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Biochemistry

चल XY स्टेज के साथ प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर: प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण को लागू करने के लिए एक नया मंच

Published: May 17, 2021 doi: 10.3791/62153
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland Baltimore, 2Technology Research Center, University of Maryland Baltimore County, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts

Summary

प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (आईसी-एफओपी) नामक प्रोटीन फुटप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करते हुए देशी सेल वातावरण में प्रोटीन संरचना और इंटरैक्शन साइटों की विशेषता के लिए एक नया स्थिर मंच का उपयोग किया जाता है।

Abstract

प्रोटीन का फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (एफओपी) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ मिलकर सॉल्वेंट पहुंच के एक समारोह के रूप में प्रोटीन इंटरैक्शन, संरचना और प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता से पूछताछ करने के लिए संरचनात्मक प्रोटेओमिक्स में एक अमूल्य उपकरण बन गया है। हाल के वर्षों में, FPOP, एक हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी प्रोटीन फुट प्रिंटिंग (HRPF) तकनीक के दायरे, लाइव सेल संस्कृतियों में प्रोटीन लेबलिंग के लिए विस्तारित किया गया है, जटिल सेलुलर वातावरण में प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने का साधन प्रदान करते हैं । इन-सेल प्रोटीन संशोधनों से लिगांड प्रेरित संरचनात्मक परिवर्तनों या प्रोटीन जटिल गठन के साथ अनुरूप परिवर्तनों में अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है, सभी सेलुलर संदर्भ में। प्रोटीन पदचिह्निंग को एक प्रथागत प्रवाह-आधारित प्रणाली और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के फोटोलिसिस के माध्यम से हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स को उपज देने के लिए 248 एनएम केआरएफ एक्सीमर लेजर को नियोजित किया गया है, जिसमें एक सेल नमूने के लिए 20 मिनट के विश्लेषण की आवश्यकता होती है। समय-हल FPOP प्रयोगों की सुविधा के लिए, एक नए 6-वेल प्लेट-आधारित आईसी-एफपीओपी प्लेटफॉर्म के उपयोग का बीड़ा उठाया गया था। वर्तमान प्रणाली में, एक एकल लेजर पल्स एक पूरे कुएं से विकिरणित होती है, जो एफओपी प्रायोगिक समय सीमा को काटती है जिसके परिणामस्वरूप विश्लेषण समय के 20 सेकंड होते हैं, 60 गुना कमी आती है। यह बहुत कम विश्लेषण समय एक समय पर निर्भर तरीके से जैव रासायनिक सिग्नलिंग झरना, प्रोटीन तह, और अंतर प्रयोगों (यानी, दवा मुक्त बनाम दवा बाध्य) के रूप में सेलुलर तंत्र अनुसंधान करने के लिए संभव बनाता है । यह नया इंस्ट्रूमेंटेशन, जिसका हकदार प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर विद चल XY Stage (PIXY) है, उपयोगकर्ता को तापमान, सीओ 2 और आर्द्रता नियंत्रण के साथ एक मंच इनक्यूबेटर का उपयोग करके ऑप्टिकल बेंच पर सीधे सेल कल्चर औरआईसी-एफओपी प्रदर्शन करने की अनुमति देता है। मंच भी लेजर बीम मार्गदर्शन के लिए एक स्थिति मंच, peristaltic पंप, और दर्पण प्रकाशिकी भी शामिल है । आईसी-एफओपी स्थितियों जैसे प्रकाशिकी विन्यास, प्रवाह दर, क्षणिक ट्रांसफेक्शन, और PIXY में एच2ओ2 एकाग्रता को अनुकूलित और सहकर्मी-समीक्षा की गई है। प्रणाली के सभी घटकों के स्वचालन से मानव हेरफेर में कमी आएगी और थ्रूपुट में वृद्धि होगी।

Introduction

प्रोटीन पदचिह्न तकनीक प्रोटीन के संगठन के बारे में गहन जानकारी प्रकट कर सकती है। ये आवश्यक संरचनात्मक जीव विज्ञान एमएस आधारित तकनीक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री टूलबॉक्स का एक घटक हैं। ये तरीके प्रोटीन हायर ऑर्डर स्ट्रक्चर (एचओएस) और तालमेल को सहसंयोजक लेबलिंग 1,2,3,4के माध्यम से जांच करते हैं । प्रोटीन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (FPOP) अमीनो एसिड5,6 (तालिका 1)के विलायक सुलभ साइड चेन को ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित करने के लिए हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स को रोजगार देता है। यह विधि हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स उत्पन्न करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ2)के फोटोलिसिस के लिए248एनएम पर एक एक्सिमर लेजर का उपयोग करती है। सैद्धांतिक रूप से, 20 अमीनो एसिड में से 19 को ग्लाइ अपवाद होने के साथ ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित किया जा सकता है। हालांकि, हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स के साथ अमीनो एसिड की अलग-अलग प्रतिक्रियाशीलता दरों के कारण, इनमें से केवल एक सबसेट का संशोधन प्रयोगात्मक रूप से देखा गया है। फिर भी, विधि में प्रोटीन अनुक्रम5की लंबाई में विश्लेषण की क्षमता है। FPOP माइक्रोसेकंड टाइमस्केल पर प्रोटीन को संशोधित करता है, जिससे यह तेजी से दरों के साथ कमजोर बातचीत का अध्ययन करने में उपयोगी हो जाता है। लिगांड-बाइंडिंग या प्रोटीन संरचना में परिवर्तन पर सॉल्वेंट पहुंच में परिवर्तन होता है, इस प्रकार, विधि की शक्ति कई राज्यों में प्रोटीन के लेबलिंग पैटर्न की तुलना में निहित है (यानी, लिगांड-बाउंड की तुलना में लिगांड-मुक्त)। नतीजतन, एफओपी प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-लिगांड इंटरैक्शन साइटों और अनुरूप परिवर्तन7, 8,9,10के क्षेत्रों की पहचान करने में सफल रहा है। एफओपी विधि को शुद्ध प्रोटीन प्रणालियों के अध्ययन से इन-सेल विश्लेषण तक बढ़ाया गया है। इन-सेल एफओपी (आईसी-एफपीओपी) प्रोटेम11, 12में संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने के लिए कोशिकाओं में एक हजार से अधिक प्रोटीन को ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित कर सकता है। पारंपरिक आईसी-एफपीओपी मंच लेजर बीम के पिछले एकल फ़ाइल को प्रवाहित करने के लिए एक प्रवाह प्रणाली का उपयोग करता है। इस प्रणाली के विकास ने व्यक्तिगत कोशिकाओं को लेजर विकिरण के समान जोखिम की अनुमति दी। इसके कारण ऑक्सीडेटिव लेबल वाले प्रोटीन 12 की संख्या में13गुना वृद्धि हुई । हालांकि, प्रवाह प्रणाली की एक सीमा एक नमूना प्रयोग की लंबाई है जिसमें 10 मिनट का विकिरण अंतराल होता है जिसके दौरान संशोधन होता है और एक अतिरिक्त 10 मिनट का वॉश चक्र होता है। आईसी-एफओपी की समय की कमी इसे जैव रासायनिक सिग्नलिंग कैस्केड में इंटरैक्शन नेटवर्क के बीच मौजूद अल्पकालिक प्रोटीन तह मध्यवर्ती या परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त बनाती है। इस लौकिक सीमा ने उच्च थ्रूपुट से लैस एक नए आईसी-एफपीओपी प्लेटफॉर्म के डिजाइन को प्रेरित किया।

देशी सेल वातावरण में प्रोटीन उच्च आदेश संरचना को सही ढंग से मापने के लिए, नया डिजाइन सेल संस्कृति को सीधे लेजर प्लेटफॉर्म पर पूरा करने की अनुमति देता है, जो आईसी-एफपीओपी को उच्च थ्रूपुट होने में सक्षम बनाता है। यह सेटअप सेलुलर पर्यावरण के लिए कम से कम क्षोभ की अनुमति देता है, प्रवाह का उपयोग करके आईसी-एफपीओपी के विपरीत जहां अनुयायी कोशिकाओं को सब्सट्रेट से हटाया जाना चाहिए। नया मंच आईसी-एफओपी को एक बाँझ इनक्यूबेशन प्रणाली में होने की अनुमति देता है, जबकि लेजर बीम मार्गदर्शन, XY गति के लिए एक स्थिति प्रणाली, और रासायनिक विनिमय के लिए पेरिस्टाल्टिक पंपों के लिए कॉन्फ़िगर दर्पण प्रकाशिकी का उपयोग करतेहुए एक बाँझ इनक्यूबेशन प्रणाली में होते हैं। आईसी-एफपीओपी के संचालन के लिए नया मंच चल XY स्टेज (PIXY)(चित्रा 1)के साथ प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर का हकदार है। PIXY में, आईसी-एफओपी मंच इनक्यूबेटर कक्ष के भीतर छह अच्छी प्लेटों में उगाई जाने वाली मानव कोशिकाओं पर किया जाता है। इस विन्यास के लिए, लेजर बीम एक स्थिति मंच है कि इनक्यूबेटर रखती है के रूप में बीम संगत दर्पण का उपयोग कर थाली पर नीचे परिलक्षित होता है, XY-विमान में ले जाया जाता है, तो लेजर बीम रणनीतिक केवल एक समय में एक अच्छी तरह से विकिरणित करने के लिए गठबंधन किया है । सत्यापन अध्ययनों से पता चलता है कि प्रवाह प्रणाली की तुलना में PIXY में आईसी-एफपीओपी तेजी से किया जा सकता है और प्रति प्रोटीन अमीनो एसिड संशोधनों में वृद्धि की ओर जाता है। इस नए आईसी-एफओपीओ मंच का विकास उस ज्ञान पर व्याख्या करेगा जिसे सेलुलर प्रयोगों13से प्राप्त किया जा सकता है।

Protocol

1. चल XY मंच के साथ मंच इनक्यूबेटर की विधानसभा

नोट: नए मंच इनक्यूबेशन प्रणाली, स्थिति मंच और नियंत्रकों, peristaltic पंपों, २४८ एनएम KrF एक्सीमर लेजर, और ऑप्टिकल दर्पण एक इंपीरियल ऑप्टिकल ब्रेडबोर्ड पर इकट्ठे शामिल हैं ।

  1. इनक्यूबेशन प्रणाली को इकट्ठा करें: तापमान इकाई, कार्बन डाइऑक्साइड इकाई, ह्यूमिडिफायर, एयर पंप, और टच मॉनिटरिंग सिस्टम(चित्रा 2A-E)।
    नोट: विस्तृत असेंबली निर्देश निर्माता द्वारा प्रदान किए जाते हैं। इनक्यूबेशन प्रणाली को इनक्यूबेटर के भीतर कोशिकाओं को बढ़ाने से पहले 5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस और 85% आर्द्रता को स्थिर करना होगा। ये पैरामीटर सेल लाइन पर निर्भर हो सकते हैं।
  2. कस्टम सिक्स-वेल प्लेट इनक्यूबेटर, नैनोपोजिशनिंग ड्राइव स्टेज और एक्सवाई ड्राइव स्टेज को इकट्ठा करें। बाद में पूर्व शिकंजा, क्रमशः ।
    नोट: निर्माता द्वारा प्रदान किए गए विस्तृत असेंबली निर्देश।
  3. आरएस-232 केबल के माध्यम से एक "डेज़ी चेन" अनुक्रम में चार पेरिस्टाल्टिक पंपों को कनेक्ट करें, जिसमें कंट्रोलिंग कंप्यूटर से जुड़े यूएसबी केबल के लिए रुपये-232 हैं। प्रत्येक पंप चैनल रोलर पर हर चैनल के लिए 3.18 मिमी आईडी बहुलक ट्यूबिंग (जैसे, टायगॉन) कनेक्ट करें।
    नोट: प्रत्येक पंप में चार रोलर्स होते हैं। रोलर्स की दिशा और प्रवाह दर में मैन्युअल रूप से हेरफेर किया जाता है।
  4. प्रत्येक 3.18 मिमी आईडी बहुलक ट्यूब के अंत में 1/16 "x 1/8" कनेक्टर डालें। कनेक्टर के 1/16'अंत को 1.59 आईडी पॉलीमर ट्यूबिंग में डालें, फिर कस्टम पोर्ट के माध्यम से इनक्यूबेटर में बहुलक ट्यूबिंग डालें। ट्यूब के दूसरे छोर को उस समाधान में रखें जो आईसी-एफपीओपी प्रयोग के दौरान संचार किया जाएगा।
    नोट: परफ्यूजन लाइनों के लिए, इनक्यूबेटर में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों को समायोजित करने के लिए परिधि के चारों ओर ट्यूबिंग लाइनों के लिए 36 कस्टम बंदरगाह हैं।
  5. पेंच एक 50 मिमी, 248 एनएम, 45 ° एक्सिमर लेजर लाइन दर्पण Ø2 के लिए एक काइनेमेटिक मिरर माउंट के भीतर "248 एनएम लेजर एपर्चर से 10-11 ग्रिड अंक में प्रकाशिकी। दूसरा दर्पण 90 डिग्री कोण पर इनक्यूबेटर के दूसरी तरफ पहले रखें। इनक्यूबेटर(चित्रा 2F-J)के लिए लेजर बीम मार्गदर्शन के लिए लगभग 45 डिग्री पर नीचे दूसरे दर्पण कोण।

2. एकीकरण सॉफ्टवेयर के माध्यम से सिस्टम का सिंक्रोनाइजेशन और प्रारंभिक स्वचालन

  1. ड्राइवरों और पंपों को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक एकीकरण सॉफ्टवेयर का नवीनतम संस्करण स्थापित करें।
  2. पंप मैनुअल का जिक्र करते हुए, '5' से शुरू होने वाले पंपों का नाम बदलें और मूल्य में वृद्धि करें। आदेश एकीकरण सॉफ्टवेयर में मैनुअल नियंत्रण उप कार्यक्रम का उपयोग कर पंप प्रणाली के लिए भेजा जा सकता है ।
    नोट: चैनल मोड के लिए एक पंप सेट स्वचालित रूप से सेट, 1, 2, 3 और 4, चार पंप चैनलों के अनुरूप में पंप नामकरण सम्मेलन बदलता है ।
  3. प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर के स्वचालन के लिए एकीकरण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम खोलें।
  4. पंप के लिए कॉम्पपोर्टलेबल किए गए कनेक्शन ड्रॉपडाउन मेनू से पंप सिस्टम यूएसबी केबल के अनुरूप उपयुक्त यूएसबी कॉमपोर्ट डिवाइस नाम (जैसे, COM4) चुनें।
  5. स्वचालित प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर प्लेटफॉर्म के लिए एक स्क्रिप्ट को संपादित करने/बनाने के लिए स्क्रिप्ट बिल्डर बटन पर क्लिक करें। क्लिक करें एक टेक्स्ट फाइल(चित्रा 3A)के रूप में अनुक्रम को सहेजने के लिए स्क्रिप्ट बचाओ ।
    नोट: स्क्रिप्ट बिल्डर पंप संख्या, दिशा, दर, मात्रा, ट्यूबिंग व्यास, चैनल मोड, और समय पर देरी की परिभाषा के साथ स्क्रिप्ट को परिभाषित करने के लिए एक उपयोगकर्ता इंटरफेस है ।
  6. यदि चैनल मोड स्क्रिप्ट के निर्माण में वांछित है, तो स्क्रिप्ट में एक कदम चैनल मोड में और बाहर पंप को बदलने के लिए समर्पित किया जाना चाहिए, और पंप चैनलों के अनुरूप निम्नलिखित चरणों को पंप 1-4 के रूप में चिह्नित किया जाना चाहिए।
    नोट: यह सुनिश्चित करता है कि कोई दो पंप एक साथ एक मंच इनक्यूबेटर स्क्रिप्ट के दौरान चैनल मोड में हो सकता है और प्रत्येक पंप को आवश्यक चैनलों को आदेश भेजे जाने के बाद विरासत मोड में वापस बंद कर दिया जाता है।
  7. पढ़ें स्क्रिप्ट बटन पर क्लिक करें और मंच इनक्यूबेटर ऑपरेशन के लिए वांछित उपयुक्त स्क्रिप्ट फ़ाइल चुनें।
  8. स्क्रिप्ट को चलाने के लिए रन सीक्वेंस बटन को ऑन पोजिशन (ग्रीन) पर स्विच करें और फिर स्टार्ट बटन(चित्रा 3B)पर क्लिक करें ।

3. मंच इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को विकसित करें

नोट: कोशिकाओं को प्रयोग से पहले दिन एक सेल संस्कृति हुड में बाँझ परिस्थितियों में मंच इनक्यूबेटर में रखा जाना चाहिए ।

  1. नैनोपोजिशनिंग स्टेज से प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर को अनस्क्रू करें और तापमान, गैस और ह्यूमिडिफायर लाइनों को डिस्कनेक्ट करें। 70% इथेनॉल के साथ इनक्यूबेटर छिड़कने के बाद, इसे सेल कल्चर हुड में रखें।
  2. स्थानांतरण से पहले टी-175 में लगभग 80-90% संकुचन में कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    नोट: शब्द में उदारता का उपयोग कोशिका संस्कृति पकवान या फ्लास्क में कोशिकाओं की संख्या/कवरेज के उपाय के रूप में किया जाता है ।
  3. मीडिया निकालें और बफर के साथ कुल्ला।
  4. निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करके ट्राइपसिन-ईडीटीए का उपयोग करके अलग कोशिकाएं।
  5. मीडिया के 8 एमएल में रिस्पेंड करें और कोशिकाओं की गिनती करें।
  6. बीज फाइब्रोनेक्टिन/कोलेजन14 लेपित छह अच्छी तरह से प्रत्येक अच्छी तरह से पुनर् निलंबित कोशिकाओं के लगभग 90-95 μL के साथ । यह मात्रा अगले दिन प्रत्येक कुएं में 80-90% संकुचन (~ 1.2 मिलियन कोशिकाओं) को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त होगी।
    नोट: छह अच्छी तरह से प्लेटें बोने से पहले कोलेजन के साथ लेपित किया जाना चाहिए । आईसी-एफपीओपी के दौरान उपयोग किए जाने वाले अभिकर् ता को तेज प्रवाह दरों के साथ संचार किया जाता है। लेपित प्लेटें यह सुनिश्चित करती हैं कि अभिकर् म के जलसेक के कारण कोशिकाओं को समय से पहले अलग नहीं किया जाता है।
  7. वरीयता प्राप्त प्लेट को मंच इनक्यूबेटर में रखें और क्वार्ट्ज ढक्कन के साथ कवर करें।
    नोट: डिजाइन और विकास के दौरान, एक ग्लास इनक्यूबेटर ढक्कन क्वार्ट्ज में बदल दिया गया था, इसलिए यह पराबैंगनी लेजर प्रकाश के साथ संगत है।
  8. नैनोपोजिशनिंग ड्राइव स्टेज पर प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर को वापस बदलें और सुरक्षित करें। तापमान, गैस और ह्यूमिडिफायर लाइनों को फिर से कनेक्ट करें।
  9. कोशिकाओं को रातोंरात भर में मजबूती से बढ़ने दें।
    नोट: निम्नलिखित कोशिका संस्कृति चरण वैकल्पिक हैं और उन प्रयोगों के लिए हैं जिनमें मानव कोशिकाएं क्षणिक रूप से संक्रमित होती हैं। ये कदम सेल संस्कृति की स्थितियों के तहत ट्रांसफेक्शन दक्षता का आकलन करते हैं।
  10. एक वाणिज्यिक cationic-लिपिड ट्रांसफैक्शन किट का उपयोग कर HEK २९३ कोशिकाओं में चिमरिक प्रोटीन GCaMP2 के लिए जीन युक्त प्लाज्मिड ट्रांसफेक्ट ।
  11. दो छह-अच्छी प्लेटों में HEK293T कोशिकाओं में GCaMP2 के क्षणिक ट्रांसफेक्शन करें।
  12. मंच इनक्यूबेटर में एक छह अच्छी तरह से थाली इनक्यूबेट, और एक मानक सह 2 इनक्यूबेटर में दूसरा छह अच्छीतरह से थाली ।
  13. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा प्रत्येक प्लेट के भीतर ट्रांसफेक्शन दक्षता की तुलना करें।

4. बुझाने बफर और एच2O2 बनाओ

  1. 125 mm N-tert-Butyl-α-फिनाइलनिट्रोन (PBN) और 125 mM N, N′-Dimethylthiourea (DMTU) युक्त बुझाने बफर के 100 ml बनाओ।
    नोट: DMTU और PBN मुक्त कट्टरपंथी सफाई कर्मी हैं और सेल पार पाररीय हैं।
  2. तनु एच2O2 से 200 mM। प्रत्येक नमूने को प्रत्येक कुएं के नीचे कोशिकाओं की परत को पूरी तरह से विसर्जित करने के लिए एच2ओ 2 के6 एमएल की आवश्यकता होती है।
    नोट: बुझाने बफर दिन पहले बनाया जाता है और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, जो प्रकाश से सुरक्षित होता है। प्रयोग के दिन एच2ओ2 को पतला करें।

5. आईसी-एफपीओपी के लिए प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर स्थापित करें

नोट: मंच इनक्यूबेटर बाँझ परिस्थितियों में इकट्ठा किया जाना चाहिए । एक बाँझ सेल संस्कृति हुड में इनक्यूबेटर इकट्ठा।

  1. स्थिति चरण से मंच इनक्यूबेटर को अनस्क्रू करें और तापमान, गैस और ह्यूमिडिफायर लाइनों को डिस्कनेक्ट करें।
  2. 70% इथेनॉल के साथ इनक्यूबेटर छिड़कने के बाद, इसे सेल कल्चर हुड में रखें।
  3. मंच इनक्यूबेटर से छह अच्छी तरह से प्लेट निकालें, थाली के मूल ढक्कन सुरक्षित है, और एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सेल संकुचन की पुष्टि करें ।
  4. सेल में नरमी की पुष्टि होने के बाद, सेल कल्चर हुड के अंदर प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर में छह-अच्छी तरह से प्लेट को वापस प्लेट में बदल दें।
  5. एम्बेडेड बंदरगाहों के माध्यम से प्रत्येक कुएं में तीन प्रीकट (15 सेमी) 1.59 आईडी बहुलक ट्यूब डालें। ट्यूबों को अच्छी तरह से दीवारों पर फ्लश करें और कस्टम 3 डी मुद्रित छल्ले के साथ पकड़ें।
    नोट: छह ३३ मिमी पीएलए फिलामेंट 3 डी मुद्रित छल्ले कोशिकाओं को परेशान या लेजर पल्स के रास्ते में हो रही बिना थाली की दीवारों के लिए टयूबिंग सुरक्षित करने के लिए डिज़ाइन कस्टम थे ।
  6. अपने क्वार्ट्ज ढक्कन के साथ मंच इनक्यूबेटर को कवर करें। पोजिशनिंग सिस्टम पर स्टेज टॉप इनक्यूबेटर को बदलें और सुरक्षित करें। तापमान, गैस और ह्यूमिडिफायर लाइनों को फिर से कनेक्ट करें।
  7. 1/16x1/8 "कनेक्टर्स के अंत" 1/16 के लिए 1.59 आईडी बहुलक ट्यूबिंग कनेक्ट करें।

6. मंच इनक्यूबेटर में आईसी-एफपीओपी का प्रदर्शन

  1. पंप वापसी के लिए एक एकीकरण सॉफ्टवेयर स्क्रिप्ट तैयार करें। सभी छह कुओं से सेल मीडिया को पूरी तरह से हटाने के लिए एक पेरिस्टाल्टिक पंप (पंप 8) का उपयोग करें।
  2. अन्य तीन पेरिस्टाल्टिक पंपों (पंप 5-7) के प्रत्येक चैनल में प्राइम सॉल्वैंट्स। एच2ओ2 को इन्फ्यूज करें और अपने-अपने बारी-बारी से ट्यूबों में बफर को बुझाएं जब तक कि रिएजेंट इनक्यूबेटर बंदरगाहों तक न पहुंच न जाते।
  3. पुष्टि करें कि लेजर बीम को दर्पण द्वारा सही ढंग से कोण किया गया है और इनक्यूबेटर बेहिचक तक पहुंचता है।
    नोट: लेजर सुरक्षा काले चश्मे पहना जाना चाहिए जब भी लेजर उपयोग में है। एंगलिंग/अलाइनमेंट प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को समय से पहले विकिरणित न करें। बीम को संरेखित करते समय क्वार्ट्ज ढक्कन को पूरी तरह से कवर करने के लिए कार्डबोर्ड का उपयोग करें। इसके अलावा, एक छह अच्छी तरह से थाली के सफेद कागज पर एक मुद्रित रूपरेखा का उपयोग करने के लिए आगे लेजर बीम की पुष्टि प्रत्येक अच्छी तरह से केंद्र मार रहा है । संरेखण के लिए सबसे कम आवृत्ति और ऊर्जा पर निरंतर पल्स सेटिंग का उपयोग करें।
  4. बाहरी सेंसर का उपयोग करके लेजर ऊर्जा की जांच करें। 50 हर्ट्ज और 27 केवी पर 160 एमजे की एक सिंगल लेजर पल्स का इस्तेमाल करें।
    नोट: निम्नलिखित चरणों के लिए टाइमर की आवश्यकता होती है.
  5. बीम अलाइनमेंट की पुष्टि के बाद पंप जलसेक के लिए एकीकरण सॉफ्टवेयर स्क्रिप्ट तैयार करें।
  6. टाइमर शुरू करें और एक ही समय में एकीकरण सॉफ्टवेयर पंप स्क्रिप्ट पर स्टार्ट बटन दबाएं।
  7. पहले कुएं में 35 एमएल/मिनट में200mM H 2 O2 (टाइमर पर 6-10 सेकंड का निशान) डालें।
    नोट: वहां एक पंप संचार शुरू होने से पहले एक पांच दूसरी देरी है । पल्स ट्रिगर होने से सात सेकंड पहले लेजर भी लग जाता है। लेजर पल्स एच2O2 जलसेक के तुरंत बाद आना चाहिए।
  8. टाइमर पर 11 सेकंड के निशान पर पल्स को ट्रिगर करने के लिए 5 सेकंड के निशान पर लेजर सॉफ्टवेयर पर स्टार्ट बटन दबाएं।
  9. लेजर पल्स के तुरंत बाद पहले कुएं में 35 एमएल/मिनट पर 125 m m शमन समाधान डालें। लेजर बीम के साथ अगले अच्छी तरह से संरेखित करने के लिए मैन्युअल रूप से स्थिति चरण को स्थानांतरित करें।
  10. उपरोक्त चरणों को 6.5-6.9 दोहराएं जब तक कि प्रत्येक कुएं को संसाधित नहीं किया गया हो।
    नोट: आईसी-पीओपी तीन लेजर और तीन गैर लेजर नमूनों के तकनीकी ट्रिपलीकेट में किया जाता है। एक संसाधित छह अच्छी तरह से थाली एक जैविक दोहराने के रूप में कार्य करता है ।
  11. सेल कल्चर हुड में, कोशिकाओं को प्रत्येक कुएं से अलग-अलग 15 एमएल शंकु नलियों में स्थानांतरित करने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। 5 मिनट के लिए 1,200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं।
  12. रिपा लाइसिस बफर के 100 माइक्रोन में सुपरनेट और रिसिपेंड कोशिकाओं को त्यागें।
  13. अलग-अलग 1.2 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  14. फ्लैश फ्रीज तरल नाइट्रोजन में सभी नमूनों और उपयोग तक एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जगह है।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

7. प्रोटीन निष्कर्षण, शुद्धिकरण, और प्रोटियोलिसिस

  1. नमूनों को गल लें और 5 मिनट के लिए हीट ब्लॉक में 95 डिग्री सेल्सियस पर हीट करें।
  2. हीटिंग के बाद 5 मिनट तक बर्फ पर ठंडा करें।
  3. एकल फंसे, डबल-फंसे, रैखिक और परिपत्र डीएनए और आरएनए को नीचा दिखाने के लिए सेल लिसेट में नाभिक की 25 इकाइयां जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे में शीतोष्ण करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूने।
  5. सुपरनेट लीजिए और एक साफ पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. एक कोलोरिमेट्रिक प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता की जांच करें।
  7. एक साफ पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में नमूने के 100 माइक्रोन स्थानांतरित करें और सेल लाइसिस बफर के साथ 100 माइक्रोन में लाएं।
  8. 45 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर 10 m m dithiothreitol (DTT) के साथ नमूनों को कम करें।
  9. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शांत नमूने।
  10. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 50 mM iodoacetamide (आईएए) के साथ Alkylate।
    नोट: प्रकाश से आईएए की रक्षा
  11. पूर्व ठंडा (-20 डिग्री सेल्सियस) एसीटोन के 460 माइक्रोन जोड़ें। भंवर के नमूने और रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
  12. अगले दिन 16,000 एक्स ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूने 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  13. प्रोटीन गोली को बाधित किए बिना एसीटोन निकालें।
  14. इसमें 90% प्री-चिल्ड (-20 डिग्री सेल्सियस) एसीटोन का 50 माइक्रोन डालें। भंवर नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए 16,000 x g पर मिश्रण और अपकेंद्रित्र करने के लिए।
  15. एसीटोन निकालें और नमूनों को 2-3 मिनट के लिए सूखने दें।
  16. 10 एमएम ट्रिस बफर पीएच 8 के साथ प्रोटीन गोली को फिर से रेंट करें।
  17. रिस्सुपेंड एमएस ग्रेड ट्राइप्सिन (20 माइक्रोन स्टॉक) 40 μL में 10 m Tris बफर पीएच 8 और प्रत्येक नमूने में 2.5 माइक्रोन ट्राइप्सिन जोड़ें।
  18. रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट सैंपल।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
  19. एक कोलोरिमेट्रिक पेप्टाइड परख का उपयोग करके पेप्टाइड एकाग्रता का आकलन करें।
  20. 5% फोर्मिक एसिड के साथ नमूनों को बुझाें।
  21. एक साफ पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब के लिए नमूना के 10 माइक्रोन स्थानांतरण।
  22. पानी में एमएस ग्रेड 0.1% फोर्मिक एसिड (एफए) के 20 माइक्रोन के साथ वैक्यूम अपकेंद्रित्र और पुनर्सीमित का उपयोग करके नमूना सुखाएं।
  23. प्रत्येक नमूने को पूर्व-स्लिट कैप के साथ ऑटोसम्पलर शीशियों को साफ करने के लिए स्थानांतरित करें।

8. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी-टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस)

  1. FPOP संशोधनों को स्थानीयकृत करने के लिए, एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण का उपयोग करके पचाने वाली सेल लिसेट का विश्लेषण करें।
  2. पानी में 0.1% एफए (ए) और एसीएन (एसीएन) (बी) में 0.1% एफए के मोबाइल चरणों का उपयोग करें।
  3. 180 माइक्रोन x 20 मिमी C18 (5 माइक्रोन और 100 Å) ट्रैपिंग कॉलम पर नमूने का 0.5 माइक्रोग्राम लोड करें और कॉलम को 15 मिनट के लिए 99% (ए) और 1% (बी) के साथ धोएं।
  4. 75 माइक्रोन x 30 सेमी C18 (5 माइक्रोन और 125 Å) विश्लेषणात्मक कॉलम का उपयोग करना, एल्यूट और अलग पचा पेप्टाइड्स 0.300 μL/
  5. इस प्रकार एलसी ढाल चलाएं: 0−1 मिनट, 3% सॉल्वेंट बी; 2−100 मिनट, 10−45% B;100−110 मिनट, 45-100% B; 110−115 मिनट, 100% बी
  6. कॉलम को 115-116 मिनट से 3% (बी) पर फिर से रखें और 116-120 मिनट से 3% (बी) पर होल्ड करें ।
  7. नैनो इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण के साथ सकारात्मक आयन मोड में eluted पेप्टाइड्स का विश्लेषण करें।
  8. 60,000 के संकल्प पर 375-1500 की एक मीटर/जेड स्कैन रेंज पर MS1 स्पेक्ट्रा प्राप्त करें।
  9. 50 एमएस और 5.0e4 तीव्रता सीमा के अधिकतम इंजेक्शन समय के साथ5.0e 5 करने के लिए स्वचालित लाभ नियंत्रण (AGC) लक्ष्य निर्धारित करें।
  10. 1.2 मीटर/
  11. उच्च ऊर्जा टकराव वियोजन (एचसीडी) (32% सामान्यीकृत ऊर्जा) के अधीन एमएस 2 आयन।
  12. 60 सेकंड के लिए 1 एमएस/एमएस अधिग्रहण के बाद पेप्टाइड्स को बाहर करें।
  13. 5.0e4 के एजीसी लक्ष्य और 35 एमएस के अधिकतम इंजेक्शन समय के साथ 15,000 करने के लिए एमएस/एमएस संकल्प निर्धारित करें।

9. प्रोटेम डिस्कवर/डेटा प्रोसेसिंग

  1. एक प्रासंगिक होमो सेपियंस प्रोटीन डेटाबेस के खिलाफ उपलब्ध बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर टैंडेम कच्चे डेटा फ़ाइलों को खोजें और एंजाइम को पचाएं।
  2. प्रोटीन विश्लेषण खोज मापदंडों को निर्धारित करें।
  3. 0.02 डीए और 10 पीपीएम के लिए माता पिता आयन सहिष्णुता के लिए टुकड़ा सहिष्णुता सेट करें।
  4. ट्राइप्सिन के लिए एंजाइम विशिष्टता सेट करें और एक चूक गए दरार के लिए अनुमति दें।
  5. 375-1500 मीटर/जेड के लिए मास रेंज सेट करें ।
  6. 95% (मध्यम) पर पेप्टाइड आत्मविश्वास और 99% (उच्च) पर अवशेष विश्वास स्थापित करें।
  7. प्रोटीन स्वीकार करें यदि कम से कम दो अलग पेप्टाइड्स की पहचान 5% डिस्कवरी दर (एफडीआर) फिल्टर के साथ की जाती है।
  8. एक स्थिर संशोधन के रूप में कार्बामिडोमेथाइलेशन सेट करें और सभी ज्ञात हाइड्रोक्सिल रेडिकल साइड-चेन संशोधन15,16 को गतिशील संशोधनों के रूप में करें।
  9. एक बार फ़ाइलों को खोज समाप्त कर रहे हैं, निर्यात अनुक्रम, संशोधन स्थानों, प्रोटीन परिग्रहण, स्पेक्ट्रम फ़ाइल, अग्रदूत बहुतायत, और एक इलेक्ट्रॉनिक डेटाबेस के लिए प्रतिधारण समय जानकारी ।
  10. इस समीकरण से पेप्टाइड या अवशेषों के अनुसार संशोधन की सीमा की गणना करें:
    Equation 1
    नोट: ईआईसी क्षेत्र संशोधित पेप्टाइड या अवशेषों का ऑक्सीडेटिव संशोधन के साथ निकाला गया आयन क्रोमेग्राफिक क्षेत्र (ईआईसी) है, और ईआईसी क्षेत्र ऑक्सीडेटिव संशोधन के साथ और बिना एक ही पेप्टाइड या अवशेषों का कुल क्षेत्र है। समय के साथ, हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उपस्थिति में प्रोटीन ऑक्सीकरण करेगा, जिसके परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण होगा। संशोधन की सीमा की गणना करने के लिए, संशोधित पेप्टाइड का क्षेत्रफल कुल क्षेत्रफल से विभाजित है। पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण के लिए एक गैर-विकिरणित नियंत्रण नमूना खाते हैं। नियंत्रण नमूने से पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण एक FPOP संशोधन की पहचान करने के लिए लेजर इलाज नमूने से घटाया जाता है ।

Representative Results

इस बात की पुष्टि करने के लिए कि लेजर प्लेटफॉर्म पर सेल कल्चर के लिए प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर की स्थिति पर्याप्त है, GCaMP2 को क्षणिक रूप से HEK293T में संक्रमित किया गया था और दोनों प्लेटों के लिए ट्रांसफैक्शन दक्षता का आकलन फ्लोरेसेंस इमेजिंग(चित्रा 4 ए)के माध्यम से किया गया था। GCaMP2 एक कैल्शियम संवेदन फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जो आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड इंट्रासेलुलर कैल्शियम संकेतक के रूप में उपयोग किया जाता है। इसमें ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) और कैल्शियम बाइंडिंग प्रोटीन, कैलमोडुलिन का फ्यूजन होता है। ट्रांसफेक्शन दक्षता(चित्रा 4B)की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्लाज्मिड पीआरएल-टीके से संक्रमित एचईके 293 कोशिकाओं पर एक लूसिफ़ेरेस परख की गई थी। इन परिणामों से पता चलता है कि प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर मानक इनक्यूबेटर के प्रदर्शन से अधिक है, जिसमें ट्रांसफैक्शन दक्षता में 1.13 गुना वृद्धि हुई है, जो इष्टतम सेल संस्कृति पर्यावरण के लिए मात्रात्मक बेंचमार्क प्रदान करता है।

प्रवाह प्रणाली में लेबल HEK293T कोशिकाओं में FPOP संशोधनों मंच इनक्यूबेटर में लेबल उन लोगों की तुलना में थे और पता चला है कि मंच इनक्यूबेटर दोनों प्रोटीन की संख्या में प्रवाह प्रणाली से बेहतर प्रदर्शन संशोधित(चित्रा 5)और उन प्रोटीन में कुल FPOP कवरेज । प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर में अधिग्रहीत एफपीओपी संशोधित प्रोटीन की संख्या लगभग 1051 थी, जो एक विशिष्ट प्रयोग में प्राप्त की गई तुलना में 2.2 गुना अधिक थी। संशोधनों को प्रत्येक प्रयोग के लिए दो जैविक प्रतिकृति के बीच जोड़ा गया था। इसके अलावा, PIXY उच्च थ्रूपुट प्रदान करता है।

प्रोटीन में उच्च संशोधन कवरेज के लाभ को प्रदर्शित करने के लिए, आईसी-एफओपी संशोधनों को पेप्टाइड स्तर पर स्थानीयकृत किया गया था और ऐक्टिन, 375 अमीनो एसिड प्रोटीन के लिए प्रणालियों के बीच परिणामों में अंतर को अलग करने के लिए संशोधन की सीमा निर्धारित की गई थी। प्रवाह प्रणाली में, दो संशोधित पेप्टाइड्स का पता चला, जो सीमित संरचनात्मक जानकारी(चित्रा 6A)प्रदान करते हैं। हालांकि, प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर में ऐक्टिन सीक्वेंस में फैले पांच संशोधित पेप्टाइड्स का पता चला । टैंडेम मास स्पेक्ट्रा से संकेत मिलता है कि अवशेष Pro322 दोनों संशोधित किया गया था और प्रत्येक प्रयोग(चित्रा 6B)में पता चला था । प्लेटफार्म इनक्यूबेटर नमूनों में संशोधित पांच पेप्टाइड्स में बारह संशोधित अवशेष थे, जबकि प्रवाह प्रणाली(चित्रा 6 सी)के साथ केवल चार अवशेषों को संशोधित किया गया था । ऑक्सीकरण कवरेज में वृद्धि प्रोटीन में अधिक संरचनात्मक जानकारी प्रदान करती है।

एस्पिनो एट अल ने मानव रोगराज्योंके लिए एक कृमि मॉडल सी एलिगेंसके भीतर वीवो (आईवी-एफओपी) में प्रदर्शन करने के लिए एफओपी की क्षमता का प्रदर्शन किया। जबकि चतुर्थ-FPOP भी एक प्रवाह प्रणाली के माध्यम से किया जाता है, PIXY प्रणाली कीड़े के साथ अनुकूलता के लिए परीक्षण किया गया था । 20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर में प्रत्येक कुएं में लगभग 10,000 कीड़े इनक्यूबेटेड किए गए थे एलसी−एमएस/एमएस विश्लेषण से पता चला है कि 792 प्रोटीन को आईवी-एफओपी द्वारा प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर में संशोधित किया गया था, जबकि 545 प्रोटीन को प्रवाह प्रणाली(चित्रा 7)के साथ संशोधित किया गया था। ये परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि 2डी सेल संस्कृति के अलावा, यह नई पद्धति सी एलिगेंसजैसे अन्य जैविक प्रणालियों के अध्ययन के साथ भी संगत है।

Figure 1
चित्रा 1। PIXY प्रणाली की योजनाबद्ध। सिस्टम घटक: (ए)स्टेज-टॉप इनक्यूबेटर,(बी)पोजिशनिंग सिस्टम,(सी)पेरिस्टाल्टिक पंप, और(डी)परफ्यूजन लाइनें। सेल कल्चर मीडिया को प्रत्येक अच्छी तरह से पंपों के माध्यम से हटा दिया जाता है इससे पहले कि एच2ओ2 और शमन समाधान गणना टाइमपॉइंट पर संचार कर रहे हैं। विकिरण के लिए लेजर पथ सफेद रंग में प्रदर्शित। जॉनसन, डी टी, Punshon-स्मिथ, बी, एस्पिनो, जे ए, Gershenson, ए, जोंस, एल.M से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित, एक चल XY मंच के साथ एक मंच इनक्यूबेटर में प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण को लागू करने । विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान, 92 (2), 1691-1696 2019। कॉपीराइट 2020 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। पूरी तरह से इकट्ठे PIXY प्रणाली। (A)टच मॉनिटरिंग सिस्टम,(बी)कार्बन डाइऑक्साइड यूनिट,(सी)तापमान इकाई,(डी)एयर पंप,(ई)ह्यूमिडिफायर,(एफ)ऑप्टिकल मिरर,(जी)प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर,(एच)पोजिशनिंग स्टेज,(I)248nm KrF एक्सिमर लेजर, और(जे)पेरिस्टाटिक पंप । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। पेरिस्टाल्टिक पंपों का स्वचालन। (A)लैबव्यू में उदाहरण कमांड स्क्रिप्ट। कमांड विकल्पों में वॉल्यूम, फ्लो रेट, ठहराव, प्रवाह दिशा शामिल हैं। गति, चरण दूरी, और स्थान वर्तमान में स्वचालित किया जा रहा है । (ख)लैबव्यू में स्क्रिप्ट रीडर । यहां, कमांड स्क्रिप्ट अपलोड की जाती है फिर रन सीक्वेंस और स्टार्ट पंप शुरू करने के लिए दबाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। एचईके सेल ट्रांसफैक्शन दक्षता। (A)मानक इनक्यूबेटर (नियंत्रण) और स्टेज-टॉप इनक्यूबेटर (PIXY) के बीच GCaMP2 ट्रांसफेक्शन तुलना की औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता। डॉट्स और वर्ग प्रत्येक बिंदु को एक कुएं में प्रतिनिधित्व करते हैं जहां एक उपाय किया गया था। (ख)ट्रांसफैक्शन दक्षता एक अलग वेक्टर प्लाज्मिड, पीआरएल-टीके के साथ क्वांटेट और मान्य की गई। पी मूल्य< 0.005. जॉनसन, डी टी, Punshon-स्मिथ, बी, एस्पिनो, जे ए, Gershenson, ए, जोंस, एल.M से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित, एक चल XY मंच के साथ एक मंच इनक्यूबेटर में प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण को लागू करने । विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान, 92 (2), 1691-1696 2019। कॉपीराइट 2020 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। एकल सेल प्रवाह प्रणाली और PIXY में संशोधित प्रोटीन की तुलना। प्रवाह प्रणाली (बैंगनी) और PIXY (हरे रंग) में उपयोग कर संशोधित प्रोटीन के वेन आरेख। जॉनसन, डी टी, Punshon-स्मिथ, बी, एस्पिनो, जे ए, Gershenson, ए, जोंस, एल.M से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित, एक चल XY मंच के साथ एक मंच इनक्यूबेटर में प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण को लागू करने । विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान, 92 (2), 1691-1696 2019। कॉपीराइट 2020 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6। आईसी-एफओपी संशोधनों का स्थानीयकरण। सिस्टम के बीच आईसी-एफपीओपी संशोधनों की तुलना। (A)फ्लो सिस्टम (पर्पल) बनाम प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर (ग्रीन) से ऐक्टिन के भीतर ऑक्सीडेटिवली मॉडिफाइड पेप्टाइड्स का बार ग्राफ। (ख)ऐक्टिन के टैंडेम एमएस स्पेक्ट्रा (पेप्टाइड 316-326) दोनों प्रणालियों में संशोधित प्रोलाइन के साथ और असंशोधित ऐक्टिन पेप्टाइड (सी) एफओपी संशोधित अवशेषों के ऐक्टिन (पीडीबी: 6ZXJ, चेन ए 11 संशोधित अवशेषों में प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर (हरा), प्रवाह प्रणाली में 3 संशोधित अवशेष (बैंगनी), 1 ओवरलापिंग संशोधित अवशेष (पीला) । जॉनसन, डी टी, Punshon-स्मिथ, बी, एस्पिनो, जे ए, Gershenson, ए, जोंस, एल.M से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित, एक चल XY मंच के साथ एक मंच इनक्यूबेटर में प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण को लागू करने । विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान, 92 (2), 1691-1696 2019। कॉपीराइट 2020 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7। प्रवाह बनाम PIXY द्वारा सी एलिगेंस में FPOP संशोधित प्रोटीन की तुलना। प्रवाह प्रणाली की तुलना में PIXY का उपयोग करके ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित प्रोटीन में 1.5 गुना वृद्धि हुई है। जॉनसन, डी टी, Punshon-स्मिथ, बी, एस्पिनो, जे ए, Gershenson, ए, जोंस, एल.M से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित, एक चल XY मंच के साथ एक मंच इनक्यूबेटर में प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण को लागू करने । विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान, 92 (2), 1691-1696 2019। कॉपीराइट 2020 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1. वर्कफ्लो मॉडिफिकेशन डिस्ट्रीब्यूशन और मास शिफ्ट्स (डीए)इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

प्रोटीन जीवित कोशिकाओं में बहुत काम करते हैं। इस महत्व को देखते हुए, शुद्ध प्रणालियों के विपरीत कोशिकाओं में बड़े परिसरों और एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं में जटिलताओं की समझ को गहरा करने के लिए सेलुलर वातावरण में प्रोटीन फ़ंक्शन और उच्च क्रम संरचना (एचओएस) पर विस्तृत डेटा की आवश्यकता है। ऐसा करने के लिए, इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीडेशन ऑफ प्रोटीन (आईसी-एफओपी) नामक एक हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुट प्रिंटिंग (एचआरएफपी) विधि अपनाई गई थी। अधिकांश एफओपी अध्ययन अपेक्षाकृत शुद्ध प्रोटीन प्रणालियों में विट्रो में किए गए हैं, जो भीड़ वाले आणविक वातावरण के साथ स्पष्ट रूप से विरोधाभासों को प्रभावित करता है जो बाध्यकारी बातचीत और प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता को प्रभावित करता है। नतीजतन, इन विट्रो प्रयोगों18 और उन लोगों के निष्कर्षों के बीच एक खाई है जो वास्तविक सेलुलर वातावरण में प्राप्त किए जाएंगे। इन विट्रो एफपीओपी प्रयोग की आदर्शीकृत स्थितियों और सेल की जटिल प्रकृति के बीच के अंतर को पाटने के लिए सेल-एफपीओपी प्लेटफॉर्म में एक नया स्वचालित छह-वेल प्लेट-आधारित विकसित किया गया है। यह उपन्यास एफपीओपी तकनीक इन आणविक प्रजातियों की पहचान करने और उनकी विशेषता बनाने और स्वस्थ और रोगग्रस्त दोनों राज्यों में उनके गतिशील आणविक बातचीत का पता लगाने में सक्षम है। इस नए प्लेटफॉर्म को चल XY स्टेज (PIXY) के साथ प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर कहा जाता है।

एफओपी का उपयोग प्रोटेम के भीतर संरचनात्मक जानकारी को चित्रित करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। हालांकि, हर जैविक तकनीक की कुछ सीमाएं होती हैं जिन्हें और सुधार की आवश्यकता होती है। लेजर फोटोलिसिस के दौरान और बिना किसी रिएक्टेड हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स को कुशलतापूर्वक बुझाने के लिए विशिष्ट अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। पचा पेप्टाइड्स के पृथक्करण संरचनात्मक जानकारी को अधिकतम करने के लिए बड़ी मात्रा में समय की आवश्यकता हो सकती है। जानकारी के इस धन के बाद एमएस डेटा विश्लेषण1के दौरान व्यापक मात्रा की आवश्यकता हो सकती है । लेजर प्लेटफॉर्म पर सेल कल्चर और आईसी-एफपीओपी के लिए जरूरी पेरिफेरल मशीनरी सहित प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर एक बड़ी लागत के साथ आता है जो कुछ लैब्स के लिए संभव नहीं हो सकता है । चूंकि प्रगति जारी है, इसलिए मजबूत सॉफ्टवेयर और विश्लेषण उपकरण तकनीक को आगे बढ़ाना चाहिए; जिनमें से कुछ इस अध्ययन में प्रदर्शित किया गया है । इस प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर में वर्तमान अध्ययन एचईके 293टी कोशिकाओं और सी एलिगेंसमें किए गए हैं। आईसी-एफओपी विधि को चीनी हम्सटर अंडाशय (चो), वेरो, एमसीएफ-7 और एमसीएफ10-ए कोशिकाओं19सहित विभिन्न प्रकार की सेल लाइनों के साथ संगत दिखाया गया है। चूंकि सामान्य आईसी-एफओपीओ विधि इस स्थिर मंच के लिए अनुवादयोग्य है, इसलिए इन सेल लाइनों को PIXY का उपयोग करके अध्ययन के लिए भी उत्तरदायी होना चाहिए।

आईसी-एफओपी एच2ओ2 का उपयोग अमीनो एसिड की सॉल्वेंट सुलभ साइड चेन को ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित करने के लिए करता है, फिर व्यवहार्य कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन इंटरैक्शन, संरचना और मेटाबोलिक प्रभाव को आगे बढ़ाने के लिए जो जैविक संदर्भ प्रदान करने में महत्वपूर्ण है। यह एक आईसी-FPOP प्रयोग से पहले आवश्यक है पुष्टि करने के लिए कि कोशिकाओं को एच2O2 इसके अलावा के बाद व्यवहार्य हैं । कोशिका व्यवहार्यता अध्ययनों से पता चला है कि200m M 13तक एच 2 ओ2 सांद्रता की उपस्थिति में कोशिकाएं व्यवहार्य थीं। यह भी सुनिश्चित करें कि एच 2 O2मीडिया को हटा दियाजाता है के बाद कोशिकाओं पर सीधे २०० mm की अंतिम एकाग्रता पर संचार है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । सेल कल्चर मीडिया को पूरी तरह से हटाने में विफलता के कारण एच2ओ2की सांद्रता अलग - अलग हो जाएगी । मानक स्थितियों की तुलना में, एच 2ओ 2 एकाग्रता बढ़ाने केसाथ-साथइनक्यूबेशन समय को 10 सेकंड तक बढ़ाने के कारण प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर में आईसी-एफपीओपी द्वारा संशोधित प्रोटीन की संख्या अधिक हो गई। यह सुनिश्चित करने के लिए पंप ठीक से काम कर रहे है और तरल फैलाया जा रहा है सुनिश्चित करने के लिए उपयोग से पहले प्रधानमंत्री peristaltic पंपों के लिए जरूरी है । ऐसा न करने पर टयूबिंग में हवा के बुलबुले, कोशिकाओं को विसर्जित करने के लिए एच2ओ2 की अपर्याप्त मात्रा, और/या शमन समाधान की अपर्याप्त मात्रा हो सकती है ।

एक और मुद्दा जो पैदा हो सकता है वह है प्रणाली में अवांछित देरी । इसका एक उदाहरण पंप सिस्टम के लिए प्राप्त आदेशों को सत्यापित करने की प्रक्रिया है जो एकीकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 1000 या अधिक मिलीसेकंड के आदेश पर महत्वपूर्ण देरी जोड़ता है। इस समस्या को प्रयोग के दौरान पंपों के साथ संचार को कम करके और जितना संभव हो उतना समय से पहले प्री-सेट कमांड का उपयोग करके तय किया जा सकता है।

भविष्य में, PIXY के लिए लक्ष्य एक पूरी तरह से स्वचालित और एकीकृत प्रणाली का उत्पादन कर रहा है । पेरिस्टाल्टिक पंपों के अलावा, लेजर पल्स का ट्रिगर स्वचालित होगा। गति और सटीकता बढ़ाने के लिए प्लेटफार्म इनक्यूबेटर के तेजी से आवागमन के लिए एक नई पोजिशनिंग प्रणाली का भी उपयोग किया जाएगा। सिस्टम के सभी घटकों को आगे बढ़ाने के लिए एकीकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रोग्राम किया जाना जारी रहेगा।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित की घोषणा करते हैं ।
यहां प्रस्तुत शोध नीचे संदर्भित पेटेंट आवेदन के साथ जुड़ा हुआ है:
अमेरिका गैर अनंतिम पेटेंट आवेदन संख्या: 17/042,565
शीर्षक: "प्रोटीन फोल्डिंग निर्धारित करने के लिए डिवाइस और विधि"
UMB डॉकेट संख्या: LJ-2018-104 UMass रेफरी: उमा 18-059 ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच आर01 जीएम128983-01 से मिलने वाले अनुदान से समर्थन मिला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps Cole-Palmer 122270050
 Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics Thor Labs
10X trypsin−EDTA Corning AB00490-00005
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror Edmond Optics
Acetone, HPLC Grade Fisher Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg Waters 23275 other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
ACQUITY UPLC M-Class System Waters A53225
Afinia H480 3D Printer (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
air pump OKOlabs D12345
Aluminum Foil Fisher Scientific Stock #63-120
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material Phenomenex
carbon dioxide unit OKOlabs MadMotor®-UHV
Centrifuge Eppendorf
connectors (Y PP 1/16” and 1/16x1/8”) Cole-Palmer 116891000
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 022625501
Dithiothreiotol (DTT) AmericanBio
DMSO, Anhydrous Invitrogen LS118-500
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Corning SK-78001-82
EX350 excimer laser GAM Laser PI89900
Fetal bovine serum (FBS) Corning SK-12023-78
Formic Acid, LC/MS Grade Fisher Scientific A929-4 4 L quantity is not necessary
HEK293T cells Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore)
humidifier OKOlabs Nano-LPMW stage
HV3-2 VALVE Hamilton BP152-500
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific LS120-500
Iodoacetamide (IAA) ACROS Organics
LABVIEW Professional 2018 National Instruments 86728
MadMotor Positioning system and controllers Mad City Labs W6-4
Methanol, LC/MS Grade Fisher Scientific 01-213-100 any brand is sufficient
Microcentrifuge Thermo Scientific H301-T Unit-BL-PLUS
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) ACROS Organics
Nanopositioinging stage Mad City Labs
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) ACROS Organics
OKO Touch Monitoring System OKOlabs
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific 7Z02936
PE50-C pyroelectric energy meter Ophir Optronics
Penicillin-streptomycin Corning
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Scientific
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 75002436
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis Fisher Scientific 06-666A
pressure gauge OKOlabs OKO-AIR-PUMP-BL
PTFE filter OKOlabs CO2-UNIT-BL
Six 33 mm PLA filament rings (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
sterile incubator OKOlabs
temperature unit OKOlabs OKO-TOUCH
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Fisher Scientific A117-50
TiNKERcad (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
Tris Base Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) Cole-Palmer 177350250
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific A454SK-4 4 L quantity is not necessary
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific 88702
90058
KM200
186007496

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References

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Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins. J. Vis. Exp. (171), e62153, doi:10.3791/62153 (2021).

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