 100% EtOH consécutivement. Après déshydratation, l’hémi-mandibule est conservée dans l’ECi pendant au moins 12 h jusqu’à l’imagerie. B. Hemi-mâchoire inférieure juste après la dissection. C. Hemi-mâchoire inférieure après achèvement de dégagement. Barres d’échelle = 5 mm Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Micro-CT in situ représentatives de la PDL d’un échantillon frais dans les différentes étapes du mouvement orthodontique. A-C, Pas de mouvement orthodontique. A. Image 2D de Micro-CT dans le plan transversal de l’hemi-mâchoire inférieure montrant les racines mésiales (M) et distales (D) à l’intérieur de l’os alvéolaire, B-Buccal, côtés L-Lingual de l’os alvéolaire. Entre les racines dentaires et l’os alvéolaire, l’espace PDL et les fibres qu’il contient sont clairement observés. B. Image 2D dans le plan sagittal. C. Image 2D dans le plan coronal. D-E, images 2D après 3 jours d’OTM, les têtes de flèche pointent vers des zones dans le PDL avec réduction de la densité des fibres de collagène, les flèches blanches pointent vers des zones de résorption osseuse. G-I, images 2D après 7 jours d’OTM, les flèches noires pointent vers les régions de l’apposition osseuse. Barres d’échelle = 150 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Image micro-CT 2D dans le plan sagittal, montrant des structures floues de la dent et de l’os dues au mouvement de la dent pendant la scintigraphie. Les flèches pointent vers plusieurs lignes de planche de la dent, indiquant son mouvement. Barre d’échelle 150 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Mandibule dégagée ECi montrant la première molaire entrait avec la deuxième génération harmonique (SHG). La flèche blanche pointe vers une région où des fibres de collagène du PDL sont vues, notez l’orientation verticale, les flèches noires pointent vers une région où les deux fibres verticales du PDL aussi bien que les fibres horizontales de l’os alvéolaire sont vues. Dent T, F-furcation, OS AB-alvéolaire, racine MR-mésiale, racine DR-Distale, barre d’échelle 150 μm. Les images ont été obtenues à l’aide d’une lentille multi-immersion 20X pour des solutions avec un RI de 1,33-1,56. Le laser d’excitation a été réglé à 860nm à 10% de puissance. Temps d’habitation des pixels : 0,51 μs; Mode de balayage: cadre; Moyenne : 16; Type de détecteur: détecteur à tube photomultiplicateur non scanné; Détecteur Gain 800V. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Images au microscope à feuille de lumière de la souris Flk1-Cre;tdTomato effacée par ECi. A. Hémi-mâchoire inférieure de contrôle de manière optimale dégagée. Le réseau de vaisseaux sanguins dans l’os (tête de flèche) et l’espace PDL (flèche) est visible. B. l’encart de la région mésolinguale de la première molaire (rouge tracé en A) montre les vaisseaux sanguins. C. a idéalement dégagé l’hémi-mâchoire inférieure et la D d’OTM de 7 jours. hémi-mâchoire inférieurement dégagée de manière optimale. E. Image 2D du panneau C dans le plan sagittal, l’image montre des vaisseaux sanguins bien définis dans l’os (flèche grise) et l’espace PDL (flèches blanches). F. Image de tranche bidimensionnelle du panneau D, même région que les images en E, ce qui donne une image floue. Barres d’échelle A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm Les images ont été prises avec un objectif de plan 5X, en utilisant la caméra comme détecteur. Le laser d’excitation était de 561 nm à 4% de puissance. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La génération d’OTM chez la souris est fortement souhaitée en raison de la taille, de la génétique et des avantages de la manipulation. L’utilisation de la mandibule permet une manipulation facile à la fois en termes de dissection tissulaire ainsi que de préparation des échantillons et d’imagerie. Ici nous avons présenté une méthode pour générer OTM avec le mouvement translationnel de la dent à l’intérieur de l’os dans les 7 jours d’OTM. En utilisant ce protocole, la durée globale du mouvement de la dent peut être prolongée, car la bobine activée offre un niveau de force constant pour un mouvement allant jusqu’à environ 1 mm. Cependant, le côté mésial de la bobine est fixé à l’inciseur, qui est en éruption constante. En conséquence, les vecteurs de force vont progressivement modifier et commencer à générer des forces d’extrusion. Cela peut être évité si l’ajustement du niveau d’attache à l’extrémité mésiale est effectué tous les 7 jours.

Le PDL est l’initiateur de l’OTM, donc comprendre sa structure et sa fonction au cours des différentes étapes de l’OTM est d’une grande importance. Cependant, le PDL n’est pas uniforme à la fois dans sa structure et sa fonction19,22,31,32. En conséquence, afin de récupérer des données significatives, le PDL doit être étudié en 3D et toute sectionnement et manipulation tissulaire doivent être évités autant que possible. Pourtant, l’étude d’un tissu mou situé entre deux tissus durs rend ces exigences difficiles à remplir. Les méthodes traditionnelles d’étude des PDL impliquent souvent de compromettre la structure 3D et de retirer le tissu de son environnement physiologique, ce qui modifie par conséquent les propriétés structurelles et biomécaniques des PDL. Les propriétés structurelles et biomécaniques subissent des changements dynamiques au cours de l’OTM qui justifient de préserver encore plus le contexte 3D tissulaire. Pour ce faire, nous avons décrit deux méthodes qui permettent l’imagerie des tissus entiers sans sectionnement, qui peuvent également être utilisées sur le même échantillon colocalisant les signaux fluorescents, les données morphologiques et les données de minéralisation.

La description méthodologique fournie demande aux lecteurs d’appliquer les méthodes dans leurs domaines d’études. L’imagerie micro-CT permet la visualisation 3D du réseau fibreux PDL. Les images peuvent être analysées pour produire des analyses de directionnalité et de densité et pour étudier quantitativement les changements dans le PDL pendant l’OTM. Nous avons également décrit une méthode de compensation qui permet la visualisation avec des méthodes microscopiques optiques facilement disponibles telles que la microscopie à feuille de lumière et l’imagerie confocale. La microscopie à feuille de lumière a l’avantage de produire une image 3D de grands spécimens avec une vitesse d’imagerie relativement rapide. La microscopie confocale permet une visualisation 3D haute résolution en utilisant le signal SHG pour l’imagerie des fibres de collagène et les étiquettes fluorescentes. Ces méthodes indépendamment ou combinées ouvrent de nombreuses possibilités aux études structurelles 3D avec une préparation tissulaire minimale.

Plusieurs étapes difficiles dans ce protocole nécessitent une attention particulière :

Tout d’abord, lors de la mise en place de la bobine, le fil de ligature doit être placé solidement entre les première et deuxième molaires. Ce processus est difficile en raison des petites dimensions des dents de souris. Nous recommandons l’utilisation du stéréomicroscope de paillasse pour guider le placement. Cependant, de petits mouvements au cours de la procédure peuvent déplacer la souris et faire sortir la région d’intérêt du champ de vision. Comme alternative, nous vous suggérons d’utiliser des loupes grossissantes 4-5x qui peuvent être portées sur l’opérateur, ce qui pourrait aider à visualiser la zone de manière plus dynamique.

Deuxièmement, les résultats de la compensation dépendent du processus de déshydratation. Si l’échantillon n’a pas atteint le niveau de transparence souhaité, notre suggestion est d’augmenter le temps de déshydratation. Plus précisément, il a été démontré que l’allongement du temps d’immersion dans 100% EtOH améliore la transparence du produit final. Cependant, il convient de noter qu’un niveau accru de déshydratation peut réduire considérablement les niveaux de fluorescence24,25. Il a été démontré que la méthode basée sur l’ECi présentée préserve les signaux fluorescents pendant plus de 2 semaines24.

Certains aspects de ce protocole peuvent être modifiés pour étudier une multitude d’autres objectifs. La chambre que nous avons conçue à l’intérieur du micro-CT est couplée à un système de charge et à un moteur et a la capacité d’effectuer des tests de tension / compression sur les échantillons d’hémi-mandibule. Combiné à la visualisation du micro-CT, cette configuration peut montrer des changements dans le PDL in situ avec des charges mécaniques variables21. La méthode de compensation décrite pourrait également être mise en œuvre sur des échantillons non fixes, ce qui offre la possibilité d’une combinaison intéressante de diverses modalités d’imagerie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par les NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). Nous tenons à remercier le Harvard Center for Biological Imaging pour son infrastructure et son soutien. Tous les chiffres sont générés avec biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-mL BD Luer-Lok syringe BD 309628
1X phosphate buffered saline VWR Life Sciences 0780-10L
200 proof ethanol VWR Life Sciences V1016
Aluminum alloy 5019 wire Sigma-aldrich GF15828813 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7 Thermo Fisher Scientific N/A Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm Zeiss N/A Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form G.Hartzell and son 126-CSH3 Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16 Zeiss 440321-9902 Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light 3M ESPE 76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL Eppendorf 22363204
Ethyl cinnamate, >= 98% Sigma-aldrich W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' BD 305109
Ketathesia 100mg/ml Henry Schein Animal Health NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers Kimberly-Clark 21905-026 (VWR Catalog number) Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system Zeiss LightSheet Z.1/LightSheet 7 Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope Zeiss LSM 880 NLO Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread Hahnenkratt 6220 Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200 Xradia MICRO XCT-200
Mini-Colibri Fine Science Tools 17000-01
PermaFlo Flowable Composite Ultradent 948
Procedure platform N/A N/A Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80 Leica Micosystems M80
Sentalloy NiTi open coil spring TOMY Inc. A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. 
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter Orthodontics SBLW109 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml Henry Schein Animal Health NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade 3M ESPE 5904A2

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Xu, H., Lee, A., Sun, L., Naveh, G. R. S. 3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model. J. Vis. Exp. (170), e62149, doi:10.3791/62149 (2021).

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