Summary
新しい静的プラットフォームは、タンパク質の細胞内高速光化学酸化(IC-FPOP)と呼ばれるタンパク質フットプリント技術を利用して、ネイティブ細胞環境におけるタンパク質構造および相互作用部位を特徴付けるために使用されます。
Abstract
タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)と質量分析(MS)を組み合わせることで、タンパク質相互作用、構造、タンパク質の立体構造ダイナミクスを溶媒のアクセシビリティの関数として問い合わせる構造プロテオミクスにおいて非常に貴重なツールとなっています。近年、FPOPの範囲は、ヒドロキシルラジカルプロテインフットプリンティング(HRPF)技術であり、生細胞培養におけるタンパク質標識に拡大され、複雑な細胞環境におけるタンパク質相互作用を研究する手段を提供している。細胞内タンパク質修飾は、細胞内の全てのタンパク質複合体形成に伴うリガンド誘導構造変化または構造変化に関する洞察を提供することができる。タンパク質のフットプリントは、通常のフローベースのシステムと248 nmのKrFエキシマーレーザーを採用して過酸化水素の光分解を介してヒドロキシルラジカルを得るために達成されており、1つの細胞サンプルに対して20分間の分析が必要です。時間分解FPOP実験を容易にするために、新しい6ウェルプレートベースのIC-FPOPプラットフォームの使用が開拓されました。現在のシステムでは、単一のレーザーパルスがウェル全体を1回照射し、FPOP実験時間枠を切り捨て、20秒の分析時間を生じ、60倍の減少を示します。この解析時間が大幅に短縮され、生化学的シグナル伝達カスケード、タンパク質フォールディング、および差動実験(薬物を含まない、薬物に結合した)などの細胞機構を時間依存的に研究することが可能です。この新しい計器は、可動XYステージ(PIXY)を備えたプラットフォームインキュベーターと題され、温度、CO2 および湿度制御を備えたプラットフォームインキュベーターを使用して光学ベンチで直接細胞培養およびIC-FPOPを実行することを可能にします。プラットフォームには、レーザービームガイダンス用の位置決め段階、蠕動ポンプ、ミラー光学装置も含まれています。PIXY における光学構成、流量、過渡性トランスフェクション、および H2O2 濃度などの IC-FPOP 条件が最適化され、査読されています。システムのすべてのコンポーネントを自動化すると、人間の操作が減少し、スループットが向上します。
Introduction
タンパク質のフットプリント技術は、タンパク質の組織に関する深遠な情報を明らかにすることができます。これらの必須の構造生物学MSベースの技術は、質量分析ツールの構成要素である。これらの方法は、タンパク質高次構造(HOS)と共有標識1、2、3、4を介して相乗効果をプローブする。タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)は、アミノ酸の可溶性側鎖の溶媒を酸化的に修飾するヒドロキシルラジカルを採用している5,6(表1)。この方法は、過酸化水素(H2O2)の光分解のために248nmでエキシマレーザーを利用してヒドロキシルラジカルを生成する。理論的には、20個のアミノ酸のうち19個は、Glyが唯一の例外である酸化的に変えることができる。しかしながら、ヒドロキシルラジカルを用いたアミノ酸の反応速度が変化するため、これらのサブセットのみの改変が実験的に観察されている。それでも、この方法はタンパク質配列5の長さにわたって分析する可能性を秘めている。FPOPはマイクロ秒のタイムスケールでタンパク質を変更し、高速オフレートで弱い相互作用を研究するのに役立ちます。リガンド結合またはタンパク質の立体構造の変化に伴う溶媒のアクセシビリティ変化は、したがって、この方法の力は、タンパク質の標識パターンを複数の状態(すなわち、リガンド結合と比較して自由なリガンド)の比較にある。その結果、FPOPは、タンパク質とタンパク質-リガンド相互作用部位および立体構造変化の領域7、8、9、10の同定に成功している。FPOP法は、精製タンパク質システムの研究から細胞内分析まで拡張されています。細胞内FPOP(IC-FPOP)は、1000以上のタンパク質を酸化的に改変して、プロテオーム11、12の構造情報を提供することができる。従来のIC-FPOPプラットフォームは、レーザービームを越えて単一ファイルを流れるフローシステムを利用しています。このシステムの開発により、個々の細胞はレーザー照射に等しく曝露することができました。これにより、酸化標識タンパク質12の数が13倍に増加した。しかし、流れシステムの制限は、改変が行われる10分間の照射間隔と追加の10分の洗浄サイクルからなる単一のサンプル実験の長さである。IC-FPOPの時間的制約は、生化学的シグナル伝達カスケードにおける相互作用ネットワーク間に存在する短命タンパク質折りたたみ中間体または変化を研究するのに適さない。この時間的な制限は、より高いスループットを備えた新しいIC-FPOPプラットフォームの設計に影響を与えました。
天然細胞環境におけるタンパク質の高次構造を正確に測定するために、新しい設計により、細胞培養をレーザープラットフォームで直接行うことができるため、IC-FPOPは高スループットになります。この設定はまた、接着細胞を基質から除去しなければならない流れを用いたIC-FPOPとは対照的に、細胞環境への最小の摂動を可能にする。新しいプラットホームはレーザービーム指導のための構成されたミラー光学、XY運動のための位置付けシステム、および化学交換のための蠕動ポンプを利用している間、CO2 および温度制御された段階の最室を使用して無菌のインキュベーションシステムでIC-FPOPを起こすことを可能にする。IC-FPOP を実施するための新しいプラットフォームは、可動 XY ステージ (PIXY) を持つプラットフォームインキュベーター (図 1)と題されています。PIXYでは、IC-FPOPは、プラットフォームインキュベーターチャンバー内の6ウェルプレートで成長したヒト細胞に対して行われます。この構成では、XY平面内でインキュベーターを保持する位置決め段階としてビーム適合ミラーを使用して、レーザービームをプレートに下方に反射するので、レーザービームは一度に1つの井戸のみを照射するように戦略的に整列します。検証研究は、IC-FPOPがフローシステムよりもPIXYで速く行われ、タンパク質あたりのアミノ酸修飾の増加につながることを示しています。この新しいIC-FPOPプラットフォームの開発は、細胞実験13から得ることができる知識を説明します。
Protocol
1. 可動XYステージを備えたプラットフォームインキュベーターの組み立て
注:新しいプラットフォームには、インキュベーションシステム、位置決め段階とコントローラ、蠕動ポンプ、248 nm KrFエキシマレーザー、インペリアル光学ブレッドボードに組み立てられた光学ミラーが含まれています。
- インキュベーションシステムを組み立てる:温度単位、二酸化炭素ユニット、加湿器、空気ポンプ、およびタッチ監視システム(図2A-E)。
注: 詳細なアセンブリ手順は製造元によって提供されています。インキュベーターシステムは、インキュベーター内で細胞を増殖させる前に、5%CO2、37°C、および85%の湿度に安定化する必要があります。これらのパラメータは、セルラインに依存する場合があります。 - カスタム6ウェルプレートインキュベーター、ナノ位置決め駆動ステージ、およびXY駆動ステージを組み立てます。前者はそれぞれ後者にねじ込む。
注: 製造元が提供する詳細なアセンブリ手順。 - RS-232ケーブルを介して「デイジーチェーン」シーケンスの4つの蠕動ポンプを、制御コンピュータに接続されたUSBケーブルにRS-232で接続します。各ポンプチャネルローラー上のすべてのチャネルに3.18 mm IDポリマーチューブ(例えば、タイゴン)を接続します。
メモ:各ポンプには4つのローラーがあります。ローラーの方向および流量は手動で操作される。 - 各3.18 mm IDポリマーチューブの端に1/16インチ×1/8"コネクタを挿入します。コネクタの1/16'末端を1.59 IDポリマーチューブに挿入し、カスタムポートを介してポリマーチューブをインキュベーターに挿入します。IC-FPOP 実験中に注入される溶液の中にチューブのもう一方の端を置きます。
注:灌流ラインの場合、インキュベーターは、使用されるすべての試薬を収容するために、すべての周辺の周りのチューブラインのための36のカスタムポートを持っています。 - Ø2用キネマティックミラーマウント内の1つの50 mm、248 nm、45°エキシマレーザーラインミラーを、248 nmレーザー開口部からブレッドボード10-11グリッドポイントにねじ込みます。2番目のミラーをインキュベーターの反対側の1番目の角度に90°の角度で置きます。インキュベーターにレーザー光誘導用の第2ミラーを約45°下方に角度を付けます(図2F-J)。
2. 統合ソフトウェアによるシステムの同期と初期自動化
- ドライバとポンプを制御するために必要な統合ソフトウェアの最新バージョンをインストールします。
- ポンプマニュアルを参照して、ポンプの名前を'5'から始まり、値が増加します。コマンドは、統合ソフトウェアの 手動制御 サブプログラムを使用してポンプシステムに送信できます。
注: ポンプをチャネル モードに設定すると、4 つのポンプ チャネルに対応するセット 1、2、3、4 にポンプ命名規則が自動的に変更されます。 - プラットフォームインキュベーターの自動化のための統合ソフトウェアプログラムを開きます。
- ポンプ用 Comport とラベル付けされた接続ドロップダウンメニューから、ポンプシステムの USB ケーブルに対応する適切な USB コンポートデバイス名 (COM4 など) を選択します。
- 自動プラットフォームインキュベーター プラットフォーム用のスクリプトを編集/作成するには、[スクリプト ビルダー ] ボタンをクリックします。[スクリプトの保存] をクリックしてシーケンスをテキスト ファイルとして保存します (図 3A)。
注: スクリプト ビルダには、ポンプ番号、方向、速度、体積、チューブ直径、チャネル モード、および時間指定遅延の定義を含むスクリプトを定義するためのユーザー インターフェイスがあります。 - スクリプトの作成にチャンネルモードが必要な場合、スクリプト内のステップは、チャネルモードの出入りポンプの変更に専念する必要があり、ポンプチャネルに対応する次の手順はポンプ1〜4としてラベル付けする必要があります。
注: プラットフォームインキュベータースクリプト中に 2 台のポンプを同時にチャネルモードにすることができ、必要なチャネルにコマンドを送信した後に各ポンプをレガシーモードに戻すことができます。 - [ スクリプトの読み取り ] ボタンをクリックし、プラットフォームインキュベーター操作に必要なスクリプト ファイルを選択します。
- [ シーケンスの実行 ] ボタンを ON (緑) に切り替えてスクリプトを実行し 、[START] ボタン (図 3B)をクリックします。
3. プラットフォームインキュベーターで細胞を成長させる
注:細胞は実験の前日に細胞培養フード内の無菌条件下でプラットフォームインキュベーターに配置する必要があります。
- プラットフォームインキュベーターをナノ位置位置から外し、温度、ガス、加湿器ラインを取り外します。70%エタノールをインキュベーターにスプレーした後、細胞培養フードに入れる。
- T-175で細胞を約80-90%の合流度に成長させる。
注: コンフルエンシーという用語は、細胞培養皿またはフラスコ内の細胞の数/被覆数の尺度として使用されます。 - メディアを取り外し、バッファですすいします。
- メーカーのプロトコルを使用してトリプシンEDTAを使用してセルを取り外します。
- 8 mLの培地で再中断し、セルをカウントします。
- 種子フィブロネクチン/コラーゲン14 は、各ウェルに約90〜95μLの再懸濁細胞を含む6ウェルプレートをコーティングしました。この体積は、翌日に各ウェルで80〜90%の合流率(約120万個の細胞)を達成するのに適しています。
注:6ウェルプレートは、播種する前にコラーゲンでコーティングする必要があります。IC-FPOP中に使用される試薬は速い流速と注入される。コーティングされた版は試薬の注入による細胞が早期に切り離されないことを保障する。 - シードプレートをプラットフォームインキュベーターに入れ、石英蓋で覆います。
注:設計と開発の間、ガラスのインキュベーターのふたが石英に変わったので、紫外線レーザー光と互換性があります。 - プラットフォームインキュベーターをナノポジショニングドライブステージに戻して取り付け、固定します。温度、ガス、加湿器ラインを再接続します。
- 細胞は一晩で合流に成長してみましょう。
注: 次の細胞培養手順はオプションで、ヒト細胞が一時的にトランスフェクションされる実験を目的としています。これらのステップは細胞培養条件の下でトランスフェクション効率を評価する。 - キメラタンパク質GCaMP2の遺伝子を含むプラスミドを市販のカチオン脂質トランスフェクションキットを用いてHEK 293細胞にトランスフェクトする。
- HEK293T細胞におけるGCaMP2の一過性トランスフェクションを2つの6ウェルプレートで行います。
- プラットフォームインキュベーターに1つの6ウェルプレートをインキュベートし、2番目の6ウェルプレートを標準CO2 インキュベーターにインキュベートします。
- 蛍光顕微鏡を用いた蛍光イメージングにより、各プレート内のトランスフェクション効率を比較します。
4. クエンチバッファーとH2O2を作ります
- 125 mM N-tert-ブチル-αフェニルニトロン(PBN)と125 mM N、N'-ジメチルチオウラ(DMTU)を含むクエンチバッファーの100 mLを作ります。
注:DMTUおよびPBNはフリーラジカルスカベンジャーであり、細胞透過性である。 - 希釈H2O2〜200mM. 各サンプルは、各ウェルの底部に細胞の層を完全に浸漬するために6 mLのH2O2を必要とします。
注:クエンチバッファーは前日に作られ、光から保護された一晩4°Cで保存されます。実験の日にH2O2を希釈する。
5. IC-FPOP 用プラットフォームインキュベーターをセットアップする
注:プラットフォームインキュベーターは、無菌条件下で組み立てる必要があります。無菌細胞培養フードでインキュベーターを組み立てます。
- プラットフォームインキュベーターを位置決め段階から外し、温度、ガス、加湿器ラインを取り外します。
- 70%エタノールをインキュベーターにスプレーした後、細胞培養フードに入れる。
- プラットフォームインキュベーターから6ウェルプレートを取り出し、プレートの元の蓋を固定し、顕微鏡を使用して細胞の合流を確認します。
- 細胞の合流が確認された後、6ウェルプレートを、細胞培養フード内のプラットフォームインキュベーターにコンフルエント細胞を交換します。
- 埋め込みポートを介して、各ウェルに3つのプレカット(15 cm)1.59 IDポリマーチューブを挿入します。チューブを井戸壁にフラッシュし、カスタム3Dプリントリングを保持します。
注:6つの33 mm PLAフィラメント3Dプリントリングは、細胞を邪魔したり、レーザーパルスの邪魔をすることなく、プレートの壁にチューブを固定するようにカスタム設計されました。 - プラットフォームインキュベーターを石英蓋で覆います。位置決めシステムのステージトップインキュベーターを交換して固定します。温度、ガス、加湿器ラインを再接続します。
- 1/16x1/8"コネクタの1/16"端に1.59 IDポリマーチューブを接続します。
6. プラットフォームインキュベーターでIC-FPOPを実行する
- ポンプ撤退のための統合ソフトウェアスクリプトを準備します。1つの蠕動ポンプ(ポンプ8)を使用して、6つのウェルすべてから細胞培地を完全に取り除きます。
- 他の3つの蠕動ポンプの各チャネルにおける溶媒を主とする(ポンプ5-7)。試薬がインキュベーターポートに到達するまで、それぞれの交互の管にH2O2およびクエンチバッファーを注入する。
- レーザー光が鏡によって正しく傾いており、インキュベーターに無制限に到達していることを確認します。
注:レーザー安全ゴーグルは、レーザーが使用されているときはいつでも着用する必要があります。釣り/アライメントプロセス中に細胞を早期に照射しないでください。梁を揃えるときに石英蓋を完全に覆うために段ボールを使用してください。また、6ウェルプレートの白紙に印刷された輪郭を使用して、レーザービームが各ウェルの中心に当たっていることもさらに確認します。最も低い周波数で 連続 パルス設定を使用し、アライメントにエネルギーを設定します。 - 外部センサーを使用してレーザーエネルギーをチェックします。50 Hz と 27 kV で 160 mJ の 1 つのレーザーパルスを使用します。
メモ:次の手順ではタイマーが必要です。 - ビームの位置合わせを確認した後、ポンプ注入用の統合ソフトウェアスクリプトを準備します。
- タイマーを開始し、統合ソフトウェアポンプスクリプトの [開始 ]ボタンを同時に押します。
- 200 mM H2O2 を 35 mL/min で第 1 ウェル (タイマーで 6-10 秒マーク) に注入します。
注:ポンプが注入し始める前に5秒の遅延があります。また、パルスがトリガされるまでにレーザーが7秒かかります。レーザーパルスは、H2 O2注入直後に来なければなりません。 - 5秒のマークでレーザーソフトウェアの スタート ボタンを押して、タイマーの11秒のマークでパルスをトリガします。
- レーザーパルスの直後に35 mL/minで125 mMのクエンチ溶液を最初のウェルに注入します。手動でレーザービームと次のうまく整列するために、位置決め段階を移動します。
- 各井戸が処理されるまで、上記の手順6.5~6.9を繰り返します。
注:IC-POPは、3つのレーザーと3つの非レーザーサンプルの技術的な三重で行われます。1つの処理された6ウェルプレートは、1つの生物学的複製として機能する。 - 細胞培養フードでは、細胞スクレーパーを使用して、各ウェルから個々の15 mL円錐形チューブに細胞を移管します。遠心分離細胞を1,200xgで5分間行う。
- 上清を捨て、細胞を100μLのRIPAライシスバッファーに再懸濁させます。
- 細胞を個々の1.2 mLポリプロピレンチューブに移す。
- フラッシュは液体窒素ですべてのサンプルを凍結し、使用するまで-80°Cの冷凍庫に入れます。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
7. タンパク質抽出、精製、タンパク質分解
- サンプルを解凍し、ヒートブロックで95°Cで5分間加熱します。
- 加熱後、氷の上で5分間冷やします。
- 細胞ライセートに25単位のヌクレアーゼを加えて、一本鎖、二本鎖、直線的、円形のDNAおよびRNAを分解し、室内温帯で15分間インキュベートします。
- 遠心分離機試料を16,000xgで4°Cで10分間用いた。
- 上清を収集し、きれいなポリプロピレンチューブに転送します。
- 着色タンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を確認します。
- 100 μgのサンプルをきれいなポリプロピレンチューブに移し、細胞のリシスバッファーで100 μLにします。
- 50°Cで10 mMジチオトレイトール(DTT)でサンプルを45分間減らします。
- 室温で10分間冷却します。
- アルキル酸と50 mMヨードアセトアセトアミド(IAA)を室温で20分間使用した。
注: IAA を光から保護 - 460 μLのプレチルド(-20°C)アセトンを加えます。渦試料を一晩-20°Cに置く。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。 - 翌日、遠心分離機サンプルを16,000xgで4°Cで10分間10分間サンプリングする。
- タンパク質ペレットを破壊することなくアセトンを除去します。
- 90%前冷や(-20°C)アセトンの50μLを加えます。ボルテックスサンプルを混合し、遠心分離機を16,000 x gで4°Cでさらに5分間混合する。
- アセトンを取り出し、サンプルを2〜3分間乾燥させます。
- 10 mM Tris バッファー pH 8 でタンパク質ペレットを再懸濁します。
- MSグレードのトリプシン(20 μgストック)を40 μLの10 mM TrisバッファpH 8に再び中断し、各サンプルに2.5 μgのトリプシンを加えます。
- 一晩で37°Cでサンプルをインキュベートする。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。 - 着色ペプチドアッセイを用いてペプチド濃度を評価する。
- 5%のギ酸でサンプルをクエンチします。
- 10 μgのサンプルをきれいなポリプロピレンチューブに移します。
- 真空遠心分離機を使用してサンプルを乾燥させ、MSグレード0.1%のギ酸(FA)を水中に20 μLで再懸濁します。
- 各サンプルをプリスリットキャップでクリーンオートサンプラーバイアルに移します。
8. 高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)
- FPOP の変更をローカライズするには、LC-MS/MS 分析を使用して、消化された細胞のライセートを分析します。
- 水中で0.1%FA(A)、アセトニトリル(ACN)(B)で0.1%FAの移動相を使用してください。
- サンプルを180 μm x 20 mm C18 (5 μm および 100 Å) のトラッピングカラムに 0.5 μg 積み込み、99%(A)と 1%(B)で15分間洗浄します。
- 75 μm x 30 cm C18 (5 μm および 125 Å) 分析カラムを使用して、流量 0.300 μL/min の個別の消化ペプチドを 120 分間使用します。
- LC 勾配を次のように実行します: 0 -1 分、3% 溶媒 B;2-100分、10-45%B;100-110分、45-100%B;110-115分、100%B。
- 列を 115 ~ 116 分の 3% (B) で再調整し、116 ~ 120 分の間は 3% (B) で保持します。
- ナノエレクトロスプレーイオン化で、正イオンモードで溶出したペプチドを解析します。
- 60,000の解像度で375-1500のm/zスキャン範囲でMS1スペクトルを取得します。
- 自動ゲイン制御(AGC)ターゲットを5.0e5 に設定し、最大射出時間は50 ms、最大射出時間は5.0e4 強度しきい値を設定します。
- 1.2 m/zの分離ウィンドウと4秒のサイクル時間で、データ依存取得(DDA)によって電荷状態2~6の前駆体イオンを分離します。
- 被験者MS2イオンを高エネルギー衝突解離(HCD)(32%正規化エネルギー)にする。
- 1 MS/MS取得後のペプチドを60秒間除外します。
- AGC ターゲットが 5.0e4、 最大射出時間が 35 ミリ秒の MS/MS 解像度を 15,000 に設定します。
9. プロテオーム発見者/データ処理
- 関連する ホモサピエンス タンパク質データベースおよび消化酵素に対して利用可能なボトムアッププロテオミクス分析ソフトウェア上のタンデム生データファイルを検索します。
- タンパク質分析の検索パラメータを設定します。
- フラグメント許容値を 0.02 Da に、親イオン許容値を 10 ppm に設定します。
- トリプシンに酵素の特異性を設定し、1つの切断を逃すことを可能にします。
- 質量範囲を 375~1500 m/z に設定します。
- ペプチド信頼度を95%(中)、残基信頼度を99%(高)に設定します。
- 少なくとも2つの異なるペプチドが5%の発見率(FDR)フィルターで同定されるならばタンパク質を受け入れる。
- カルバミドメチル化を静的修飾と全て既知のヒドロキシルラジカル側鎖修飾15,16と動的修飾として設定する。
- ファイルの検索が完了したら、エクスポート シーケンス、変更場所、タンパク質のアクセス、スペクトル ファイル、前駆体の豊富さ、および保持時間情報を電子データベースにエクスポートします。
- この方程式からペプチドまたは残基あたりの修飾の程度を計算します。
注:変性EIC領域は、酸化修飾を有するペプチドまたは残基の抽出されたイオンクロマトグラフィー領域(EIC)であり、かつEIC領域は、酸化修飾の有無にかかわらず同じペプチドまたは残基の総面積である。時間が経つにつれて、過酸化水素の存在下でタンパク質が酸化し、バックグラウンド酸化をもたらす。修飾の程度を計算するために、改変ペプチドの面積を全面積で除算する。非照射制御サンプルは、バックグラウンド酸化を占める。コントロールサンプルからのバックグラウンド酸化をレーザー処理サンプルから差し引き、FPOP修飾を同定します。
Representative Results
プラットフォームインキュベーター条件がレーザープラットフォームでの細胞培養に十分であることを確認するために、GCaMP2はHEK293Tに一過性トランスフェクションし、両方のプレートのトランスフェクション効率を蛍光イメージングを介して評価した(図4A)。GCaMP2は、遺伝的にコード化された細胞内カルシウム指標として使用されるカルシウムセンシング蛍光タンパク質である。緑色蛍光タンパク質(GFP)とカルシウム結合タンパク質、カルモジュリンの融合です。トランスフェクション効率を定量化するためにプラスミドprl-TKをトランスフェクトしたHEK 293細胞に対してルシファーゼアッセイを行った(図4B)。これらの結果は、プラットフォームインキュベーターが標準的なインキュベーターの性能を超え、トランスフェクション効率が1.13倍向上し、最適な細胞培養環境の定量的ベンチマークを提供したことを示している。
フローシステムで標識されたHEK293T細胞におけるFPOP修飾を、プラットフォームインキュベーターで標識されたものと比較し、プラットフォームインキュベーターが、改変されたタンパク質の数およびそれらのタンパク質におけるFPOP総被覆率の両方においてフローシステムを上回ることを示した。プラットフォームインキュベーターで獲得したFPOP改変タンパク質の数は、一般的な実験で得られたタンパク質よりも約1051、2.2倍多かった。各実験について2つの生物学的複製の間で改変を組み合わせた。さらに、PIXY は高いスループットを提供します。
タンパク質全体でより高い修飾カバレッジの利点を実証するために、IC-FPOP修飾はペプチドレベルに局在し、修飾の程度を定量化してアクチンの系間の結果の違いを区別した、375アミノ酸タンパク質である。フローシステムでは、2つの修飾ペプチドが検出され、限られた構造情報を提供した(図6A)。しかし、アクチン配列にまたがる5個の改変ペプチドがプラットフォームインキュベーターで検出された。タンデム質量スペクトルは、各実験で残留物Pro322が改変され、検出されたことを示す(図6B)。プラットフォームインキュベーターサンプルで改変された5つのペプチドには12個の改変残基が含まれ、フローシステムで改変された残基は4個のみであった(図6C)。酸化カバレッジの増加は、タンパク質全体のより多くの構造情報を提供します。
Espinoら. 生体 内で 行われるFPOPの能力を実証した (IV-FPOP) C. エレガンス, ヒト疾患状態のワームモデル17.IV-FPOPはフローシステムを介して実行されますが、PIXYシステムはワームとの互換性についてテストされました。LC-MS/MS分析では、プラットフォームインキュベーターの各井戸に約10,000個のワームがインキュベートされ、792個のタンパク質がフローシステムで改変された545個のタンパク質と比較して、プラットフォームインキュベーター内のIV-FPOPによって改変されたことが明らかになった(図7)。これらの結果は、2D細胞培養に加えて、この新しい方法論が C.エレガンスのような他の生物学的システムの研究とまた互換性があることを示している。
図 1.PIXYシステムの概略図。システムコンポーネント: (A) ステージトップインキュベーター, (B) ポジショニングシステム , (C) 蠕動ポンプ, (D) 灌流ライン.細胞培養培地は、H2O2の前にポンプを介して各ウェルから除去され、クエンチ溶液は計算されたタイムポイントで注入される。白色で示される照射のためのレーザー経路。ジョンソン、D.T.、パンションスミス、B.、エスピーノ、J.A.、ゲルシェンソン、A.、ジョーンズ、L.M.、可動XYステージを有するプラットフォームインキュベーターでタンパク質の細胞内高速光化学酸化を実施する。分析化学, 92(2), 1691-1696 2019.著作権 2020 アメリカ化学会.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.完全に組み立てられたPIXYシステム。(A)タッチ監視システム、( B)炭酸ガスユニット、(C)温度単位、(D)空気ポンプ、(E)加湿器、(F)光学ミラー、(G)プラットフォームインキュベーター、(H)ポジショニングステージ、(I)248nm KrF励起剤レーザー、及び(J)の蠕動ポンプ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.蠕動ポンプの自動化。 (A) LABVIEWのコマンドスクリプトの例。コマンドオプションには、ボリューム、流量、一時停止、流れ方向があります。スピード、ステージの距離、位置は現在自動化されています。(B) LABVIEWのスクリプトリーダー。ここでは、コマンド スクリプトがアップロードされ、その後、Run Sequence と START が押されてポンプが開始されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.HEK細胞トランスフェクション効率。(A)標準インキュベーター(コントロール)とステージトップインキュベーター(PIXY)の間のGCaMP2トランスフェクション比較の平均蛍光強度。ドットと四角形は、メジャーが取られた井戸の各点を表します。(B)異なるベクタープラスミド pRL-TK で定量し、検証されたトランスフェクション効率。p値<0.005。ジョンソン、D.T.、パンションスミス、B.、エスピーノ、J.A.、ゲルシェンソン、A.、ジョーンズ、L.M.、可動XYステージを有するプラットフォームインキュベーターでタンパク質の細胞内高速光化学酸化を実施する。分析化学, 92(2), 1691-1696 2019.著作権 2020 アメリカ化学会.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.単細胞流動系とPIXYで改変したタンパク質の比較 フローシステム(紫)とPIXY(緑色)で修飾されたタンパク質のベン図。ジョンソン、D.T.、パンションスミス、B.、エスピーノ、J.A.、ゲルシェンソン、A.、ジョーンズ、L.M.、可動XYステージを有するプラットフォームインキュベーターでタンパク質の細胞内高速光化学酸化を実施する。分析化学, 92(2), 1691-1696 2019.著作権 2020 アメリカ化学会. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.IC-FPOP の変更のローカライズ。システム間のIC-FPOPの変更の比較。(A)フローシステム(紫色)とプラットフォームインキュベーター(緑色)からのアクチン内の酸化的に改変されたペプチドの棒グラフ。(B)アクチンのタンデムMSスペクトル(ペプチド316-326)とアクチンの両方の系で改変プロリン(C)FPOP改変残基のアクチン(PDB:6ZXJ、チェーンA11)はプラットフォームインキュベーター内の改変残基(緑色)、フロー系中3個の改変残基(黄)を重ね合わせ、1個の変性残基(黄黄色)。ジョンソン、D.T.、パンションスミス、B.、エスピーノ、J.A.、ゲルシェンソン、A.、ジョーンズ、L.M.、可動XYステージを有するプラットフォームインキュベーターでタンパク質の細胞内高速光化学酸化を実施する。分析化学, 92(2), 1691-1696 2019.著作権 2020 アメリカ化学会.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7. フローによるC.エレガンス におけるFPOP修飾タンパク質の比較とPIXYの比較 流れシステムと比較すると、PIXYを用いた酸化修飾タンパク質の1.5倍の増加があります。ジョンソン、D.T.、パンションスミス、B.、エスピーノ、J.A.、ゲルシェンソン、A.、ジョーンズ、L.M.、可動XYステージを有するプラットフォームインキュベーターでタンパク質の細胞内高速光化学酸化を実施する。分析化学, 92(2), 1691-1696 2019.著作権 2020 アメリカ化学会. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表 1.ワークフロー変更分布と質量シフト (Da). ここをクリックしてこの表をダウンロードしてください。
Discussion
タンパク質は生きている細胞で仕事の多くを行います。この重要性を考えると、細胞環境におけるタンパク質機能および高次構造(HOS)に関する詳細なデータは、精製システムとは対照的に、細胞内のより大きな複合体および酵素反応における複雑さの理解を深めるために必要である。これを行うために、ヒドロキシルラジカルプロテインフットプリンティング(HRFP)法を採用し、タンパク質の高速光化学酸化(IC-FPOP)と題した。ほとんどのFPOP研究は、結合相互作用およびタンパク質立体構造ダイナミクスに影響を与える混雑した分子環境とは対照的な比較的純粋なタンパク質系 でインビトロで 行われてきた。その結果、 インビトロ 実験18 からの知見と実際の細胞環境で得られるものとの間に、シスムがある。 インビトロ FPOP実験の理想化された条件と細胞の複雑な性質との間のギャップを埋めるために、セルFPOPプラットフォームで新しい自動化された6ウェルプレートベースのギャップが開発されました。この新しいFPOP技術は、これらの分子種を同定し、特徴付け、健康な状態と病気の両方の状態でそれらの動的分子相互作用をトレースすることができる。この新しいプラットフォームは、移動可能 XY ステージ(PIXY)を備えたプラットフォームインキュベーターと呼ばれています。
FPOPは、プロテオーム内の構造情報の特徴付けに成功しました。しかし、すべての生物学的手法には、さらなる改善が必要な特定の制限があります。レーザー光分解時に、かつ、未反応のヒドロキシルラジカルを効率的に焼入れさせるために、特定の試薬が必要です。消化されたペプチドの分離は、構造情報を最大化するために多くの時間を必要とします。この豊富な情報は、MS後のデータ分析1の間に、大量の定量化を必要とすることもできます。レーザープラットフォームでの細胞培養やIC-FPOPに必要な周辺機械を含むプラットフォームインキュベーターには、一部のラボでは実現不可能な大きなコストが付属しています。進歩が続く中、堅牢なソフトウェアおよび分析ツールは、この技術をさらに進める必要があります。その一部は、この研究で紹介されています。このプラットフォームインキュベーターの現在の研究は、HEK293T細胞および C.エレガンスで行われている。このIC-FPOP法は、中国のハムスター卵巣(CHO)、ベロ、MCF-7、およびMCF10-A細胞19を含む多種多様な細胞株との相性が示されている。一般的なIC-FPOP法はこの静的プラットフォームに翻訳可能であるため、これらの細胞株はPIXYを用いた研究にも適しているはずです。
IC-FPOPは、H2O2を利用して、アミノ酸のアクセス可能な側鎖の溶媒を酸化的に修飾し、生物学的文脈を提供する上で有意である生存細胞内のタンパク質相互作用、構造、代謝効果をさらに識別する。H2O2添加後に細胞が生存可能であることを確認することは、IC-FPOP実験の前に不可欠である。細胞生存率試験は、細胞が200 mM 13までのH2O2濃度の存在下で生存可能であることを実証した。また、培地を取り除いた後、H2O2を細胞に直接200 mMの最終濃度で注入することも重要です。細胞培養培地を完全に除去しないと、H2O2の濃度が変化する。標準的な条件と比較して、H2O2濃度を増加させるとともにインキュベーション時間を10秒に増加させることで、プラットフォームインキュベーター内のIC-FPOPによってより多くのタンパク質が修飾された。ポンプが正常に動作し、液体が分散されていることを確認するために使用する前に蠕動ポンプをプライムすることが不可欠です。これを怠ると、チューブ内の気泡、細胞を浸漬するH2O2のボリュームが不十分、および/またはクエンチ溶液の量が不足する可能性があります。
発生する可能性のある別の問題は、システムの不要な遅延です。この例は、統合ソフトウェアを使用して 1000 ミリ秒以上の大きな遅延を追加するポンプ システムの受信コマンドを検証するプロセスです。この問題は、実験中にポンプとの通信を最小限に抑え、事前に設定されたコマンドをできるだけ早く使用することで解決できます。
今後、PIXY の目標は、完全に自動化された統合システムを生産することです。蠕動ポンプに加えて、レーザーパルスのトリガーは自動化される。また、プラットフォームインキュベーターの迅速な移動に新しい測位システムを利用して、速度と精度を向上させます。システムのすべてのコンポーネントは、スループットをさらに向上させるために統合ソフトウェアを使用してプログラムされ続けます。
Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益を宣言しない。
本明細書に示される研究は、以下の参照される特許出願に関連しています:
米国非仮特許出願件数:17/042,565
タイトル:「タンパク質フォールディングを決定するためのデバイスと方法」
UMB ドケット番号: LJ-2018-104 UMass Ref: UMA 18-059.
Acknowledgments
この作業は、NIH R01 GM128983-01からの助成金によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
| Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
| 10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
| 50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
| Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
| air pump | OKOlabs | D12345 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| connectors (Y PP 1/16” and 1/16x1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
| EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
| humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
| LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
| MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
| Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
| OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
| Penicillin-streptomycin | Corning | ||
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
| pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
| PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
| Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
| sterile incubator | OKOlabs | ||
| temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
| TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
| Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
| 90058 | |||
| KM200 | |||
| 186007496 |
References
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