Summary
Vi præsenterer en protokol for generering af ortodontisk tandbevægelse i mus og metoder til 3D-visualisering af kollagenfibre og blodkar af parodontal ligament uden sektionsopdelt.
Abstract
Ortodontisk tand bevægelse er en kompleks biologisk proces med ændret blødt og hårdt væv remodeling som følge af eksterne kræfter. For at forstå disse komplekse ombygningsprocesser er det afgørende at studere tand- og parodontale væv inden for deres 3D-kontekst og derfor minimere eventuelle sektions- og vævsgenstande. Musemodeller bruges ofte i udviklings- og strukturbiologi såvel som i biomekanik på grund af deres lille størrelse, høje stofskifte, genetik og nem håndtering. I princippet gør dette dem også fremragende modeller til tandrelaterede undersøgelser. Men en stor hindring er deres lille tandstørrelse, især molarerne. Dette papir har til formål at give en trin for trin protokol for at generere ortodontiske tand bevægelse og to metoder til 3D-billeddannelse af parodontale ligament fiberkomponenten i en mus mandibular molar. Den første præsenterede metode er baseret på en mikro-CT setup muliggør fase ekstraudstyr billeddannelse af friske kollagen væv. Den anden metode er en knoglerydningsmetode ved hjælp af ethylcinnamat, der muliggør billeddannelse gennem knoglen uden at sektionsopdele og bevarer endogen fluorescens. Kombination af denne clearingmetode med reportermus som Flk1-Cre; TdTomato gav en første af sin slags mulighed for at afbilde 3D-vaskulaturen i PDL- og alveolarbenet.
Introduction
Den grundlæggende underliggende biologiske proces i ortodontisk tand bevægelse (OTM) er knogle remodeling. Udløseren til denne remodeling proces tilskrives ændringer i strukturen af parodontale ligament (PDL) såsom ekstracellulær matrix (ECM) stress, nekrose samt blodkar ødelæggelse ogdannelse 1,2,3. Andre mulige udløsere til alveolar knogle remodeling er relateret til kraft sensing af osteocytter i knoglen, samt mekanisk deformation af alveolar knoglen selv; deres rolle i OTM er dog stadig ikke fuldt ud belyst4,5.
På trods af mange undersøgelser, der har til formål at afsløre PDL's strukturfunktionsrelationer under OTM , er der endnu ikke defineret en klar funktionel mekanisme6,7. Hovedårsagen til dette er udfordringen med at hente data fra et blødt væv (PDL) placeret mellem to hårde væv (cementum og alveolar knogle). De accepterede metoder til at indsamle strukturelle oplysninger kræver normalt fiksering og sektionsopderinger, der forstyrrer og ændrer PDL-strukturen. Desuden giver de fleste af disse metoder 2D-data, der, selvom de ikke fordrejes, kun giver delvise og lokaliserede oplysninger. Da PDL ikke er ensartet i sin struktur og funktion, er en tilgang, der adresserer den intakte 3D-struktur i hele tand-PDL-knoglekomplekset, berettiget.
Dette papir vil beskrive en metode til at generere en OTM i mus og to metoder, der muliggør 3D-visualisering af kollagenfibrene i PDL uden nogen opdeling af prøven.
Murine modeller er meget udbredt til in-vivo eksperimenter inden for medicin, udviklingsbiologi, medicin levering og strukturelle undersøgelser. De kan genetisk modificeres for at fjerne eller forbedre specifikke proteiner og funktioner; de giver hurtig, repeterbar og forudsigelig udviklingsmæssig kontrol de er også nemme at billedet på grund af deres lille størrelse8. På trods af deres mange fordele anvendes musemodeller i tandforskning ikke ofte, især når kliniske manipulationer er berettiget, hovedsagelig på grund af de små tænder. Dyremodeller som rotter9,10,11, hunde12,13,grise14,15,16 og aber17 bruges oftere end mus. Med den nylige udvikling af høj opløsning billedbehandling teknikker, fordelene ved at bruge en mus model til at dechifrere de indviklede processer i OTM er talrige. Dette papir præsenterer en metode til at generere en mesial bevægelse af molar tand i underkæben med konstant kraft niveauer, der udløser knogle remodeling. De fleste OTM-eksperimenter i gnavere udføres i maxillaen, da mandiblens mobilitet og tilstedeværelsen af tungen tilføjer et andet kompleksitetsniveau. Men underkæbe har mange fordele, når 3D strukturel integritet ønskes. Det kan let dissekeres som en hel knogle; i nogle arter kan det opdeles i to hemi-mandibler gennem fiber symphysis; den er kompakt, flad og indeholder kun tænderne uden sinus rum. I modsætning hertil er maxillaen en del af kraniet og tæt forbundet med andre organer og strukturer, således er omfattende sektionsopdelte nødvendige for at dissekere alveolarbenet med de tilhørende tænder.
Ved hjælp af en in house fugtighed kammer koblet til en lastning system inde i en høj opløsning mikro-CT, der muliggør fase ekstraudstyr, vi udviklet en metode til at visualisere friske fibervæv i 3D som tidligere beskrevet9,18,19,20,21,22,23. Frisk væv scannes umiddelbart efter, at dyret er ofret uden farvning eller fiksering, hvilket reducerer vævsgenstande samt ændringer af biomekaniske egenskaber. Disse 3D-data kan bruges til distributions- og retningsanalyser af fibrene som beskrevet andetsteds19.
Den anden 3D hele væv billeddannelse metode præsenteret her er baseret på optisk clearing af mandiblen, som gør det muligt billeddannelse af PDL fibre gennem knoglen uden nogen sektion. Interessant det gør det også muligt visualisering af kollagen fibre af knoglen selv, men dette vil ikke blive diskuteret her. Generelt er der to metoder til vævsrydning. Den første er vandig-baseret clearing, hvor prøven er nedsænket i en vandig opløsning med et brydningsindeks større end 1,4 enten gennem en simpel nedsænkning, hyperhydrering eller hydrogel indlejring. Denne metode er imidlertid begrænset i graden af gennemsigtighed såvel som den strukturelle bevarelse af vævet og kræver derfor fiksering af vævet. Den anden metode, der giver meget gennemsigtige prøver og ikke kræver fiksering, er den opløsningsmiddelbaserede clearingmetode24,25. Vi genererede en modificeret opløsningsmiddelbaseret clearingmetode baseret på ethyl-3-phenylprop-2-enoate (ethylcinnamat, ECi) til mandibularprøverne. Denne metode har fordelene ved at bruge ikke-giftige fødevarer-grade clearing agent, minimal væv svind, og bevarelse af fluorescerende proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med NIH's retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr og retningslinjer fra Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (protokol nr. 01840).
1. Ortodontisk tand bevægelse
- For at generere en museseng skal du bruge en flad plastplatform med en kileformet, 45° vinklet nakkestøtte. Nakkestøtten kan genereres ved at skære en plastikkasse.
- Løft platformens hovedende for at generere en ca. 30° vinkel mellem nakkestøtten og bordplanet. Fastgør en bøjet tyk papirclips (0,036" i diameter) til hovedsiden ende for at holde de øverste fortænder.
- På enden genereres en forhøjet overflade, som en ortodontisk kraftkæde kan fastgøres til for at holde de nederste fortænder. Se figur 1 for et eksempel platform.
- Bedøve musen ved intraperitoneal injektion af xylazin på 10 mg/kg og ketamin 100mg/kg ved hjælp af 1 mL sprøjte og en 27 Gauge nål.
- Placer bedøvet mus på specialfremstillede platform og immobilisere overkæben ved at tilslutte den øverste fortænder på papirclips loop. Åbn musens underkæbe med den ortodontiske kraftkæde tilsluttet de nederste fortænder. Hold kinderne trukket tilbage med mini-colibri munden retractor.
- Placer platformen under et kirurgisk mikroskop eller et andet stereoskop, der kan nå op på 5-6x forstørrelse.
- Påfør 50 μL saltvand (ca. 1 dråbe) på museøjnene for at forhindre hornhindedehydrering. Genopfyld saltvand hvert 20. minut.
- Skær et stykke aluminiumstråd (0,08 mm diameter) 1 cm i længden. Skub ledningen fra buccalsiden lingually i det interproksimale område bælg kontaktpunktet mellem første og anden kindtænder ved hjælp af en mikrokirurgisk nåleholder. Lad 2 mm fri kant stå foran den første kindtand for at blive gevind i fjederenden.
- Skær et stykke nikkel titanium (NiTi) spole, omkring 7 til 9 tråde i længden.
BEMÆRK: Spolens elastiske egenskaber vil give konstant kraft til ortodontisk bevægelse. Den samlede ustrengte længde af spolen skal være kortere end afstanden mellem fortænderne og molaren. Husk, at der er brug for yderligere 2 tråde i hver ende for at forankre spolen til tanden. Aluminiumstråd vælges for at reducere scanningsgenstande som strålehærdning under mikro-CT-scanningen. - Skær NiTi spolefjeder (0,15 mm tråddiameter, 0,9 mm indvendig spolediameter; leverer en kraft på 10 g) mellem lavere første molar og nedre fortand. Brug wire ligatur indsat omkring den første molar i trin 1,6, drej ledningen tæt omkring 2 tråde af spolen foråret til at fastsætte spolen på molar side.
- For at sikre ensartet kraftniveau skal du bruge nøjagtigt 3 aktive tråde mellem den første molar og fortænderne. Fjern midlertidigt kraftkæden fra fortænderne og sløjfe 2 til 3 ubestrakte tråde over fortænderne for at forankre spolen. Skub trådene ned til fortænderne gratis gingival margin.
- Placer et lag af flowable komposit harpiks på inderstædet kant af spolen og helbrede det med dental hærdning lys. Udskift kraftkæden efter hærdning af harpiksen.
- Brug det samme hærdelys til at opvarme NiTi-spolen i 20 s. Dette vil stramme NiTi spolen. Den færdige placering vises figur 1C.
- Lad enten kontralateralsiden være intakt, eller indsæt et fupnummer som ledningen mellem første og anden kindtænder.
- Placer den bedøvede mus under et opvarmet lys for at holde musen varm, indtil den kommer sig.
- Placer musen tilbage i et individuelt bur og overvåge dagligt. Ingen kostændring er nødvendig under ortodontisk bevægelse.
BEMÆRK: OTM-enhed på den ene side forårsager ubehag, men forringer ikke fodring. Det anbefales dog ikke at indsætte enheder på begge sider på grund af den ekstra mængde ubehag. Smertestillende medicin er ikke nødvendig, medmindre ydre tegn på smerte ses.
2. Micro-CT-scanning af PDL-fibre i friske hemi-mandibler
- Montering af hemi-mandiblen (figur 2)
- Efter den ønskede varighed af ortodontisk bevægelse, ofre musen via livmoderhalskræft dislokation. Fjern underkæbbet og adskil det i hemi-mandibler.
BEMÆRK: Da prøven ikke vil blive fastgjort, er det vigtigt at udføre dissektion af kæben og montering så hurtigt som muligt, ideelt inden for 30 minutter. - Fjern det omgivende bløde væv forsigtigt med en ren fnugfri aftørring.
- Fjern den ortodontiske enhed ved hjælp af mikroskopisk saks og pincet under et stereomikroskop med mindst 4x forstørrelse.
- Prøven skal være fugtig i et volumen på 1,5 mL, mikrocentrifugerøret sammen med et stykke fnugfri tør fugtet med vand.
- Placer kompositharpiksen, der kan pakkes, i prøvepladsen på scenen, og placer derefter den friske hemi-mandible i kompositten. Før montering sørg for, at knogleoverfladen i kontakt med dental komposit er fri for blødt væv og tør, ellers dental komposit vil ikke helbrede ordentligt.
- Juster placeringen af hemi-mandiblen, indtil den første molar er centreret ved midterlinjen rille af scenen. Sørg for, at okklusaloverfladen er vandret. Hærd kompositten, når den er tilfreds med positioneringen.
BEMÆRK: Yderligere små mængder af dental kompositter kan placeres på siderne af hemi-mandible og / eller på tværs af fortænderne til støtte for at stabilisere prøven. - Placer dæmpet fnugfri tør inde i fugtighedsbassinerne i prøvestadiet. Placer dental komposit på okklusal overflade af den første molar. Før du lukker kammeret, skal du sørge for, at intet blokerer røntgenvejen på prøveniveau.
- Ansætter kammeret i mikro-CT. Skru kammeret ind i mikro-CT prøve fase, således at bevægelsen under billeddannelse minimeres.
- Tænd for røntgenbillederne og tag 2D-billeder, mens du sænker ambolten lodret, indtil amboltens spids er omgivet af kompositten, men der registreres ingen stigning i kraften.
- Når ambolten er indlejret i kompositten, skal du lukke røntgenkilden. Åbn derefter mikro-CT-kammeret og hærde kompositten gennem det klare Plexiglas-vindue.
- Efter den ønskede varighed af ortodontisk bevægelse, ofre musen via livmoderhalskræft dislokation. Fjern underkæbbet og adskil det i hemi-mandibler.
- Indstillinger for mikro-CT
- Sæt kildespændingen til 40 kV og strøm til 200 μA. Ved hjælp af en 10x forstørrelsesdetektor skal prøven placeres inden for synsrammen. Brug binning af 2 til de hentede billeder.
BEMÆRK: Da PDL er betydeligt mindre tæt end knoglen og tanden, kræver visualisering af PDL højere effekt og eksponeringstid. Denne protokol indeholder indstillinger til visualisering af PDL'en. - Indstil eksponeringstiden for enkeltbillede til 25 s. Indstil rotationen af prøvestadiet til et interval på 183 grader eller mere. Indstil scanningen til 2500 fremskrivninger. Brug ikke noget røntgenkildefilter, de resulterende scanninger har en voxelstørrelse på 0,76 μm på hver side.
- Indsaml en referencescanning for korrekt rekonstruktion i henhold til mikro-CT-retningslinjerne. Brug 1/3 antal referencebilleder som det samlede antal fremskrivninger. Rekonstruer diskenheden uden yderligere placering ved hjælp af en tilbageprojektionsfiltreret algoritme.
- Sæt kildespændingen til 40 kV og strøm til 200 μA. Ved hjælp af en 10x forstørrelsesdetektor skal prøven placeres inden for synsrammen. Brug binning af 2 til de hentede billeder.
3. Clearingmetode (figur 3)
- Forbered fem 1,5 mL mikrocentrifugerør.
- Der fremstilles 1,4 mL af følgende opløsninger i 1,5 mL mikrocentrifugerør: 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbufferet saltvand (PBS), 50% ethanol (EtOH) i deioniseret (DI) vand, 70% EtOH i DI-vand og to rør på 100% EtOH.
BEMÆRK: PFA anvendes til fiksering af prøven. ECi clearing vil også arbejde på ikke-fastgjorte prøver. For at rydde ikke-fastgjorte prøver skal du blot springe PFA-trinnet over. - Placer dissekeret hemi-mandible i 4% PFA. Dæk med aluminiumsfolie og læg på vippe på blid indstilling ved stuetemperatur i 6 timer.
- Flyt hemi-mandiblen til 50% EtOH. Placer den på rocker dækket af lys i 16 timer.
- Flyt hemi-mandiblen til 70% EtOH. Placer den på rocker dækket af lys i 16 timer.
- Flyt hemi-mandiblen til 100% EtOH. Placer den på rocker dækket af lys i 16 timer.
- Gentag 3.6. i det andet 100% EtOH-rør.
- Der fremstilles 5 mL ECi i et glas- eller polypropylenrør.
BEMÆRK: ECi opløser polystyren, men ikke polypropylen. Hvis der ikke anvendes et væv med fluorescerende proteiner, kan prøven også udsættes for lys under rydningsproceduren. - Flyt hemi-mandiblen til ECi-røret. Dæk røret med aluminiumsfolie og læg på vippe på blid indstilling i mindst 12 timer.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Dehydreret prøve kan opbevares i ECi ved stuetemperatur. Frysnings- eller smeltepunktet for ECi er 6,5 til 8,0 °C. Må ikke opbevares ved 4 °C. - Den hemi-mandible er klar til billeddannelse med fluorescens mikroskop.
BEMÆRK: Under billeddannelsen skal prøven nedsænkes i ECi for at forblive optisk gennemsigtig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette papir præsenterer en metode til at producere OTM samt to metoder til 3D-billeddannelse af kollagenfibre inde i PDL uden nogen sektion. Til dyreforskningsformål, når tilpasning af tænderne ikke er nødvendig, betragtes en tandbevægelse som ortodontisk, hvis den genererer remodeling af alveolarbenet på alle rodniveauer. Konstant kraftniveau, der påføres tænder, er påkrævet for at generere en pålidelig OTM. Her bruges en aktiveret form-hukommelse NiTi spole til at generere en ensartet kraft på 10 g i hele forsøgstiden på 7 dage og derefter, hvis det er berettiget. Den spoleaktivering, der er beskrevet her (Figur 1), genererer belastning i NiTi-spolen i den martensitiske fase og bringer spolen til hysteresetilstanden, som leverer konstant stress på tanden. Opvarmning af spolen med hærdningslyset efter indføring af spolen vil også sørge for, at legeringen skifter til sin austenitiske form, og at formhukommelseseffekten vil finde sted.
Her viser vi repræsentative resultater fra 9 uger gamle, mandlige mus. Det gennemsnitlige mesiodistale mellemrum mellem kronerne på første og anden kindtænder efter 7 dages OTM er 40 μm målt mellem molarernes interproksimale overflader i mikro-CT med 1X forstørrelse (n=12, st.dev. = 15 μm) (Figur 1E). Det gennemsnitlige rum for PDL i mesiodistal retning er 80 μm før og efter 7 dage med OTM (Figur 4B). Dette bekræfter, at den første molar oversat mesially og 7 dage er en tilstrækkelig tid til at generere OTM i en mus model, mens generere processer af knogle resorption og apposition i naturen (Figur 4). Mus blev fodret med en standard hård palle kost. Ingen kost ændring blev foretaget efter enheden indsættelse.
Den første metode , der præsenteres for at visualisere ændringerne i tand-PDL-knoglekomplekset under OTM , er baseret på faseforbedret mikro-CT-billeddannelse af frisk væv (Figur 4), som blev beskrevet detaljeret tidligere9,18,19,20,22,23. Kort sagt, forudsat en fase ekstraudstyr evne til enten en mikro-CT eller en synkrotron, mekanisk stabilisering af fibervæv og befugtet miljø, friske kollagenfibre kan visualiseres uden fiksering eller kontrasterende midler. I PDL de fibre, der ses, er dem, der er forbundet til både tand og knogle, hovedsageligt type I kollagen19. Denne unikke mulighed for at visualisere i 3D en intakt PDL muliggør analyse af 3D fibertæthed, fibre orientering samt 3D-bevægelsen af tanden som tidligere beskrevet9,19. Konkret præsenterer vi her visualiseringen af fibernetværket i PDL. På tidspunktet 0 kan fysiologisk remodeling i både knoglen og PDL observeres. Remodeling forekommer også i cellulær cementum; Dette er dog ikke direkte relateret til den præsenterede metode og vil derfor ikke blive uddybet. Bone-PDL-grænsefladen er for det meste glat både i de tværgående (Figur 4A) og sagittal (Figur 4B) fly forud for enhver kraftanvendelse. I koronaplanet (Figur 4C) er knogle-PDL-grænsefladen grovere, især i retning af den apikale region, som kan være tegn på ombygningsbalancen, der har tendens til resorption. Ved 3 dage otm(Figur 4D-F), hvorpå den første molar flyttes mesially (retningen er repræsenteret af den stiplede pil), reduceres fibertætheden i PDL (hvide pilespidser). Bone-PDL-grænsefladen er grovere end ved 0 dage på grund af udviklingen af kratere i knogleoverfladen, som er tegn på osteoklastisk aktivitet og knoglereorptionsprocesser forbundet med hovedsageligt kompressionskræfter i PDL26, men her ses i spændingsområder på 3 dage. Vævsdestruktion i spændingsområder inden for PDL blev foreslået27,28 og kan tydeligt ses ved hjælp af denne metode. Den ru kant ses på forskellige niveauer af rødderne (hvide pile) og tyder derfor på, at tandbevægelsen er translationel i naturen og ikke kun deponering af kronen. På 7 dage OTM (Figur 4G-I), knogle resorption tegn, såsom kratere i knoglen, ru grænser og udvidelse af PDL rummet, ses på alle fly, men den gennemsnitlige PDL plads er smallere end på 3 dage OTM (Figur 4D-F). I nogle områder er knogle-PDL-grænsen imidlertid blevet glattere efter 7 dage med OTM, disse områder er placeret på røddernes distale overflader, hvilket sandsynligvis er en indikation for knogleudskiftning, som forventet i OTM til den mesiale retning.
På grund af den lange mikro-CT-billedtid (~19 h) og scenens rotation er montering af prøven afgørende for at holde prøven stille. Ustabil prøve vil resultere i slørede scanninger. Figur 5 viser, hvordan mikro-CT-scanningen ser ud, når prøven er flyttet under scanningen. Tanden og knoglen er sløret. Hverken PDL-fibre eller osteocytter observeres. I sådanne tilfælde er der en silhuet til stede omkring margenen af et objekt. I figur 5kan der observeres flere konturer af tandkronen (pile).
Afhængigt af forskningsmålet kan opløsningen og visualiseringen af PDL-fibrene ofres i handelen i kortere scanningstid, når der kun ønskes oplysninger om det hårde væv.
En supplerende metode til 3D-visualisering af PDL-fibrene uden nogen opdeling sker via optisk mikroskopi på optisk ryddede prøver ved hjælp af ECi (Figur 3). Denne metode kan bruges på en prøve uden fiksering og bevarer fluorescerende signaler, der findes i vævet før rydning. Hemi-mandibler før og efter ECi-clearing er vist i figur 3B og 3C. Tilstrækkelig prøve clearing af PDL kan bekræftes, når et gitter papir kan ses gennem ramus af mandiblen. Mængden af clearing kan justeres ved forlængelse af dehydreringsprocessen. Figur 6 viser det andet harmoniske generations (SHG) signal fra kollagenfibre i både alveolarben og PDL i en ryddet mandible. Imaging kollagen fibre af knoglen i 3D er en kompliceret proces, som ofte bruger elektron mikroskopi metoder såsom FIB / SEM. Men ved hjælp af ECi-baserede clearing metode og SHG, alveolar knoglefibre er tydeligt set, især i vandret retning. Ved oversættelse gennem prøven dybt ind i PDL fra knogleoverfladen er overgangen til PDL-fiberniveauet meget klar, da fibrene pludselig ændrer deres orientering til en lodret.
Lightsheet mikroskopi kan også bruges til billeddannelse fluorescerende proteiner gennem knoglen. I dette tilfælde af en ryddet prøve fra en transgen Flk1-cre; Tdtomato mus19,29,30, de fluorescerende endotelceller foring blodkarrene er tydeligt observeret ( Figur7A,B, C, E). Korrekt clearing er nøglen til at generere forståelige billeder med lightsheet mikroskopi. Når knoglen ikke er helt ryddet, blev blodkarrene i PDL ikke observeret (Figur 7D, F).
Figur 1:Opsættende stik til ortodontisk apparat. A. Det er ikke så lidt. Museseng lavet af laboratorieforsyning for at støtte dyret og holde munden åben. Plastplatformen (PP) til kroppen er på en 30° hældning, og nakkestøtten (HR) er i en 45° vinkel fra pp's overflade. En 2-differentieret rørstander (TS) bruges til at løfte sluthovedet på PP. Papirclipssløjfen (sort pil) forankrer de øverste fortænder, og den nederste ortodontiske effektkæde (hvid pil) kroge på de nederste fortænder. Inspektionsspejlet med en diameter på 5 mm blev anvendt til visuel inspektion af molarerne. B. Sidevisning af musesengen. Vinkler mellem overflader er markeret (grøn og magenta). C. Repræsentativt billede af den korrekt placerede enhed. D. Det er mig. Molarer set gennem inspektionsspejlet før implantation af enheden. E. Repræsentativt billede af molarer efter den ortodontiske bevægelse. Stiplede linjer sporer konturen af første og anden kindtænder. F. Diagram over enheden og dens placering. Rød linje repræsenterer wire ligatur omkring første kindtand. Orange linje repræsenterer flowable komposit harpiks bruges til at forankre spolen. NiTi spole er vist med blåt og mærket. G. Dissekeret hemi-mandible med enheden fastgjort efter 7-dages ortodontisk bevægelse. Bemærk, hvordan de 3 spoletråde stadig er åbne, hvilket indikerer, at spolen stadig er aktiv efter 7 dage. Skalabjælke = 1 mm i E og G. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Hemi-mandible monteret i et specialfremstillet kammer til mikro-CT-billeddannelse. Røntgenkilden ses til venstre og detektoren til højre. Rødt rektangel skitserer den hemi-mandible, der er monteret i kammeret på prøvestadiet (SS). Det eksempelkammer, der vises her, er en del af et mekanisk testsæt, herunder motor (M), ambolt (A, skitseret af hvide stiplede linjer) og amboltaksel (AS) oven på kammeret. Den fulde opsætning skrues på CT-scenen. Indsat billede viser nærbillede af det røde skitserede område, der indeholder fugtighedskammeret med prøve indeni. B. Første visning af prøven monteret på prøvestadiet. Fugtighedsbassiner (grå pil) er indbygget på omkredsen for at opretholde fugtighed under billeddannelse. På den cirkulære scene i midten kan hemi-mandible monteres i den skrå dybe rille (sort pil). En tynd rille (hvid pil) markerer midterlinjen i fasen for at hjælpe med at orientere prøven. C. Diagram over den cirkulære fase med prøverillen. Rillens hældning understøtter underkæbbet og gør det muligt at montere kindtænderne langs røddernes lodrette akse. D. Det er mig. Repræsentativ mikro-CT 2D skive kombineret med et 3D-volumenbillede af hemi-mandible prøven. Det interproksimale hul her er 52 μm. Prøven monteres på prøvestadiet nedenfor (ikke vist) og ambolten (A) på toppen af dental komposit (DC). Skalalinje = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. ECi-baseret clearingmetode til dissekerede muse-hemi-mandibler. A. Det er ikke så lidt. Den dissekerede hemi-mandible er nedsænket i 4% PFA, 50% EtOH, 70% EtOH og 100% EtOH i træk. Efter dehydrering opbevares hemi-mandiblen i ECi i mindst 12 timer indtil billeddannelse. B. Hemi-mandible umiddelbart efter dissektion. C. Hemi-mandible efter afslutningen af clearing. Skalalinjer = 5 mm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative in situ-mikro-CT-scanninger af PDL af en ny prøve i de forskellige stadier af den ortodontiske bevægelse. A-C, ingen ortodontisk bevægelse. A. Det er ikke så lidt. Micro-CT 2D billede i tværgående plan af hemi-mandible viser mesial (M) og distale (D) rødder inde i alveolar knoglen, B-Buccal, L-Lingual sider af alveolar knoglen. Mellem tandrødderne og alveolarbenet observeres PDL-rummet og fibrene i det tydeligt. B. 2D billede i sagittal flyet. C. 2D billede i koronar flyet. D-E, 2D-billeder efter 3 dage med OTM, pilespidser peger på områder i PDL med reduktion i kollagenfibre tæthed, hvide pile peger på områder med knogle resorption. G-I, 2D billeder efter 7 dage otm, sorte pile punkt på regioner af knogle apposition. Skalalinjer = 150 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: 2D mikro-CT-billede i sagittalplanet, der viser slørede strukturer af både tand og ben på grund af tandens bevægelse under scanningen. Pile peger på flere board linjer af tanden, der angiver dens bevægelse. Skalalinje 150 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: ECi ryddet mandible viser den første molar afbildet med anden harmoniske generation (SHG). Hvid pil peger på et område, hvor kollagenfibre af PDL ses, bemærk den lodrette orientering, sorte pile peger på en region, hvor både lodrette fibre af PDL samt vandrette fibre af alveolarbenet ses. T-tand, F-furcation, AB-alveolar knogle, MR-mesial rod, DR-Distal rod, skala bar 150 μm. Billeder blev opnået ved hjælp af en 20X multi-nedsænkning linse til løsninger med RI på 1,33-1,56. Excitation laser blev sat til 860nm ved 10% strøm. Pixel boligtid: 0,51μs; Scanningstilstand: ramme; Gennemsnit: 16; Detektortype: nondescanned photomultiplier tube detector; Detektor Gain 800V. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Lightsheet mikroskop billeder af ECi-ryddet Flk1-Cre;tdTomato mus. A. Det er ikke så lidt. Optimalt ryddet kontrol hemi-mandible. Netværket af blodkar i knoglen (pilehovedet) og PDL-rummet (pil) er synligt. B. inset af den mesiolingual region i den første kindtand (rød skitseret i A) viser blodkarrene. C. optimalt ryddet 7-dages OTM hemi-mandible og D. underoptimalt ryddet hemi-mandible. E. 2D billede af panel C i sagittal plan, billedet viser veldefinerede blodkar i knogle (grå pil) og PDL plads (hvide pile). F. Todimensionelt udsnitbillede af panel D, samme område som billeder i E, hvilket resulterer i et sløret billede. Skala barer A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm Billeder blev taget med en 5X plan mål, ved hjælp af kameraet som detektor. Excitation laser var 561 nm ved 4% strøm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering af OTM hos mus er meget ønsket på grund af størrelse, genetik og håndteringsfordele. Brug af mandiblen giver en nem håndtering både med hensyn til vævsdissektion samt prøveforberedelse og billeddannelse. Her præsenterede vi en metode til at generere OTM med translationel bevægelse af tanden inde i knoglen inden for 7 dage efter OTM. Ved hjælp af denne protokol kan tandbevægelsens samlede varighed forlænges, da den aktiverede spole leverer et konstant kraftniveau for bevægelse på op til ca. 1 mm. Men den mesiale side af spolen er fastgjort til fortænderne, som konstant bryder ud. Som følge heraf vil kraftvektorerne gradvist ændre sig og begynde at generere ekstruderingskræfter. Dette kan undgås, hvis justeringen af fastgørelsesniveauet på mesialenden udføres hver 7. dag.
PDL er initiativtageren til OTM, derfor er det af stor betydning at forstå dets struktur og funktion i de forskellige faser af OTM. PDL'en er dog ikke ensartet i både struktur og funktion19,22,31,32. Som følge heraf skal PDL for at hente meningsfulde data undersøges i 3D, og vævssektion og manipulation bør undgås så meget som muligt. Men at undersøge et blødt væv beliggende mellem to hårde væv gør sådanne krav udfordrende at opfylde. Traditionelle metoder til at studere PDL indebærer ofte at kompromittere 3D-strukturen og fjerne vævet ud af dets fysiologiske miljø, hvilket derfor ændrer PDL strukturelle og biomekaniske egenskaber. Både strukturelle og biomekaniske egenskaber undergår dynamiske ændringer under OTM, hvilket berettiger til at bevare vævs-3D-konteksten yderligere. For at gøre dette beskrev vi to metoder, der muliggør hele vævsscanning uden sektionsopdele, som også kan bruges på den samme prøve, der samlokerer fluorescerende signaler, morfologiske og mineraliseringsdata.
Den medfølgende metodologiske beskrivelse pålægger læserne at anvende metoderne inden for deres studieområder. Mikro-CT-billeddannelsen giver mulighed for 3D-visualisering af PDL-fibernetværk. Billeder kan analyseres for at producere retningsbestemtheds- og tæthedsanalyser og for kvantitativt at undersøge ændringer i PDL under OTM. Vi beskrev også en clearingmetode, der muliggør visualisering med let tilgængelige optiske mikroskopiske metoder som lightsheet mikroskopi og konfokal billeddannelse. Lightsheet mikroskopi har den fordel, at producere et 3D-billede af store prøver med relativt hurtig billedhastighed. Konfokal mikroskopi muliggør 3D-visualisering i høj opløsning ved hjælp af SHG-signal til kollagenfibre billeddannelse og fluorescerende tags. Disse metoder uafhængigt eller kombineret åbne mange muligheder for at 3D strukturelle undersøgelser med minimal vævsforberedelse.
Flere udfordrende trin i denne protokol kræver ekstra opmærksomhed:
For det første skal ligaturtråden under spoleplaceringen placeres sikkert mellem første og anden kindtænder. Denne proces er udfordrende på grund af musens tænders små dimensioner. Vi anbefaler, at der anvendes stereomikroskop på bænken til at styre placeringen. Små bevægelser under proceduren kan dog flytte musen og få interesseområdet til at gå ud af synsfeltet. Alternativt foreslår vi at bruge 4-5x forstørrelsesrør, der kan bæres på operatøren, hvilket kan hjælpe med at se området mere dynamisk.
For det andet afhænger clearingresultaterne af dehydreringsprocessen. Hvis prøven ikke har nået det ønskede gennemsigtighedsniveau, er vores forslag at øge dehydreringstiden. Mere specifikt har længere nedsænkningstid i 100% EtOH vist sig at forbedre gennemsigtigheden af det endelige produkt. Det skal dog bemærkes, at øget dehydrering kan reducere fluorescensniveauerne24,25. Den præsenterede ECi-baserede metode viste sig at bevare lysstofrør i mere end 2 ugerog 24.
Aspekter af denne protokol kan ændres for at studere en lang række andre formål. Kammeret vi designet inde i mikro-CT er kombineret med en belastning celle og en motor og har evnen til at udføre spænding / kompression test på hemi-mandible prøver. Kombineret med visualiseringen af mikro-CT kan dette sæt vise ændringer i PDL in-situ med varierende mekaniske belastninger21. Den beskrevne clearingmetode kunne også implementeres på ikke-fastgjorte prøver, hvilket giver mulighed for en interessant kombination af forskellige billedbehandlingsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). Vi vil gerne takke Harvard Center for Biological Imaging for infrastruktur og støtte. Alle tal genereres med biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, suppl 1 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. dA., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
