Summary
Представлен протокол генерации ортодонтического движения зубов у мышей и методы 3D визуализации коллагеновых волокон и кровеносных сосудов пародонтальной связки без сечения.
Abstract
Ортодонтическое движение зубов представляет собой сложный биологический процесс изменения ремоделирования мягких и твердых тканей в результате внешних сил. Чтобы понять эти сложные процессы ремоделирования, крайне важно изучить ткани зуба и пародонта в их 3D-контексте и, следовательно, свести к минимуму любые сечения и тканевые артефакты. Мышиные модели часто используются в биологии развития и структурной биологии, а также в биомеханике из-за их небольшого размера, высокой скорости метаболизма, генетики и простоты обращения. В принципе, это также делает их отличными моделями для стоматологических исследований. Однако основным препятствием является их небольшой размер зубов, в частности моляров. Данная работа направлена на предоставление пошагового протокола генерации ортодонтического движения зуба и двух методов 3D-визуализации фиброзного компонента пародонтальной связки мышиного моляра нижней части. Первый представленный метод основан на микро-КТ-установке, позволяющей фазовую визуализацию свежих коллагеновых тканей. Второй метод представляет собой метод очистки кости с использованием этилциннамата, который позволяет визуализировать кость без сечения и сохраняет эндогенную флуоресценцию. Сочетание этого метода очистки с репортерными мышами, такими как Flk1-Cre; TdTomato предоставил первую в своем роде возможность изобизировать 3D-сосудистую в PDL и альвеолярной кости.
Introduction
Основным биологическим процессом в ортодонтическом движении зубов (OTM) является ремоделирование кости. Триггер для этого процесса ремоделирования приписывается изменениям в структуре пародонтальной связки (PDL), таким как напряжение внеклеточного матрикса (ECM), некроз, а также разрушение кровеносных сосудов и образование1,2,3. Другие возможные триггеры для ремоделирования альвеолярной кости связаны с зондированием силы остеоцитами в кости, а также механической деформацией самой альвеолярной кости; однако их роль в ОТМ до сих пор до конца не выяснена4,5.
Несмотря на множество исследований, направленных на выявление структурно-функциональных отношений PDL при OTM, четкий функциональный механизм еще предстоит определить6,7. Основной причиной этого является проблема с получением данных о мягких тканях (PDL), расположенных между двумя твердыми тканями (цементом и альвеолярной костью). Принятые методы сбора структурной информации обычно требуют фиксации и секционирования, которые нарушают и изменяют структуру PDL. Более того, большинство из этих методов дают 2D-данные, которые даже если и не искажены, дают лишь частичную и локализованную информацию. Поскольку PDL не является однородным по своей структуре и функциям, оправдан подход, который обращается к неповрежденной 3D-структуре всего комплекса зуб-PDL-кость.
В этой статье будет описан метод генерации OTM у мышей и два метода, которые позволяют 3D-визуализацию коллагеновых волокон в PDL без какого-либо сечения образца.
Мышиные модели широко используются для экспериментов in vivo в медицине, биологии развития, доставке лекарств и структурных исследованиях. Они могут быть генетически модифицированы для устранения или усиления специфических белков и функций; они обеспечивают быстрый, воспроизводимый и предсказуемый контроль развития; они также легко изобразимы из-за их небольшого размера8. Несмотря на свои многочисленные преимущества, мышиные модели в стоматологических исследованиях используются не часто, особенно когда клинические манипуляции оправданы, в основном из-за небольших размеров зубов. Животныемодели,такие как крысы9,10,11,собаки12,13,свиньи14,15,16 и обезьяны17, используются чаще, чем мыши. С недавним развитием методов визуализации с высоким разрешением преимущества использования мышиной модели для расшифровки запутанных процессов в OTM многочисленны. В данной работе представлен метод генерации мезиального движения молярного зуба в мандибле с постоянными силовыми уровнями, которые вызывают ремоделирование кости. Большинство экспериментов OTM на грызунах проводятся в верхней челюсти, так как подвижность мандиблы и наличие языка добавляют еще один уровень сложности. Тем не менее, мандибля имеет много преимуществ, когда желательна 3D-структурная целостность. Его можно легко рассекать как целую кость; у некоторых видов он может быть разделен на две геми-мандиблы через волокнистый симфиз; он компактный, плоский и содержит только зубы без каких-либо синусовых пространств. Напротив, верхняя челюсть является частью черепа и тесно связана с другими органами и структурами, поэтому необходимо обширное сечение, чтобы рассекать альвеолярную кость с ассоциированными зубами.
Используя камеру влажности в доме, соединенную с системой загрузки внутри микро-КТ высокого разрешения, которая позволяет фазовое усиление, мы разработали метод визуализации свежих волокнистых тканей в 3D, как описаноранее 9,18,19,20,21,22,23. Свежие ткани сканируются сразу после жертвоприношения животного без какого-либо окрашивания или фиксации, что уменьшает тканевые артефакты, а также изменения биомеханических свойств. Эти 3D-данные могут быть использованы для распределения и анализа направления волокон, как описано в другом месте19.
Второй 3D-метод визуализации целых тканей, представленный здесь, основан на оптической очистке мандиблы, которая позволяет визуализировать волокна PDL через кость без какого-либо сечения. Интересно, что он также позволяет визуализировать коллагеновые волокна самой кости, однако это не будет обсуждаться здесь. В целом, существует два метода очистки тканей. Первый представляет собой очистку на водной основе, когда образец погружается в водный раствор с показателем преломления более 1,4 либо путем простого погружения, гипергидратации или встраивания гидрогеля. Однако этот метод ограничен в уровне прозрачности, а также структурной сохранности ткани и поэтому требует фиксации ткани. Вторым способом, который дает высокопрозрачные образцы и не требует фиксации, является метод очистки на основе растворителей24,25. Мы создали модифицированный метод очистки на основе растворителей на основе этил-3-фенилпропа-2-еноата (этилциннамат, ECi) для образцов нижней и нижней впальца. Этот метод имеет преимущества использования нетоксичного пищевого очищающего агента, минимального усадки тканей и сохранения флуоресцентных белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководящими принципами NIH по уходу за лабораторными животными и их использованию и руководящими принципами Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию Гарвардского университета (Протокол No 01840).
1. Ортодонтическое движение зубов
- Чтобы создать кровать для мыши, используйте плоскую пластиковую платформу с клиновидным подголовником под углом 45 °. Подголовник может быть получен путем разрезания пластиковой коробки.
- Поднимите головной конец платформы, чтобы создать угол примерно 30° между подголовником и плоскостью стола. Прикрепите изогнутую толстую скрепку (диаметром 0,036 дюйма) к головному боковому концу, чтобы удерживать верхние резцы.
- На хвостовом конце создайте приподнятую поверхность, к которой может быть прикреплена ортодонтическая силовая цепь для удержания нижних резцов. Пример платформы приведен на рисунке 1.
- Обезболить мышь путем внутрибрюшинной инъекции ксилазина в 10 мг/кг и кетамина 100 мг/кг с использованием шприца 1 мл и иглы 27 калибра.
- Поместите обезболенную мышь на изготовленную по индивидуальному заказу платформу и обездвиживайте верхнюю челюсть, зацепив верхние резцы за петлю скрепки. Откройте нижнюю челюсть мыши ортодонтической силовой цепью, зацепленной за нижние резцы. Держите щеки втянутыми с помощью втягивателя рта мини-колибри.
- Поместите платформу под хирургический микроскоп или любой другой стереоскоп, который может достигать 5-6-кратного увеличения.
- Нанесите 50 мкл физиологического раствора (примерно 1 капля) на глаза мыши, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы. Пополняйте физиологический раствор каждые 20 мин.
- Вырежьте кусок алюминиевой проволоки (диаметром 0,08 мм) длиной 1 см. Сдвиньте проволоку с щечной стороны на язычно в межпроксимальной области ниже точки контакта между первым и вторым моляром с помощью микрохирургического игольчатого держателя. Оставьте 2 мм свободного края перед первым коренным голеном, чтобы вставить его в конец пружины.
- Вырежьте кусок никель-титановой (NiTi) катушки длиной от 7 до 9 нитей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Упругие свойства катушки обеспечат постоянную силу для ортодонтического движения. Общая ненапряженная длина катушки должна быть короче зазора между резцем и моляром. Имейте в виду, что на каждом конце необходимы дополнительные 2 резьбы, чтобы закрепить катушку к зубу. Алюминиевая проволока выбирается для того, чтобы уменьшить артефакты сканирования, такие как закалка луча во время микро-КТ сканирования. - Вставьте пружину катушки NiTi (диаметр проволоки 0,15 мм, внутренний диаметр катушки 0,9 мм; обеспечивает усилие 10 г) между нижним первым моляром и нижним резцем. Используйте проволочную лигатуру, вставленную вокруг первого моляра на шаге 1.6, плотно скрутите проволоку вокруг 2 резьбы пружины катушки, чтобы закрепить катушку на молярной стороне.
- Для обеспечения равномерного уровня силы используйте ровно 3 активные нити между первым моляром и резцей. Временно снимите силовую цепь с резцового резка и петлю от 2 до 3 ненатянутых резьб над резцем, чтобы закрепить катушку. Сдвиньте нити вниз к свободному от резцов краю дева.
- Поместите слой текучих композитных смол на резцевую границу катушки и отвержите ее зубным отверждающим светом. Замените силовую цепь после отверждения смолы.
- Используя тот же отверждающий свет, нагрейте катушку NiTi в течение 20 с. Это позволит затянуть катушку NiTi. Готовое размещение показано на рисунке 1С.
- Либо оставьте контралатеральную сторону неповрежденной, либо вставьте фикцию, такую как проволока между первым и вторым коренными лярами.
- Поместите анестезируемую мышь под нагретый свет, чтобы держать мышь в тепле до выздоровления.
- Поместите мышь обратно в индивидуальную клетку и следите за ней ежедневно. Во время ортодонтического движения не требуется менять диету.
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство OTM с одной стороны вызывает некоторый дискомфорт, но не ухудшает кормление. Тем не менее, вставка устройств с обеих сторон не рекомендуется из-за дополнительного количества дискомфорта. Обезболивающие препараты не нужны, если не видны внешние признаки боли.
2. Микро-КТ волокон PDL в свежих геми-мандиблях
- Монтаж геми-мандиблы (Рисунок 2)
- После желаемой продолжительности ортодонтического движения жертвуйте мышью через вывих шейки матки. Снимите мандиблю и разделите на геми-мандибли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку образец не будет зафиксирован, крайне важно выполнить рассечение челюсти и монтаж как можно скорее, в идеале в течение 30 минут. - Аккуратно удалите окружающие мягкие ткани чистой безворсовой салфеткой.
- Извлеките ортодонтическое устройство с помощью микрохирургических ножниц и пинцета под стереомикроскопом с увеличением не менее 4 раз.
- Держите образец влажным в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл вместе с кусочком безворсовой салфетки, смоченным водой.
- Поместите упаковываемую стоматологическую композитную смолу в прорезь образца на сцене, затем поместите свежую геми-мандиму в композит. Перед монтажом убедитесь, что поверхность кости, контактировка с зубным композитом, свободна от каких-либо мягких тканей и суха, иначе стоматологический композит не будет затвердеть должным образом.
- Отрегулируйте положение геми-мандиблы до тех пор, пока первый моляр не будет центрирован в средней канавке сцены. Убедитесь, что окклюзионная поверхность горизонтальна. Отверждите композит, когда удовлетворены позиционированием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные небольшие количества стоматологических композитов могут быть размещены по бокам получелюсти и/или поперек резца, чтобы помочь стабилизировать образец. - Поместите влажную безворсовую салфетку внутрь влагоемких бассейнов на стадии отбора проб. Поместите зубной композит на окклюзионную поверхность первого моляра. Прежде чем закрыть камеру, убедитесь, что ничто не блокирует рентгеновский путь на уровне образца.
- Прикрепите камеру в микро-КТ. Вкрутите камеру в стадию образца микро-КТ, чтобы движение во время визуализации было сведено к минимуму.
- Включите рентгеновские лучи и делайте 2D-изображения, опуская наковальню вертикально, пока кончик наковальни не будет окружен композитом, но увеличения силы не будет обнаружено.
- Как только наковальня будет встроена в композит, закройте источник рентгеновского излучения. Затем откройте камеру микро-КТ и отвержите композит через прозрачное окно из плексигласа.
- После желаемой продолжительности ортодонтического движения жертвуйте мышью через вывих шейки матки. Снимите мандиблю и разделите на геми-мандибли.
- Настройки микро-КТ
- Установите напряжение источника на 40 кВ и ток на 200 мкА. Используя детектор 10-кратного увеличения, поместите образец в рамки обзора. Используйте биннинг 2 для захваченных изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку PDL значительно менее плотный, чем кость и зуб, визуализация PDL требует более высокой мощности и времени воздействия. Этот протокол предоставляет параметры для визуализации PDL. - Установите время экспозиции одного изображения на 25 с. Установите поворот ступени образца в диапазоне 183 градусов и более. Установите сканирование для 2500 проекций. Не используйте фильтр источника рентгеновского излучения, полученные сканы имеют размер вокселя 0,76 мкм с каждой стороны.
- Соберите эталонное сканирование для правильной реконструкции в соответствии с рекомендациями микро-КТ. Используйте 1/3 количества эталонных изображений в качестве общих проекций. Восстановите том без дополнительного биннинга, используя алгоритм фильтрации обратной проекции.
- Установите напряжение источника на 40 кВ и ток на 200 мкА. Используя детектор 10-кратного увеличения, поместите образец в рамки обзора. Используйте биннинг 2 для захваченных изображений.
3. Метод очистки(рисунок 3)
- Подготовьте пять микроцентрифужных трубок по 1,5 мл.
- Готовят 1,4 мл следующих растворов в микроцентрифужных пробирках по 1,5 мл: 4% параформальдегид (PFA) в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), 50% этанол (EtOH) в деионизированной (DI) воде, 70% EtOH в воде DI и две трубки 100% EtOH.
ПРИМЕЧАНИЕ: PFA используется для фиксации образца. Очистка ECi также будет работать на нефиксированных образцах. Чтобы очистить нефиксированные образцы, просто пропустите шаг PFA. - Поместите рассеченную геми-мандиблю в 4% PFA. Накрыть алюминиевой фольгой и поместить на коромысло на щадящую установку при комнатной температуре на 6 ч.
- Переместите геми-мандиблю на 50% EtOH. Поместите его на коромышку, закрытую от света на 16 ч.
- Переместите геми-мандиблю на 70% EtOH. Поместите его на коромышку, закрытую от света на 16 ч.
- Переместите геми-мандиму до 100% EtOH. Поместите его на коромышку, закрытую от света на 16 ч.
- Повторите 3.6. во второй 100% etOH трубке.
- Приготовьте 5 мл ECi в стеклянной или полипропиленовой трубке.
ПРИМЕЧАНИЕ: ECi растворяет полистирол, но не полипропилен. Кроме того, если не использовать ткань с флуоресцентными белками, образец может подвергаться воздействию света во время процедуры очистки. - Переместите геми-мандиму в трубку ECi. Накройте трубку алюминиевой фольгой и поместите на коромышку на щадящую установку минимум на 12 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Обезвоженный образец может храниться в ECi при комнатной температуре. Температура замерзания или плавления ECi составляет от 6,5 до 8,0 °C. Не хранить при 4 °C. - Геми-мандибля готова к визуализации с помощью флуоресцентного микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время визуализации образец должен быть погружен в ECi, чтобы оставаться оптически прозрачным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой статье представлен метод получения OTM, а также два метода для 3D-визуализации коллагеновых волокон внутри PDL без какого-либо сечения. Для целей исследования на животных, когда выравнивание зубов не требуется, движение зуба считается ортодонтическим, если оно генерирует ремоделирование альвеолярной кости на всех уровнях корней. Постоянный уровень силы, приложенной к зубам, необходим для создания надежного OTM. Здесь активированная катушка NiTi с памятью формы используется для создания постоянной силы в 10 г в течение экспериментального времени 7 дней и более, если это оправдано. Активация катушки, описанная здесь(рисунок 1),генерирует деформацию в катушке NiTi в мартенситной фазе и приводит катушку в состояние гистерезиса, которое создает постоянную нагрузку на зуб. Нагревание катушки с помощью отверждающего света после вставки катушки также гарантирует, что сплав перейдет в свою аустенитную форму и произойдет эффект памяти формы.
Здесь мы показываем репрезентативные результаты от 9-недельных самцов мышей. Усредненное мезиодистальное пространство между коронками первого и второго моляров после 7 дней ОТМ составляет 40 мкм, измеренное между межпроксимальными поверхностями моляров в микро-КТ с 1-кратным увеличением (n=12, st.dev. = 15 мкм)(рисунок 1E). Усредненное пространство PDL в мезиодистальном направлении составляет 80 мкм до и после 7 дней OTM(рисунок 4B). Это подтверждает, что первый моляр, переведенный мезиально и 7 дней, является достаточным временем для генерации OTM в мышиной модели при генерации процессов резорбции и аппозиции кости в природе(рисунок 4). Мышей кормили стандартной жесткой паллетной диетой. После введения устройства никаких изменений в диете не производилось.
Первый представленный способ визуализации изменений в зубо-PDL-костном комплексе при ОТМ основан на фазовой усиленной микро-КТ визуализации свежих тканей(рисунок 4),которая была подробно описанаранее 9,18,19,20,22,23. Короче говоря, при условии возможности усиления фазы микро-КТ или синхротрона, механической стабилизации фиброзной ткани и увлажненной среды, свежие коллагеновые волокна могут быть визуализированы без какой-либо фиксации или контрастных агентов. В PDL видны волокна, которые связаны как с зубом, так и с костью, в основном коллагеном I типа19. Эта уникальная возможность визуализировать в 3D неповрежденный PDL позволяет анализировать плотность 3D-волокна, ориентацию волокон, а также 3D-движение зуба, как описаноранее 9,19. В частности, здесь мы представляем визуализацию волокнистой сети в PDL. В момент 0 может наблюдаться физиологическое ремоделирование как в кости, так и в PDL. Ремоделирование также происходит в ячеистом цементе; однако это не имеет прямого отношения к представленного методу и поэтому не будет подробно рассмотрено. Интерфейс кости-PDL в основном гладкий как в поперечной(рисунок 4A),так и в сагиттальной(рисунок 4B)плоскостях до любого приложения силы. В корональной плоскости(рисунок 4C)интерфейс кости-PDL более грубый, особенно по отношению к апикальной области, что может указывать на ремоделирование баланса, склонного к резорбции. Через 3 дня ОТМ(рисунок 4D-F),при котором первый моляр перемещается мезиально (направление представлено пунктирной стрелкой), плотность волокон в PDL уменьшается (белые наконечники стрелок). Интерфейс кости-PDL более грубый, чем через 0 дней, из-за развития кратеров на поверхности кости, которые свидетельствуют об остеокластической активности и процессах резорбции кости, связанных в основном с силами сжатия в PDL26,однако здесь наблюдается в областях растяжения через 3 дня. Разрушение тканей в зонах напряжения в пределах PDL было предложено27,28 и может быть четко видно с помощью этого метода. Грубая граница видна на разных уровнях корней (белые стрелки) и поэтому говорит о том, что движение зуба является поступанным по своей природе, а не просто опрокидыванием коронки. Через 7 дней OTM(рисунок 4G-I)признаки резорбции кости, такие как кратеры внутри кости, грубые границы и расширение пространства PDL, видны на всех плоскостях, но усредненное пространство PDL уже, чем через 3 дня OTM(рисунок 4D-F). Однако в некоторых областях граница между костью и PDL стала более гладкой после 7 дней OTM, эти области расположены на дистальных поверхностях корней, что, скорее всего, является показанием к аппозиции кости, как и ожидалось в OTM в мезиальном направлении.
Из-за длительного времени микро-КТ визуализации (~ 19 ч) и вращения ступени, монтаж образца необходим для сохранения образца неподвижным. Нестабильный образец приведет к размытому сканированию. На рисунке 5 показано, как выглядит микро-КТ-сканирование, когда образец переместился во время сканирования. Зуб и кость размыты. Ни волокон PDL, ни остеоцитов не наблюдается. В таких случаях присутствует силуэт вокруг края объекта. На рисунке 5 можнонаблюдать множественные очертания коронки зуба (стрелки).
В зависимости от цели исследования, разрешение и визуализация волокон PDL могут быть принесены в жертву в торговле для более короткого времени сканирования, когда требуется только информация о твердых тканях.
Дополнительным методом 3D-визуализации волокон PDL без какого-либо сечения является оптическая микроскопия на оптически очищенных образцах с использованием ECi(рисунок 3). Этот метод может быть использован на образце без фиксации и сохраняет флуоресцентные сигналы, которые существуют в ткани до очистки. Геми-мандиблы до и после очистки ECi показаны на рисунках 3B и 3C. Адекватная очистка образца PDL может быть подтверждена, когда сетчатая бумага может быть видна через рамус мандиблы. Объем очистки может быть скорректирован путем удлинения процесса обезвоживания. На рисунке 6 показан сигнал второй генерации гармоник (SHG) от коллагеновых волокон как в альвеолярной кости, так и в PDL в очищенной мандибле. Визуализация коллагеновых волокон кости в 3D является сложным процессом, который часто использует методы электронной микроскопии, такие как FIB / SEM. Однако, используя метод очистки на основе ECi и SHG, альвеолярные костные волокна хорошо видны, особенно в горизонтальном направлении. При переводе через образец глубоко в PDL с поверхности кости переход на уровень волокна PDL очень четкий, так как волокна внезапно меняют свою ориентацию на вертикальную.
Микроскопия Lightsheet также может быть использована для визуализации флуоресцентных белков через кость. В этом случае очищается образец из трансгенного Flk1-cre; У мышей Tdtomato19,29,30,флуоресцентные эндотелиальные клетки, выстилающие кровеносные сосуды, хорошо наблюдаются(рисунок 7A,B, C, E). Правильная очистка является ключом к созданию понятных изображений с помощью микроскопии светового листа. Когда кость не полностью очищена, кровеносные сосуды внутри PDL не наблюдались(рисунок 7D,F).
Рисунок 1:Установка ортодонтического устройства. А. Мышиная кровать сделана из лабораторного питания, чтобы поддерживать животное и держать рот открытым. Пластиковая платформа (PP) для кузова находится на наклоне 30°, а подголовник (HR) находится под углом 45° от поверхности PP. 2-уровневая трубчатая подставка (TS) используется для поднятия торцевой головки PP. Петля скрепки (черная стрелка) закрепляет верхние резцы, а нижняя ортодонтическая силовая цепь (белая стрелка) зацепляется за нижние резцы. Для визуального осмотра моляров использовалось смотровое зеркало диаметром 5 мм. В. Вид сбоку мышиной кровати. Отмечены углы между поверхностями (зеленый и пурпурный). С. Репрезентативное изображение правильно размещенного устройства. Д. Моляра видны через смотровое зеркало перед имплантацией устройства. Э. Репрезентативное изображение моляров после ортодонтического движения. Пунктирные линии прослеживают очертания первого и второго коренных гор. Ф. Схема устройства и его размещение. Красная линия представляет собой проволочную лигатуру вокруг первого моляра. Оранжевая линия представляет собой текую композитную смолу, используемую для закрепления катушки. Катушка NiTi показана синим цветом и помечена. Г. Рассеченная геми-мандибля с прикрепленным аппаратом после 7-дневного ортодонтического движения. Обратите внимание, что 3 резьбы катушки все еще открыты, что указывает на то, что катушка все еще активна через 7 дней. Шкала = 1 мм в E и G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Геми-мандибля, установленная в изготовленной на заказ камере для микро-КТ визуализации. А. Полная настройка камеры образца в аппарате микро-КТ. Источник рентгеновского излучения виден слева, а детектор справа. Красный прямоугольник очерчивает геми-мандиблю, установленную в камере на стадии образца (SS). Пример камеры, показанный здесь, является частью механической испытательной установки, включая двигатель (M), наковальню (A, очерченную белыми пунктирными линиями) и вал наковальни (AS) на вершине камеры. Полная настройка привинчивается к сцене КТ. На изображении вставки крупным планом показана красная очерченная область, содержащая камеру влажности с образцом внутри. В. Вид сверху образца, установленного на стадии образца. Бассейны влажности (серая стрелка) встроены по периметру для поддержания влажности во время визуализации. На круглой ступени посередине геми-мандибля может быть установлена в наклонной глубокой канавке (черная стрелка). Тонкая канавка (белая стрелка) отмечает среднюю линию сцены, чтобы помочь в ориентации образца. С. Схема круговой ступени с пробным пазом. Наклон канавки поддерживает мандиблю и позволяет устанавливать моляра вдоль вертикальной оси корней. Д. Репрезентативный микро-CT 2D срез в сочетании с 3D объемным изображением образца геми-мандиблы. Межпроксимальный разрыв здесь составляет 52 мкм. Образец устанавливается на стадию образца ниже (не показан), а наковальню (А) сверху с помощью стоматологического композита (DC). Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Метод очистки на основе ECi для рассеченных геми-мандиблей мыши. А. Рассеченная геми-мандибля погружается в 4% PFA, 50% EtOH, 70% EtOH и 100% EtOH последовательно. После обезвоживания геми-мандиблю хранят в ECi не менее 12 ч до получения изображения. В. Геми-мандибл сразу после рассечения. С. Геми-мандибл после завершения расчистки. Шкала стержней = 5 мм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Репрезентативная микро-КТ-сканирование in-situ PDL свежего образца на разных стадиях ортодонтического движения. A-C, Без ортодонтического движения. А. Микро-КТ 2D изображение в поперечной плоскости геми-нижней части, показывающее мезиальные (M) и дистальные (D) корни внутри альвеолярной кости, B-буккальную, L-язычную стороны альвеолярной кости. Между корнями зуба и альвеолярной костью отчетливо наблюдается пространство PDL и волокна внутри него. B. 2D изображение в сагиттальной плоскости. C. 2D изображение в корональной плоскости. D-E, 2D изображения после 3 дней OTM, наконечники стрел указывают на области в PDL с уменьшением плотности коллагеновых волокон, белые стрелки указывают на области резорбции кости. G-I, 2D изображения после 7 дней OTM, черные стрелки указывают на области аппозиции кости. Шкала = 150 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:2D микро-КТ изображение в сагиттальной плоскости, показывающее размытые структуры как зуба, так и кости из-за движения зуба во время сканирования. Стрелки указывают на несколько линий доски зуба, указывая на его движение. Шкала 150 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:ECi очищенная мандибля, показывающая первый моляр, изображенный со второй генерацией гармоник (SHG). Белая стрелка указывает на область, где видны коллагеновые волокна PDL, обратите внимание на вертикальную ориентацию, черные стрелки указывают на область, где видны как вертикальные волокна PDL, так и горизонтальные волокна альвеолярной кости. Т-зуб, F-фуркация, AB-альвеолярная кость, MR-мезяный корень, DR-дистальный корень, шкала бар 150 мкм. Изображения были получены с использованием 20-кратного мульти-погружного объектива для решений с RI 1,33-1,56. Лазер возбуждения был установлен на 860 нм при мощности 10%. Время пребывания пикселя: 0,51 мкс; Режим сканирования: кадр; В среднем: 16; Тип детектора: неосканированный фотоумножимный ламповый детектор; Усиление детектора 800 В. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7. Изображения микроскопа с ECi-очисткой мыши Flk1-Cre;tdTomato. А. Оптимально очищено управление геми-мандиблей. Видна сеть кровеносных сосудов внутри кости (наконечник стрелы) и пространства PDL (стрелка). В. вставка мезиолингвальной области первого моляра (выделена красным цветом в А) показывает кровеносные сосуды. C. оптимально очищенный 7-дневный ОТМ геми-мандибля и D. неоптимально очищенная геми-мандибля. Э. 2D изображение панели C в сагиттальной плоскости, изображение демонстрирует хорошо определенные кровеносные сосуды в кости (серая стрелка) и пространстве PDL (белые стрелки). Ф. Двумерное срез-изображение панели D, та же область, что и изображения в E, в результате чего изображение размыто. Шкала шкал A, C, D = 500 мкм, B, E, F = 100 мкм Изображения были сделаны с целью плана 5X, с использованием камеры в качестве детектора. Возбуждение лазера составляло 561 нм при мощности 4%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Генерация OTM у мышей очень желательна из-за размера, генетики и преимуществ обработки. Использование мандиблы обеспечивает простоту обращения как с точки зрения рассечения тканей, так и с точки зрения подготовки образцов и визуализации. Здесь мы представили метод генерации OTM с трансляционным движением зуба внутри кости в течение 7 дней OTM. Используя этот протокол, общая продолжительность движения зуба может быть увеличена, так как активированная катушка обеспечивает постоянный уровень силы для движения примерно до 1 мм. Однако мезиальная сторона катушки закреплена на резце, который постоянно извергается. В результате векторы силы будут постепенно изменяться и начнут генерировать экструзионные силы. Этого можно избежать, если регулировка уровня прикрепления на мезиальном конце выполняется каждые 7 дней.
PDL является инициатором OTM, поэтому понимание его структуры и функций на разных этапах OTM имеет большое значение. Однако PDL не является однородным как по своейструктуре,так и по функциям19,22,31,32. В результате, чтобы получить значимые данные, PDL необходимо изучать в 3D, и любые сечения тканей и манипуляции должны быть максимально исключены. Тем не менее, исследование мягкой ткани, расположенной между двумя твердыми тканями, делает такие требования сложными для выполнения. Традиционные методы изучения PDL часто включают в себя компрометацию 3D-структуры и удаление ткани из ее физиологической среды, что, следовательно, изменяет структурные и биомеханические свойства PDL. Как структурные, так и биомеханические свойства претерпевают динамические изменения во время OTM, что еще больше оправдывает сохранение тканевого 3D-контекста. Для этого мы описали два метода, которые позволяют визуализировать всю ткань без сечения, которые также могут быть использованы на одном образце, колокализуя флуоресцентные сигналы, морфологические данные и данные минерализации.
Представленное методологическое описание направляет читателей на применение методов в своих областях обучения. Микро-КТ визуализация позволяет 3D-визуализацию фиброзной сети PDL. Изображения могут быть проанализированы для получения анализа направленности и плотности и количественного исследования изменений в PDL во время OTM. Мы также описали метод очистки, который позволяет визуализировать с помощью легкодоступных оптических микроскопических методов, таких как микроскопия светового листа и конфокальная визуализация. Lightsheet микроскопия имеет преимущество в создании 3D-изображения больших образцов с относительно высокой скоростью изображения. Конфокальная микроскопия обеспечивает 3D-визуализацию с высоким разрешением с использованием сигнала SHG для визуализации коллагеновых волокон и флуоресцентных меток. Эти методы независимо или в сочетании открывают множество возможностей для 3D-структурных исследований с минимальной подготовкой тканей.
Несколько сложных шагов в этом протоколе требуют дополнительного внимания:
Во-первых, во время размещения катушки лигатурный провод должен быть надежно размещен между первым и вторым коренными лярами. Этот процесс является сложным из-за небольших размеров зубов мыши. Мы рекомендуем использовать настольный стереомикроскоп для руководства размещением. Однако небольшие движения во время процедуры могут переместить мышь и привести к тому, что интересуящая область выйдет из поля зрения. В качестве альтернативы мы предлагаем использовать 4-5-кратные увеличительно-лупы, которые можно носить на операторе, что может помочь более динамично просматривать область.
Во-вторых, результаты очистки зависят от процесса обезвоживания. Если образец не достиг желаемого уровня прозрачности, мы предлагаем увеличить время обезвоживания. В частности, было показано, что более длительное время погружения в 100% EtOH улучшает прозрачность конечного продукта. Однако следует отметить, что повышенный уровень обезвоживания может резко снизить уровни флуоресценции24,25. Было показано, что представленный метод на основе ECi сохраняет флуоресцентные сигналы дольше 24 недель24.
Аспекты этого протокола могут быть изменены для изучения множества других целей. Камера, которую мы разработали внутри микро-КТ, соединена с тензодатчиком и двигателем и имеет возможность выполнять испытания на растяжение / компрессию образцов геми-мандиблы. В сочетании с визуализацией микро-КТ эта установка может показать изменения в PDL in-situ с различными механическими нагрузками21. Описанный метод очистки также может быть реализован на нефиксированных образцах, что дает возможность для интересного сочетания различных модальностей визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано NIH (NIDCR R00- DE025053, PI: Naveh). Мы хотели бы поблагодарить Гарвардский центр биологической визуализации за инфраструктуру и поддержку. Все цифры генерируются с biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, suppl 1 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. dA., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
