Summary
Vi presenterar ett protokoll för att generera tandreglering tand rörlighet hos möss och metoder för 3D visualisering av kollagen fibrer och blodkärl av parodontala ligament utan sektionering.
Abstract
Tandreglering tandrörelse är en komplex biologisk process av förändrad mjuk och hård vävnadsrenovering som ett resultat av yttre krafter. För att förstå dessa komplexa ombyggnadsprocesser är det viktigt att studera tand- och parodontala vävnader i deras 3D-sammanhang och därför minimera eventuella sektionerings- och vävnadsföremål. Musmodeller används ofta i utvecklings- och strukturbiologi, liksom i biomekanik på grund av deras lilla storlek, höga ämnesomsättning, genetik och enkel hantering. I princip gör detta dem också utmärkta modeller för tandrelaterade studier. Ett stort hinder är dock deras lilla tandstorlek, molarerna i synnerhet. Detta papper syftar till att tillhandahålla ett steg för steg protokoll för att generera tandreglering tandrörelse och två metoder för 3D imaging av parodontala ligament fibrös komponenten i en mus mandibular molar. Den första metoden som presenteras är baserad på en mikro-CT-installation som möjliggör fasförstoring av färska kollagenvävnader. Den andra metoden är en benrensningsmetod med etylcinnamat som möjliggör avbildning genom benet utan att dela upp och bevarar endogen fluorescens. Kombinera denna clearingmetod med reportermöss som Flk1-Cre; TdTomato gav en första av sitt slag möjlighet att avbilda 3D vaskulaturen i PDL och alveolar ben.
Introduction
Den grundläggande underliggande biologiska processen i tandreglering tand rörelse (OTM) är ben ombyggnad. Utlösaren för denna ombyggnadsprocess tillskrivs förändringar i strukturen hos parodontala ligament (PDL) såsom extracellulär matris (ECM) stress, nekros samt blodkärl förstörelse och bildandet1,2,3. Andra möjliga utlösare för alveolär benombyggnad är relaterade till kraftavkänning av osteocyter i benet, liksom mekanisk deformation av själva alveolära benet; men deras roll i OTM är fortfarande inte helt klarlagd4,5.
Trots många studier som syftar till att avslöja struktur-funktion relationer av PDL under OTM, en tydlig funktionell mekanism är ännu inte definierad6,7. Den främsta orsaken till detta är utmaningen att hämta data från en mjukvävnad (PDL) som ligger mellan två hårda vävnader (cementum och alveolar ben). De accepterade metoderna för att samla in strukturell information kräver vanligtvis fixering och sektionering som stör och ändrar PDL-strukturen. Dessutom ger de flesta av dessa metoder 2D-data som även om de inte förvrängs, bara ger partiell och lokaliserad information. Eftersom PDL inte är enhetlig i sin struktur och funktion, är ett tillvägagångssätt som adresserar den intakta 3D-strukturen hos hela tand-PDL-benkomplexet motiverat.
Detta papper kommer att beskriva en metod för att generera en OTM hos möss och två metoder som möjliggör 3D-visualisering av kollagenfibrerna i PDL utan någon sektionering av provet.
Murinmodeller används ofta för in vivo-experiment inom medicin, utvecklingsbiologi, läkemedelsleverans och strukturella studier. De kan modifieras genetiskt för att eliminera eller förbättra specifika proteiner och funktion. De ger snabb, repeterbar och förutsägbar utvecklingsstyrning. de är också lätta att avbilda på grund av deras lilla storlek8. Trots sina många fördelar används musmodeller i tandforskning inte ofta, särskilt när kliniska manipuleringar är motiverade, främst på grund av de små tänderna. Djurmodeller som råttor9,10,11,hundar12,13,grisar14,15,16 ochapor 17 används oftare än möss. Med den senaste utvecklingen av högupplösta bildtekniker är fördelarna med att använda en musmodell för att dechiffrera de invecklade processerna i OTM många. Detta papper presenterar en metod för att generera en mesial rörelse av molar tand i underdible med konstant kraft nivåer som utlöser ben ombyggnad. De flesta AV OTM-experimenten hos gnagare görs i maxillan, eftersom underkäkens rörlighet och närvaron av tungan lägger till en annan komplexitetsnivå. Underdiblen har dock många fördelar när 3D strukturell integritet önskas. Det kan lätt dissekeras som ett helt ben; i vissa arter kan det delas in i två hemi-mandibles genom fibrös symphysis; den är kompakt, platt och innehåller endast tänderna utan sinusutrymmen. Däremot är maxillan en del av skallen och nära besläktade med andra organ och strukturer, vilket innebär att omfattande sektionering behövs för att dissekera det alveolära benet med tillhörande tänder.
Med hjälp av en in house fuktighetskammare i kombination med ett lastningssystem inuti en högupplöst mikro-CT som möjliggör fasförbättring, utvecklade vi en metod för att visualisera färska fibrösa vävnader i 3D som tidigarebeskrivits 9,18,19,20,21,22,23. Färska vävnader skannas omedelbart efter att djuret offras utan färgning eller fixering, vilket minskar vävnadsartefakter samt förändringar av biomekaniska egenskaper. Dessa 3D-data kan användas för distributions- och riktningsanalyser av fibrerna enligt beskrivningen på annat håll19.
Den andra 3D-metoden för helvävnadsavbildning som presenteras här är baserad på optisk rensning av underdiblen som möjliggör avbildning av PDL-fibrerna genom benet utan någon sektionering. Intressant nog möjliggör det också visualisering av själva benets kollagenfibrer, men detta kommer inte att diskuteras här. I allmänhet finns det två metoder för vävnadsrensning. Den första är vattenbaserad röjning där provet är nedsänkt i en vattenlösning med ett brytningsindex som är större än 1,4 antingen genom en enkel nedsänkning, hyperhydrering eller hydrogelinbäddning. Denna metod är dock begränsad i graden av öppenhet samt det strukturella bevarandet av vävnaden och kräver därför fixering av vävnaden. Den andra metoden som ger mycket transparenta prover och inte kräver fixering är den lösningsmedelsbaserade clearingmetoden24,25. Vi genererade en modifierad lösningsmedelsbaserad clearingmetod baserad på etyl-3-fenylprop-2-enoat (etylcinnamat, ECi) för mandibularproverna. Denna metod har fördelarna med att använda giftfritt livsmedelskvalitets clearingmedel, minimal vävnadskrymp och bevarande av fluorescerande proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med NIH:s riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur och riktlinjer från Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll nr 01840).
1. Tandreglering av ortodontiska
- För att generera en mussäng, använd en platt plastplattform med ett kilformat, 45° vinklat nackstöd. Nackstödet kan genereras genom att skära en plastlåda.
- Lyft plattformens huvudände för att generera en cirka 30° vinkel mellan nackstödet och bordsplanet. Fäst ett böjt tjockt gem (0,036" i diameter) på huvudsidans ände för att hålla de övre snedställningarna.
- På svansänden, generera en förhöjd yta till vilken en tandregleringskraftkedja kan fästas för att hålla de nedre snedställningarna. Se bild 1 för en exempelplattform.
- Söv musen genom intraperitoneal injektion av xylazin vid 10 mg/kg och ketamin 100 mg/kg med 1 ml spruta och en 27 gauge nål.
- Placera sövd mus på specialtillverkad plattform och immobilisera överkäken genom att haka fast de övre snedställningarna på gemslingan. Öppna musens underkäke med tandregleringskraftkedjan fast på de nedre snedställningarna. Håll kinderna indragna med mini-colibri mun upprullningsdonet.
- Placera plattformen under ett kirurgiskt mikroskop eller något annat stereoskop som kan nå 5-6x förstoring.
- Applicera 50 μL saltlösning (ungefär 1 droppe) på musögonen för att förhindra hornhinnans uttorkning. Fyll på saltlösning var 20:e minut.
- Skär en bit av en aluminiumtråd (0,08 mm diameter) 1 cm lång. Skjut tråden från buccalsidan lingually i det interproximala området bälga kontaktpunkten mellan första och andra molarer med hjälp av en mikrokirurgisk nålhållare. Lämna 2 mm fri kant framför den första molaren för att gängas in i fjäderänden.
- Skär en bit nickeltitan (NiTi) spole, cirka 7 till 9 trådar i längd.
OBS: Spolets elastiska egenskaper ger konstant kraft för tandreglering. Den totala obegränsade längden på spolen bör vara kortare än gapet mellan framtänden och molaren. Tänk på att det behövs ytterligare 2 trådar i varje ände för att förankra spolen i tanden. Aluminiumtråd väljs för att minska skanningsföremål som strålhärdning under mikro-CT-skanningen. - Sätt in NiTi-spolefjädern (0,15 mm tråddiameter, 0,9 mm innerspoldiameter; ger en kraft på 10 g) mellan nedre första molar och nedre snedställningar. Använd trådligturen som sätts in runt den första molaren i steg 1.6, vrid tråden tätt runt 2 trådar på spolfjädern för att fixa spolen på molarsidan.
- För att säkerställa jämn kraftnivå, använd exakt 3 aktiva trådar mellan den första molaren och framtänden. Ta tillfälligt bort strömkedjan från framtänden och slingan 2 till 3 ohämmade gängor över framtänden för att förankra spolen. Skjut trådarna ner till den framtandsfria gingivalmarginalen.
- Placera ett lager av flödesbart kompositharts på spolens snittkant och härda det med tandhärdande ljus. Byt ut kraftkedjan efter härdning av hartset.
- Använd samma härdningslampa, värm upp NiTi-spolen i 20 s. Detta kommer att dra åt NiTi-spolen. Den färdiga placeringen visas bild 1C.
- Lämna antingen kontralateralsidan intakt eller sätt in en bluff som tråden mellan den första och andra molars.
- Placera den bedövade musen under ett uppvärmt ljus för att hålla musen varm tills den återhämtar sig.
- Placera musen tillbaka i en enskild bur och övervaka dagligen. Ingen kost förändring är nödvändig under tandreglering.
OBS: OTM-enheten på ena sidan orsakar viss obehag men försämrar inte utfodringen. Att sätta in enheter på båda sidor rekommenderas dock inte på grund av den extra mängden obehag. Smärtstillande läkemedel är inte nödvändigt om inte yttre tecken på smärta ses.
2. Mikro-CT skanning av PDL fibrer i färska hemi-mandibles
- Montering av hemimandible (Figur 2)
- Efter önskad varaktighet av tandregleringsrörelsen, offra musen via massundersökning förskjutning. Ta bort underdiblen och separera i hemi-mandibles.
OBS: Eftersom provet inte kommer att fixeras är det viktigt att utföra dissekeringen av käken och monteringen så snart som möjligt, helst inom 30 minuter. - Ta försiktigt bort den omgivande mjukvävnaden med en ren luddfri våtservett.
- Ta bort tandregleringsanordningen med hjälp av mikrokirurgisk sax och pincett under ett stereomikroskop med minst 4x förstoring.
- Håll provet fuktigt i en volym på 1,5 ml, mikrocentrifugrör tillsammans med en bit luddfri våtservett fuktad med vatten.
- Placera förpackningsbart dentalt kompositharts i provplatsen på scenen och placera sedan den färska hemi-mandiblen i kompositen. Innan montering se till att benytan i kontakt med tandkompositen är fri från mjuka vävnader och torr, annars kommer tandkomposit inte att härda ordentligt.
- Justera hemi-mandibles position tills den första molaren är centrerad vid mitten av scenen. Kontrollera att ocklusalytan är horisontell. Härda kompositen när den är nöjd med positionering.
OBS: Ytterligare små mängder tandkompositer kan placeras på sidorna av hemi-mandible och/eller över framtänder för att underlätta stabiliseringen av provet. - Placera fuktad luddfri våtservett inuti fuktpoolerna i provstadiet. Placera dental komposit på den ocklusala ytan av den första molaren. Innan du stänger kammaren, se till att inget blockerar röntgenvägen på provnivå.
- Fäst kammaren i mikro-CT. Skruva in kammaren i mikro-CT-provstadiet så att rörelsen under avbildningen minimeras.
- Slå på röntgenstrålarna och ta 2D-bilder medan du sänker städet vertikalt tills städspetsen är omgiven av kompositen men ingen ökning av kraften detekteras.
- När städet är inbäddat i kompositen stänger du röntgenkällan. Öppna sedan mikro-CT-kammaren och härda kompositen genom det klara plexiglasfönstret.
- Efter önskad varaktighet av tandregleringsrörelsen, offra musen via massundersökning förskjutning. Ta bort underdiblen och separera i hemi-mandibles.
- Inställningar för mikro-CT
- Ställ in källspänningen på 40 kV och ström till 200 μA. Använd en 10x förstoringsdetektor och placera provet inom synramen. Använd binning av 2 för de tagna bilderna.
OBS: Eftersom PDL är betydligt mindre tät än ben och tand kräver visualisering av PDL högre effekt och exponeringstid. Det här protokollet innehåller inställningar för visualisering av PDL. - Ställ in exponeringstiden för enstaka bilder på 25 s. Ställ in rotationen av provsteget till ett intervall på 183 grader eller mer. Ställ in skanningen för 2500 projektioner. Använd inget röntgenfilter, de resulterande skanningarna har en voxelstorlek på 0,76 μm på varje sida.
- Samla in en referenssökning för korrekt rekonstruktion enligt mikro-CT-riktlinjerna. Använd 1/3 antal referensbilder som de totala projektionerna. Rekonstruera volymen utan ytterligare binning med hjälp av en bakåtprojektionsfiltreringsalgoritm.
- Ställ in källspänningen på 40 kV och ström till 200 μA. Använd en 10x förstoringsdetektor och placera provet inom synramen. Använd binning av 2 för de tagna bilderna.
3. Clearingmetod (figur 3)
- Förbered fem 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Bered 1,4 ml av följande lösningar i 1,5 ml mikrocentrifugrör: 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 50% etanol (EtOH) i avjoniserat (DI) vatten, 70% EtOH i DI-vatten och två rör på 100% EtOH.
OBS: PFA används för fixering av provet. ECi-clearing fungerar också på ofixerade prover. Om du vill ta bort ej fästa prover hoppar du helt enkelt över PFA-steget. - Placera dissekerad hemi-mandible i 4% PFA. Täck med aluminiumfolie och placera på vippen på skonsam inställning vid rumstemperatur i 6 h.
- Flytta hemi-mandible till 50% EtOH. Placera den på vippen täckt från ljus i 16 timmar.
- Flytta hemi-mandible till 70% EtOH. Placera den på vippen täckt från ljus i 16 timmar.
- Flytta hemi-mandible till 100% EtOH. Placera den på vippen täckt från ljus i 16 timmar.
- Upprepa 3.6. i det andra 100% EtOH-röret.
- Förbered 5 ml ECi i ett glas- eller polypropylenrör.
OBS: ECi löser upp polystyren, men inte polypropylen. Om du inte använder en vävnad med fluorescerande proteiner kan provet också utsättas för ljus under röjningsproceduren. - Flytta hemi-mandiblen till ECi-röret. Täck röret med aluminiumfolie och placera på vippen på mild inställning i minst 12 timmar.
Protokollet kan pausas här. Uttorkat prov kan förvaras i ECi vid rumstemperatur. ECi:s frys- eller smältpunkt är 6,5–8,0 °C. Förvara den inte vid 4 °C. - Hemi-mandiblen är klar för avbildning med fluorescensmikroskop.
OBS: Under avbildningen måste provet nedsänkas i ECi för att förbli optiskt genomskinligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta dokument presenterar en metod för att producera OTM samt två metoder för 3D-avbildning av kollagenfibrer inuti PDL utan någon sektionering. För djurforskningsändamål, när anpassning av tänderna inte är nödvändig, anses en tandrörelse tandreglering tandreglering om den genererar ombyggnad av det alveolära benet på alla rotnivåer. Konstant kraftnivå som appliceras på tänder krävs för att generera en pålitlig OTM. Här används en aktiverad formminne NiTi-spole för att generera en konsekvent kraft på 10 g under hela försökstiden på 7 dagar och därefter om det är motiverat. Den spoleaktivering som beskrivs här (Figur 1) genererar belastning i NiTi-spolen i martensitisk fas och för spolen till hysterestillståndet, vilket ger konstant stress på tanden. Uppvärmning av spolen med härdningsljuset efter att spolen har förts in ser också till att legeringen övergår till sin austenitiska form och formminneseffekten kommer att äga rum.
Här visar vi representativa resultat från 9 veckor gamla, manliga möss. Det genomsnittliga mesiodistala utrymmet mellan kronan på den första och andra molars efter 7 dagar av OTM är 40 μm mätt mellan molars interproximala ytor i mikro-CT med 1X förstoring (n =12, st.dev. = 15 μm) (figur 1E). PDL:s genomsnittliga utrymme i mesiodisktal riktning är 80 μm före och efter 7 dagars OTM (Figur 4B). Detta bekräftar att den första molar översatt mesially och 7 dagar är en lämplig tid för att generera OTM i en mus modell samtidigt generera processer av ben resorption och apposition i naturen (Figur 4). Möss matades med en vanlig hård palldiet. Ingen koständring gjordes efter enheten insättning.
Den första metoden som presenteras för att visualisera förändringarna i tand-PDL-benkomplexet under OTM är baserad på fasförbättrad mikro-CT-avbildning av färskavävnader( figur 4 ) som beskrevs i detaljtidigare 9,18,19,20,22,23. Kort sagt, förutsatt en fas förbättring kapacitet antingen en mikro-CT eller en synkrotron, mekanisk stabilisering av fibrösa vävnad och fuktad miljö, färska kollagen fibrer kan visualiseras utan någon fixering eller kontrasterande medel. I PDL är fibrerna som ses de som är anslutna till både tanden och benet, främst typ I kollagen19. Denna unika möjlighet att visualisera i 3D möjliggör en intakt PDL analys av 3D-fibertäthet, fiberorientering samt tandens 3D-rörelse som tidigare beskrivits9,19. Specifikt presenterar vi visualiseringen av det fibrösa nätverket i PDL. Vid tidpunkt 0 kan fysiologisk ombyggnad i både benet och PDL observeras. Ombyggnad sker också i cellulär cementum; Detta är dock inte direkt relaterat till den presenterade metoden och kommer därför inte att utarbetas. Ben-PDL-gränssnittet är mestadels smidigt både i de tvärgående (figur 4A) och sagittala (figur 4B) plan före någon kraftapplikation. I koronalplanet (Figur 4C) är ben-PDL-gränssnittet grövre, särskilt mot den apatiska regionen som kan tyda på att ombyggnadsbalansen tenderar mot resorption. Vid 3 dagars OTM (Figur 4D-F), på vilken den första molaren flyttas mesiellt (riktning representeras av den streckade pilen), reduceras fibertätheten i PDL (vita pilhuvuden). Ben-PDL gränssnittet är grövre än vid 0 dagar på grund av utveckling av kratrar i benytan som är vägledande för osteoklastisk aktivitet och benresorptionsprocesser i samband med främst kompressionskrafter i PDL26, men här ses i spänningsområden vid 3 dagar. Vävnad förstörelse i spänningsområden inom PDL föreslogs27,28 och kan tydligt ses med denna metod. Den grova gränsen ses på olika nivåer av rötterna (vita pilar) och föreslår därför att tandrörelsen är translationell till sin natur och inte bara tippar kronan. Vid 7 dagars OTM (Figur 4G-I), benresorptionsskyltar, såsom kratrar i benet, grova gränser och expansion av PDL-utrymmet, ses på alla plan men det genomsnittliga PDL-utrymmet är smalare än vid 3 dagar av OTM (Figur 4D-F). I vissa områden har dock ben-PDL gränsen blivit jämnare efter 7dagar av OTM dessa områden ligger vid de distala ytorna av rötterna, vilket sannolikt är en indikation för ben apposition, som förväntat i OTM till mesial riktning.
På grund av den långa mikro-CT-avbildningstiden (~ 19 h) och scenens rotation är montering av provet avgörande för att hålla provet stilla. Instabilt prov resulterar i suddiga skanningar. I bild 5 presenteras hur mikro-CT-skanningen ser ut när provet har flyttats under skanningen. Tanden och benet är suddiga. Varken PDL-fibrer eller osteocyter observeras. I sådana incidenter finns det en silhuett närvarande runt marginalen på ett objekt. I figur 5kan flera konturer av tandkronan observeras (pilar).
Beroende på forskningsmålet kan upplösningen och visualiseringen av PDL-fibrerna offras i handeln under kortare skanningstid när endast information om de hårda vävnaderna önskas.
En kompletterande metod för 3D-visualisering av PDL-fibrerna utan sektionering är via optisk mikroskopi på optiskt rensade prover med hjälp av ECi (figur 3). Denna metod kan användas på ett prov utan fixering och bevarar fluorescerande signaler som finns i vävnaden före röjning. Hemi-mandibles före och efter ECi-röjning visas i figur 3B och 3C. Adekvat provrensning av PDL kan bekräftas när ett rutnätspapper kan ses genom underdibleens ramus. Mängden clearing kan justeras genom förlängning av uttorkningsprocessen. Figur 6 visar den andra harmoniska generationens (SHG) signal från kollagenfibrer i både alveolärt ben och PDL i en rensad underdible. Att avbilda kollagenfibrerna i benet i 3D är en komplicerad process, som ofta använder elektronmikroskopimetoder som FIB/SEM. Men med hjälp av den ECi-baserade clearingmetoden och SHG ses de alveolära benfibrerna tydligt, särskilt i horisontell riktning. När man översätter genom provet djupt in i PDL från benytan är övergången till PDL-fibernivån mycket tydlig eftersom fibrerna plötsligt ändrar sin orientering till en vertikal.
Ljusbladsmikroskopi kan också användas för avbildning av fluorescerande proteiner genom benet. I detta fall av ett rensat prov från en transgen Flk1-cre; Tdtomato mus19,29,30, de fluorescerande endotelcellerna som fodrar blodkärlen är tydligt observerade(Figur 7A,B, C, E). Korrekt röjning är nyckeln till att generera begripliga bilder med ljusbladmikroskopi. När benet inte är helt rensat observerades inte blodkärlen i PDL (figur 7D, F).
Bild 1:Infogning av ortodontiska apparater. A. Mussäng gjord av labbförsörjning för att stödja djuret och hålla munnen öppen. Plastplattform (PP) för kroppen är på en 30° lutning och nackstödet (HR) är i 45° vinkel från PP:s yta. Ett 2-tiered rörstativ (TS) används för att höja PP: s ändhuvud. Gemslingan (svart pil) förankrar de övre snedställningarna och den nedre tandregleringskraftkedjan (vit pil) hakar på de nedre snedställningarna. 5 mm diameter inspektion spegel användes för visuell inspektion av molars. B. Jag är inte så bra på Sidovy av mussängen. Vinklar mellan ytor är markerade (grön och magenta). C. Representativ bild av den korrekt placerade enheten. D. Jag är inte så bra på Molars ses genom inspektionsspegeln före enhetens implantation. E. Representativ bild av molarer efter tandregleringen. Streckade linjer spårar konturen av den första och andra molars. F. F. Diagram över enheten och dess placering. Röd linje representerar tråd ligaturen runt första molar. Orange linje representerar flödesbart kompositharts som används för att förankra spolen. NiTi-spolen visas i blått och märkt. G. Dissekerad hemi-mandible med enheten bifogas efter 7-dagars tandreglering. Observera hur de 3 spoletrådarna fortfarande är öppna, vilket indikerar att spolen fortfarande är aktiv efter 7 dagar. Skalstreck = 1 mm i E och G. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:Hemimandible monterad i en specialtillverkad kammare för mikro-CT-avbildning. A. Fullständig uppsättning av provkammaren i mikro-CT-maskinen. Röntgenkällan ses till vänster och detektorn till höger. Röd rektangel beskriver hemimandiblen monterad i kammaren på provscenen (SS). Exempelkammaren som visas här är en del av en mekanisk provningsuppsättning, inklusive motor (M), städ (A, skisserad av vita streckade linjer) och städaxel (AS) ovanpå kammaren. Hela uppsättningen skruvas fast på CT-scenen. Inset-bilden visar närbild av det röda konturerade området, som innehåller fuktighetskammaren med prov inuti. B. Jag är inte så bra på Överst på provet monterat på provsteget. Fuktighetspooler (grå pil) är inbyggda på omkretsen för att bibehålla luftfuktigheten under avbildningen. På den cirkulära scenen i mitten kan hemi-mandible monteras i det sneda djupa spåret (svart pil). Ett tunt spår (vit pil) markerar scenens mittlinje för att underlätta orienteringen av provet. C. Diagram över det cirkulära stadiet med provspåret. Spårets lutning stöder underdiblen och gör att molarerna kan monteras längs rötternas vertikala axel. D. Jag är inte så bra på Representativ mikro-CT 2D-skiva kombinerad med en 3D-volymbild av hemi-mandible provet. Det interproximala gapet här är 52 μm. Provet monteras på provsteget nedan (visas ej) och städet (A) ovanpå med dental komposit (DC). Skalbar = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3. ECi-baserad clearingmetod för dissekerade mus hemi-mandibles. A. Den dissekerade hemi-mandible är nedsänkt i 4% PFA, 50% EtOH, 70% EtOH och 100% EtOH i följd. Efter uttorkning lagras hemi-underdiblen i ECi i minst 12 timmar tills avbildning. B. Jag är inte så bra på Hemi-mandible omedelbart efter dissekering. C. Hemi-underdible efter avslutad röjning. Skalstänger = 5 mm Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativa mikro-CT-skanningar på plats av pdl för ett färskt prov i de olika stadierna av tandregleringsrörelsen. A-C, Ingen tandreglering. A. Micro-CT 2D bild i tvärgående plan av hemi-mandible visar mesial (M) och distala (D) rötter inuti alveolar ben, B-Buccal, L-Lingual sidor av alveolar ben. Mellan tandrötterna och det alveolära benet observeras PDL-utrymmet och fibrerna inuti det tydligt. B. 2D-bild i sagittalplanet. C. 2D-bild i koronarplanet. D-E, 2D-bilder efter 3 dagars OTM, pilhuvuden pekar på områden i PDL med minskning av kollagenfibrer densitet, vita pilar pekar på områden med benresorption. G-I, 2D-bilder efter 7 dagar av OTM pekar svarta pilar på regioner med benapposition. Skalstänger = 150 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5:2D-mikro-CT-bild i sagittalplanet, som visar suddiga strukturer av både tand och ben på grund av tandens rörelse under skanningen. Pilarna pekar på flera brädlinjer i tanden, vilket indikerar dess rörelse. Skala stapel 150 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:ECi rensade underdible som visar den första molar som avbildas med andra harmoniska generationen (SHG). Vit pil pekar på en region där kollagenfibrer i PDL ses, notera den vertikala orienteringen, svarta pilar pekar på en region där både vertikala fibrer i PDL samt horisontella fibrer i det alveolära benet ses. T-tand, F-furcation, AB-alveolar ben, MR-mesial rot, DR-Distal rot, skala bar 150 μm. Bilder erhölls med hjälp av en 20X multi-nedsänkningslins för lösningar med RI på 1,33-1,56. Excitation laser sattes till 860nm på 10% effekt. Pixelbostadstid: 0,51 μs; Skanningsläge: ram; Genomsnitt: 16; Detektortyp: icke-scannad fotomultiplierrörsdetektor; Detector Gain 800V. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Ljusbladsmikroskopbilder av ECi-rensad Flk1-Cre;tdTomato-mus. A. Optimalt rensad kontroll hemi-mandible. Nätverket av blodkärl i benet (pilhuvudet) och PDL-utrymmet (pilen) är synligt. B. Jag är inte så bra på inset av den mesiolingual regionen av den första molar (röd skisserad i A) visar blodkärlen. C. optimalt rensas 7-dagars OTM hemi-mandible och D. suboptimalt rensad hemi-mandible. E. 2D-bild av panel C i sagittalplanet, bilden visar väldefinierade blodkärl i ben (grå pil) och PDL-utrymme (vita pilar). F. F. Tvådimensionell segmentbild av panel D, samma region som bilder i E, vilket resulterar i en suddig bild. Skalstänger A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm Bilder togs med ett 5X-planmål, med kamera som detektor. Excitation laser var 561 nm vid 4% effekt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att generera OTM hos möss är mycket önskvärt på grund av storlek, genetik och hanteringsfördelar. Att använda underdiblen ger en enkel hantering både när det gäller vävnadsav dissekering samt provberedning och avbildning. Här presenterade vi en metod för att generera OTM med translationell rörelse av tanden inuti benet inom 7 dagar efter OTM. Med hjälp av detta protokoll kan tandrörelsens totala varaktighet förlängas, eftersom den aktiverade spolen ger en konstant kraftnivå för rörelse på upp till cirka 1 mm. Men den mesiala sidan av spolen är fastsatt på framtänden, som ständigt bryter ut. Som ett resultat kommer kraftvektorerna gradvis att förändras och börja generera extruderingskrafter. Detta kan undvikas om justering av fastsättningsnivån på den mesiala änden utförs var 7: e dag.
PDL är initiativtagare till OTM, därför är det av stor betydelse att förstå dess struktur och funktion under OTM: s olika stadier. PDL är dock inte enhetlig i både dess struktur och funktion19,22,31,32. För att hämta meningsfulla data måste därför PDL studeras i 3D och eventuella vävnadssektionering och manipulering bör undvikas så mycket som möjligt. Men att undersöka en mjukvävnad som ligger mellan två hårda vävnader gör sådana krav utmanande att uppfylla. Traditionella metoder för att studera PDL innebär ofta att kompromissa med 3D-strukturen och ta bort vävnaden ur sin fysiologiska miljö, vilket följaktligen förändrar PDL strukturella och biomekaniska egenskaper. Både strukturella och biomekaniska egenskaper genomgår dynamiska förändringar under OTM som motiverar att vävnads 3D-sammanhang bevaras ytterligare. För att göra det beskrev vi två metoder som möjliggör helvävnadsavbildning utan sektionering, som också kan användas på samma prov som samlokalisering av fluorescerande signaler, morfologiska och mineraliseringsdata.
Den tillhandahållna metodbeskrivningen får läsarna att tillämpa metoderna inom sina studieområden. Mikro-CT-avbildningen möjliggör 3D-visualisering av PDL-fibrösa nätverk. Bilder kan analyseras för att producera riktnings- och densitetsanalyser och för att kvantitativt undersöka förändringar i PDL under OTM. Vi beskrev också en clearingmetod som möjliggör visualisering med lättillgängliga optiska mikroskopiska metoder som ljusbladmikroskopi och konfokal avbildning. Ljusbladsmikroskopi har fördelen att producera en 3D-bild av stora exemplar med relativt snabb bildhastighet. Konfokal mikroskopi möjliggör högupplöst 3D-visualisering med SHG-signal för kollagenfibrer och fluorescerande taggar. Dessa metoder självständigt eller kombinerade öppna många möjligheter till 3D strukturella studier med minimal vävnad beredning.
Flera utmanande steg i detta protokoll kräver extra uppmärksamhet:
För det första måste ligaturtråden placeras säkert mellan första och andra molarerna under spoleplaceringen. Denna process är utmanande på grund av muständens små dimensioner. Vi rekommenderar användning av bänkskiva stereomikroskop för att styra placeringen. Små rörelser under proceduren kan dock flytta musen och få intresseområdet att gå utanför synfältet. Som ett alternativ föreslår vi att du använder 4-5x förstoringssnuppar som kan bäras på operatören, vilket kan hjälpa till att se området mer dynamiskt.
För det andra beror clearingresultaten på uttorkningsprocessen. Om provet inte har nått önskad transparensnivå är vårt förslag att öka uttorkningstiden. Mer specifikt har längre nedsänkningstid i 100% EtOH visat sig förbättra insynen i slutprodukten. Det bör dock noteras att ökad uttorkningsnivå dramatiskt kan minska fluorescensnivåerna24,25. Den presenterade ECi-baserade metoden visade sig bevara fluorescerande signaler längre än 2 veckor24.
Aspekter av detta protokoll kan ändras för att studera en mängd andra ändamål. Kammaren vi designade inuti mikro-CT är i kombination med en lastcell och en motor och har förmågan att utföra spännings-/kompressionstester på hemi-mandible-proverna. I kombination med visualiseringen av mikro-CT kan denna uppsättning visa förändringar på PDL in situ med varierande mekanisk belastning21. Den beskrivna clearingmetoden kan också implementeras på unfixed prover, vilket ger en möjlighet till en intressant kombination av olika bildframställning formerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). Vi vill tacka Harvard Center for Biological Imaging för infrastruktur och support. Alla siffror genereras med biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, suppl 1 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. dA., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
