Summary
Presentamos un protocolo para generar movimiento dental ortodóncico en ratones y métodos para la visualización 3D de las fibras de colágeno y vasos sanguíneos del ligamento periodontal sin seccionamiento.
Abstract
El movimiento ortodóncico de los dientes es un proceso biológico complejo de remodelación de tejidos blandos y duros alterados como resultado de fuerzas externas. Con el fin de entender estos complejos procesos de remodelación, es fundamental estudiar los tejidos dentales y periodontales dentro de su contexto 3D y, por lo tanto, minimizar cualquier seccionamiento y artefactos tisulares. Los modelos de ratón se utilizan a menudo en biología estructural y del desarrollo, así como en biomecánica debido a su pequeño tamaño, alta tasa metabólica, genética y facilidad de manejo. En principio esto también los convierte en excelentes modelos para estudios relacionados con la odontología. Sin embargo, un impedimento importante es su pequeño tamaño de diente, los molares en particular. Este papel se dirige proporcionando un protocolo paso a paso para generar el movimiento ortodóntico del diente y dos métodos para la proyección de imagen 3D del componente fibroso del ligamento periodontal de una muela de la mandíbula del ratón. El primer método presentado se basa en una configuración del micro-CT que permite la proyección de imagen del realce de la fase de los tejidos frescos del colágeno. El segundo método es un método del claro del hueso usando el cinnamato de etilo que permite la proyección de imagen a través del hueso sin seccionar y preserva fluorescencia endógena. Combinando este método de limpieza con ratones reporteros como Flk1-Cre; TdTomato proporcionó una primera oportunidad de su tipo para obtener imágenes de la vasculatura 3D en la PDL y el hueso alveolar.
Introduction
El proceso biológico subyacente básico en el movimiento ortodóntico del diente (OTM) es el remodelado del hueso. El desencadenante de este proceso de remodelación se atribuye a los cambios en la estructura del ligamento periodontal (PDL) como el estrés de la matriz extracelular (MEC), la necrosis, así como la destrucción y formación de los vasos sanguíneos1,2,3. Otros posibles desencadenantes de la remodelación ósea alveolar están relacionados con la detección de fuerza por los osteocitos en el hueso, así como la deformación mecánica del propio hueso alveolar; sin embargo, su papel en OTM todavía no está completamente dilucidado4,5.
A pesar de muchos estudios dirigidos a revelar las relaciones estructura-función de la PDL durante la OTM, aún no se ha definido un mecanismo funcional claro6,7. La razón principal de esto es el desafío en la recuperación de datos de un tejido suave (PDL) situado entre dos tejidos duros (cemento y hueso alveolar). Los métodos aceptados para recopilar información estructural generalmente requieren fijación y seccionamiento que interrumpen y modifican la estructura de PDL. Además, la mayoría de estos métodos producen datos 2D que, incluso si no están distorsionados, solo dan información parcial y localizada. Puesto que el PDL no es uniforme en su estructura y función, un acercamiento que aborde la estructura intacta 3D del complejo entero del diente-PDL-hueso se autoriza.
Este trabajo describirá un método para generar un OTM en ratones y dos métodos que permiten la visualización 3D de las fibras de colágeno en la PDL sin ningún seccionamiento de la muestra.
Los modelos murinos son ampliamente utilizados para experimentos in vivo en medicina, biología del desarrollo, administración de fármacos y estudios estructurales. Pueden ser modificados genéticamente para eliminar o mejorar proteínas y funciones específicas; proporcionan un control del desarrollo rápido, repetible y predecible; también son fáciles de imagen debido a su pequeño tamaño8. A pesar de sus muchas ventajas, los modelos de ratón en la investigación dental no se utilizan con frecuencia, especialmente cuando se justifican manipulaciones clínicas, sobre todo debido a los dientes de pequeño tamaño. Los modelos animales como ratas9,10,11,perros12,13,cerdos14,15,16 y monos17 se utilizan con más frecuencia que los ratones. Con el reciente desarrollo de técnicas de imagen de alta resolución, las ventajas de utilizar un modelo de ratón para descifrar los procesos enrevesados en OTM son numerosas. Este papel presenta un método para generar un movimiento mesial del diente molar en la mandíbula con los niveles constantes de la fuerza que accionan el remodelado del hueso. La mayoría de los experimentos OTM en roedores se realizan en el maxilar, ya que la movilidad de la mandíbula y la presencia de la lengua añaden otro nivel de complejidad. Sin embargo, la mandíbula tiene muchas ventajas cuando se desea la integridad estructural 3D. Se puede diseccionar fácilmente como un hueso entero; en algunas especies se puede separar en dos hemi-mandíbulas a través de la sínfisis fibrosa; es compacto, plano y contiene sólo los dientes sin espacios sinusales. En cambio, el maxilar es una parte del cráneo y estrechamente relacionado con otros órganos y estructuras, por lo que se necesita un seccionamiento extenso para diseccionar el hueso alveolar con los dientes asociados.
Utilizando una cámara de humedad en la casa acoplada a un sistema de carga dentro de un micro-CT de alta resolución que permite la mejora de fase, desarrollamos un método para visualizar tejidos fibrosos frescos en 3D como se describió anteriormente9,18, 19,20,21,22,23. Los tejidos frescos se escanean inmediatamente después de que el animal es sacrificado sin ninguna mancha o fijación, lo que reduce los artefactos tisulares, así como las alteraciones de las propiedades biomecánicas. Estos datos 3D pueden ser utilizados para análisis de distribución y dirección de las fibras como se describe en otra parte19.
El segundo método 3D entero de la proyección de imagen del tejido presentado aquí se basa en el claro óptico de la mandíbula que permite la proyección de imagen de las fibras de PDL a través del hueso sin ninguna seccionamiento. Curiosamente también permite la visualización de las fibras de colágeno del hueso en sí, sin embargo, esto no se discutirá aquí. En general, hay dos métodos para la limpieza de tejidos. El primero es el claro a base acuosa donde la muestra se sumerge en una solución acuosa con un índice de refracción superior a 1,4 ya sea mediante una simple inmersión, hiperhidratación o incrustación de hidrogel. Sin embargo, este método está limitado en el nivel de transparencia, así como la preservación estructural del tejido y por lo tanto requiere la fijación del tejido. El segundo método que produce muestras altamente transparentes y no requiere fijación es el método de limpieza a base dedisolventes 24,25. Se generó un método modificado de compensación a base de solventes basado en etil-3-fenilprop-2-enoato (cinamato de etilo, ECi) para las muestras de la mandíbula. Este método tiene las ventajas de usar el agente de claro no tóxico del alimento-grado, la contracción mínima del tejido, y la preservación de proteínas fluorescentes.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las Directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Harvard (Protocolo nº 01840).
1. Movimiento dental ortodóncico
- Para generar una cama de ratón, utilice una plataforma de plástico plana con un reposacabezas en forma de cuña, 45 ° en ángulo. El reposacabezas se puede generar cortando una caja de plástico.
- Eleve el extremo de la cabeza de la plataforma para generar un ángulo de aproximadamente 30° entre el reposacabezas y el plano de la mesa. Coloque un clip de papel grueso doblado (0,036 " de diámetro) al extremo del lado de la cabeza para sostener los incisivos superiores.
- En el extremo de la cola, genere una superficie elevada a la que se pueda unir una cadena de potencia de ortodoncia para sostener los incisivos inferiores. Consulte la figura 1 para obtener un ejemplo de plataforma.
- Anestesiar ratón mediante inyección intraperitoneal de xilazina a 10 mg/kg y ketamina a 100 mg/kg utilizando jeringa de 1 mL y una aguja calibre 27.
- Coloque el ratón anestesiado en una plataforma hecha a medida e inmovilice la mandíbula superior enganchando los incisivos superiores en el bucle del clip. Abra la mandíbula inferior del ratón con la cadena de potencia de ortodoncia enganchada a los incisivos inferiores. Mantenga las mejillas retraídas con el retractor bucal mini-colibri.
- Coloque la plataforma bajo un microscopio quirúrgico o cualquier otro estereoscopio que pueda alcanzar un aumento de 5-6x.
- Aplique 50 μL de solución salina (aproximadamente 1 gota) en los ojos del ratón para prevenir la deshidratación corneal. Reponer solución salina cada 20 min.
- Cortar una pieza de un alambre de aluminio (0,08 mm de diámetro) de 1 cm de longitud. Deslice el alambre desde el lado bucal lingualmente en el área interproximal debajo del punto de contacto entre el primer y segundo molar usando un porta agujas microquirúrgicas. Dejar 2 mm de borde libre delante del primer molar para ser roscado en el extremo del resorte.
- Corte un pedazo de bobina de titanio de níquel (NiTi), alrededor de 7 a 9 hilos de longitud.
NOTA: Las propiedades elásticas de la bobina proporcionarán una fuerza constante para el movimiento de ortodoncia. La longitud total no reñida de la bobina debe ser más corta que el espacio entre el incisivo y el molar. Tenga en cuenta que se necesitan 2 hilos adicionales en cada extremo para anclar la bobina al diente. El alambre de aluminio se selecciona para reducir los artefactos de exploración tales como endurecimiento del haz durante la exploración del micro-CT. - Inserte el resorte helicoidal NiTi (0,15 mm de diámetro de alambre, 0,9 mm de diámetro de bobina interior; entrega una fuerza de 10 g) entre el primer molar inferior y el incisivo inferior. Utilice la ligadura del alambre insertada alrededor del primer molar en el paso 1.6, gire el alambre firmemente alrededor de 2 hilos del resorte helicoidal para fijar la bobina en el lado molar.
- Para asegurar un nivel de fuerza uniforme, utilice exactamente 3 hilos activos entre el primer molar y el incisivo. Retire temporalmente la cadena de alimentación del incisivo y coloque de 2 a 3 hilos no ajustados sobre el incisivo para anclar la bobina. Deslice los hilos hacia abajo hasta el margen gingival libre de incisivos.
- Coloque una capa de resina compuesta fluible en el borde incisal de la bobina y cúrtela con luz de curado dental. Substituya la cadena de alimentación después de curar la resina.
- Usando la misma luz de curado, caliente la bobina de NiTi durante 20 s. Esto apretará la bobina de NiTi. La colocación terminada se muestra en la Figura 1C.
- Deje intacto el lado contralateral o inserte una farsa como el alambre entre el primer y segundo molar.
- Coloque el ratón anestesiado bajo una luz calentada para mantenerlo caliente hasta la recuperación.
- Coloque el ratón de nuevo en una jaula individual y monitoree diariamente. No es necesario ningún cambio en la dieta durante el movimiento de ortodoncia.
NOTA: El dispositivo OTM en un lado causa algunas molestias, pero no perjudica la alimentación. Sin embargo, no se recomienda insertar dispositivos en ambos lados debido a la cantidad adicional de molestias. La medicación para el dolor no es necesaria a menos que se vean signos externos de dolor.
2. Exploración micro-CT de fibras pdl en hemi-mandíbulas frescas
- Montaje de la mandíbula hemi (Figura 2)
- Después de la duración deseada del movimiento de ortodoncia, sacrificar el ratón a través de la dislocación cervical. Retire la mandíbula y separe en hemi-mandíbulas.
NOTA: Dado que la muestra no se fijará, es fundamental realizar la disección de la mandíbula y el montaje lo antes posible, idealmente dentro de los 30 min. - Retire suavemente el tejido blando circundante con una toallita limpia sin pelusas.
- Retire el dispositivo de ortodoncia usando tijeras microquirúrgicas y pinzas bajo un microscopio estéreo con al menos 4x de aumento.
- Mantenga la muestra húmeda en un tubo de microcentrifuga de volumen de 1,5 mL junto con una pieza de toallita sin pelusa humedecida con agua.
- Coloque la resina compuesta dental empaquetable en la ranura de muestra en el escenario, luego coloque la mandíbula hemi fresca en el compuesto. Antes de montar, asegúrese de que la superficie ósea en contacto con el compuesto dental esté libre de cualquier tejido blando y seca, de lo contrario el compuesto dental no se curará correctamente.
- Ajuste la posición de la mandíbula hemi hasta que el primer molar esté centrado en el surco de la línea media del escenario. Asegúrese de que la superficie oclusal sea horizontal. Cure el compuesto cuando esté satisfecho con el posicionamiento.
NOTA: Se pueden colocar pequeñas cantidades adicionales de compuestos dentales en los lados de la mandíbula hemi y / o a través del incisivo para ayudar a estabilizar la muestra. - Coloque la toallita húmeda sin pelusas dentro de las piscinas de humedad en la etapa de muestra. Coloque el compuesto dental en la superficie oclusal del primer molar. Antes de cerrar la cámara, asegúrese de que nada bloquee la trayectoria de rayos X a nivel de la muestra.
- Coloque la cámara en el micro-CT. Atornille la cámara en la etapa de muestra de micro-TC para que se minimice el movimiento durante la toma de imágenes.
- Encienda los rayos X y tome imágenes 2D mientras baja el yunque verticalmente, hasta que la punta del yunque esté rodeada por el compuesto pero no se detecte ningún aumento en la fuerza.
- Una vez que el yunque está incrustado en el compuesto, cierre la fuente de rayos X. Luego, abra la cámara micro-CT y cure el compuesto a través de la ventana de plexiglás transparente.
- Después de la duración deseada del movimiento de ortodoncia, sacrificar el ratón a través de la dislocación cervical. Retire la mandíbula y separe en hemi-mandíbulas.
- Configuración de micro-TC
- Ajuste el voltaje de la fuente a 40 kV y la corriente a 200 μA. Utilizando un detector de aumento de 10x, coloque la muestra dentro del marco de visión. Utilice la agrupación de 2 para las imágenes capturadas.
NOTA: Dado que la PDL es significativamente menos densa que el hueso y el diente, la visualización de la PDL requiere mayor potencia y tiempo de exposición. Este protocolo proporcionará la configuración para visualizar la PDL. - Establezca el tiempo de exposición de una sola imagen en 25 s. Establezca la rotación de la etapa de muestra en un rango de 183 grados o más. Establezca el escaneo para 2500 proyecciones. No utilice ningún filtro de fuente de rayos X, las exploraciones resultantes tienen un tamaño de vóxel de 0,76 μm en cada lado.
- Recoja una exploración de la referencia para la reconstrucción apropiada según las pautas del micro-CT. Utilice 1/3 número de imágenes de referencia como proyecciones totales. Reconstruya el volumen sin binning adicional, utilizando un algoritmo filtrado de retroproyección.
- Ajuste el voltaje de la fuente a 40 kV y la corriente a 200 μA. Utilizando un detector de aumento de 10x, coloque la muestra dentro del marco de visión. Utilice la agrupación de 2 para las imágenes capturadas.
3. Método de compensación (Figura 3)
- Prepare cinco tubos de microcentrifugadoras de 1,5 mL.
- Preparar 1,4 mL de las siguientes soluciones en tubos microcentrifugadores de 1,5 mL: paraformadehído al 4% (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), etanol al 50% (EtOH) en agua desionizada (DI), EtOH al 70% en agua DI y dos tubos de EtOH al 100%.
Nota : PFA se utiliza para la fijación de la muestra. La limpieza de ECi también funcionará en muestras no fijadas. Para borrar muestras no fijadas, simplemente omita el paso PFA. - Coloque la hemi-mandíbula disecada en el 4% PFA. Cubrir con papel de aluminio y colocar sobre el balancín en un ajuste suave a temperatura ambiente durante 6 h.
- Mueva la mandíbula hemi al 50% de EtOH. Colóctelo sobre el balancín cubierto de luz durante 16 h.
- Mueva la mandíbula hemi al 70% de EtOH. Colóctelo sobre el balancín cubierto de luz durante 16 h.
- Mueva la mandíbula hemi a 100% EtOH. Colóctelo sobre el balancín cubierto de luz durante 16 h.
- Repetir 3.6. en el segundo tubo 100% EtOH.
- Preparar 5 mL de ECi en un tubo de vidrio o polipropileno.
NOTA: ECi disuelve el poliestireno, pero no el polipropileno. Además, si no se utiliza un tejido con proteínas fluorescentes, la muestra puede exponerse a la luz durante el procedimiento de limpieza. - Mueva la mandíbula hemi al tubo ECi. Cubra el tubo con papel de aluminio y colóquelo sobre el balancín en un ajuste suave durante un mínimo de 12 h.
Nota : el protocolo puede pausarse aquí. La muestra deshidratada se puede almacenar en ECi a temperatura ambiente. El punto de congelación o fusión de ECi es de 6,5 a 8,0 °C. No almacenar a 4 °C. - La mandíbula hemi está lista para la obtención de imágenes con microscopio de fluorescencia.
NOTA: Durante la toma de imágenes, la muestra debe estar sumergida en el ECi para que permanezca ópticamente transparente.
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Representative Results
Este papel presenta un método para producir OTM así como dos métodos para la proyección de imagen 3D de las fibras del colágeno dentro del PDL sin ninguna seccionamiento. Para fines de investigación animal, cuando la alineación de los dientes no es necesaria, un movimiento dental se considera ortodoncia si genera la remodelación del hueso alveolar en todos los niveles de la raíz. Se requiere un nivel de fuerza constante aplicado en los dientes para generar un OTM confiable. Aquí, una bobina de NiTi de memoria de forma activada se utiliza para generar una fuerza constante de 10 g a lo largo del tiempo experimental de 7 días y más allá si se justifica. La activación de la bobina descrita aquí (Figura 1) genera tensión en la bobina de NiTi dentro de la fase martensítica y lleva la bobina al estado de histéresis, lo que entrega tensión constante en el diente. Calentar la bobina con la luz de curado después de la inserción de la bobina también se asegurará de que la aleación cambiará a su forma austenítica y el efecto de memoria de forma tendrá lugar.
Aquí mostramos resultados representativos de 9 semanas de edad, ratones machos. El espacio mesiodial promediado entre las coronas del primer y segundo molar después de 7 días de OTM es de 40 μm medido entre las superficies interproximales de los molares en el micro-CT con aumento 1X (n = 12, st.dev. = 15 μm) (Figura 1E). El espacio promediado de la PDL en la dirección mesiodtal es de 80 μm antes y después de 7 días de OTM (Figura 4B). Esto confirma que el primer molar traducido mesialmente y 7 días es un tiempo adecuado para generar OTM en un modelo de ratón mientras se generan procesos de resorción ósea y aposición en la naturaleza(Figura 4). Los ratones fueron alimentados con una dieta estándar de paletas duras. No se hizo ndo n. cambio de la dieta después de la inserción del dispositivo.
El primer método presentado para visualizar los cambios en el complejo diente-PDL-hueso durante la OTM se basa en la fase mejorada de imágenes micro-CT de tejidos frescos(Figura 4)que se describió en detalle anteriormente9,18,19,20,22,23. En resumen, siempre que una capacidad de mejora de fase de un micro-CT o un sincrotrón, la estabilización mecánica del tejido fibroso y el ambiente humidificado, las fibras colagenosas frescas se pueden visualizar sin ninguna fijación o agentes de contraste. En la PDL las fibras que se ven son las que están conectadas tanto al diente como al hueso, principalmente el colágeno tipo I19. Esta oportunidad única de visualizar en 3D una PDL intacta permite el análisis de la densidad de la fibra 3D, la orientación de las fibras, así como el movimiento 3D del diente como se describió anteriormente9,19. En concreto, aquí presentamos la visualización de la red fibrosa en la PDL. En el tiempo 0, se puede observar remodelación fisiológica tanto en el hueso como en la PDL. La remodelación también ocurre en el cemento celular; sin embargo, esto no está directamente relacionado con el método presentado y, por lo tanto, no se elaborará. La interfaz hueso-PDL es mayormente lisa tanto en los planos transversal(Figura 4A)como sagital(Figura 4B)antes de cualquier aplicación de fuerza. En el plano coronal(Figura 4C),la interfase hueso-PDL es más áspera especialmente hacia la región apical, lo que podría ser indicativo de que el equilibrio de remodelación tiende a la resorción. A los 3 días de OTM(Figura 4D-F),sobre los cuales se mueve mesialmente el primer molar (la dirección está representada por la flecha discontinua), se reduce la densidad de fibras en la PDL (puntas de flecha blancas). La interfaz hueso-PDL es más áspera que en 0 días debido al desarrollo de cráteres en la superficie del hueso que son indicativos de la actividad osteoclástica y los procesos de resorción ósea asociados con principalmente las fuerzas de compresión en el PDL26,sin embargo aquí se ve en las áreas de tensión a los 3 días. La destrucción del tejido en áreas de tensión dentro del PDL fue sugerida27,28 y se puede ver claramente usando este método. El borde áspero se ve en diferentes niveles de las raíces (flechas blancas) y por lo tanto sugiere que el movimiento del diente es de naturaleza traslacional y no solo inclinación de la corona. A los 7 días de OTM(Figura 4G-I),se observan signos de resorción ósea, como cráteres dentro del hueso, bordes rugosos y expansión del espacio PDL, en todos los planos, pero el espacio PDL promediado es más estrecho que a los 3 días de OTM(Figura 4D-F). En algunas áreas sin embargo, la frontera hueso-PDL se ha vuelto más suave después de 7 días de OTM estas áreas se encuentran en las superficies distales de las raíces, que es muy probablemente una indicación para la aposición ósea, como se espera en OTM a la dirección mesial.
Debido al largo tiempo de imagen micro-CT (~ 19 h) y la rotación de la etapa, el montaje de la muestra es esencial para mantener la muestra quieta. La muestra inestable dará lugar a exploraciones borrosas. La Figura 5 presenta cómo se ve la gammagrafía micro-TC cuando la muestra se ha movido durante la exploración. El diente y el hueso son borrosos. Ni las fibras de PDL ni los osteocitos se observan. En tales incidentes hay una silueta presente alrededor del margen de un objeto. En la Figura 5,se pueden observar múltiples contornos de la corona dental (flechas).
Dependiendo del objetivo de la investigación, la resolución y visualización de las fibras PDL pueden sacrificarse en el comercio por un tiempo de exploración más corto cuando solo se desea información sobre los tejidos duros.
Un método complementario para la visualización 3D de las fibras PDL sin ningún tipo de seccionamiento es a través de microscopía óptica en muestras ópticamente despejadas utilizando ECi (Figura 3). Este método se puede utilizar en un espécimen sin fijación y preserva las señales fluorescentes que existen en el tejido antes de la limpieza. Las hemi-mandíbulas antes y después de la limpieza de ECi se muestran en las Figuras 3B y 3C. El claro adecuado de la muestra del PDL se puede confirmar cuando un papel de rejilla se puede ver a través del ramus de la mandíbula. La cantidad de desbroce se puede ajustar alargando el proceso de deshidratación. La Figura 6 muestra la segunda señal de generación armónica (SHG) de fibras de colágeno tanto en el hueso alveolar como en la PDL en una mandíbula despejada. La proyección de imagen de las fibras del colágeno del hueso en 3D es un proceso complicado, que utiliza a menudo métodos de la microscopia electrónica tales como FIB/SEM. Sin embargo, utilizando el método de claro basado en ECi y SHG, las fibras óseas alveolares se ven claramente, especialmente en la dirección horizontal. Al traducir a través de la muestra profundamente en el PDL de la superficie del hueso, la transición al nivel de la fibra de PDL es muy clara pues las fibras cambian repentinamente su orientación a una vertical.
La microscopia de la hoja de luz se puede también utilizar para las proteínas fluorescentes de la proyección de imagen a través del hueso. En este caso de una muestra despejada de un Flk1-cretransgénico ; Tdtomato ratón19,29,30,las células endoteliales fluorescentes que recubren los vasos sanguíneos se observan claramente(Figura 7A,B, C, E). El despeje adecuado es clave para generar imágenes inteligibles con microscopía de hojas de luz. Cuando el hueso no está completamente despejado, no se observaron vasos sanguíneos dentro de la PDL(Figura 7D,F).
Figura 1:Configuración de inserción de aparatos de ortodoncia. A. Cama de ratón hecha de laboratorio para apoyar al animal y mantener la boca abierta. La plataforma de plástico (PP) para el cuerpo está en una inclinación de 30 ° y el reposacabezas (HR) está en un ángulo de 45 ° de la superficie de PP. Un soporte de tubo de 2 niveles (TS) se utiliza para elevar la cabeza final de PP. El bucle de clip de papel (flecha negra) ancla los incisivos superiores, y la cadena de potencia de ortodoncia inferior (flecha blanca) se engancha a los incisivos inferiores. El espejo de inspección de 5 mm de diámetro se utilizó para la inspección visual de las muelas. B. Vista lateral de la cama del ratón. Los ángulos entre superficies están marcados (verde y magenta). C. Imagen representativa del dispositivo colocado correctamente. D. Molares vistos a través del espejo de inspección antes de la implantación del dispositivo. E. Imagen representativa de los molares después del movimiento de ortodoncia. Las líneas discontinuas trazan el contorno del primer y segundo molar. F. Diagrama del dispositivo y su colocación. La línea roja representa la ligadura del alambre alrededor de la primera muela. La línea naranja representa la resina compuesta fluible utilizada para anclar la bobina. La bobina de NiTi se muestra en azul y etiquetada. G. Hemi-mandíbula disecada con el dispositivo atado después del movimiento ortodóntico de 7 días. Observe cómo las 3 roscas de la bobina todavía están abiertas, lo que indica que la bobina sigue activa después de 7 días. Barra de escala = 1 mm en E y G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:Mandíbula hemi montada en una cámara hecha a medida para imágenes micro-CT. A. Configuración completa de la cámara de muestra dentro de la máquina micro-CT. La fuente de rayos X se ve a la izquierda y el detector a la derecha. El rectángulo rojo delinea la mandíbula hemi montada en la cámara en la etapa de muestra (SS). La cámara de ejemplo que se muestra aquí es parte de una configuración de prueba mecánica, que incluye motor (M), yunque (A, delineado por líneas discontinuas blancas) y eje de yunque (AS) encima de la cámara. La configuración completa está atornillada en la etapa de TC. La imagen insertada muestra un primer plano de la región roja delineada, que contiene la cámara de humedad con la muestra en el interior. B. Vista superior de la muestra montada en la etapa de muestra. Las piscinas de humedad (flecha gris) están integradas en el perímetro para mantener la humedad durante las imágenes. En el escenario circular en el centro, la mandíbula hemi se puede montar en el surco profundo inclinado (flecha negra). Una ranura delgada (flecha blanca) marca la línea media del escenario para ayudar a orientar la muestra. C. Diagrama de la etapa circular con la ranura de muestra. La inclinación de la ranura soporta la mandíbula y permite que los molares se monten a lo largo del eje vertical de las raíces. D. Rebanada 2D micro-CT representativa combinada con una imagen de volumen 3D de la muestra de mandíbula hemi. La brecha interproximal aquí es de 52 μm. La muestra se monta en la etapa de muestra a continuación (no se muestra) y el yunque (A) en la parte superior por compuesto dental (DC). Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Método de claro basado en ECi para hemi-mandíbulas de ratón disecadas. A. La mandíbula hesecada se sumerge en 4% de PFA, 50% de EtOH, 70% de EtOH y 100% de EtOH de forma consecutiva. Después de la deshidratación, la mandíbula hemi se almacena en ECi durante un mínimo de 12 h hasta la obtención de imágenes. B. Hemi-mandíbula inmediatamente después de la disección. C. Hemi-mandíbula después de la terminación del claro. Barras de escala = 5 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Micro-TC in situ representativas de la PDL de una muestra fresca en las diferentes etapas del movimiento de ortodoncia. A-C, Sin movimiento de ortodoncia. A. Imagen 2D de Micro-CT en el plano transversal de la mandíbula hemi que muestra las raíces mesiales (M) y distales (D) dentro del hueso alveolar, B-Bucal, L-Lingual lados del hueso alveolar. Entre las raíces de los dientes y el hueso alveolar, el espacio pdl y las fibras dentro de él se observan claramente. B. Imagen 2D en el plano sagital. C. Imagen 2D en el plano coronal. D-E, imágenes 2D después de 3 días de OTM, puntas de flecha apuntan a áreas en el PDL con reducción en la densidad de fibras de colágeno, flechas blancas apuntan a áreas de resorción ósea. G-I, imágenes 2D después de 7 días de OTM, flechas negras apuntan a regiones de aposición ósea. Barras de escala = 150 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:Imagen micro-CT 2D en el plano sagital, que muestra estructuras borrosas tanto del diente como del hueso debido al movimiento del diente durante la exploración. Las flechas apuntan a múltiples líneas de tablero del diente, lo que indica su movimiento. Barra de escala 150 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6:ECi despejó la mandíbula que muestra el primer molar fotoizado con la segunda generación armónica (SHG). La flecha blanca apunta en una región donde se ven las fibras del colágeno del PDL, observe la orientación vertical, las flechas negras señalan en una región donde se ven las fibras verticales del PDL así como las fibras horizontales del hueso alveolar. Diente en T, F-furcación, hueso AB-alveolar, raíz MR-mesial, raíz DR-Distal, barra de escamas 150 μm. Las imágenes se obtuvieron utilizando una lente multiinmersiones 20X para soluciones con RI de 1,33-1,56. El láser de excitación se fijó en 860nm al 10% de potencia. Tiempo de permanencia de píxeles: 0,51μs; Modo de escaneo: marco; Promedio: 16; Tipo de detector: detector de tubo fotomultiplicador no descender; Ganancia del detector 800V. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Lightsheet microscope images of ECi-cleared Flk1-Cre;tdTomato mouse. A. Hemi-mandíbula óptimamente despejada del control. La red de vasos sanguíneos dentro del hueso (cabeza de flecha) y el espacio PDL (flecha) es visible. B. recuadro de la región mesiolingüe de la primera muela (rojo delineado en A) muestra los vasos sanguíneos. C. despejó óptimo la hemi-mandíbula y D de OTM de 7 días. hemi-mandíbula subóptimamente despejada. E. Imagen 2D del panel C en el plano sagital, la imagen muestra vasos sanguíneos bien definidos en hueso (flecha gris) y espacio PDL (flechas blancas). F. Imagen de división bidimensional del panel D, misma región que las imágenes en E, lo que resulta en una imagen borrosa. Barras de escala A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm Las imágenes se tomaron con un objetivo de plan 5X, utilizando la cámara como detector. El laser de la excitación era 561 nanómetro en la energía del 4%. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
La generación de OTM en ratones es muy deseada debido al tamaño, la genética y las ventajas de manejo. El uso de la mandíbula proporciona un fácil manejo tanto en términos de disección de tejidos como de preparación de muestras e imágenes. Aquí presentamos un método para generar OTM con el movimiento de traslación del diente dentro del hueso en el plazo de 7 días de OTM. Usando este protocolo, la duración total del movimiento del diente se puede extender, ya que la bobina activada entrega un nivel de fuerza constante para el movimiento de hasta aproximadamente 1 mm. Sin embargo, el lado mesial de la bobina se fija al incisivo, que está en erupción constante. Como resultado, los vectores de fuerza se alterarán gradualmente y comenzarán a generar fuerzas de extrusión. Esto se puede evitar si el ajuste del nivel de fijación en el extremo mesial se realiza cada 7 días.
La PDL es el iniciador de la OTM, por lo que la comprensión de su estructura y función durante las diferentes etapas de la OTM es de gran importancia. Sin embargo, la PDL no es uniforme tanto en su estructura como en su función19,22,31,32. Como resultado, con el fin de recuperar datos significativos, la PDL debe estudiarse en 3D y cualquier seccionamiento y manipulación de tejidos debe evitarse tanto como sea posible. Sin embargo, la investigación de un tejido blando situado entre dos tejidos duros hace que tales requisitos sean difíciles de cumplir. Los métodos tradicionales de estudio de la PDL a menudo implican comprometer la estructura 3D y eliminar el tejido de su entorno fisiológico, lo que en consecuencia altera las propiedades estructurales y biomecánicas de la PDL. Tanto las propiedades estructurales como las biomecánicas sufren cambios dinámicos durante la OTM que justifican la preservación del contexto 3D tisular aún más. Para ello se describen dos métodos que permiten la obtención de imágenes de tejido entero sin seccionamiento, que también se pueden utilizar en la misma muestra de co-localización de señales fluorescentes, datos morfológicos y de mineralización.
La descripción metodológica proporcionada dirige a los lectores a aplicar los métodos en sus campos de estudio. La proyección de imagen del micro-CT permite la visualización 3D de la red fibrosa de PDL. Las imágenes se pueden analizar para producir análisis de direccionalidad y densidad e investigar cuantitativamente los cambios en la PDL durante la OTM. También describimos un método del claro que permita la visualización con métodos microscópicos ópticos fácilmente disponibles tales como microscopia de la hoja de luz y proyección de imagen confocal. La microscopía de hojas de luz tiene la ventaja de producir una imagen 3D de especímenes grandes con una velocidad de imagen relativamente rápida. La microscopía confocal permite la visualización 3D de alta resolución utilizando la señal SHG para imágenes de fibras de colágeno y etiquetas fluorescentes. Estos métodos de forma independiente o combinada abren muchas posibilidades a los estudios estructurales 3D con una preparación mínima de tejidos.
Varios pasos desafiantes en este protocolo requieren atención adicional:
En primer lugar, durante la colocación de la bobina, el alambre de ligadura debe colocarse de forma segura entre el primer y el segundo molar. Este proceso es un desafío debido a las pequeñas dimensiones de los dientes de ratón. Recomendamos el uso de estereomicroscopio de sobremesa para guiar la colocación. Sin embargo, pequeños movimientos durante el procedimiento pueden mover el ratón y hacer que la región de interés salga del campo de visión. Como alternativa, sugerimos usar lupas de aumento de 4-5x que se pueden usar en el operador, lo que podría ayudar a ver el área de manera más dinámica.
En segundo lugar, los resultados de la limpieza dependen del proceso de deshidratación. Si la muestra no ha alcanzado el nivel de transparencia deseado, nuestra sugerencia es aumentar el tiempo de deshidratación. Más específicamente, se ha demostrado que un tiempo de inmersión más largo en EtOH al 100% mejora la transparencia del producto final. Sin embargo, cabe señalar que el aumento del nivel de deshidratación puede reducir drásticamente los niveles de fluorescencia24,25. Se demostró que el método basado en ECi presentado preserva las señales fluorescentes durante más de 2 semanas24.
Los aspectos de este protocolo se pueden modificar para estudiar una multitud de otros propósitos. La cámara que diseñamos dentro de la micro-TC está acoplada con una célula de carga y un motor y tiene la capacidad de realizar pruebas de tensión / compresión en las muestras de mandíbula hemi. Combinado con la visualización del micro-CT, esta configuración puede mostrar cambios en la PDL in situ con cargas mecánicas variables21. El método de compensación descrito también podría implementarse en muestras no fijadas, lo que proporciona una oportunidad para una combinación interesante de varias modalidades de imágenes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). Nos gustaría agradecer al Centro de Imágenes Biológicas de Harvard por su infraestructura y apoyo. Todas las cifras se generan con biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, suppl 1 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. dA., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
