Summary
Apresentamos um protocolo para geração de movimento dentário ortodôntico em camundongos e métodos para visualização 3D das fibras de colágeno e vasos sanguíneos do ligamento periodontal sem secção.
Abstract
O movimento dontário ortodôntico é um processo biológico complexo de remodelação de tecidos moles e duros alterados como resultado de forças externas. Para compreender esses complexos processos de remodelação, é fundamental estudar os tecidos dentários e periodontais dentro de seu contexto 3D e, portanto, minimizar quaisquer secções e artefatos tecuais. Modelos de camundongos são frequentemente utilizados em biologia desenvolvimentante e estrutural, bem como em biomecânica devido ao seu pequeno tamanho, alta taxa metabólica, genética e facilidade de manuseio. Em princípio, isso também os torna excelentes modelos para estudos odontológicos. No entanto, um grande impedimento é o tamanho do dente pequeno, os molares em particular. Este artigo visa fornecer um protocolo passo a passo para a geração de movimento dentário ortodôntico e dois métodos para imagem 3D do componente fibroso do ligamento periodontal de um molar mandibular de camundongos. O primeiro método apresentado baseia-se em uma configuração de micro-TC que permite a melhor imagem de aprimoramento de fase de tecidos de colágeno frescos. O segundo método é um método de limpeza óssea usando cinnamate etílico que permite a imagem através do osso sem secção e preserva fluorescência endógena. Combinando este método de compensação com ratos repórteres como Flk1-Cre; TdTomato proporcionou uma primeira oportunidade de imagem da vasculatura 3D no PDL e osso alveolar.
Introduction
O processo biológico básico subjacente no movimento dentário ortodôntico (OTM) é a remodelagem óssea. O gatilho para este processo de remodelação é atribuído a alterações na estrutura do ligamento periodontal (PDL) como estresse da matriz extracelular (ECM), necrose, bem como destruição e formação de vasos sanguíneos1,2,3. Outros possíveis gatilhos para a remodelação óssea alveolar estão relacionados à detecção de força por osteocitos no osso, bem como a deformação mecânica do próprio osso alveolar; no entanto, seu papel na OTM ainda não é totalmente elucidado4,5.
Apesar de muitos estudos que visam revelar relações estrutura-função do PDL durante o OTM, um mecanismo funcional claro ainda está para ser definido6,7. A principal razão para isso é o desafio na recuperação de dados de um tecido mole (PDL) localizado entre dois tecidos duros (cementum e osso alveolar). Os métodos aceitos para coletar informações estruturais geralmente exigem fixação e seção que interrompem e modificam a estrutura PDL. Além disso, a maioria desses métodos produz dados 2D que, mesmo que não distorcidos, dão apenas informações parciais e localizadas. Uma vez que o PDL não é uniforme em sua estrutura e função, uma abordagem que aborda a estrutura 3D intacta de todo o complexo de osso dentário-PDL é justificada.
Este artigo descreverá um método para gerar um OTM em camundongos e dois métodos que permitem a visualização 3D das fibras de colágeno no PDL sem qualquer seção da amostra.
Os modelos murinos são amplamente utilizados para experimentos in vivo em medicina, biologia do desenvolvimento, entrega de medicamentos e estudos estruturais. Eles podem ser geneticamente modificados para eliminar ou melhorar proteínas e funções específicas; eles fornecem controle de desenvolvimento rápido, repetível e previsível; eles também são fáceis de imagem devido ao seu pequeno tamanho8. Apesar de suas muitas vantagens, os modelos de camundongos em pesquisas odontológicas não são utilizados com frequência, especialmente quando as manipulações clínicas são justificadas, principalmente devido aos dentes de pequeno porte. Modelos animais como ratos9,10,11, cães12,13, porcos14,15,16 e macacos17 são usados com mais frequência do que ratos. Com o recente desenvolvimento de técnicas de imagem de alta resolução, as vantagens de utilizar um modelo de mouse para decifrar os processos complicados em OTM são inúmeras. Este artigo apresenta um método para gerar um movimento mesial do dente molar na mandíbula com níveis constantes de força que desencadeiam a remodelação óssea. A maioria dos experimentos de OTM em roedores são feitos na maxila, uma vez que a mobilidade da mandíbula e a presença da língua adicionam outro nível de complexidade. No entanto, a mandíbula tem muitas vantagens quando a integridade estrutural 3D é desejada. Pode ser facilmente dissecado como um osso inteiro; em algumas espécies pode ser separado em duas mandíbulas hemi através da sífilis fibrosa; é compacto, plano e contém apenas os dentes sem espaços sinusos. Em contraste, a maxila é uma parte do crânio e intimamente relacionada a outros órgãos e estruturas, assim é necessária uma seção extensiva para dissecar o osso alveolar com os dentes associados.
Utilizando uma câmara de umidade interna acoplada a um sistema de carregamento dentro de uma micro-TC de alta resolução que permite o aprimoramento de fase, desenvolvemos um método para visualizar tecidos fibrosos frescos em 3D como descrito anteriormente9,18,19,20,21,22,23. Tecidos frescos são escaneados imediatamente após o animal ser sacrificado sem qualquer coloração ou fixação, o que reduz artefatos teciduais, bem como alterações de propriedades biomecânicas. Esses dados 3D podem ser utilizados para análises de distribuição e direção das fibras descritas em outros lugares19.
O segundo método de imagem tecidual 3D apresentado aqui é baseado na limpeza óptica da mandíbula que permite a imagem das fibras PDL através do osso sem qualquer secção. Curiosamente, também permite a visualização das fibras de colágeno do próprio osso, porém isso não será discutido aqui. Em geral, existem dois métodos para limpeza tecidual. A primeira é a limpeza baseada em aquoso, onde a amostra está imersa em uma solução aquosa com um índice refrativo superior a 1,4, seja através de uma simples imersão, hiperhidratação ou incorporação de hidrogel. No entanto, esse método é limitado ao nível de transparência, bem como à preservação estrutural do tecido e, portanto, requer fixação do tecido. O segundo método que produz amostras altamente transparentes e não requer fixação é o método de compensação baseado em solventes24,25. Geramos um método de compensação modificado à base de solventes baseado em etil-3-fenilprop-2-enoato (etil cinnamate, ECi) para as amostras mandibulares. Este método tem as vantagens de usar um agente de compensação de grau alimentar não tóxico, encolhimento mínimo de tecidos e preservação de proteínas fluorescentes.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Harvard (Protocolo nº 01840).
1. Movimento ortodôntico de dente
- Para gerar uma cama de rato, use uma plataforma de plástico plana com uma cunha em forma de encravado, encostou em 45° de enceinte. O encores de cabeça pode ser gerado cortando uma caixa de plástico.
- Eleve a extremidade da cabeça da plataforma para gerar um ângulo de aproximadamente 30° entre o encorfeito da cabeça e o plano de mesa. Conecte um clipe de papel grosso dobrado (0,036" de diâmetro) à extremidade lateral da cabeça para segurar os incisivos superiores.
- Na extremidade da cauda, gere uma superfície elevada à qual uma corrente de energia ortodôntica pode ser anexada para segurar os incisivos inferiores. Consulte a Figura 1 para uma plataforma de exemplo.
- Anesthetize mouse por injeção intraperitoneal de xilazina a 10 mg/kg e cetamina 100mg/kg usando seringa de 1 mL e uma agulha calibre 27.
- Coloque o mouse anestesiado na plataforma personalizada e imobilize a mandíbula superior, enganchando os incisivos superiores no loop do clipe de papel. Abra a mandíbula inferior do mouse com a corrente de energia ortodôntica ligada nos incisivos inferiores. Mantenha as bochechas retraídas com o retrátil da boca mini-colibri.
- Coloque a plataforma sob um microscópio cirúrgico ou qualquer outro estereoscópio que possa atingir a ampliação de 5-6x.
- Aplique 50 μL de soro fisiológico (aproximadamente 1 gota) nos olhos do rato para evitar a desidratação da córnea. Reabastecer soro fisiológico a cada 20 minutos.
- Corte um pedaço de um fio de alumínio (0,08 mm de diâmetro) de 1 cm de comprimento. Deslize o fio do lado bucal linguly na área interproxmal abaixo do ponto de contato entre o primeiro e o segundo molares usando um suporte de agulha microcirúrgica. Deixe a borda livre de 2 mm na frente do primeiro molar para ser enfiada na extremidade da mola.
- Corte um pedaço de bobina de titânio de níquel (NiTi), em torno de 7 a 9 fios de comprimento.
NOTA: As propriedades elásticas da bobina fornecerão força constante para o movimento ortodôntico. O comprimento total não treinado da bobina deve ser menor do que a distância entre o incisivo e o molar. Tenha em mente que são necessários 2 fios extras em cada extremidade para ancorar a bobina até o dente. O fio de alumínio é selecionado para reduzir os artefatos de varredura, como o endurecimento do feixe durante a micro-tomografia computadorizada. - Insira mola de bobina NiTi (diâmetro de fio de 0,15 mm, diâmetro da bobina interna de 0,9 mm; fornece uma força de 10 g) entre o primeiro molar inferior e o incisivo inferior. Use a ligadura de arame inserida ao redor do primeiro molar na etapa 1.6, gire o fio firmemente em torno de 2 fios da mola da bobina para fixar a bobina no lado molar.
- Para garantir o nível de força uniforme, use exatamente 3 roscas ativas entre o primeiro molar e o incisivo. Remova temporariamente a corrente de alimentação do incisivo e enrole 2 a 3 roscas não treinadas sobre o incisivo para ancorar a bobina. Deslize os fios para baixo para a margem gengival livre incisivo.
- Coloque uma camada de resina composta esvoaçante na borda incisal da bobina e cure-a com luz de cura dental. Substitua a corrente de alimentação após a cura da resina.
- Usando a mesma luz de cura, aqueça a bobina NiTi por 20 s. Isso vai apertar a bobina NiTi. A colocação finalizada é mostrada Figura 1C.
- Deixe o lado contralateral intacto ou insira uma farsa, como o fio entre o primeiro e o segundo molares.
- Coloque o mouse anestesiado sob uma luz aquecida para manter o mouse aquecido até a recuperação.
- Coloque o mouse de volta em uma gaiola individual e monitore diariamente. Nenhuma mudança de dieta é necessária durante o movimento ortodôntico.
NOTA: O dispositivo OTM de um lado causa algum desconforto, mas não prejudica a alimentação. No entanto, a inserção de dispositivos em ambos os lados não é aconselhável devido à quantidade adicional de desconforto. A medicação para dor não é necessária a menos que sinais externos de dor sejam vistos.
2. Micro-tomografia de fibras PDL em mandíbulas hemi-mandíveis frescas
- Montagem da hemi-mandíbula (Figura 2)
- Após a duração desejada do movimento ortodôntico, sacrifique o rato através de deslocamento cervical. Remova a mandíbula e se separe em mandíbulas hemi.
NOTA: Como a amostra não será fixada, é fundamental realizar a dissecção da mandíbula e a montagem o mais rápido possível, idealmente dentro de 30 minutos. - Remova o tecido mole circundante suavemente com uma limpeza limpa sem fiapos.
- Remova o dispositivo ortodôntico usando tesouras microcirúrgicas e pinças sob um microscópio estéreo com pelo menos 4x de ampliação.
- Mantenha a amostra úmida em um volume de 1,5 mL, tubo de microcrédito, juntamente com um pedaço de lenço sem fiapos umedecido com água.
- Coloque resina composta dentária embalada no slot amostral no palco e coloque a hemi-mandible fresca no composto. Antes de montar certifique-se de que a superfície óssea em contato com o composto dentário esteja livre de quaisquer tecidos moles e seco, caso contrário, o composto dental não será curado adequadamente.
- Ajuste a posição da hemi-mandíbula até que o primeiro molar esteja centrado no sulco médio do palco. Certifique-se de que a superfície oclusal é horizontal. Cure o composto quando estiver satisfeito com o posicionamento.
NOTA: Podem ser colocadas pequenas quantidades adicionais de compósitos dentários nas laterais da hemi-mandíbula e/ou em todo o incisivo para ajudar na estabilização da amostra. - Coloque umedecimento sem fiapos umedecido dentro das piscinas de umidade no estágio amostral. Coloque composto dentário na superfície oclusal do primeiro molar. Antes de fechar a câmara, certifique-se de que nada bloqueie o caminho do raio-x no nível da amostra.
- Afixe a câmara no micro-CT. Enrosque a câmara no estágio da amostra microcsicular para que o movimento durante a imagem seja minimizado.
- Ligue os raios-X e tire imagens 2D enquanto baixa a bigorna verticalmente, até que a ponta da bigorna esteja cercada pelo composto, mas nenhum aumento na força é detectado.
- Uma vez que a bigorna esteja incorporada no composto, feche a fonte de raios-X. Em seguida, abra a câmara micro-CT e cure o composto através da janela plexiglass clara.
- Após a duração desejada do movimento ortodôntico, sacrifique o rato através de deslocamento cervical. Remova a mandíbula e se separe em mandíbulas hemi.
- Configurações de microcsição
- Ajuste a tensão de origem para 40 kV e corrente para 200 μA. Utilizando um detector de ampliação de 10x, posicione a amostra dentro do quadro de visão. Use binning de 2 para as imagens capturadas.
NOTA: Uma vez que o PDL é significativamente menos denso que o osso e o dente, visualizar o PDL requer maior potência e tempo de exposição. Este protocolo fornecerá configurações para visualizar o PDL. - Defina o tempo de exposição de imagem única para 25 s. Definir a rotação do estágio amostral para uma faixa de 183 graus ou mais. Defina a varredura para 2500 projeções. Não utilize nenhum filtro de origem de raios-X, os exames resultantes têm um tamanho voxel de 0,76 μm de cada lado.
- Colete uma verificação de referência para reconstrução adequada de acordo com as diretrizes da microcs . Use 1/3 de imagens de referência como as projeções totais. Reconstrua o volume sem binning adicional, usando um algoritmo filtrado de projeção traseira.
- Ajuste a tensão de origem para 40 kV e corrente para 200 μA. Utilizando um detector de ampliação de 10x, posicione a amostra dentro do quadro de visão. Use binning de 2 para as imagens capturadas.
3. Método de compensação(Figura 3)
- Prepare cinco tubos de microcrédito de 1,5 mL.
- Preparar 1,4 mL das seguintes soluções em tubos de micro centrífugas de 1,5 mL: 4% paraformaldeído (PFA) em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), 50% de etanol (EtOH) em água desionizada (DI), 70% EtOH em água DI e dois tubos de 100% EtOH.
NOTA: O PFA é usado para fixação da amostra. A limpeza do ECi também funcionará em amostras não fixas. Para limpar amostras não fixas, basta pular a etapa PFA. - Coloque a hemi-mandible dissecada em 4% pfa. Cubra com papel alumínio e coloque sobre o roqueiro em ajuste suave à temperatura ambiente por 6h.
- Mova a hemi-mandible para 50% EtOH. Coloque-o no roqueiro coberto de luz por 16 horas.
- Mova a hemi-mandible para 70% EtOH. Coloque-o no roqueiro coberto de luz por 16 horas.
- Mova a hemi-mandible para 100% EtOH. Coloque-o no roqueiro coberto de luz por 16 horas.
- Repita 3.6. no segundo tubo 100% EtOH.
- Prepare 5 mL de ECi em um tubo de vidro ou polipropileno.
NOTA: O ECi dissolve o poliestireno, mas não o polipropileno. Além disso, se não usar um tecido com proteínas fluorescentes, a amostra pode ser exposta à luz durante o procedimento de compensação. - Mova a hemi-mandible para o tubo ECi. Cubra o tubo com papel alumínio e coloque sobre o roqueiro em um ajuste suave por um mínimo de 12 h.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. A amostra desidratada pode ser armazenada em ECi à temperatura ambiente. O ponto de congelamento ou fusão de ECi é de 6,5 a 8,0 °C. Não armazene a 4 °C. - A hemi-mandíbula está pronta para imagem com microscópio de fluorescência.
NOTA: Durante a imagem, a amostra deve ser imersa no ECi para permanecer opticamente transparente.
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Representative Results
Este artigo apresenta um método para produzir OTM, bem como dois métodos para imagem 3D de fibras de colágeno dentro do PDL sem qualquer secção. Para fins de pesquisa animal, quando o alinhamento dos dentes não é necessário, um movimento dentário é considerado ortodôntico se gera remodelação do osso alveolar em todos os níveis radiculares. O nível de força constante aplicado nos dentes é necessário para gerar um OTM confiável. Aqui, uma bobina NiTi de memória de forma ativada é usada para gerar uma força consistente de 10 g durante o tempo experimental de 7 dias e além, se necessário. A ativação da bobina descrita aqui (Figura 1) gera tensão na bobina NiTi dentro da fase martensítica e traz a bobina para o estado da histerese, que proporciona estresse constante no dente. O aquecimento da bobina com a luz de cura após a inserção da bobina também garantirá que a liga mudará para sua forma austenítica e o efeito da memória da forma ocorrerá.
Aqui mostramos resultados representativos de ratos machos de 9 semanas. O espaço mesiodistal médio entre as coroas do primeiro e segundo molares após 7 dias de OTM é de 40 μm medido entre as superfícies interproximais dos molares no micro-CT com ampliação 1X (n=12, st.dev. = 15 μm) (Figura 1E). O espaço médio do PDL na direção mesiodistal é de 80 μm antes e depois de 7 dias de OTM (Figura 4B). Isso confirma que o primeiro molar traduzido mesialmente e 7 dias é um tempo adequado para gerar OTM em um modelo de camundongos, gerando processos de reabsorção óssea e apposition na natureza(Figura 4). Os ratos foram alimentados com uma dieta padrão de paletes duros. Nenhuma mudança de dieta foi feita após a inserção do dispositivo.
O primeiro método apresentado para visualizar as alterações no complexo dentário-PDL-osso durante o OTM baseia-se na imagem micro-CT aprimorada em fase de tecidos frescos(Figura 4) que foi descrita em detalhes anteriormente9,18,19,20,22,23. Em suma, desde que seja visualizada uma capacidade de melhoria de fase de um microcântron ou síncrotron, estabilização mecânica do tecido fibroso e ambiente umidificado, fibras colágenas frescas podem ser visualizadas sem qualquer fixação ou agentes contrastantes. No PDL as fibras que são vistas são aquelas que estão conectadas tanto ao dente quanto ao osso, principalmente o colágeno tipo I19. Esta oportunidade única de visualizar em 3D um PDL intacto permite a análise da densidade de fibras 3D, orientação de fibras, bem como o movimento 3D do dente como descrito anteriormente9,19. Especificamente, aqui apresentamos a visualização da rede fibrosa no PDL. No momento 0, pode-se observar a remodelagem fisiológica tanto no osso quanto no PDL. A remodelação também ocorre no cimentão celular; no entanto, isso não está diretamente relacionado ao método apresentado e, portanto, não será elaborado. A interface osso-PDL é principalmente suave tanto nos planos transversal(Figura 4A) quanto sagital(Figura 4B)antes de qualquer aplicação de força. No plano coronal(Figura 4C),a interface osso-PDL é mais áspera especialmente para a região apical, o que pode ser indicativo do equilíbrio de remodelação tende a reabsorção. Aos 3 dias de OTM(Figura 4D-F),sobre o qual o primeiro molar é movido mesialmente (a direção é representada pela seta tracejada), a densidade de fibras no PDL é reduzida (cabeças de seta branca). A interface osso-PDL é mais áspera do que em 0 dias devido ao desenvolvimento de crateras na superfície óssea que são indicativas de atividade osteoclástica e processos de resorção óssea associados principalmente às forças de compressão no PDL26,porém aqui visto em áreas de tensão em 3 dias. A destruição tecidual em áreas de tensão dentro do PDL foi sugerida27,28 e pode ser claramente vista usando este método. A fronteira áspera é vista em diferentes níveis das raízes (setas brancas) e, portanto, sugere que o movimento dos dentes é translacional na natureza e não apenas a derrubada da coroa. Aos 7 dias de OTM (Figura 4G-I),sinais de resorção óssea, como crateras dentro do osso, bordas ásperas e expansão do espaço PDL, são vistos em todos os planos, mas o espaço PDL médio é mais estreito do que em 3 dias de OTM (Figura 4D-F). Em algumas áreas, no entanto, a fronteira osso-PDL tornou-se mais suave após 7 dias de OTM essas áreas estão localizadas nas superfícies distais das raízes, o que é provavelmente uma indicação para aposição óssea, como esperado em OTM para a direção mesial.
Devido ao longo tempo de imagem micro-CT (~19 h) e à rotação do estágio, a montagem da amostra é essencial para manter a amostra parada. A amostra instável resultará em varreduras embaçadas. A Figura 5 apresenta como fica a microcografia quando a amostra se moveu durante a varredura. O dente e o osso estão embaçados. Nem fibras PDL nem osteocitos são observadas. Em tais incidentes há uma silhueta presente em torno da margem de um objeto. Na Figura 5,podem ser observados vários contornos da coroa dente (setas).
Dependendo do objetivo da pesquisa, a resolução e visualização das fibras PDL podem ser sacrificadas no comércio por um tempo de varredura mais curto quando apenas as informações sobre os tecidos duros são desejadas.
Um método complementar para visualização 3D das fibras PDL sem qualquer seção é via microscopia óptica em amostras adequadamente limpas usando ECi (Figura 3). Este método pode ser usado em uma amostra sem fixação e preserva sinais fluorescentes que existem no tecido antes da limpeza. Mandíbulas hemi antes e depois da limpeza do ECi são mostradas nas Figuras 3B e 3C. A limpeza adequada da amostra do PDL pode ser confirmada quando um papel de grade pode ser visto através do ramus da mandíbula. A quantidade de compensação pode ser ajustada por meio do alongamento do processo de desidratação. A Figura 6 mostra o sinal de segunda geração harmônica (SHG) de fibras de colágeno tanto no osso alveolar quanto no PDL em uma mandíbula limpa. A imagem das fibras de colágeno do osso em 3D é um processo complicado, que muitas vezes utiliza métodos de microscopia eletrônica, como FIB/SEM. No entanto, utilizando o método de compensação baseado em ECi e SHG, as fibras ósseas alveolares são claramente vistas, especialmente na direção horizontal. Ao traduzir através da amostra profundamente no PDL da superfície óssea, a transição para o nível de fibra PDL é muito clara à medida que as fibras mudam repentinamente sua orientação para uma vertical.
A microscopia de folha de luz também pode ser utilizada para a imagem de proteínas fluorescentes através do osso. Neste caso de uma amostra limpa de um Flk1-cretransgênico; O camundongo Tdtomato19,29,30, as células endoteliais fluorescentes que revestem os vasos sanguíneos são claramente observadas(Figura 7A,B, C, E). A limpeza adequada é fundamental para gerar imagens inteligíveis com microscopia de folha de luz. Quando o osso não está completamente limpo, não foram observados vasos sanguíneos dentro do PDL(Figura 7D, F).
Figura 1: Configuração da inserção do aparelho ortodôntico. A. Cama de rato feita de suprimento de laboratório para apoiar o animal e manter a boca aberta. A plataforma plástica (PP) para o corpo está em uma inclinação de 30° e o enconte de cabeça (HR) está em um ângulo de 45° da superfície do PP. Um suporte de tubo de 2 camadas (TS) é usado para elevar a cabeça final do PP. O laço de clipe de papel (seta preta) ancora os incisivos superiores, e a cadeia de energia ortodôntica inferior (seta branca) se conecta aos incisivos inferiores. O espelho de inspeção de 5 mm de diâmetro foi utilizado para inspeção visual dos molares. B. Vista lateral da cama do rato. Os ângulos entre as superfícies são marcados (verde e magenta). C. Imagem representativa do dispositivo devidamente colocado. D. Molares vistos através do espelho de inspeção antes da implantação do dispositivo. E. Imagem representativa dos molares após o movimento ortodôntico. Linhas tracem o contorno do primeiro e segundo molares. F. Diagrama do dispositivo e sua colocação. A linha vermelha representa a ligadura de arame em torno do primeiro molar. A linha laranja representa resina composta fluível usada para ancorar a bobina. A bobina NiTi é mostrada em azul e rotulada. G. Dissecoed hemi-mandible com o dispositivo ligado após movimento ortodôntico de 7 dias. Observe como os 3 fios de bobina ainda estão abertos, indicando que a bobina ainda está ativa após 7 dias. Barra de escala = 1 mm em E e G. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Hemi-mandible montado em uma câmara personalizada para micro-tomografia. A. Configuração completa da câmara de amostra dentro da máquina micro-CT. A fonte de raio-x é vista à esquerda e ao detector à direita. O retângulo vermelho descreve a hemi-mandíbula montada na câmara no estágio amostral (SS). A câmara de exemplo mostrada aqui faz parte de uma configuração de teste mecânico, incluindo motor (M), bigorna (A, delineado por linhas brancas tracejadas) e eixo de bigorna (AS) no topo da câmara. A configuração completa está ferrada no palco da tomografia. A imagem de entrada mostra o close-up da região delineada vermelha, contendo a câmara de umidade com amostra no interior. B. Vista superior da amostra montada no estágio amostral. As piscinas de umidade (seta cinza) são incorporadas no perímetro para manter a umidade durante a imagem. No palco circular no meio, a hemi-mandíbula pode ser montada no sulco profundo inclinado (seta preta). Uma ranhura fina (seta branca) marca a linha média do palco para ajudar na orientação da amostra. C. Diagrama do estágio circular com o sulco amostral. A inclinação da ranhura suporta a mandíbula e permite que os molares sejam montados ao longo do eixo vertical das raízes. D. Fatia 2D microCTista representativa combinada com uma imagem de volume 3D da amostra de hemi-mandíbula. A diferença interproxial aqui é de 52 μm. A amostra é montada no estágio amostral abaixo (não mostrado) e a bigorna (A) em cima por composto dentário (DC). Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Método de compensação baseado em ECi para hemi-mandíbulas de rato dissecado. A. A hemi-mandible dissecada está imersa em 4% PFA, 50% EtOH, 70% EtOH e 100% EtOH consecutivamente. Após a desidratação, a hemi-mandíbula é armazenada em ECi por um mínimo de 12 h até a imagem. B. Hemi-mandible imediatamente após a dissecação. C. Hemi-mandible após a conclusão da limpeza. Barras de escala = 5 mm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Microc tomografias in-situ representativas do PDL de uma nova amostra nos diferentes estágios do movimento ortodôntico. A-C, sem movimento ortodôntico. A. Imagem 2D micro-CT no plano transversal da mandíbula hemi mostrando as raízes mesial (M) e distal (D) dentro do osso alveolar, B-Buccal, L-Lingual do osso alveolar. Entre as raízes dentárias e o osso alveolar, o espaço PDL e as fibras dentro dele são claramente observados. Imagem B. 2D no avião sagital. Imagem 2D C. no plano coronal. D-E, imagens 2D após 3 dias de OTM, cabeças de seta apontam para áreas do PDL com redução na densidade de fibras de colágeno, setas brancas apontam para áreas de resorção óssea. G-I, imagens 2D após 7 dias de OTM, setas pretas apontam para regiões de aposição óssea. Barras de escala = 150 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagem microC 2D no plano sagital, mostrando estruturas embaçadas tanto do dente quanto do osso devido ao movimento do dente durante a varredura. Setas apontam para múltiplas linhas de prancha do dente, indicando seu movimento. Barra de escala 150 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: ECi limpa mandíbula mostrando o primeiro molar imaged com segunda geração harmônica (SHG). Pontos de seta branca em uma região onde são vistas fibras de colágeno do PDL, note a orientação vertical, setas pretas apontam para uma região onde tanto as fibras verticais do PDL quanto as fibras horizontais do osso alveolar são vistas. T-tooth, F-furcaation, osso AB-alveolar, raiz MR-mesial, raiz DR-Distal, barra de escala 150 μm. As imagens foram obtidas utilizando uma lente de multi-imersão 20X para soluções com RI de 1,33-1,56. O laser de excitação foi fixado em 860nm com 10% de potência. Tempo de moradia do pixel: 0,51μs; Modo de varredura: quadro; Média: 16; Tipo detector: detector de tubos fotomultiplier não examinado; Detector Gain 800V. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Imagens de microscópio de folha de luz do mouse Flk1-Cre;tdTomato. A. O controle idealmente limpo hemi-mandible. A rede de vasos sanguíneos dentro do osso (cabeça de flecha) e espaço PDL (seta) é visível. B. o inset da região mesiolíngue do primeiro molar (vermelho delineado em A) mostra os vasos sanguíneos. C. ótimamente limpo 7 dias OTM hemi-mandible e D. sub-idealmente limpo hemi-mandíbula. E. Imagem 2D do painel C no plano sagital, a imagem demonstra vasos sanguíneos bem definidos em osso (seta cinza) e espaço PDL (setas brancas). F. Imagem fatia bidimensional do painel D, mesma região que as imagens em E, resultando em uma imagem embaçada. Barras de escala A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm As imagens foram tiradas com um objetivo de plano 5X, utilizando a câmera como detector. O laser de excitação era de 561 nm com 4% de potência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Gerar OTM em camundongos é altamente desejado devido ao tamanho, genética e vantagens de manuseio. O uso da mandíbula proporciona um manuseio fácil tanto em termos de dissecção tecidual quanto de preparação de amostras e imagens. Aqui apresentamos um método para gerar OTM com movimento translacional do dente dentro do osso dentro de 7 dias de OTM. Utilizando este protocolo, a duração geral do movimento dos dentes pode ser estendida, uma vez que a bobina ativada fornece um nível de força constante para o movimento de até aproximadamente 1 mm. No entanto, o lado mesial da bobina é fixado ao incisivo, que está em constante erupção. Como resultado, os vetores de força gradualmente alterarão e começarão a gerar forças de extrusão. Isso pode ser evitado se o ajuste do nível de fixação na extremidade mesial for realizado a cada 7 dias.
O PDL é o iniciador da OTM, portanto, entender sua estrutura e função durante as diferentes etapas do OTM é de grande importância. No entanto, o PDL não é uniforme tanto em sua estrutura quanto na função19,22,31,32. Como resultado, para recuperar dados significativos, o PDL precisa ser estudado em 3D e qualquer seção e manipulação de tecidos deve ser evitada tanto quanto possível. No entanto, investigar um tecido mole situado entre dois tecidos duros torna tais requisitos desafiadores de cumprir. Os métodos tradicionais de estudo do PDL muitas vezes envolvem comprometer a estrutura 3D e remover o tecido de seu ambiente fisiológico, o que consequentemente altera as propriedades estruturais e biomecânicas do PDL. Tanto as propriedades estruturais quanto as biomecânicas sofrem alterações dinâmicas durante o OTM que justificam ainda mais a preservação do contexto 3D do tecido. Para isso, descrevemos dois métodos que permitem imagens de tecido inteiro sem secção, que também podem ser usados na mesma amostra co-localizando sinais fluorescentes, dados morfológicos e mineralização.
A descrição metodológica fornecida orienta os leitores a aplicar os métodos em suas áreas de estudo. A imagem microcsicular permite visualização 3D da rede fibrosa PDL. As imagens podem ser analisadas para produzir análises de direcionalidade e densidade e investigar quantitativamente mudanças no PDL durante o OTM. Também descrevemos um método de compensação que permite a visualização com métodos microscópicos ópticos prontamente disponíveis, como microscopia de folhas de luz e imagens confocal. A microscopia de lightsheet tem a vantagem de produzir uma imagem 3D de grandes espécimes com velocidade de imagem relativamente rápida. A microscopia confocal permite visualização 3D de alta resolução utilizando sinal SHG para imagens de fibras de colágeno e tags fluorescentes. Esses métodos independentemente ou combinados abrem muitas possibilidades para estudos estruturais 3D com preparação mínima de tecidos.
Várias etapas desafiadoras neste protocolo requerem atenção extra:
Em primeiro lugar, durante a colocação da bobina, o fio de ligadura deve ser colocado com segurança entre o primeiro e o segundo molares. Este processo é desafiador devido às pequenas dimensões dos dentes do rato. Recomendamos o uso de estereótipo de bancada para orientar a colocação. No entanto, pequenos movimentos durante o procedimento podem mover o mouse e fazer com que a região de interesse saia do campo de visão. Como alternativa, sugerimos o uso de lupas de 4-5x que podem ser usadas no operador, o que poderia ajudar a visualizar a área de forma mais dinâmica.
Em segundo lugar, os resultados de compensação dependem do processo de desidratação. Se a amostra não atingiu o nível de transparência desejado, nossa sugestão é aumentar o tempo de desidratação. Mais especificamente, o tempo de imersão mais longo em 100% EtOH tem sido mostrado para melhorar a transparência do produto final. No entanto, deve-se notar que o aumento do nível de desidratação pode reduzir drasticamente os níveis de fluorescência24,25. O método apresentado baseado em ECi foi mostrado para preservar sinais fluorescentes por mais de 2 semanas24.
Aspectos deste protocolo podem ser modificados para estudar uma infinidade de outros propósitos. A câmara que projetamos dentro da micro-TC é acoplada a uma célula de carga e um motor e tem a capacidade de realizar testes de tensão/compressão nas amostras de hemi-mandíbula. Combinado com a visualização do microCS, esta configuração pode apresentar alterações no PDL in-situ com cargas mecânicas variadas21. O método de compensação descrito também poderia ser implementado em amostras não fixadas, o que proporciona uma oportunidade para uma combinação interessante de várias modalidades de imagem.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). Gostaríamos de agradecer ao Centro de Imagens Biológicas de Harvard por infraestrutura e apoio. Todos os números são gerados com biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
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