Summary
אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תנועת שן אורתודונטית בעכברים ושיטות להדמיה תלת מימדית של סיבי הקולגן וכלי הדם של רצועה חניכיים ללא חתך.
Abstract
תנועת שן אורתודונטית היא תהליך ביולוגי מורכב של שינוי שיפוץ רקמות רכות וקשות כתוצאה מכוחות חיצוניים. על מנת להבין את תהליכי השיפוץ המורכבים הללו, חיוני לחקור את רקמות השן והתקופה בהקשר התלת מימדי שלהם ולכן למזער כל ניתוק וחפצי רקמות. מודלים של עכברים מנוצלים לעתים קרובות בביולוגיה התפתחותית ומבנית, כמו גם בביומכניקה בשל גודלם הקטן, קצב חילוף החומרים הגבוה, גנטיקה וקלות הטיפול. בעיקרון זה גם עושה אותם מודלים מצוינים עבור מחקרים הקשורים לרפואת שיניים. עם זאת, מכשול גדול הוא גודל השן הקטן שלהם, הטוחנות בפרט. נייר זה נועד לספק פרוטוקול צעד אחר צעד ליצירת תנועת שן אורתודונטית ושתי שיטות להדמיה תלת-ממדית של הרכיב הסיבי של רצועה חניכיים של טוחנת גברים של עכבר. השיטה הראשונה שהוצגה מבוססת על מערך מיקרו-CT המאפשר הדמיה של שיפור פאזה של רקמות קולגן טריות. השיטה השנייה היא שיטת ניקוי עצמות המשתמשת באתיל קינמט המאפשרת הדמיה דרך העצם ללא חתך ושומרת על פלואורסצנטיות אנדוגנית. שילוב שיטת סליקה זו עם עכברי כתב כמו Flk1-Cre; TdTomato סיפק הזדמנות ראשונה מסוגה לדמיין את כלי הדם 3D ב PDL ועצם מכתשית.
Introduction
התהליך הביולוגי הבסיסי בתנועת השן האורתודונטית (OTM) הוא שיפוץ עצם. הטריגר לתהליך שיפוץ זה מיוחס לשינויים במבנה הרצועה התקופתית (PDL) כגון מטריצה חוץ-תאית (ECM), נמק, כמו גם הרס כלידםוהיווצרות 1,2,3. גורמים אפשריים אחרים לשיפוץ עצם מכתוש קשורים לחישת כוח על ידי אוסטאוציטים בעצם, כמו גם עיוות מכני של עצם מכתוש עצמו; עם זאת תפקידם ב- OTM עדיין אינו ברור לחלוטין4,5.
למרות מחקרים רבים שמטרתם לחשוף יחסי מבנה-פונקציה של PDL במהלך OTM, מנגנון תפקודי ברור עדיין לא הוגדר6,7. הסיבה העיקרית לכך היא האתגר באחזור נתונים של רקמה רכה (PDL) הממוקמת בין שתי רקמות קשות (מלט ועצם מכתשית). השיטות המקובלות לאיסוף מידע מבני מחייבות בדרך כלל קיבעון ומקטעים המשבשים ומשנים את מבנה ה- PDL. יתר על כן, רוב השיטות הללו מניבות נתונים דו-מימדיים שגם אם אינם מעוותים, נותנים מידע חלקי ומקומי בלבד. מכיוון שה- PDL אינו אחיד במבנה ובתפקודו, יש צורך בגישה המטפלת במבנה תלת-ממדי שלם של כל קומפלקס עצם השיניים-PDL.
מאמר זה יתאר שיטה ליצירת OTM בעכברים ושתי שיטות המאפשרות הדמיה תלת-ממדית של סיבי הקולגן ב- PDL ללא כל מקטע של המדגם.
מודלים מורין נמצאים בשימוש נרחב עבור ניסויים in-vivo ברפואה, ביולוגיה התפתחותית, אספקת תרופות ומחקרים מבניים. הם יכולים להיות מהונדסים גנטית כדי לחסל או לשפר חלבונים ספציפיים ותפקוד; הם מספקים שליטה התפתחותית מהירה, חוזרת וצפויה; הם גם קלים לדימוי בגלל גודלם הקטן8. למרות היתרונות הרבים שלהם, מודלים עכבר במחקר שיניים אינם משמשים לעתים קרובות, במיוחד כאשר מניפולציות קליניות מוצדקות, בעיקר בשל השיניים בגודל קטן. דגמים של בעליחייםכגון חולדות 9,10,11, כלבים12,13, חזירים14,15,16 וקופים17 משמשים לעתים קרובות יותר מאשר עכברים. עם ההתפתחות האחרונה של טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה, היתרונות של ניצול מודל העכבר כדי לפענח את התהליכים מפותלים OTM הם רבים. נייר זה מציג שיטה ליצירת תנועה mesial של השן הטוחנת בלסת התחתונה עם רמות כוח קבועות המפעילות שיפוץ העצם. רוב הניסויים OTM מכרסמים נעשים maxilla, שכן הניידות של הלסת התחתונה ואת נוכחות הלשון להוסיף רמת מורכבות נוספת. עם זאת, הלסת התחתונה יש יתרונות רבים כאשר שלמות מבנית 3D רצוי. זה יכול להיות מנותח בקלות כמו עצם שלמה; במינים מסוימים ניתן להפריד אותו לשני חמי-לסתות דרך סימפיזיס סיבי; הוא קומפקטי, שטוח ומכיל רק את השיניים ללא כל חללי סינוס. לעומת זאת, המקסילה היא חלק מהגולגולת וקשורה קשר הדוק לאיברים ומבנים אחרים, ולכן יש צורך בניתוח נרחב על מנת לנתח את עצם מכתוש עם השיניים הקשורות.
באמצעות תא לחות בבית יחד עם מערכת טעינה בתוך מיקרו CT ברזולוציה גבוהה המאפשרת שיפור פאזה, פיתחנו שיטה לדמיין רקמות סיביות טריות בתלת מימד כפי שתואר קודם לכן9,18,19,20,21,22,23. רקמות טריות נסרקות מיד לאחר ההקרבה של החיה ללא כל כתמים או קיבעון, אשר מפחית חפצי רקמות, כמו גם שינויים של תכונות ביומכניות. נתונים תלת מימדיים אלה יכולים להיות מנוצלים לניתוחי הפצה וכיוון של הסיבים כמתואר במקומות אחרים19.
שיטת הדמיית הרקמה השלישית כולה השנייה המוצגת כאן מבוססת על ניקוי אופטי של הלסת התחתונה המאפשר הדמיה של סיבי ה- PDL דרך העצם ללא כל חתך. מעניין שזה גם מאפשר הדמיה של סיבי הקולגן של העצם עצמה, אולם זה לא יידונו כאן. באופן כללי, ישנן שתי שיטות לניקוי רקמות. הראשון הוא סליקה מימית שבו המדגם הוא שקוע בתמיסה מימית עם אינדקס שבירה גדול מ 1.4 או באמצעות טבילה פשוטה, hyperhydration או הטמעת הידרוג'ל. עם זאת, שיטה זו מוגבלת ברמת השקיפות, כמו גם בשימור המבני של הרקמה ולכן מחייבת קיבעון של הרקמה. השיטה השנייה אשר מניב דגימות שקופות מאוד ואינו דורש קיבעון היא שיטת סליקה מבוססת ממס24,25. יצרנו שיטת סליקה מבוססת ממס שונה המבוססת על אתיל-3-פנילפרופ-2-אנואט (אתיל קינמאט, ECi) עבור דגימות הלסת התחתונה. לשיטה זו יש את היתרונות של שימוש בחומר ניקוי ברמה של מזון לא רעיל, הצטמקות רקמות מינימלית ושימור חלבונים פלואורסצנטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה והנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת הרווארד (פרוטוקול מס' 01840).
1. תנועת שן אורתודונטית
- כדי ליצור מיטת עכבר, השתמש בפלטפורמת פלסטיק שטוחה עם משענת ראש בצורת טריז בזווית של 45°. משענת הראש יכולה להיווצר על ידי חיתוך קופסת פלסטיק.
- הרימו את קצה הראש של הפלטפורמה כדי ליצור זווית של כ-30° בין משענת הראש למישור השולחן. חבר מהדק נייר עבה מכופף (קוטר 0.036 אינץ') לקצה צד הראש כדי להחזיק את החותכות העליונות.
- בקצה הזנב, צור משטח מוגבה שאליו ניתן לחבר שרשרת חשמל אורתודונטית כדי להחזיק את החותכות התחתונות. ראה איור 1 לקבלת פלטפורמה לדוגמה.
- הרדמה עכבר על ידי הזרקה תוך-אישית של xylazine ב 10 מ"ג / קילוגרם וקטמין 100mg/kg באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט 27 מד.
- מניחים עכבר מורדם על פלטפורמה בהתאמה אישית ומשתקים את הלסת העליונה על ידי חיבור החותכות העליונות בלולאת המהדק. פתח את הלסת התחתונה של העכבר עם שרשרת החשמל האורתודונטית מכור על החותכים התחתונים. שמור על הלחיים נסוגות עם רקטור הפה מיני קוליברי.
- הנח את הפלטפורמה תחת מיקרוסקופ כירורגי או כל סטריאוסקופ אחר שיכול להגיע להגדלה של 5-6x.
- החל 50 μL של מלוחים (בערך 1 טיפה) על עיני העכבר כדי למנוע התייבשות הקרנית. לחדש מלוחים כל 20 דקות.
- חותכים חתיכה של חוט אלומיניום (קוטר 0.08 מ"מ) 1 ס"מ אורך. החלק את החוט מהצד השודד באופן לשוני באזור הבין-פרוקסימלי לשאוג את נקודת המגע בין הטוחנות הראשונה והשנייה באמצעות מחזיק מחט מיקרוכירורגי. השאירו קצה חופשי של 2 מ"מ מול הטוחנת הראשונה על מנת להיות מושחלים לקצה האביב.
- חותכים חתיכת סליל ניקל טיטניום (NiTi), סביב 7 עד 9 חוטים אורך.
הערה: התכונות האלסטיות של הסליל יספקו כוח קבוע לתנועה אורתודונטית. האורך הכולל הבלתי מרוסן של הסליל צריך להיות קצר יותר מהפער בין החותך לבין הטוחנת. זכור כי 2 חוטים נוספים נדרשים בכל קצה כדי לעגן סליל לשן. חוט אלומיניום נבחר על מנת להפחית חפצי סריקה כגון התקשות קרן במהלך סריקת מיקרו CT. - הכנס קפיץ סליל NiTi (קוטר חוט 0.15 מ"מ, קוטר סליל פנימי 0.9 מ"מ; מספק כוח של 10 גרם) בין הטוחנת הראשונה התחתונה והחותך התחתון. השתמש קשירה תיל מוכנס סביב הטוחנת הראשונה בשלב 1.6, לסובב את החוט בחוזקה סביב 2 חוטים של קפיץ סליל כדי לתקן את סליל בצד טוחן.
- כדי להבטיח רמת כוח אחידה, השתמש בדיוק 3 חוטים פעילים בין הטוחנת הראשונה לבין החותך. הסר באופן זמני את שרשרת החשמל מהחותך ולולאה 2 עד 3 הליכי משנה ללא מאמץ מעל החותך כדי לעגן את סליל. החלק את הליכי המשנה כלפי מטה אל שוליים של חניכיים חופשיים של החותך.
- מניחים שכבה של שרף מרוכב זרימה על הגבול החותך של סליל לרפא אותו עם אור ריפוי שיניים. החלף את שרשרת החשמל לאחר ריפוי שרף.
- בעזרת אותו אור ריפוי, מחממים את סליל NiTi למשך 20 שניות. זה יהדק את סליל NiTi. המיקום הסופי מוצג באיור 1C.
- או להשאיר את הצד הנגדי שלם או להכניס תרמית כגון החוט בין הטוחנות הראשונה והשניה.
- מניחים את העכבר המרדים תחת אור מחומם כדי לשמור על העכבר חם עד ההתאוששות.
- הנח את העכבר בחזרה לתוך כלוב בודד ולפקח מדי יום. אין צורך בשינוי דיאטה במהלך תנועה אורתודונטית.
הערה: מכשיר OTM בצד אחד גורם לאי נוחות מסוימת אך אינו פוגע בהאכלה. עם זאת, החדרת מכשירים משני הצדדים אינם מומלצים בשל כמות נוספת של אי נוחות. אין צורך בתרופות לשיכוך כאבים אלא אם כן נראים סימנים חיצוניים של כאב.
2. סריקת מיקרו-CT של סיבי PDL בהמי-גמל טרי
- הרכבה על ההמי-מנדיבל (איור 2)
- לאחר משך הזמן הרצוי של תנועה אורתודונטית, להקריב את העכבר באמצעות נקע בצוואר הרחם. הסר את הלסת התחתונה ונפרד ללסתות ההמי-גברים.
הערה: מאז המדגם לא יתוקן, זה קריטי כדי לבצע את הניתוח של הלסת הרכבה בהקדם האפשרי, באופן אידיאלי בתוך 30 דקות. - מוציאים בעדינות את הרקמה הרכה שמסביב עם מגבון נקי ללא מוך.
- הסר את המכשיר האורתודונטי באמצעות מספריים מיקרוכירורגיים ופינצ'רים תחת מיקרוסקופ סטריאו עם הגדלה של פי 4 לפחות.
- יש לשמור על דגימה לחה בנפח של 1.5 מ"ל, צינור מיקרו-צנטריפוגה יחד עם פיסת מגבון נטולת מוך לחה במים.
- מניחים שרף מרוכב שיניים לאריזה לתוך חריץ המדגם על הבמה, ולאחר מכן למקם את ההמי-mandible טרי לתוך מרוכבים. לפני ההרכבה לוודא כי משטח העצם במגע עם מרוכבים שיניים הוא ללא כל רקמות רכות יבש, אחרת מרוכבים שיניים לא לרפא כראוי.
- התאימו את מיקום ההמי-נדיבל עד שהטוחנת הראשונה תתמקד בחריץ האמצעי של הבמה. ודאו שהמשטח ה-occlusal אופקי. לרפא את מרוכבים כאשר מרוצה עם המיקום.
הערה: כמויות קטנות נוספות של מרוכבים שיניים ניתן להציב על הצדדים של hemi-mandible ו / או על פני החותך כדי לסייע בייצוב המדגם. - מניחים לנגב מוך מעומעם בתוך בריכות לחות בשלב המדגם. מניחים מרוכב שיניים על פני השטח occlusal של הטוחנת הראשונה. לפני סגירת התא, ודא ששום דבר לא חוסם את נתיב הרנטגן ברמת הדגימה.
- תדביק את התא במיקרו-סי-טי. בורג התא לתוך שלב מדגם מיקרו CT כך התנועה במהלך ההדמיה ממוזער.
- הפעל את צילומי הרנטגן וצלם תמונות דו-מימדיות תוך הנמכת הסדן אנכית, עד שהקצה של הסדן מוקף בהרכב אך לא זוהתה עלייה בכוח.
- לאחר הסדן מוטבע מורכב, לסגור את מקור הרנטגן. לאחר מכן, פתח את תא המיקרו-CT וריפוי המרוכב דרך חלון פרספקס שקוף.
- לאחר משך הזמן הרצוי של תנועה אורתודונטית, להקריב את העכבר באמצעות נקע בצוואר הרחם. הסר את הלסת התחתונה ונפרד ללסתות ההמי-גברים.
- הגדרות מיקרו-CT
- הגדר את מתח המקור ל- 40 kV ואת הזרם ל- 200 μA. באמצעות גלאי הגדלה 10x, מקם את הדגימה בתוך מסגרת הראייה. השתמש ב- binning של 2 עבור התמונות שנלכדו.
הערה: מכיוון שה-PDL פחות צפוף משמעותית מהעצם והשן, הדמיה של ה-PDL דורשת כוח גבוה יותר וזמן חשיפה גבוה יותר. פרוטוקול זה יספק הגדרות להמחלה חזותית של ה- PDL. - הגדר זמן חשיפה של תמונה בודדת ל- 25 שניות. הגדר סיבוב של שלב הדגימה לטווח של 183 מעלות או יותר. כוון את הסריקה ל-2500 תחזיות. אין להשתמש בכל מסנן מקור רנטגן, הסריקות וכתוצאה מכך יש גודל voxel של 0.76 מיקרומטר בכל צד.
- לאסוף סריקת ייחוס לשחזור נאות על פי הנחיות מיקרו CT. השתמש במספר 1/3 של תמונות ייחוס כסך ההקרנות. בנה מחדש את אמצעי האחסון ללא איזון נוסף, באמצעות אלגוריתם מסונן להקרנה אחורית.
- הגדר את מתח המקור ל- 40 kV ואת הזרם ל- 200 μA. באמצעות גלאי הגדלה 10x, מקם את הדגימה בתוך מסגרת הראייה. השתמש ב- binning של 2 עבור התמונות שנלכדו.
3. שיטת סליקה (איור 3)
- הכן חמישה צינורות מיקרו צנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- הכן 1.4 מ"ל של הפתרונות הבאים בצינורות מיקרו צנטריפוגה 1.5 מ"ל: 4% paraformaldehyde (PFA) מלוחים חוצץ פוספט (PBS), 50% אתנול (EtOH) במים deionized (DI), 70% EtOH במים DI, ושני צינורות של 100% EtOH.
הערה: PFA משמש לעיבוע המדגם. סליקה ECi יעבוד גם על דוגמאות שלא תוסף. כדי לנקות דוגמאות שלא תעודה, פשוט דלג על שלב PFA. - מקום ניתח hemi-mandible ב 4% PFA. מכסים בנייר אלומיניום ומניחים על הנדנדה על תפאורה עדינה בטמפרטורת החדר למשך 6 שעות.
- להעביר את hemi-mandible ל 50% EtOH. מניחים אותו על הנדנדה מכוסה אור במשך 16 שעות.
- להעביר את ההמי-מנדיבל ל-70% אט"ו. מניחים אותו על הנדנדה מכוסה אור במשך 16 שעות.
- להעביר את ההמי-90 ל 100% EtOH. מניחים אותו על הנדנדה מכוסה אור במשך 16 שעות.
- חזור על 3.6. בצינור 100% EtOH השני.
- הכן 5 מל של ECi בצינור או פוליפרופילן.
הערה: ECi ממיס פוליסטירן, אך לא פוליפרופילן. כמו כן, אם לא באמצעות רקמה עם חלבונים פלואורסצנטיים המדגם יכול להיחשף לאור במהלך הליך הסליקה. - העבר את ההמי-מנדיבל לצינור ECi. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום ומניחים על הנדנדה על הגדרה עדינה למשך 12 שעות לפחות.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן דגימה מיובשת ב-ECi בטמפרטורת החדר. נקודת ההקפאה או ההיתוך של ECi היא 6.5 עד 8 °C (60 °F). אין לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. - ההמי-מנדוס מוכן להדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערה: במהלך ההדמיה, המדגם חייב להיות שקוע ב- ECi כדי להישאר שקוף אופטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נייר זה מציג שיטה לייצור OTM, כמו גם שתי שיטות להדמיה תלת-ממדית של סיבי קולגן בתוך ה- PDL ללא כל חתך. למטרות מחקר בבעלי חיים, כאשר יישור השיניים אינו הכרחי, תנועת השן נחשבת אורתודונטית אם היא יוצרת שיפוץ של עצם מכתש בכל רמות השורש. נדרשת רמת כוח קבועה המופעלת על השיניים על מנת ליצור OTM אמין. כאן, סליל NiTi מופעל צורה זיכרון משמש כדי ליצור כוח עקבי של 10 גרם לאורך זמן הניסוי של 7 ימים ומעבר אם מוצדק. הפעלת הסליל המתוארת כאן (איור 1) יוצרת מתח בסליל NiTi בתוך השלב המרטנזיטי ומביאה את הסליל למצב ההיסטרזיס, אשר מספק מתח מתמיד על השן. חימום סליל עם אור ריפוי לאחר החדרת סליל גם לוודא את הססוגת יעבור לצורה האוסטרלית שלה אפקט זיכרון הצורה יתקיים.
כאן אנו מראים תוצאות מייצגות מעכברים זכרים בני 9 שבועות. הרווח המזיודיסטלי הממוצע בין הכתרים של הטוחנות הראשונה והשנייה לאחר 7 ימים של OTM הוא 40 מיקרומטר כפי שנמדד בין המשטחים הבין-פרוקסימליים של הטוחנות במיקרו-CT עם הגדלה של 1X (n = 12, st.dev. = 15 מיקרומטר) (איור 1E). השטח הממוצע של ה-PDL בכיוון המזיודיסטלי הוא 80 מיקרומטר לפני ואחרי 7 ימים של OTM (איור 4B). זה מאשר כי הטוחנת הראשונה שתורגמה באופן מסילי ו-7 ימים היא זמן הולם ליצירת OTM במודל עכבר תוך יצירת תהליכים של ספיגת עצם ואפיוז בטבע (איור 4). עכברים קיבלו דיאטה סטנדרטית של משטחים קשים. לא נעשה שינוי דיאטה לאחר החדרת המכשיר.
השיטה הראשונה שהוצגה כדי לדמיין את השינויים בתסביך עצם השיניים PDL במהלך OTM מבוססת על הדמיית מיקרו-CT משופרת פאזה של רקמות טריות (איור 4) שתוארה בפירוט בעבר9,18,19,20,22,23. בקיצור, בתנאי יכולת שיפור פאזה של מיקרו CT או סינכרוטרון, ייצוב מכני של הרקמה הסיבית וסביבה לחה, סיבי קולגן טריים ניתן לדמיין ללא כל קיבוע או סוכנים מנוגדים. ב PDL הסיבים שנראים הם אלה המחוברים הן השן ואת העצם, בעיקר סוג אני קולגן19. הזדמנות ייחודית זו לדמיין בתלת מימד PDL שלם מאפשר ניתוח של צפיפות סיבים 3D, כיוון סיבים, כמו גם את התנועה 3D של השן כפי שתואר קודם לכן9,19. באופן ספציפי, כאן אנו מציגים את ההדמיה של הרשת הסיבית ב- PDL. בזמן 0, שיפוץ פיזיולוגי הן את העצם ואת PDL ניתן לראות. שיפוץ מתרחש גם במלט הסלולר; עם זאת, זה לא קשור ישירות לשיטה המוצגת ולכן לא יהיה פירט. ממשק העצם-PDL חלק ברובו הן במישורים הרוחביים (איור 4A) והן במישור הסגיטלי(איור 4B)לפני כל יישום כוח. במישור הקורונה(איור 4C),ממשק העצם-PDL מחוספס במיוחד לכיוון האזור האפור שעשוי להצביע על איזון השיפוץ נוטה לכיוון ספיגה מחדש. ב- 3 ימים של OTM (איור 4D-F), שעליו הטוחנת הראשונה מועברת באופן מסיאלי (הכיוון מיוצג על-ידי החץ המקווקו), צפיפות הסיבים ב- PDL מצטמצמת (ראשי חצים לבנים). ממשק העצם-PDL הוא מחוספס יותר מאשר ב 0 ימים עקב התפתחות של מכתשים על פני העצם אשר מעידים על פעילות osteoclastic ותהליכי ספיגת עצם הקשורים בעיקר כוחות דחיסה PDL26, אולם כאן נראה באזורי מתח ב 3 ימים. הרס רקמות באזורי מתח בתוך PDL הוצע27,28 וניתן לראות בבירור בשיטה זו. הגבול המחוספס נראה ברמות שונות של השורשים (חצים לבנים) ולכן מרמז על כך שתנועת השן היא תרגום בטבע ולא רק להטות את הכתר. ב 7 ימים של OTM (איור 4G-I), סימני ספיגת עצם, כגון מכתשים בתוך העצם, גבולות מחוספסים והתרחבות של שטח PDL, נראים בכל המישורים אבל שטח PDL הממוצע הוא צר יותר מאשר ב 3 ימים של OTM (איור 4D-F). באזורים מסוימים עם זאת, גבול העצם-PDL הפך חלק יותר לאחר 7 ימים של OTM אזורים אלה ממוקמים על משטחים דיסטליים של השורשים, אשר ככל הנראה אינדיקציה apposition העצם, כצפוי OTM לכיוון mesial.
בשל זמן הדמיית מיקרו-CT ארוך (~ 19 שעות) ואת הסיבוב של הבמה, הרכבה של המדגם הוא חיוני כדי לשמור על המדגם עדיין. דגימה לא יציבה תגרום לסריקות מטושטשות. איור 5 מציג כיצד נראית סריקת המיקרו-CT כאשר הדגימה זזה במהלך הסריקה. השן והעצם מטושטשות. לא סיבי PDL ולא אוסטאוציטים נצפו. במקרים כאלה קיימת צללית סביב שולי החפץ. באיור 5, ניתן לראות קווי מתאר מרובים של כתר השן (חצים).
בהתאם ליעד המחקר, הרזולוציה וההדמיה של סיבי PDL עשויים להיות מוקרבים במסחר לזמן סריקה קצר יותר כאשר רק מידע על הרקמות הקשות רצוי.
שיטה משלימה להדמיה תלת-ממדית של סיבי ה-PDL ללא כל חתך היא באמצעות מיקרוסקופיה אופטית על דגימות שנוקו אופטית באמצעות ECi (איור 3). שיטה זו יכולה לשמש על דגימה ללא קיבעון ושומרת אותות פלואורסצנטיים הקיימים ברקמה לפני הסליקה. חימי-mandibles לפני ואחרי סליקה ECi מוצגים באיור 3B ו 3C. סליקה מדגם נאותה של PDL ניתן לאשר כאשר נייר רשת ניתן לראות דרך ramus של הלסת התחתונה. ניתן להתאים את כמות הסליקה על ידי הארכת תהליך ההתייבשות. איור 6 מציג את אות הדור ההרמוני השני (SHG) מסיבי קולגן הן בעצם מכתשית והן ב- PDL בלסת בלתי אפשרית מנוקה. הדמיית סיבי הקולגן של העצם בתלת מימד היא תהליך מסובך, אשר לעתים קרובות משתמש בשיטות מיקרוסקופיה אלקטרונים כגון FIB / SEM. עם זאת, באמצעות שיטת סליקה מבוססת ECi ו SHG, סיבי העצם מכתשי נראים בבירור, במיוחד בכיוון האופקי. כאשר מתרגמים דרך המדגם עמוק לתוך PDL מפני השטח של העצם, המעבר לרמת סיבי PDL ברור מאוד כמו הסיבים פתאום לשנות את הכיוון שלהם אחד אנכי.
מיקרוסקופיית אור יכולה לשמש גם להדמיית חלבונים פלואורסצנטיים דרך העצם. במקרה זה של דגימה מנוקה מ Flk1-creמהונדס ; עכבר Tdtomato19,29,30, תאי האנדותל הפלואורסצנטיים המצפים את כלי הדם נצפו בבירור(איור 7A,B, C, E). סליקה נכונה היא המפתח ליצירת תמונות מובנות עם מיקרוסקופיית גליון אור. כאשר העצם אינה מנוקה לחלוטין, כלי הדם בתוך ה- PDL לא נצפו (איור 7D, F).
איור 1: הגדרת הכנסת מכשיר אורתודונטי. א. מיטת עכבר עשויה מאספקת מעבדה כדי לתמוך בבעל החיים ולשמור על הפה פתוח. פלטפורמת פלסטיק (PP) לגוף היא על שיפוע 30 ° ואת משענת הראש (HR) הוא על זווית 45 ° מפני השטח של PP. מעמד צינור דו שכבתי (TS) משמש כדי לרומם את ראש הקצה של PP. לולאת מהדק הנייר (חץ שחור) מעגנת את החותכות העליונות, ושרשרת החשמל האורתודונטית התחתונה (חץ לבן) מתחברת אל החותכות התחתונות. מראה בדיקה בקוטר 5 מ"מ שימשה לבדיקה חזותית של הטוחנות. ב. ב. מבט צדדי על מיטת העכבר. זוויות בין משטחים מסומנות (ירוק ומגנטה). ג. ג. תמונה מייצגת של ההתקן הממוקם כראוי. ד. הטוחנות נראות דרך מראה הבדיקה לפני השתלת המכשיר. אי, אי. תמונה מייצגת של טוחנות לאחר התנועה האורתודונטית. קווים מקווקווים עוקבים אחר קווי המתאר של הטוחנות הראשונה והשניה. ו. דיאגרמה של המכשיר והמיקום שלו. הקו האדום מייצג את חיבור התיל סביב הטוחנת הראשונה. קו כתום מייצג את שף ללא הפרדות צבע הניתן להזרמה המשמש לעיגון הסליל. סליל NiTi מוצג בכחול ומסומן. ג'י, ג'י. ניתח hemi-mandible עם המכשיר מחובר לאחר תנועה אורתודונטית של 7 ימים. שים לב כיצד 3 הליכי המשנה סליל עדיין פתוחים, המציין כי סליל עדיין פעיל לאחר 7 ימים. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ ב- E ו- G. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: Hemi-mandible רכוב בתא בהתאמה אישית להדמיית מיקרו-CT. A. הגדרה מלאה של תא הדגימה בתוך מכונת המיקרו-CT. מקור הרנטגן נראה משמאל ואת הגלאי מימין. מלבן אדום מתאר את ההמי-9ן רכוב בתא על שלב המדגם (SS). תא הדוגמה המוצג כאן הוא חלק ממסדר בדיקות מכניות, כולל מנוע (M), סדן (A, המתואר על ידי קווים מקווקווים לבנים) ופיר סדן (AS) על גבי התא. ההגדרה המלאה על במת הסי-טי. תמונת הכניסה מציגה תקריב של האזור המסוקף בקו מיתאר אדום, המכיל את תא הלחות עם דגימה בפנים. ב. ב. תצוגה עליונה של מדגם נטענת על שלב הדגימה. בריכות לחות (חץ אפור) בנויות על ההיקף כדי לשמור על לחות במהלך ההדמיה. על הבמה המעגלית באמצע, hemi-mandible יכול להיות מותקן בחריץ עמוק מלוכסן (חץ שחור). חריץ דק (חץ לבן) מסמן את קו האמצע של הבמה כדי לסייע בהכוונת המדגם. ג. ג. דיאגרמה של השלב המעגלי עם הגרוב לדוגמה. שנטוי החריץ תומך בלסת התחתונה ומאפשר להרכיב את הטוחנות לאורך הציר האנכי של השורשים. ד. פרוסת מיקרו-CT דו-ממדית מייצגת בשילוב עם תמונת נפח תלת-ממדית של הדגימה הניתנת ל-hemi-mandible. הפער הבין-פרוקסימלי כאן הוא 52 מיקרומטר. המדגם מותקן על שלב המדגם שלהלן (לא מוצג) והסדן (A) למעלה על ידי מרוכב שיניים (DC). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר.
איור 3. שיטת סליקה מבוססת ECi עבור hemi-mandibles עכבר מנותח. א. ה-hemi-mandible המנותח שקוע ב-4% PFA, 50% EtOH, 70% EtOH ו-100% EtOH ברצף. לאחר התייבשות, hemi-mandible מאוחסן ECi עבור מינימום של 12 שעות עד הדמיה. ב. ב. חימי-mandible מיד לאחר הניתוח. ג. ג. חמי-מנדבל לאחר השלמת הסליקה. סרגלי קנה מידה = 5 מ"מ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סריקות מיקרו-CT מייצגות של ה-PDL של מדגם טרי בשלבים השונים של התנועה האורתודונטית. איי-סי, אין תנועה אורתודונטית. א. תמונה מיקרו-CT 2D במישור הרוחבי של ההמי-mandible מראה את השורשים mesial (ז) ודיסטלי (D) בתוך עצם מכתשית, B-Buccal, L-Lingual הצדדים של עצם מכתשית. בין שורשי השן לבין עצם מכתשית, מרחב PDL והסיבים בתוכו נצפו בבירור. ב. תמונה דו-מימדית במישור הסגיטלי. ג. תמונה דו-מימדית במטוס הקורונל. D-E, תמונות דו-ממדיות לאחר 3 ימים של OTM, ראשי החצים מצביעים על אזורים ב- PDL עם ירידה בצפיפות סיבי הקולגן, חצים לבנים מצביעים על אזורים של ספיגת עצם. G-I, תמונות דו מימד לאחר 7 ימים של OTM, חצים שחורים נקודה באזורים של apposition העצם. סרגלי קנה מידה = 150 מיקרומטר.
איור 5: תמונת מיקרו-CT דו-מימדית במישור הסגיטלי, המציגה מבנים מטושטשים של השן והעצם עקב תנועת השן במהלך הסריקה. החצים מצביעים על קווי לוח מרובים של השן, המציינים את תנועתה. סרגל קנה מידה 150 מיקרומטר.
איור 6: ECi פינה את הלסת התחתונה המציגה את הטוחנת הראשונה בתמונה עם הדור ההרמוני השני (SHG). נקודות חץ לבן באזור שבו סיבי קולגן של PDL נראים, לציין את הכיוון האנכי, חצים שחורים מצביעים על אזור שבו שני סיבים אנכיים של PDL, כמו גם סיבים אופקיים של עצם מכתשית נראים. T-שן, F-furcation, עצם מכתש AB, שורש MR-mesial, שורש DR-דיסטל, סרגל קנה מידה 150 מיקרומטר. תמונות התקבלו באמצעות עדשה מרובת טבילה פי 20 לפתרונות עם RI של 1.33-1.56. לייזר עירור נקבע על 860nm ב 10% כוח. זמן מגורים פיקסל: 0.51μs; מצב סריקה: מסגרת; ממוצע: 16; סוג גלאי: גלאי שפופרת פוטומולטייארי שאינו מוסק; גלאי רווח 800V. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. תמונות מיקרוסקופ גליון אור של ECi-פינה Flk1-Cre;tdTomato עכבר. א. ניקוי אופטימלי של השליטה בהמי-מנדיבל. רשת כלי הדם בתוך העצם (ראש החץ) ומרחב PDL (חץ) גלויה. ב. ב. התחלה של האזור mesiolingual של הטוחנת הראשונה (אדום מתואר ב- A) מראה את כלי הדם. ג. פינה בצורה אופטימלית OTM 7 ימים חמי-mandible ו- D. תת-אופטימלי פינה חמי-9ן. אי, אי. תמונה דו-מימדית של פאנל C במישור הסגיטלי, התמונה מדגימה כלי דם מוגדרים היטב בעצמות (חץ אפור) וחלל PDL (חצים לבנים). ו. תמונת פרוסה דו-ממדית של חלונית D, באותו אזור כמו תמונות ב- E, והתוצאה היא תמונה מטושטשת. סרגלי קנה מידה A, C, D = 500 מיקרומטר, B, E, F = 100 מיקרומטר תמונות צולמו עם מטרה תוכנית 5X, באמצעות המצלמה כמו גלאי. לייזר עירור היה 561 ננומטר ב 4% כוח. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יצירת OTM בעכברים רצויה מאוד בשל הגודל, הגנטיקה ויתרונות הטיפול. השימוש בלסת התחתונה מספק טיפול קל הן מבחינת ניתוח רקמות והן מבחינת הכנה והדמיה לדוגמה. כאן הצגנו שיטה ליצירת OTM עם תנועה תרגום של השן בתוך העצם בתוך 7 ימים של OTM. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להאריך את משך הזמן הכולל של תנועת השן, שכן סליל מופעל מספק רמת כוח קבועה לתנועה של עד כ 1 מ"מ. עם זאת, הצד mesial של סליל קבוע החותך, אשר מתפרץ כל הזמן. כתוצאה מכך, וקטורי הכוח ישתנו בהדרגה ויתחילו לייצר כוחות שחול. ניתן להימנע מכך אם מתבצעת התאמה של רמת הקובץ המצורף בקצה החיבור כל 7 ימים.
ה- PDL הוא היוזם של OTM, ולכן להבנת המבנה והתפקוד שלו בשלבים השונים של ה- OTM יש חשיבות רבה. עם זאת, PDL אינו אחיד הן במבנהו והן בתפקודו19,22,31,32. כתוצאה מכך, על מנת לאחזר נתונים משמעותיים, PDL צריך להיחקר בתלת מימד וכל סעיף רקמות ומניפולציה יש להימנע ככל האפשר. עם זאת, חקירת רקמה רכה הממוקמת בין שתי רקמות קשות הופכת דרישות כאלה לאתגרות למימוש. שיטות מסורתיות של לימוד PDL לעתים קרובות כרוך להתפשר על המבנה 3D והסרת הרקמה מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלה, אשר כתוצאה מכך משנה PDL תכונות מבניות ביומכניות. הן תכונות מבניות והן תכונות ביומכניות עוברות שינויים דינמיים במהלך OTM המצדיקים שמירה על הקשר 3D הרקמה עוד יותר. על מנת לעשות זאת תיארנו שתי שיטות המאפשרות הדמיית רקמות שלמות ללא חתך, אשר ניתן להשתמש בהם גם על אותות פלואורסצנטיים לוקליזציה מדגם זהה, נתונים מורפולוגיים ומינרליזציה.
התיאור המתודולוגי שסופק מנחה את הקוראים ליישם את השיטות בתחומי הלימוד שלהם. הדמיית המיקרו-CT מאפשרת הדמיה תלת-ממדית של רשת סיבית PDL. ניתן לנתח תמונות כדי לייצר כיווניות וניתוחי צפיפות ולחקור כמותית שינויים ב- PDL במהלך OTM. תיארנו גם שיטת סליקה המאפשרת הדמיה בשיטות מיקרוסקופיות אופטיות זמינות כגון מיקרוסקופיית גליון אור והדמיה קונפוקלית. מיקרוסקופיית גליון אור יש את היתרון של הפקת תמונה 3D של דגימות גדולות עם מהירות הדמיה מהירה יחסית. מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה תוך שימוש באות SHG להדמיית סיבי קולגן ותגי פלואורסצנט. שיטות אלה באופן עצמאי או משולב לפתוח אפשרויות רבות מחקרים מבניים 3D עם הכנת רקמות מינימלית.
מספר שלבים מאתגרים בפרוטוקול זה דורשים תשומת לב נוספת:
ראשית, במהלך מיקום סליל, חוט קשירה חייב להיות ממוקם בבטחה בין טוחנות הראשון והשני. תהליך זה מאתגר בשל הממדים הקטנים של שיני העכבר. אנו ממליצים להשתמש בסטריאומיקרוסקופ ספסל כדי להנחות את המיקום. עם זאת, תנועות קטנות במהלך ההליך עשוי להזיז את העכבר ולגרום לאזור העניין לצאת משדה הראייה. כחלופה, אנו מציעים להשתמש 4-5x זכוכית מגדלת כי ניתן ללבוש על המפעיל, אשר יכול לעזור להציג את האזור באופן דינמי יותר.
שנית, תוצאות הסליקה תלויות בתהליך ההתייבשות. אם המדגם לא הגיע לרמת השקיפות הרצויה, ההצעה שלנו היא להגדיל את זמן ההתייבשות. ליתר דיוק, זמן טבילה ארוך יותר ב- 100% EtOH הוכח כמ לשפר את השקיפות של המוצר הסופי. עם זאת, יש לציין כי רמה מוגברת של התייבשות יכולה להפחית באופן דרמטי את רמות הפלואורסצנטיות24,25. השיטה המוצגת המבוססת על ECi הוצגה כדי לשמר אותות פלואורסצנטיים במשך יותר מ 2 שבועות24.
היבטים של פרוטוקול זה ניתן לשנות כדי ללמוד שפע של מטרות אחרות. התא שעיצבנו בתוך המיקרו-CT יחד עם תא עומס ומנוע ויש לו את היכולת לבצע בדיקות מתח/דחיסה על דגימות ההמי-מאני. בשילוב עם ההדמיה של המיקרו-CT, הגדרה זו יכולה להראות שינויים ב- PDL in-situ עם עומסים מכניים משתנים21. שיטת הסליקה המתוארת יכולה להיות מיושמת גם על דגימות לא משויסות, מה שמספק הזדמנות לשילוב מעניין של שיטות הדמיה שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). ברצוננו להודות למרכז הרווארד להדמיה ביולוגית על תשתיות ותמיכה. כל הדמויות נוצרות עם biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, suppl 1 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. dA., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
