Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

استهداف الحمض النووي الريبي في كل مكان والأنسجة محددة في Drosophila Melanogaster باستخدام CRISPR / CasRx

Published: February 5, 2021 doi: 10.3791/62154
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكول مفصل لاستخدام إنزيم Cas13D (RfxCas13D) الذي يستهدف الحمض النووي الريبي في الذباب.

Abstract

CasRx ، وهو عضو في عائلة Cas13 التي تستهدف الحمض النووي الريبي ، هو إضافة جديدة واعدة لتقنيات CRISPR / Cas في تقليل نسخة الجينات الفعالة مع ملف تعريف جذاب خارج الهدف على المستويين الخلوي والكائن الحي. وتفيد التقارير مؤخرا أن نظام CRISPR / CasRx يمكن استخدامها لتحقيق خفض النص الجيني في كل مكان والأنسجة محددة في Melanogaster Drosophila. هذه الورقة تفاصيل أساليب العمل الأخير، وتتألف من ثلاثة أجزاء: 1) في كل مكان في الجسم الحي RNA الذاتية استهداف باستخدام نظام CasRx مكونين؛ 2) في كل مكان في الجسم الحي الداخلي RNA استهداف باستخدام نظام CasRx مكونين؛ 2) في كل مكان في الجسم الحي. 2) في كل مكان في الجسم الحي الخارجي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات؛ و 3) الأنسجة محددة في الجسم الحي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات. وتشمل آثار استهداف الحمض النووي الريبي الملاحظ التغيرات الجينية المحددة المستهدفة، والحد من نسخة الحمض النووي الريبي المستهدف، والأنماط الظاهرية المميتة في بعض الأحيان المرتبطة بالتعبير العالي عن بروتين CasRx والنشاط الجانبي. بشكل عام ، أظهرت هذه النتائج أن نظام CasRx قادر على استهداف تقليل نسخة الحمض النووي الريبي على مستوى الكائن الحي بطريقة قابلة للبرمجة والكفاءة ، مما يدل على أنه في استهداف النسخ الحية ، والهندسة ممكنة وتضع الأساس للمستقبل في تقنيات استهداف الحمض النووي الريبي المستندة إلى vivo CRISPR.

Introduction

منذ ظهور تقنيات تكرارات باليندروميك القصيرة المتشابكة بانتظام (CRISPR) ، كان الكثير من التركيز في هذا المجال على تحرير الحمض النووي ، والذي يقدم تطبيقات تحويلية في الطب والتكنولوجيا الحيوية1. ومع ذلك، فإن التغيير الدائم لتسلسل الحمض النووي ليس مرغوبا دائما بسبب الاعتبارات الأخلاقية. وفي ضوء ذلك، بدأت الدراسات الحديثة في تطوير أدوات قائمة على كريسبر لاستهداف الحمض النووي الريبي وأظهرت أن تكنولوجيات CRISPR يمكن استخدامها بالفعل لاستهداف الحمض النووي الريبي في مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية2,3,4,5,6,7. في العديد من هذه الأنظمة التي تم اختبارها ، فإن النهج الحالي المستخدم على نطاق واسع لاستهداف الحمض النووي الريبي والحد من النسخ هو تداخل الحمض النووي الريبي (RNAAi) ، وهو أبعد ما يكون عن الكمال ، وغالبا ما يظهر فعالية متنوعة ونشاطا مرتفعا خارج الهدف عند استخدامه في vivo8 و 9 و 10 و 11 و 12 و 13 و 14 و 15 و 16 و 17 . ولذلك، وبالنظر إلى حالة هذه التكنولوجيات، يجدر مواصلة استكشاف إمكانات الأدوات القائمة على كريسبر لاستهداف الحمض النووي الريبي.

وذكرت إحدى الدراسات الحديثة البارزة أن ريبونوكليز كاسرإكس، وهو عضو في فئة Cas13d، يمكن أن يقلل بكفاءة من مستويات النسخ الجينية في ثقافة الخلايا البشرية ويمتلك ملفا شخصيا جذابا خارج الهدف4. أدت هذه النتيجة إلى مسألة ما إذا كان هذا الريبونوكليا الجديد يمكن الحفاظ على فعاليته وانخفاض معدل خارج الهدف لاستهداف الحمض النووي الريبي على مستوى الكائن الحي. تناولت دراسة حديثة هذه المسألة من خلال إظهار أنه يمكن استخدام نظام CasRx لتحقيق تخفيض في كل مكان والنص الجيني الخاص بالأنسجة في Drosophila melanogaster5.

لتبسيط قابلية استخدام هذا النهج المنشور مؤخرا، يفصل هذا البروتوكول الأساليب من هذا العمل الأخير، الذي يتكون من ثلاثة أجزاء رئيسية: 1) في كل مكان في استهداف الحمض النووي الريبي الحي باستخدام نظام CasRx مكون من مكونين؛ 1) في كل مكان في الجسم الحي RNA استهداف باستخدام نظام CasRx مكونين؛ (2) في كل مكان في نظام CasRx مكونين؛ (2) في كل مكان في نظام CasRx مكون من مكونين؛ (2) في كل مكان في نظام CasRx المكون من مكونين؛ (2) في كل مكان في نظام CasRx المكون من مكونين؛ (2) في كل مكان في نظام CasRx المكون من مكونين؛ (2) في كل مكان في نظام 2) في كل مكان في الجسم الحي الخارجي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات؛ و 3) الأنسجة specificin في الجسم الحي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات.

تم تصميم دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) الذي يستهدف الجينات المستهدفة المختلفة تحت سيطرة مروج في كل مكان وتم إنشاء خطوط طيران تعبر عن هذه البنى المحتوية على الحمض النووي الريبي. تم تصميم بنيات CasRx تحت سيطرة إما مروج في كل مكان ، أو مروج تسلسل تنشيط المنبع المشروط (UASt) القابل للتفعيل بواسطة عامل النسخ GAL4 ، وخطوط الطيران التي تؤوي هذه البنى المحتوية على CasRx التي تم إنشاؤها. تم تصميم وبناء CasRx غير نشطة بشكل حفاز، dCasRx، واستخدامها كعناصر تحكم سالبة. يتم تحقيق استهداف الحمض النووي الريبي في كل مكان في الذباب من خلال عبور خطوط الطيران المعبرة عن الحمض النووي الريبي مع خطوط الطيران المعبرة عن CasRx في كل مكان. ذرية التعبير عن كل من بناء الحمض النووي الريبي التي تستهدف نسخة جينية محددة وبروتين CasRx لديه انخفاض في كل مكان من النصوص الجينية المستهدفة. يتم تحقيق استهداف الحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة في الذباب من خلال عبور الذباب المعبر عن الحمض النووي الريبي لأول مرة مع UASt-CasRx الذي يعبر عن الذباب ، والحصول على ذباب transheterozygous يحمل كلا من GRNA و UASt-CasRx. يتم عبور مثل هذه الذباب بدوره مع الذباب المعبر عن GAL4 الخاص بالأنسجة ، مما يؤدي إلى توليد تعبير CasRx الخاص بالأنسجة واستهداف الحمض النووي الريبي في الذباب.

توفر الطبيعة القابلة للبرمجة لنظام CasRx إمكانية التخصيص والتحسين للمساعدة في تحقيق فعالية عالية ونشاط منخفض خارج الهدف لاستهداف الحمض النووي الريبي الحي. التطبيقات المحتملة لاستهداف الحمض النووي الريبي القائم على CRISPR عديدة ، بما في ذلك استبدال الحمض النووي الريبي في المختبر والمساهمة في مكافحة ناقلات الحشرات في البرية. ومن بين هذه الاحتياجات الأخيرة، هناك حاجة عالمية لم تلب بعد، وهي استحداث أدوات فعالة لمكافحة عدوى فيروسات الحمض النووي الريبي التي تنتقل عن طريق البعوض. وينتقل العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي، مثل حمى الضنك وزيكا وشيكونغونيا، عن طريق البعوض، مما يؤثر على صحة الإنسان، ويساهم في الوفيات. وقد قدمت مقترحات عديدة لهندسة أعداد البعوض التي لديها مقاومة للفيروسات للوقاية من الأمراض؛ ومع ذلك ، لا توجد تكنولوجيا حالية قادرة على جعل البعوض مقاوما في وقت واحد لجميع فيروسات الحمض النووي الريبي الهامة18،19،20،21،22،23. وقد توفر أنظمة Cas التي تستهدف الحمض النووي الريبي نقطة انطلاق لمثل هذه التكنولوجيا من خلال تمكين منصة قابلة للبرمجة لاستهداف جميع فيروسات الحمض النووي الريبي التي يحملها البعوض.

Protocol

1. في كل مكان في الجسم الحي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx مكونين

  1. توليد يوبيك-كاسرإكس و متجه التعبير يوبيك-dCasRx
    1. تضخيم تسلسل CasRx باستخدام تفاعل سلسلة البوليميراز (PCR) مع التمهيدي 1050E. C3 و 1050E. C4 و CasRx الأصلي بناء pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx); وتضخيم تسلسل dCasRx باستخدام PCR مع التمهيدي 1050E. C3 و 1050E. C4 و dCasRx الأصلي بناء pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)4 (الجدول 1). جل تنقية شظايا CasRx وdCasRx مكبرة بعد ذلك باستخدام عدة تنقية هلام.
    2. هضم قاعدة ناقلات (أدجين بلازميد # 112686) مع تقييد الإنزيمات سواي وPacI24. في المنتجات الناتجة، استخدم مجموعة لتنقية الجزء الأكبر، والذي يسمى العمود الفقري للنواقل الأساسية.
    3. تجميع متجه Ubiq-CasRx مع العمود الفقري متجه أساسية و جزء CasRx باستخدام أسلوب التجميع Gibson; تجميع متجه Ubiq-dCasRx مع العمود الفقري متجه قاعدة وجزء dCasRx باستخدام طريقة التجميع Gibson25.
      ملاحظة: معرف Addgene المتجه Ubiq-CasRx (OA-1050E) هو #132416، و معرف Addgene لمتجه Ubiq-dCasRx (OA-1050R) هو #132417.
  2. توليد متجه التعبير عن gRNA
    1. تصميم كل جزء من GRNA على أساس المعايير التالية: التسلسل المستهدف هو 30 نيوكليوتيدات في الطول؛ الطول الأقصى لامتدادات poly-U في التسلسل المستهدف هو 4 أزواج أساسية؛ الهدف تسلسل GC المحتوى يجري في نطاق 30٪ - 70٪؛ تسلسل الهدف المتوقع عدم تشكيل هياكل دبوس الشعر الجيش الملكي النيبالي قوية؛ والتسلسل المستهدف الذي يحتوي على الحد الأدنى من بنية الحمض النووي الريبي الثانوية أو الثالثة المتوقعة5.
      ملاحظة: صممت هذه الدراسة كل gRNA كما 4 تسلسل جنبا إلى جنب كل 30 النيوكليوتيدات طويلة، متباعدة من قبل 36 النيوكليوتيدات يكرر مباشرة طويلة، ومع المنهي 7-الثيمين على كلا الطرفين5. بالنسبة للجين المستهدف الخارجي ، GFP ، تم اتباع نفس المعايير المذكورة أعلاه بإضافة جزء OpIE2-GFP5.
    2. تضخيم تسلسل المروج U6:3 باستخدام PCR مع التمهيديات 1043.C1 و 1043.C23 وPlasmid Addgene # 112688 (الجدول 1)26. جل تنقية شظايا U6:3 تضخيم باستخدام عدة تنقية هلام.
    3. Digest Addgene plasmid #112688 مع تقييد إنزيم AscI وXbaI24. في المنتجات الناتجة، استخدم مجموعة لتنقية الشظايا الأكبر، والتي تسمى العمود الفقري لمتجه ما قبل القاعدة.
    4. تجميع متجه قاعدة مع العمود الفقري ناقلات ما قبل القاعدة و U6:3 جزء باستخدام طريقة التجميع جيبسون25. ويسمى المتجه الأساسي فيما بعد OA-1043.
      ملاحظة: معرف أدجين OA-1043 بلازميد هو #164586.
    5. توليف جزء الحمض النووي الريبي للجين المستهدف باستخدام خدمة تخليق الجينات الخارجية.
    6. هضم قاعدة ناقلات الزراعة العضوية-1043 مع تقييد إنزيم PstI و NotI24. احتفظ بمنتج الهضم بأكمله، والذي يسمى OA-1043 المهضوم.
    7. تجميع gRNA التعبير المتجه مع OA-1043 هضمها والهدف جزء gRNA الجينات باستخدام طريقة التجميع جيبسون25.
      ملاحظة: تمت دراسة أربعة جينات مستهدفة: ثلاثة جينات داخلية (بيضاء، نوتش، صفراء)، واحدة كانت خارجية المنشأ (GFP). معرفات Addgene الخاصة بهم هي: #132420 (gRNAw) و #132421(gRNAN) و #132425 (gRNAY) و #133304 (gRNAGFP).
  3. توليد الذباب المعدل وراثيا
    1. حقن ناقلات التعبير في الأجنة تطير باستخدام خدمة حقن الأجنة ذبابة خارجية والأجنة من الذباب التي تحتوي على مواقع التكامل ØC31. إعادة الأجنة المحقونة عند 26 درجة مئوية.
      ملاحظة: تم استخدام خط attp40w (مع مواقع التكامل على الكروموسوم الثاني ) لتوليد خطوط CasRx وتم استخدام خط 8622 (مع مواقع التكامل على الكروموسوم الثالث ) لتوليد خطوط gRNA مختلفة.
    2. الحفاظ على الذباب إما كخطوط متجانسة أو كخطوط heterozygous متوازنة.
      ملاحظة: تم الاحتفاظ الذباب يوبيك-CasRx وUbiq-dCasRx كخطوط متوازنة heterozygous مع CyO كما موازن. بالإضافة إلى ذلك، تحتوي كل من ناقلات Ubiq-CasRx وUbiq-dCasRx على علامة dsRed. ونتيجة لذلك ، فإن الذباب يوبيك -CasRx وUbiq-dCasRx له الأنماط الظاهرية الثلاثة التالية: أجنحة dsRed إيجابية ومجعدة وعيون بيضاء. تم الاحتفاظ بالذباب المعبر عن الحمض النووي الريبي كخطوط متجانسة. بلومينغتون Drosophila مركز الأسهم (BDSC) أرقام الأسهم تطير هي : # 84118 (يوبيك كاسرإكس) ، # 84119 (يوبيك - dCasRx) ، # 84124 (gRNAW) ، # 84122 (gRNAN) ، # 84123 (gRNAY) ، # 84986 (gRNAGFP).
  4. علم الوراثة الذبابي (الشكل 1A)
    1. جمع 10 الذباب الإناث البالغين العذراء من خط gRNA homozygous وجمع 5 الذباب الذكور الكبار من خط متوازن heterozygous يوبيك-CasRx/CyO. وضع الإناث والذكور التي تم جمعها الذباب، والتي تسمى الذباب الأبوية، في قارورة تكملها مسحوق الخميرة الجافة (الشكل 1A).
    2. كرر الخطوة السابقة 3 مرات لإنشاء 3 نسخ متماثلة. لمجموعة التحكم، استخدم خط Ubiq-dCasRx/CyO مع الاحتفاظ بكل شيء آخر كما هو.
      ملاحظة: لقارورة زجاجية منتظمة من الطعام، 0.1 غرام من مسحوق الخميرة الجافة كافية. يتم استخدام وصفة الطعام ذبابة BDSC.
    3. إعادة قوارير تحتوي على الذباب الأبوي عند 26 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ثم إزالة جميع الذباب الأبوية من كل قارورة. ثم احتفظ بالقنينات عند 26 درجة مئوية لمدة 20 يوما على الأقل.
    4. مراقبة قوارير كل يوم لمعرفة ما إذا كان أي ذرية الكبار جديدة ظهرت من الخوخ من جيل F1. إذا كان الأمر كذلك، تخدير لهم مع ثاني أكسيد الكربون عن طريق إدخال أنبوب متصل بخزان ثاني أكسيد الكربون داخل قوارير الذبابة، ثم تشغيل التبديل تدفق لمدة 10 ثانية.
    5. بمجرد أن يصبح الذباب غير متحرك ، قم بإفراغه من القارورة على لوحة ذبابة ، والتي ترتبط أيضا بخزان ثاني أكسيد الكربون ويتدفق ثاني أكسيد الكربون باستمرار من خلال منصة الطيران.
    6. تسجيل النمط الظاهري للذباب المخدر وصورتهم باستخدام كاميرا ملونة متصلة بمنظار مجسم فلوري. عد أعداد الذرى ذات الأنماط الظاهرية المختلفة. استخدام برامج معالجة الصور لمعالجة الصور وتجميعها (الشكل 2A - 2D).
      ملاحظة: استنادا إلى علم الوراثة المندلي، من المتوقع وجود نوعين من الذباب بين الذرى لكل صليب (الشكل 1A).
  5. RNA-Seq (الشكل 2 هاء – 2G)
    1. جمع نماذج
      ملاحظة: اختر أسلوب مجموعة نماذج مناسب من الأمثلة 3 أدناه; مطلوب 3 نسخ متماثلة لكل نوع عينة مميزة.
      1. جمع عينة رأس الذبابة للبالغين
        1. جمع 10 الذباب الإناث البالغات العذراء من خط gRNA homozygous. جمع 5 الذباب الذكور البالغين من خط متوازن heterozygous يوبيك-CasRx/CyO. وضع الإناث والذكور التي تم جمعها الذباب، والتي هي الذباب الوالدين، في قارورة تكملها مسحوق الخميرة الجافة.
        2. كرر الخطوة السابقة 3 مرات للنسخ المتماثلة 3. لمجموعة التحكم، استخدم خط Ubiq-dCasRx/CyO مع الاحتفاظ بكل شيء آخر كما هو.
        3. إعادة قوارير تحتوي على الذباب الأبوي عند 26 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ثم إزالة جميع الذباب الأبوية من كل قارورة. ثم الاحتفاظ قوارير في 26 درجة مئوية حتى ذريات الخروج من الخوخ.
        4. جمع 10 1 يوم الذباب الكبار القديمة مع النمط الظاهري الصحيح. تخدير الذباب بثاني أكسيد الكربون، ثم قطع رأس الذبابة ووضع الرؤوس في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل على الجليد الجاف. تخزين أنبوب الطرد المركزي في -80 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة 3 مرات ل 3 نسخ متماثلة.
      2. 17 - 20 ساعة جمع عينة الجنين
        1. جمع 8-10 الذباب الإناث البالغات العذراء من خط gRNA homozygous. جمع 4-5 الذباب الذكور البالغين من خط يتيروزيغوس يوبيك-CasRx/CyO متوازنة. وضع الإناث والذكور التي تم جمعها الذباب، والتي هي الذباب الوالدين، في قارورة تكملها مسحوق الخميرة الجافة.
        2. كرر الخطوة السابقة 3 مرات للنسخ المتماثلة 3. لمجموعة التحكم، استخدم خط Ubiq-dCasRx/CyO مع الاحتفاظ بكل شيء آخر كما هو.
        3. إعادة قوارير تحتوي على الذباب الأبوي عند 26 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
        4. إعداد غرفة واحدة لجمع الأجنة عصير العنب لكل تكرار بعد هذه الوصفة: 376 مل من الماء، 126 مل من عصير العنب، 15 غرام من أجار، و 6 غرام من السكروز. وضع وسائل الإعلام في كوب 1 L والميكروويف على ارتفاع لمدة 5-6 دقائق مع إبقاء العين عن كثب على وسائل الإعلام في الكأس للتحقق مما إذا كان يظهر فقاعات / رغوة. إذا كان الأمر كذلك، ووقف الميكروويف والسماح للفقاعة / رغوة لتسوية. استمر في التجهم بهذه الطريقة حتى تصبح الفقاعة واضحة. لا تدور حتى تكون جميع الفقاعات واضحة. وأخيرا، إضافة 10 مل من الكحول 100٪ و 5 مل من حمض الخليك. مزيج جيدا، ثم pipet وسائل الإعلام في أطباق بيتري 35 ملم مع ماصة المصلية 25 مل. عندما تتماسك الوسائط في طبق بيتري ، فهي جاهزة للاستخدام.
        5. في نهاية الحضانة التي استمرت 48 ساعة، قم بنقل ذباب الوالدين إلى غرف جمع الأجنة بعصير العنب واحتضنها عند 26 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. ثم إزالة الذباب الكبار مع الحفاظ على الأجنة وضعت حديثا على لوحات عصير العنب لمدة 17 ساعة أخرى في 26 درجة مئوية.
        6. بعد الحضانة، وجمع 50-100 الأجنة من لوحات عصير العنب، وتنظيف سطح الجنين عن طريق غمرها في الماء deionized، ثم نقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل على الجليد. تخزينها في -80 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة 3 مرات ل 3 نسخ متماثلة.
      3. أول جمع عينة يرقات النجوم
        1. جمع 8-10 الذباب الإناث البالغات العذراء من خط gRNA homozygous. جمع 4-5 الذباب الذكور البالغين من خط يتيروزيغوس يوبيك-CasRx/CyO متوازنة. وضع الإناث والذكور التي تم جمعها الذباب، والتي هي الذباب الوالدين، في قارورة تكملها مسحوق الخميرة الجافة. كرر هذه الخطوة 3 مرات ل 3 نسخ متماثلة. لمجموعة التحكم، استخدم خط Ubiq-dCasRx/CyO مع الاحتفاظ بكل شيء آخر كما هو.
        2. إعادة قوارير تحتوي على الذباب الأبوي عند 26 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ثم نقل الذباب الكبار إلى قارورة طعام عادية جديدة أخرى لاحتضان بين عشية وضحاها (16 ساعة) في 26 درجة مئوية. ثم، إزالة الذباب الكبار.
        3. احتفظ القارورة المحتوية على الجنين عند 26 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، ثم سجل يرقات النجمة المتحولة تحت المجهر باستخدام علامات متميزة قائمة. جمع 15-30 يرقة مع الأنماط الظاهرية الصحيحة ووضعها في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة 3 مرات ل 3 نسخ متماثلة.
    2. التسلسل
      1. استخراج الحمض النووي الريبي: استخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا واتبع تعليمات عدة لمعالجة جميع العينات. ثم، احتضان عينات الحمض النووي الريبي المستخرجة مع deoxyribonuclease المتاحة تجاريا واتبع تعليماتها لإزالة أي الحمض النووي الملوثة من العينات.
      2. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية المتاحة تجاريا. قياس سلامة الحمض النووي الريبي في العينات باستخدام إعداد فحص سلامة الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا.
      3. بناء المكتبات RNA-seq باستخدام مجموعة إعداد مكتبة الجيش الملكي النيبالي المتاحة تجاريا.
      4. استخدم خدمة التسلسل الخارجي لتسلسل المكتبة مع الإعدادات التالية: وضع القراءة المفرد؛ وضع القراءة المفرد؛ وضع القراءة الأحادية قراءة طول: 50nt، عمق: 20 مليون يقرأ لكل مكتبة. إجراء مكالمات أساسية مع RTA 1.18.64 ثم تحويل البيانات إلى FASTQ باستخدام bcl2fastq 1.8.4.
        ملاحظة: يمكن العثور على بيانات التسلسل الأولي في المركز الوطني لتسلسل المعلومات الحيوية قراءة الأرشيف (معرف التقديم: SUB6818910 [المشروع الحيوي: PRJNA600654]).
    3. المعلوماتية الحيوية
      1. تقرأ الخريطة من بيانات التسلسل إلى الإصدار 6 Drosophila melanogaster الجينوم من مشروع الجينوم بيركلي Drosophila (رقم الانضمام GenBank: GCA_000001215.4) وتسلسل CasRx وGFP الخارجية باستخدام إعداد المعلمة الافتراضي من STAR aligner28 مع إضافة خيار مرشح "outFilterType BySJout" و "-sjdbGTFfile Drosophila_melanogaster. BDGP6.22.97.gtf" ملف تنسيق نقل الجينات من ENSEMBL.
      2. تحديد عدد النسخ الخام لكل نص مشروح مع ميزة Counts35 باستخدام خيارات "-t exon-g gene_id-M-O -fraction". ثم، تطبيع التهم النسخ الخام باستخدام مجموع التهم نسخة باستخدام "addTpmFpkmToFeatureCounts.pl" بيرل النصي.
      3. استخدم أقصى طريقة الخلفي مع مقدر الانكماش الأصلي في خط أنابيب DESeq2 لتقدير تغيير أضعاف لوغاريتمي لكل جين (LFC).

2. في كل مكان في الجسم الحي الخارجية الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات

  1. توليد موجه التعبير الخارجي الهدف في كل مكان
    1. PCR تضخيم جزء المروج يوبيك باستخدام التمهيديات 1052B. C1 و 1052B. C2 وبلازميد أدجين #112686 26. ثم، PCR تضخيم جزء T2A-eGFP تضخيمها من أدجين بلازميد #112686 مع التمهيديات 908A.1 و 908A.2 (الجدول 1)26. ثم، PCR تضخيم جزء المروج يوبيك والتسلسل عكس باستخدام أدجين بلازميد #112686 مع التمهيديات 908A.3 و 908A.4 (الجدول 1)26. هلام تنقية جزء المروج يوبيك، وجزء T2A-eGFP، وعكس جزء المروج يوبيك باستخدام عدة تنقية هلام.
    2. اطلب تسلسل ترميز مخصص لنسيفيراز اليراعات وجزء مخصص يحتوي على جزء P10 3'UTR ، معكوس رينيلا لوسيفيراز متبوعا بجزأة SV40 3'UTR.
    3. Digest Addgene plasmid #112688 مع تقييد إنزيم AscI وXbaI24. في المنتجات الناتجة، هلام تنقية شظايا أكبر باستخدام عدة تنقية هلام، والذي يسمى العمود الفقري ناقلات قاعدة.
    4. استخدم طريقة تجميع Gibson لتجميع متجه أساسي مع العمود الفقري للمتجه الأساسي والشظايا التالية: جزء مروج Ubiq ، وجزء T2A-eGFP ، وجزء مروج Ubiq المعكوس ، وتسلسل ترميز اليراعة لوسيفيراز ، وs luciferase رينيلا المعكوس متبوعا بجزأ SV40 3'UTR25.
      ملاحظة: معرف Addgene متجه التعبير المزدوج لوسيفيراز الناتج (OA-1052B) هو #132426.
  2. توليد متجه التعبير عن gRNA
    1. PCR تضخيم تسلسل المروج U6:3 باستخدام التمهيديات 1043.C1 و 1043.C23 وplasmid Addgene # 112688 (الجدول 1)26. جل تنقية شظايا U6:3 تضخيم باستخدام عدة تنقية هلام.
    2. Digest Addgene plasmid #112688 مع تقييد إنزيم AscI وXbaI24. في المنتجات الناتجة، هلام تنقية شظايا أكبر، والذي يسمى العمود الفقري ناقلات ما قبل القاعدة، وذلك باستخدام عدة تنقية هلام.
    3. تجميع متجه قاعدة مع العمود الفقري ناقلات ما قبل القاعدة و U6:3 جزء باستخدام طريقة التجميع جيبسون25. ويسمى المتجه الأساسي فيما بعد OA-1043.
    4. توليف جزء الحمض النووي الريبي للجين المستهدف باستخدام خدمة تخليق الجينات الخارجية.
    5. هضم قاعدة ناقلات الزراعة العضوية-1043 مع تقييد إنزيم PstI و NotI24. الحفاظ على كامل المنتج الهضم، الذي يسمى الزراعة العضوية وا 1043 هضم.
    6. تجميع gRNA التعبير المتجه مع OA-1043 هضمها والهدف جزء gRNA الجينات باستخدام طريقة التجميع جيبسون25.
      ملاحظة: معرف Addgene من plasmid الناتجة (OA-1052K) هو #132422.
  3. توليد الذباب المعدل وراثيا
    1. حقن OA-1052B ناقلات في الأجنة تطير باستخدام الأجنة من الذباب التي تحتوي على موقع التكامل ØC31 على الكروموسوم 3، BDSC يطير المخزون رقم 9744، عن طريق خدمة حقن الأجنة ذبابة خارجية. وبالمثل، حقن ناقلات OA-1052K في الأجنة تطير باستخدام الأجنة من الذباب التي تحتوي على موقع التكامل ØC31 على الكروموسوم الثالث، BDSC يطير الأسهم رقم 8622. إعادة الأجنة المحقونة عند 26 درجة مئوية.
    2. الحفاظ على الذباب المزدوج لوسيفراز التعبير عن وGRNA الذباب وخطوط homozygous; الحفاظ على خطوط يوبيك-CasRx كخطوط heterozygous مزدوجة التوازن عن طريق تجاوز خط heterozygous Ubiq-CasRx المتوازن الوحيد المتولد في القسم 1 إلى خطوط متوازنة تحمل كروموسوم TM6 balancer مع علامة قصبة (Stb) والاحتفاظ فقط بالذريات المتوازنة المزدوجة مع أجنحة بيضاء العينين مجعدة ، وأنماط افتراضية dsRed-fluorescent في وقت واحد.
      ملاحظة: أرقام الأسهم ذبابة BDSC هي: #84127 (يوبيك-فلوك-Rluc)، #84125 (gRNAFluc).
  4. علم الوراثة الذبابي (الشكل 1B والشكل 3A)
    1. جمع 8-10 الذباب الإناث البالغات العذراء من خط التعبير عن لوسيفراز المزدوج. جمع 4-5 الذباب الذكور البالغين من heterozygous متوازن يوبيك-CasRx/CyO; +/TM6، خط Stb التي تظهر أبيض العينين، أجنحة مجعد، وdsRed مضان في وقت واحد. وضع الإناث والذكور التي تم جمعها الذباب، والتي هي الذباب الوالدين، في قارورة تكملها مسحوق الخميرة الجافة (تسمى فيما بعد الخطوة 1 الصليب).
    2. كرر الخطوة السابقة 3 مرات للنسخ المتماثلة 3. لمجموعة التحكم، استخدم Ubiq-dCasRx/CyO; +/TM6، خط Stb مع الحفاظ على كل شيء آخر على حاله.
    3. إعادة قارورة الصليب الخطوة 1 التي تحتوي على الذباب الأبوية في 26 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ثم إزالة جميع الذباب الأبوية من كل قارورة. ثم الاحتفاظ قوارير في 26 درجة مئوية لمدة 14 يوما على الأقل. خلال هذا الوقت، وجمع 8-10 العذارى الإناث من اليراعة اليراع المثلية لوسيفيراز استهداف خط GRNA. كرر هذه الخطوة 3 مرات ل 3 نسخ متماثلة.
    4. مراقبة قوارير الصليب الخطوة 1 كل يوم لمعرفة ما إذا كان أي ذبابة الكبار جديدة يخرج من الخوخ. إذا كان الأمر كذلك ، تخدير لهم مع ثاني أكسيد الكربون ، وجمع 5 الذباب الذكور التعبير عن كل من يوبيك كاسRx (أو يوبيك - dCasRx) ومراسل لوسيفيراز المزدوج من ذريات ووضعها في قارورة جديدة جنبا إلى جنب مع 10 إناث عذراء من خط اليراعة لوسيفراز التي تستهدف gRNA (تسمى فيما بعد الخطوة 2 الصليب). كرر هذه الخطوة 3 مرات ل 3 نسخ متماثلة.
    5. جمع آخر 5 ذكر يبلغ من العمر يوما واحدا التعبير عن كل من يوبيك-CasRx (أو يوبيك-dCasRx) ومراسل لوسيفيراز المزدوج من قنينات الصليب الخطوة 1 واحتضانها لمدة 2 - 4 أيام في 26 درجة مئوية. ثم، نقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة 3 مرات لثلاث نسخ متماثلة.
    6. إعادة قارورة الصليب الخطوة 2 التي تحتوي على الذباب الوالدين في 26 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ثم إزالة جميع الذباب الأبوية من كل قارورة. ثم احتفظ بالقنينات عند 26 درجة مئوية لمدة 20 يوما على الأقل.
    7. مراقبة قوارير الصليب الخطوة 2 كل يوم لمعرفة ما إذا كان أي ذريات الكبار جديدة ظهرت من الخوخ. إذا كان الأمر كذلك ، تخدير لهم مع ثاني أكسيد الكربون ، ويسجل الأنماط الظاهرية للذباب تخدير وصورة لهم باستخدام كاميرا ملونة مجهزة مجسمة الفلورسنت. عد أعداد الذرى ذات الأنماط الظاهرية المختلفة. استخدام برامج معالجة الصور لمعالجة الصور وتجميعها (الشكل 3B - 3C).
      ملاحظة: تشير الوراثة المندلية إلى أنه إذا كان الذباب قابلا للتطبيق، فمن المتوقع وجود 4 أنواع من الذباب بين الذرى من الخطوة 2 كروس، حيث يمثل كل منها 25٪ من السكان (الشكل 1B والشكل 3A).
  5. فحص لوسيفراز (الشكل 3D)
    1. توليد الذباب transheterozygous الثلاثي وكذلك الذباب التحكم عن طريق تكرار الخطوات 2.4.1-2.4.5. جمع الذباب الذكور عند الولادة والعمر لهم حتى 3 أيام من العمر.
    2. نقل الذباب البالغ من العمر 3 أيام إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل وتحلل لهم باستخدام الآفات وحاجز تحلل لوسيفيراز من عدة المقايسة لوسيفيراز المتاحة تجاريا.
    3. استخدام 5 ميكرولتر من الأنسجة المفرحة من كل عينة لقياس كل من نشاط اليراعة ورينيلا لوسيفيراز باستخدام مجموعة أجهزة قياس لوسيفيراز المتاحة تجاريا ومقياس الإنارة.

3. الأنسجة محددة في الجسم الحي RNA استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات

  1. توليد UASt-CasRx وUASt-dCasRx التعبير المتجه
    1. PCR تضخيم تسلسل المروج UASt باستخدام pJFRC81 البلازميد والتمهيدي 1041.C9 و 1041.C11; ثم، PCR تضخيم CasRx جزء باستخدام OA-1050E plasmid (معرف أدجين # 132416) والتمهيدي 1050L. C1 و 1050E. C4; ومن ثم PCR تضخيم شظايا dCasRx باستخدام OA-OA-1050R (معرف أدجين # 132417) والتمهيدي 1050L. C1 و 1050E. جيم-4 (الجدول 1)26- الجداول 26 جل تنقية تسلسل المروج UASt تضخيمها، CasRx، وشظايا dCasRx باستخدام عدة تنقية هلام.
    2. خلاصة قاعدة ناقلات (أدجين بلازميد # 112686) مع تقييد الإنزيمات NotI وPacI24. في المنتجات الناتجة، هلام تنقية الجزء الأكبر، الذي يسمى العمود الفقري ناقلات قاعدة، وذلك باستخدام عدة تنقية هلام.
    3. تجميع متجه UASt-CasRx مع العمود الفقري متجه قاعدة تسلسل المروج UASt و جزء CasRx باستخدام التجميع Gibson; ثم تجميع متجه UASt-dCasRx مع backbone متجه أساسي تسلسل المروج UASt و جزء dCasRx باستخدام أسلوب التجميع Gibson25.
      ملاحظة: المتجه UASt-CasRx هو أدجين بلازميد #132418، وUASt-dCasRx المتجه هو أدجين بلازميد #132419
  2. توليد الذباب المعدل وراثيا
    1. حقن ناقل UASt-CasRx في الأجنة الطائرة باستخدام خدمة حقن الأجنة الذباب والأجنة من الذباب ØC31 موقع التكامل 8621 على الكروموسومات 2; ثم حقن UASt-dCasRx ناقلات في الأجنة تطير باستخدام خدمة حقن الأجنة تطير والأجنة من الذباب ØC31 موقع التكامل 8621 على الكروموسومات 2. إعادة الأجنة المحقونة عند 26 درجة مئوية.
    2. الحفاظ على الذباب وخطوط heterozygous متوازنة مزدوجة مع علامات CyO وSB. ملاحظة: معرفات خطوط الطيران في BDSC هي 84121 (UASt-CasRx) و 84120 (UASt-dCasRx).
  3. علم الوراثة الذبابي (الشكل 1C)
    1. ترتيب خطوط GAL4 المطلوبة من BDSC؛ الحصول على خطوط gRNA ذات الصلة من الخطوة 3.2.2 (أو من BDSC).
      ملاحظة: تم استخدام الذباب GAL4 2 التالية من BDSC: GAL4-GMR (معرف BDSC: #29967), GAL4-y (معرف BDSC: #44373). تم استخدام نفس خطوط 3 gRNA التي تم إنشاؤها في القسم الأول: gRNAw (معرف BDSC: #84124) ، gRNAN (معرف BDSC # 84122) ، gRNAy (معرف BDSC: # 84123).
    2. جمع 5-10 الذباب الإناث البالغات العذراء من خط الجيش الملكي النيبالي. جمع الذباب الذكور البالغين 2-4 من heterozygous UASt-CasRx/CyO متوازنة مزدوجة; +/TM6، خط SB التي تظهر بيضاء العينين، أجنحة مجعد، وdsRed مضان في وقت واحد. وضع الذباب الإناث والذكور التي تم جمعها، والتي هي الذباب الوالدين، في قارورة الغذاء العادية (تسمى فيما بعد الخطوة 1 الصليب). كرر هذه الخطوة 3 مرات ل 3 نسخ متماثلة. لمجموعة التحكم، استخدم UASt-dCasRx/CyO; +/TM6، خط SB مع الحفاظ على كل شيء آخر على حاله.
    3. إعادة قارورة الصليب الخطوة 1 التي تحتوي على الذباب الأبوية في 26 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ثم إزالة جميع الذباب الأبوية من كل قارورة. ثم الاحتفاظ قوارير في 26 درجة مئوية لمدة 14 يوما على الأقل. خلال هذا الوقت، وجمع 5-10 العذارى الإناث من خط GAL4. كرر هذه الخطوة 3 مرات ل 3 نسخ متماثلة.
    4. مراقبة قوارير الصليب الخطوة 1 كل يوم لمعرفة ما إذا كان أي ذبابة الكبار جديدة يخرج من الخوخ. إذا كان الأمر كذلك ، تخدير لهم مع ثاني أكسيد الكربون ، وجمع الذباب الذكور 2-4 التعبير عن كل من UASt - CasRx (أو UASt - dCasRx) وناقل الحمض النووي الريبي من الذرى التي لديها في وقت واحد dsRed الفلورسنت والأنماط الظاهرية قصبة. وضع الذكور التي تم جمعها من الخطوة 1 الصليب في قارورة جديدة جنبا إلى جنب مع 5-10 جمعت أنثى عذراء من خط GAL4 (تسمى فيما بعد الخطوة 2 الصليب). كرر هذه الخطوة 3 مرات ل 3 نسخ متماثلة.
    5. إعادة قارورة الصليب الخطوة 2 التي تحتوي على الذباب الوالدين في 26 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ثم إزالة جميع الذباب الأبوية من كل قارورة. ثم احتفظ بالقنينات عند 26 درجة مئوية لمدة 20 يوما على الأقل.
    6. مراقبة قوارير الصليب الخطوة 2 كل يوم لمعرفة ما إذا كان أي ذبابة الكبار جديدة يخرج من الخوخ. إذا كان الأمر كذلك ، تخدير لهم مع ثاني أكسيد الكربون ، ويسجل الأنماط الظاهرية للذباب تخدير وصورة لهم باستخدام كاميرا ملونة مجهزة مجسمة الفلورسنت. عد أعداد الذرى ذات الأنماط الظاهرية المختلفة. استخدام برامج معالجة الصور لمعالجة الصور وتجميعها (الشكل 4).
      ملاحظة: تشير الوراثة المندلية إلى أنه إذا كان الذباب قابلا للحياة، فمن المتوقع وجود 4 أنواع من الذباب بين الذرى من الخطوة 2 كروس، حيث يمثل كل منها 25٪ من السكان (الشكل 1C).

Representative Results

في كل مكان في الجسم الحي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx مكونين
وF1 transheterozygous الذباب التعبير عن كل من يوبيك كاسرإكس وgRNA (استهداف كل من الجينات الذاتية والخارجية) وأظهرت البنى الظاهري ملحوظ بالمقارنة مع الذباب السيطرة التعبير عن يوبيك-dCasRx وGRNA يبني (الشكل 2 والشكل 4). وعلى وجه التحديد، فإن الذباب ترانسهيتروزيغوس كاسرإكس لديها مستويات أقل بكثير من معدل البقاء على قيد الحياة مقارنة بالذباب dCasRx transheterozgyous، مما يشير إلى سمية نظام يوبيك-كاسرإكس (الشكل 2A والشكل 4A). تجدر الإشارة إلى أن كلا من الذباب Transheterozygous CasRx و dCasRx لديهما أقل من 50٪ من معدل الميراث ، وهي النسبة المتوقعة استنادا إلى علم الوراثة المندلي. ومن بين الجينات الثلاثة المستهدفة، يوبيك - كاسرإكس/+؛ U6-gRNAN / + الذباب وUbiq-CasRx /+; الذباب U6-gRNAy/+ غير قابل للحياة (0٪ ميراث) ولم ينمو بعد مرحلة يرقات النجوم الثانية (الشكل 2A-2B). يوبيك-كاسرإكس/+؛ U6-gRNAw /+ الذباب، والميراث الذي كان 12.9٪، وأظهرت متميزة تماما البنتانت النمط الظاهري الأبيض العينين (الشكل 2B). بالإضافة إلى الصفات الملحوظة المرتبطة ب CasRx ، تمكنا من تأكيد انخفاض كبير في النصوص الجينية المستهدفة ل 3 جينات مستهدفة: الشق والأصفر وGFP (الشكل 2E-2G). لوحظ انخفاض في نصوص الجينات البيضاء في الذباب يوبيك-كاسكRx/+، U6-gRNAw/+ ، مقارنة بالتحكم يوبيك-dCasRx/+، U6-gRNAW/+ الذباب، على الرغم من أن الانخفاض لم يكن مهما إحصائيا (الشكل 2E - 2F). تم العثور على أدلة على النشاط خارج الهدف الناجم عن CasRx عند مقارنة النصوص المعرب عنها بشكل تفاضلي بين عينات من الذباب المعبر عن CasRx وعينات من الذباب المعبر عن dCasRx (الشكل 2E ، 2G). وفيما يلي عدد النصوص غير المستهدفة التي يعبر عنها بشكل متفاوت إلى حد كبير: أبيض، 253 (1.4 في المائة من مجموع المحاضر)؛ و 253 نسخة (1.4 في المائة من مجموع المحاضر)؛ و 253 (1.4 في المائة من مجموع المحاضر)؛ و 253 (1.4 في المائة من مجموع المحاضر)؛ و 253 (1.4 في المائة من مجموع المحاضر)؛ نوتش، 300 (1.7 في المائة)؛ الأصفر, 41 (0.23٪); GFP، 5,880 (33٪) ومن أصل مجموع 779 17 نسخة مختلفة، تم التعبير عن 6 نصوص غير مستهدفة بشكل متفاوت إلى حد كبير في جميع مجموعات العينات البالغ عددها 4 مجموعات. كان أحد النصوص ال 6 التي تم تحديدها Gadd45 ، وهو جين متورط في موت الخلايا المبرمج والاعتقال الخلوي في الذباب ، مما يزيد من احتمال أن يؤدي العمل الأنزيمي ل CasRx إما إلى حدوث موت الخلايا المبرمج الخلوي مباشرة أو يؤدي بشكل غير مباشر إلى سوء التعبير عن الجينات الأخرى ، مما يؤدي بدوره إلى موت الخلايا المبرمج. وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن ذباب يوبيك-كاسرإكس وأوبيك-dCasRx لم يتم تأسيسهما كمخزونات متجانسة، ويفترض أن ذلك يرجع إلى السمية التي يمنحها التعبير العالي في كل مكان. ونتيجة لذلك، تم استخدام ذباب هيتروزيغوس يوبيك-كاسرإكس/سايو وأوبيك-dCasRx/CyO للعبور بخطوط طيران هوزيغوس رنا. وخلاصة القول، فإن نظام يوبيك-كاسرإكس المكون من مكونين قادر على تحقيق استهداف الحمض النووي الريبي في كل مكان لكل من الأهداف الذاتية والخارجية مما يؤدي إلى أنماط ظاهرة يمكن ملاحظتها وتقليل النسخ. وأظهرت هذه النتائج أيضا أن استهداف الحمض النووي الريبي بوساطة CasRx قد يدخل السمية في الجسم الحي.

في كل مكان في الجسم الحي الخارجي RNA استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات
وأظهرت نتائج الصليب ذو الخطوتين أنه على الرغم من الطبيعة الخارجية للجين المستهدف (أي فلوك)، فإنها تعبر عن جميع المتحولات الثلاثة في المركبات المتحولة ثلاثية التوائم F2 (Ubiq-CasRx/+؛ أدى gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) إلى فتك بنسبة 100٪ مقارنة بصلالب التحكم التي تنطوي على يوبيك-dCasRx، حيث لم يلاحظ أي فتك في الترانزفيروزيغوتات الثلاثية F2 (يوبيك-dCasRx/+؛ gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) (الشكل 3B-C ). وبشكل أكثر تحديدا، لم يسفر سوى الجمع بين جميع المتحولين جنسيا الثلاثة (يوبيك - كاسرإكس/+؛ gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) عن فتك بنسبة 100 في المائة (الشكل 3B وD)، في حين أن (يوبيك - كاسك آر إكس/+؛ gRNAFluc/TM6) و (يوبيك - كاسرإكس/+؛ كانت الأنماط الجينية Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6 قابلة للحياة وتفتقر إلى الأنماط الظاهرية مع معدلات الميراث الخاصة بها التي تتطابق مع معدلات انتقال المندلي المتوقعة، مما يشير إلى أن توافر التسلسل المستهدف (أي لوسيفيراز اليراع) بالاشتراك مع يوبيك-كاسرإكس/+ وgRNAFluc هو ما أدى إلى الأنماط الظاهرية الفتكية الملاحظة، التي يفترض أنها نابعة من النشاط الجانبي لأنزيمات Cas132,8 . وبالإضافة إلى ذلك، لا توجد أنماط الظاهرية المميزة أو تأثير كبير على الميراث في F1 transheterozygotes (يوبيك-CasRx/+; gRNAFluc/+ أو يوبيك-CasRx/+; ولوحظ أن يوبيك - فلوك - يوبيك - Rluc /+) مقارنة مع عناصر التحكم يوبيك - dCasRx (يوبيك - dCasRx / + ؛ gRNAFluc / + أو يوبيك - dCasRx / +؛ يوبيك فلوك-يوبيك-Rluc/+) (الشكل 3B)، مما يشير إلى أن إنزيم نشط تحفيزي ضروري للحصول على الأنماط الظاهرية الفتكية الملاحظة. وعلاوة على ذلك، لم تظهر مستويات التعبير فلوك وRluc في الذباب من جميع الأنماط الجينية قابلة للحياة انخفاضا كبيرا في التعبير فلوك في Ubiq-dCasRx transheterozygotes الثلاثي (يوبيك-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) مقارنة بضوابط مراسل لوسيفيراز المزدوجة. وهذا يشير إلى أن مستويات التعبير عن البروتين فلوك لم تخفض عن طريق استهداف dCasRx (الشكل 3D). معا، والنمط الظاهري القاتلة المشتركة في تجربتي استهداف الحمض النووي الريبي المختلفة التي تتوسط فيها CasRx في كل مكان تشير إلى أنه عند استخدامها على الأنسجة في كل مكان، يمكن أن يكون استهداف الحمض النووي الريبي بوساطة CasRx ساما للكائن الحي.

الأنسجة الخاصة في الجسم الحي الجيش الملكي النيبالي الاستهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات
دفعنا المستوى العالي من السمية الذي لوحظ في تجارب استهداف الحمض النووي الريبي في كل مكان إلى استكشاف استهداف الحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة باستخدام تصميم نظام CasRx مكون من ثلاثة مكونات مفصل في قسم الأساليب. في الواقع ، تم تقليل مستوى السمية الملاحظ عندما تم خفض التعبير الشامل CasRx باستخدام مروج UASt مقارنة بمروج Ubiq ، ويتجلى ذلك في ثلاثة جوانب: 1) تم الحفاظ على خطوط UASt-CasRx و UASt-dCasRx كخطوط متجانسة ، على الرغم من أنه استنادا إلى مخطط التقاطع ثنائي الخطوة المزدوج UASt-CasRx وخطوط UASt-dCasRx تم استخدامها لأداء الصلبان ، 2) جميع F2 جيل dCasRx ثلاثي transheterozygous معدلات الميراث مطابقة المتوقع 25٪ معدل الميراث المندلي، و 3) تم تخفيض الجيل F2 CasRx الثلاثي transheterozygous الفتك النمط الظاهري معتدل. في تجربة الاستهداف الأبيض ، من بين معدلات الميراث المندلية البالغة 25٪ المتوقعة في الترانزتروزيغات الثلاثية F2 ، لوحظ فقط 0.57٪ ذباب بالغ قابل للحياة (UASt-CasRx / +؛ gRNAw / GMR-Gal4) ، وكلها أظهرت تصبغا شديدا محددا للعين وأنماطا وصفية مورفولوجيا (الشكل 4A و 4B). بالنسبة للصليب الأبيض الاستهدافي، كان معدل الميراث الثلاثي عبر عن ترانسهيروسيجوس F2 المعبر عن CasRx أقل بكثير من معدل مجموعة التحكم الثلاثية عبر ال transheterozygous (27.6٪) (الشكل 4A). في تجربة استهداف Notch ، كانت CasRx -التعبير عن tranheterozygous الثلاثية التي تحمل جميع المتحولين جنسيا الثلاثة قاتلة بنسبة 100٪، في حين كان معدل الميراث التحكم dCasRx 29.3٪ (الشكل 4A). في تجربة الاستهداف الصفراء ، أظهر F2 ثلاثي transheterozygous CasRx التعبير ، gRNAy ، و y-GAL4 الحد من صبغة الكيتين الهامشية ورقع صغيرة من بشرة صفراء على الصدر والبطن مع معدل الميراث من 2.67 ٪، أقل بكثير من ذلك من مجموعة التحكم dCasRx (25.2 ٪) (Figure4A ). لم تقدم جميع الذباب ثلاثية التحكم dCasRx transheterozygous الأنماط الظاهرية واضحة كما الذباب التعبير عن CasRx، مما يشير إلى أن النشاط الحفاز من CasRx ساهمت في الأنماط الظاهرية لوحظ. وأشار انخفاض معدل الميراث في مجموعة CasRx transheterozygous الثلاثية إلى وجود مصدرين للسمية في استهداف CasRx RNA: أحدهما يرتبط بالتعبير العالي عن CasRx ، والذي تم تقليل سميته عن طريق تعبير CasRx التقييدي ، ويرتبط الآخر بنشاط الضمان. وأظهرت هذه النتائج مجتمعة أن نظام CasRx يمكن أن يحقق استهدافا خاصا بالأنسجة في الجسم الحي الحمض النووي الريبي من خلال الاستفادة من نظام Gal4/UASt الكلاسيكي وفي الوقت نفسه تقليل السمية. ومع ذلك، لا تزال السمية والأنماط الظاهرية للقاتل العرضي تلاحظ عند مستوى أدنى من الشدة مقارنة بالنهج المنتشرة في كل مكان، مما يشير إلى أن نشاط الانقسام الجانبي يرتبط بالسمية.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على استهداف الحمض النووي الريبي باستخدام نظام Cas13D. (أ) مخططات الصليب الوراثي من خطوة واحدة في كل مكان في استهداف الحمض النووي الريبي الحي باستخدام نظام CasRx مكونين. (ب) مخططات صليب وراثي من خطوتين في كل مكان في الجسم الحي الخارجي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات. (ج) مخططات صليب وراثي من خطوتين في الأنسجة المحددة في الجسم الحي الحمض النووي الريبي استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: في كل مكان في الجسم الحي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx مكونين (إعادة طبع5). (أ) مجموع النسب المئوية الميراث من الذباب transheterozygous وراثة يوبيك-CasRx (أو يوبيك-dCasRx) وgRNAs. التظليل الأزرق في مؤامرة مربع يشير إلى penetrance النمط الظاهري. (ب) الأنماط الظاهرية من الذباب ترانسهيتروزيغوس. تشير الأسهم إلى نخر الأنسجة في العين. ذبابة بالأبيض والأسود تحمل علامة "X" تمثل الفتك. (ج) النسب المئوية الإجمالية للميراث من الذباب عبر الزيغوس من الصلبان ثنائية الاتجاه بين الذباب يوبيك-كاسرإكس (أو يوبيك-dCasRx) وgRNAGFP-OpIE2-GFP. M، ميراث الأم من CasRx؛ P، الميراث الأبوي من CasRx. (د) يرقات F1 في الصليب الأبوي. (ه) الحد الأقصى لتقديرات النصوص الخلفية لتغيير الطية اللوغاريتمية. تم استخدام خط أنابيب DESeq2. (F) النصوص لكل مليون (TPM) المستهدفة مع CasRx أو dCasRx. (ز) أعرب كاسرإكس - depentent بشكل متفاوت عن نسبة نسخة من النصوص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: في كل مكان في الجسم الحي الخارجي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx ثلاثة مكونات. (أ) التخطيطات من الصليب الجيني من خطوتين. (ب) مجموع نسب الميراث لجميع الأنماط الجينية الناشئة في جيل F2 . وراثة جميع المتحولين جنسيا الثلاثة (يوبيك-CasRx، يوبيك-فلوك-يوبيك-Rluc، وgRNAFLuc) في ذرية F2 أدى إلى 100٪ فتك وكان أقل بكثير بالمقارنة مع Ubiq-dCasRx الثلاثي transheterozygotes مجموعة التحكم (ع = 0.001، تي اختبار). (ج) حمل يوبيك - كاسرإكس/gRNAFluc وحدها أو يوبيك - كاسرإكس ويبيك - فلوك - يوبيك - Rluc وحدها لم يؤد إلى فتك شديد ، ونسب الميراث بين يوبيك - كاسرإكس ويوبيك - dCasRx transheterozygotes لم تكن مختلفة بشكل كبير (ع = 0.41 وب = 0.51 ، على التوالي ، تي اختبار). (د) نسب لوسيفيراز تطبيع قراءات فلوك لقراءات Rluc. ذبابة ثلاثية عبر الزيغوس تعبر عن يوبيك-كاسرإكس، يوبيك-فلوك-يوبيك-Rluc، gRNAFLuc كانت قاتلة جنينية، والتي مثلتها ذبابة ب "X"، ونتيجة لذلك لم يتم قياس تعبير لوسيفيراز. فلوك / Rluc نسبة يوبيك - CasRx / + ، يوبيك فلوك - يوبيك - Rluc / TM6 ، Stb transheterozygotes كان أقل بكثير من غيرها من يوبيك فلوك يوبيك - Rluc التعبير عن المجموعات (ع = 1.2e - 06 أو أقل ، تي الاختبار). وكانت نتائج المجموعة gRNAFLuc فقط أقل بكثير من جميع المجموعات الأخرى (ع = 1.2e-06 أو أقل، تي اختبار). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: استهداف الأنسجة الخاصة في الجسم الحي الحمض النووي الريبي باستخدام نظام CasRx مكون من ثلاثة (إعادة طبع5). (أ) إجمالي نسبة الميراث من الذباب transheterozygous الثلاثي تحمل ثلاثة transgenes (UASt-CasRx أو UASt-dCasRx، gRNAs، وGal4-driver. (ب) الأنماط الظاهرية للذباب الثلاثي transheterozygous. يشير السهم الأبيض إلى انخفاض صبغة الكيتين في الصدر. ذبابة بالأبيض والأسود تحمل علامة "X" تمثل الفتك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بناء وصف التمهيدي تسلسل التمهيدي (5'to 3') قالب PCR
OA-1050E كاس آر إكس 1050E. C3 تاكتااتاتكاك
أتكتاتاتغاك
1 - لجنة التنسيق
أغاغكاغا
AGAA		 pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)
1050E. C4 كاتاتجاتغاتا
تتاهااكغات
كاتكتاغكتاكت
تاغكتاتغ
AACA
OA-1050R dCasRx 1050E. C3 تاكتااتاتكاك
أتكتاتاتغاك
1 - لجنة التنسيق
أغاغكاغا
AGAA		 pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)
1050E. C4 كاتاتجاتغاتا
تتاهااكغات
كاتكتاغكتاكت
تاغكتاتغ
غاكا
OA-1050L UASt المروج 1041.C9 جي جي جي جي تي تي سي
CGGTCACGGCGG
GCATGTCGACGC
GGCCGCAACCAA
كاكاتاتاج		 pJFRC81
1041.C11 CTGGCCTCCACC
TTTCTكتكتكت
تي جي جيكتكت كات
تااكاكات
مكافحة الجريمة
كاس آر إكس 1050L. C1 أاتاكااغاغا
غاكتاغاتا
غاغاتغغت
تااكاكاتغاغك
كاكاغاغاغا		 pCasRx
1050E. C4 كاتاتجتغت
تاتتاهاك
جاتكاتكتكاتا
جي سيتاجكتاج
CGTAاتCTGGA
ACA
OA-1050S UASt المروج 1041.C9 جي جي جي تي تي سي
غاغتكاكج
جي جي جي غاكات
لجنة التنسيق
هيئة ادارة الشؤون الاقتصادية
كاكتاغ		 pJFRC81
1041.C11 CTGGCCTCCA
CCTTTCTك
TTCTTGGCT
كاتجتتاك
CCAATTCCCTA
TTCAGA
dCasRx 1050L. C1 أاتاكاغاغ
أغاكتكتغاات
أغغااتغ
تاتاكاكاتغاغ
ركاكااغاغا		 pdCasRx
1050E. C4 كاتاتجتغت
تاتتاهاك
جاتكاتكتاج
كلتاغك
تاتكتغاكا
OA-1043 U6:3 المروج 1043.C1 غاغاتغغا
أتغغغاتاهات
تااتغكغك
جي جي سي سيغاكت
تي تي تي جي سي تي سي أكات		 أدجين بلازميد #164586
1043.C23 أكاكتاغاتغات
مكافحة الإرهاب
CGTTGCGGCCG
جعآغاغت
أاتاكاككتاكا
أاكتغكات
سيكاكاكتغكاغ
سي سيغاكتات
TGAAA
OA-1052B مروج يوبيك 1052B. C1 غاغا تغغاكا
أتاتاتغاغك
GGCTGCAGC
هيئة مكافحة التبغ		 أدجين بلازميد #112686
1052B. C2 تكتاتاتغت
TTGGCGTCTTCC
أكتاغاغتكتغ
كججتكااتا
غاغاتغ
T2A-يغف 908A1 أتاجاجكاغ
أجغكغا
غاتكغغغغ
أغغاغاغاغا
أجتكتكتاكا
م ع		 أدجين بلازميد #112686
908A2 تتغاتا
أجاتكت كاتكتاتا
جي جي غاتكغاتا
CTTGTACAGCTC
جي تي سي تي سي
عكس المروج يوبيك 908A3 ACCGTGACCTAC
أتكغتكغاكاتكاتا
جي تغغاتككتاغا
CGCGCAGATCGC
CGATG		 أدجين بلازميد #112686
908A4 غجاتاكاكت
TCGAAGTCATGC
GGCCGCTCTGCG
جي جي تي سياتاغاغ
ATGT

الجدول 1: قائمة البناء الجزيئي والمبرمجين المستخدمة في هذه الدراسة. تتضمن هذه القائمة كافة الإنشاءات (كلا من معرف و وصف) و التمهيديات المقترنة لكل بناء (كلا من معرف و تسلسل (5'to 3')) والقوالب المستخدمة.

Discussion

مع ثلاثة تصاميم تطبيق مختلفة من نظام CasRx ، أظهر هذا العمل في استهداف الحمض النووي الريبي القابل للبرنامج في الذباب. تلبي الاستراتيجيات المختلفة احتياجات المشروع المختلفة ، مثل استهداف الجينات الذاتية مقابل الخارجية واستهداف الحمض النووي الريبي في كل مكان مقابل استهداف الحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة. وشملت آثار استهداف الحمض النووي الريبي التغيرات الجينية المستهدفة المحددة phenotypic، والحد من نص الحمض النووي الريبي المستهدف، والأنماط الظاهرية القاتلة في بعض الأحيان المرتبطة بالتعبير العالي عن بروتين CasRx والنشاط الجانبي. وعموما، أظهرت هذه النتائج أن نظام CasRx قادر على استهداف خفض نسخة الحمض النووي الريبي على مستوى الكائن الحي بطريقة قابلة للبرمجة والكفاءة.

أحد العوامل الرئيسية في تخصيص بنجاح نظام CasRx هو تصميم gRNAs. على وجه التحديد ، يجب أن يتم الاحتاء إلى النصيحة التالية: التسلسل المستهدف حوالي 30 نيوكليوتيدات في الطول ، وطول امتدادات poly-U في التسلسل المستهدف هو 4 أزواج أساسية أو أقل ، والتسلسل المستهدف محتوى GC في نطاق 30٪ - 70٪، ولا يتوقع أن يشكل التسلسل المستهدف هياكل دبوس شعر RNA قوية ، ويحتوي التسلسل المستهدف على الحد الأدنى من البنية الثانوية أو الثالثة المتوقعة للجيش الملكي النيبالي5.

بالإضافة إلى تصاميم الحمض النووي الريبي ، فإن خطوة علم الوراثة الذبابية في كل بروتوكول أمر بالغ الأهمية أيضا في التنفيذ الناجح. وجود أو عدم وجود الأنماط الظاهرية المحددة التي تنتقل من الآباء والأمهات في الذرى مهمة لتحديد وتحديد الأنماط الظاهرية الناجمة عن نظام CasRx في ذريات transheterozygous. أيضا، إعداد الصلبان التحكم باستخدام الذباب dCasRx بالتوازي هي أيضا مفيدة في استبعاد الأنماط الظاهرية غير محددة في ذريات transheterozygous.

تجدر الإشارة إلى أن هذه النتائج كشفت عن مشكلة سمية تم تقديمها من خلال التعبير عن بروتين CasRx و dCasRx في كل مكان في الذبابة ، وهو قيد على نظام CasRx. جاء التعبير في كل مكان من CasRx أو dCasRx تحت الترويجي Ubiq وحدها ، دون gRNAs ، مع تكاليف اللياقة البدنية غير تافهة ، كما لا يوبيك - CasRx ولا الذباب يوبيك - dCasRx يمكن أن تنشأ كخطوط homozygous. على العكس من ذلك ، يمكن تأسيس ذباب UASt-CasRx و UASt-dCasRx كمخزونات متجانسة صحية ، على الرغم من أنه بسبب تصميم مخطط الصليب تم الاحتفاظ بها كمخزونات متوازنة مزدوجة ، وهي حقيقة تدعم وجود السمية الناجمة عن التعبير البروتيني CasRx في كل مكان. قطعة أخرى من الأدلة الداعمة هي أنه في تجارب التحكم التي تنطوي على dCasRx ، وهو غير نشط بشكل تحفيزي ، كانت نسب الذباب التي تحمل كل من dCasRx و gRNA من إجمالي عدد الذباب في جيل F1 أقل باستمرار من 50 ٪ ، وكانت النسبة المتوقعة على أساس الوراثة المندلية إذا لم تكن هناك سمية مرتبطة ب dCasRx. وأشار هذا إلى أن التعبير عن dCasRx في كل مكان ، جنبا إلى جنب مع gRNAs ، يحفز السمية في الذبابة ، مما يؤدي إلى نسبة ميراث أقل من المتوقع. نسب الميراث من transheterozygous UASt-dCasRx، gRNA، الذباب GAL4 يتبع علم الوراثة المندلي، مما يشير مرة أخرى إلى السمية الناجمة على وجه التحديد عن طريق التعبير في كل مكان من البروتينات CasRx وdCasRx. السمية في نظام CRISPR / Cas ليست جديدة. وقد تبين أن كميات عالية من بروتين Cas9 سامة في العديد من الكائنات الحية، بما في ذلك الذباب29,30,31,32. وقد وضعت دراسة حديثة نظام GAL4/UAS مخصصة التي يمكن ضبط كمية البروتين Cas9 أعرب في الذباب عن طريق إضافة إطار القراءة المفتوحة من طول متفاوت بين تسلسل UAS وتسلسل Cas9 في بناء UAS-Cas933. لذلك ، يجدر استكشاف طرق للحد من السمية الناجمة عن CasRx عن طريق ضبط مستوى التعبير عن البروتين CasRx.

بخلاف السمية الناجمة عن التعبير في كل مكان من البروتينات CasRx و dCasRx ، أظهرت النتائج أيضا فتكا مرتبطا بالآثار الجانبية غير المحددة لنظام CasRx خارج الهدف ، وهي سمة للعديد من أنظمة CRISPR1،2،7،34. في بعض الذباب CasRx والجينات غير الأساسية التي تعبر عن الحمض النووي الريبي المزدوج أو الثلاثي transheterozygous ، على سبيل المثال عند استهداف Notch ، يكون لدى ذباب Transheterozygous CasRx مستويات أقل بكثير من معدل البقاء على قيد الحياة مقارنة بالذباب dCasRx transheterozgyous. في تحليل الحمض النووي الريبي-seq لهذه الذباب CasRx وgRNA التعبير transheterozygous، لوحظ كل من انخفاض مستويات النص الجيني المستهدف والحد من النصوص الجينية غير المستهدفة. وكانت هذه الآثار الجانبية تعتمد على CasRx وتعتمد على الهدف، كما لوحظت فقط في الذباب transheterozygous التعبير عن كل من البروتين CasRx وgRNA. تجدر الإشارة إلى أن واحدة من الجينات المستهدفة ، البيضاء ، أظهرت انخفاضا محدودا وغير ذي دلالة إحصائية في النصوص عندما تم استهداف الجين الأبيض من قبل CasRx ، والذي كان على النقيض من النمط الظاهري الواضح للحد من الصباغ. ومن المفترض أن هذا قد يكون راجعا إلى حقيقة أن 1) توقيت جمع عينة الحمض النووي الريبي-seq لم يكن متوافقا بشكل جيد مع التوقيت عندما يصل الجين الأبيض إلى ذروة التعبير خلال التطور المبكر، و 2) التعبير المترجم للجين الأبيض في العينين يجعل من الصعب جمع الأنسجة ذات الصلة خلال مرحلة التطوير المبكر عندما يكون جمع عينات الجسم كله فقط ممكنا. وللحد من النشاط الجانبي في نظام CasRx، تدعو الحاجة إلى إجراء دراسات في المستقبل لفهم الآليات الكامنة وراء نظام الظاهرة خارج الهدف فهما كاملا على مستوى الكائنات الحية.

ومن المثير للاهتمام، دراسة حديثة35 تصف أدوات Cas13 استهداف الحمض النووي الريبي في الذباب ويبدو أن تحسين السمية العامة المرتبطة التعبير CasRx، لعدة أسباب محتملة. أولا ، أعاد المؤلفون ترميز المتحولين Cas13 لتحسين التعبير في Drosophila واستخدموا مروجا أكثر ضعفا (actin 5C) مقارنة بمروج كل مكان المستخدم في هذه الدراسة ، مما يؤدي على الأرجح إلى مستويات أقل من تعبير Cas13 وبالتالي سمية أقل. في الواقع ، يدعم هذا الملاحظات التي لم يكن تعبير CasRx و dCasRx مدفوعا ب UASt ، في حد ذاته ، ساما ، لأن هذه الدراسة (والمؤلفين في 35) لم يلاحظوا أي فتك واضح في ذباب UASt-CasRx. وعلاوة على ذلك، قام هؤلاء المؤلفون بترميز الحمض النووي الريبي بشكل مختلف مقارنة بهذه الدراسة، والتي ربما أثرت على تعبيرهم وخفضت سمية النظام في ذباب ترانسهيتروزيغوس Cas13/gRNA. على سبيل المثال، في دراستهم تم التعبير عن اثنين من gRNAs باستخدام المروج U6:3 ويحيط بها tRNAs لتمكين تجهيز الحمض النووي الريبي عند نضوج الحمض النووي الريبي دون الحاجة CasRx35. وعلى العكس من ذلك، في هذه الدراسة، تم ترميز الحمض النووي الريبي كصفائف تستهدف ما يصل إلى 4 مواقع لكل جين وتقليد بنية صفيف Cas13 الذاتية الموجودة في البكتيريا، والتي تتطلب أنزيم Cas13 لمعالجة كل gRNA. وربما أدت هذه النهج المختلفة إلى اختلافات في مستويات التعبير عن الحمض النووي الريبي وعوامل أخرى قد تكون لها آثار متأصلة على سمية النظام بأكمله. وأخيرا، استهدف هوينه وآخرون جينات مختلفة عن تلك المستهدفة في هذه الدراسة، مما يؤدي إلى اختلافات في التفاعل بين الهدف وكاس/الجيش الملكي النيبالي والنشاط الجانبي وقد تكون له آثار على المستويات الملاحظة من الفتك. وهذه الاختلافات في السمية الملاحظة تبرر إجراء مزيد من التحقيقات لتحديد السبل التي يمكن بها تحسين النظم العامة.

وعموما، فإن هذه الدراسة هي أول عرض لنظام كاس ترميز الحمض النووي الريبي الوظيفي المشفر وراثيا في D. melanogaster، وإن كان من الضروري زيادة تحسين نظام CasRx (بما يتماشى مع ما تم الإبلاغ عنه35) لزيادة الحد من الفتك خارج الهدف وزيادة فعالية شق CasRx على الهدف. استهداف الحمض النووي الريبي مع إنزيمات Cas هو مجال يتطور بسرعة مع العديد من التطبيقات المحتملة التي تتراوح بين مكافحة ناقلات الحشرات إلى الاستخدامات العلاجية1،2،3،4،5،6،7 ، وهذا البروتوكول يقدم حزمة بداية لأي شخص مهتم بتصميم نظام CasRx الأول في الذباب ، مع التوافق مع التخصيص وزيادة تحسين النظام. وتبين الأمثلة المعروضة هنا مجموعة من النتائج التي قد يواجهها المرء أثناء تنفيذ هذا النظام في الجسم الحي، وقد تكون بمثابة معايير للمستخدمين الآخرين في تقييم أداء نظام CasRx في تطبيقاتهم.

Disclosures

O.S.A هي مؤسسة شركة Agragene، ولديها حصة في الأسهم، وتعمل في المجلس الاستشاري العلمي للشركة. وقد استعرضت جامعة كاليفورنيا في سان دييغو شروط هذا الترتيب ووافقت عليها وفقا لسياساتها المتعلقة بتضارب المصالح. جميع المؤلفين الآخرين لا يعلنون عن مصالح متنافسة.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من منحة برنامج الجينات الآمنة DARPA (HR0011-17-2-0047)، وجوائز المعاهد القومية للصحة (R21RAI149161A، DP2AI152071) الممنوحة لشركة O.S.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Grape Juice Welch Foods Inc. N/A
Active Dry Yeast (908g) Red Star Yeast Company, LLC N/A
DMC4500 color camera Leica Microsystems DMC4500
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
GAL4-GMR flies Bloomington Drosophila Stock Center 29967
GAL4-y flies Bloomington Drosophila Stock Center 44373
Glomax 20/20 Luminometer Promega E5331
Illumina HiSeq2500 Sequencer Illumina, Inc. HiSeq2500
M165FC fluorescent stereomicroscope Leica Microsystems M165FC
Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer ThermoFisher NDONEC-W
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit New England Biolabs, Inc. E7770
plasmid # 112686 Addgene 112686
plasmid # 112688 Addgene 112688
plasmid # 132416 Addgene 132416
plasmid # 132417 Addgene 132417
plasmid # 132419 Addgene 132419
plasmid # 132420 Addgene 132420
plasmid # 132421 Addgene 132421
plasmid # 132422 Addgene 132422
plasmid # 132425 Addgene 132425
plasmid # 132426 Addgene 132426
plasmid # 133304 Addgene 133304
plasmid # 164586 Addgene 164586
plasmid #132418 Addgene 132418
plasmid pJFRC81 Addgene 36432
Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Restriction endonucleases AscI New England Biolabs Inc. R0558L
Restriction endonucleases NotI New England Biolabs Inc. R0189L
Restriction endonucleases PacI New England Biolabs Inc. R0547L
Restriction endonucleases PstI New England Biolabs Inc. R0140L
Restriction endonucleases SwaI New England Biolabs Inc. R0604L
Restriction endonucleases XbaI New England Biolabs Inc. R0145L
RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer Agilent Technologies 5067-1513
Turbo DNase Invitrogen AM2238
U6-3:4-gRNA-Fluc flies Bloomington Drosophila Stock Center 84125
U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies Bloomington Drosophila Stock Center 84986
U6-3:4-gRNA-N flies Bloomington Drosophila Stock Center 84122
U6-3:4-gRNA-w flies Bloomington Drosophila Stock Center 84124
U6-3:4-gRNA-y flies Bloomington Drosophila Stock Center 84123
UASt-CasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84121
UASt-dCasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84120
Ubiq-CasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84118
Ubiq-dCasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84119
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies Bloomington Drosophila Stock Center 84127
Zymoclean Gel DNA Recovery Kits Zymo Research Corporation D4007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat Communications. 9, 1911 (2018).
  2. Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), 5573 (2016).
  3. East-Seletsky, A., O'Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes. Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).
  4. Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell. 173 (3), 665-676 (2018).
  5. Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies. The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).
  6. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  7. Abudayyeh, O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550, 280-284 (2017).
  8. Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. In vivo RNAi: today and tomorrow. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640 (2010).
  9. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
  10. Ni, J., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  11. Ni, J., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature Methods. 8, 405-407 (2011).
  12. Ni, J., et al. Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster. Nature Methods. 5, 49-51 (2008).
  13. Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).
  14. Kulkarni, M., et al. Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays. Nature Methods. 3, 833-838 (2006).
  15. Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens. Nature. 443, 359-363 (2006).
  16. Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila. Fly. 1 (1), 1-5 (2007).
  17. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).
  18. Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations. Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).
  19. Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103 (2020).
  20. Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).
  21. Franz, A., et al. Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).
  22. Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti. Communications Biology. 1, 11 (2018).
  23. Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
  24. Addgene. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/ (2020).
  25. Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  26. Addgene. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr/ (2020).
  27. Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL (2020).
  28. Dobin, A., et al. STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  29. Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).
  30. Poe, A., et al. Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila. Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).
  31. Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).
  32. Yang, S., Li, S., Li, X. Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).
  33. Port, F., et al. A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila. eLife. 9, 53865 (2020).
  34. Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4 (17), 264 (2015).
  35. Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila. Genome Biology. 21, 279 (2020).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 168، CRISPR، إنزيم Cas، ريبونوكليز، CasRx، Drosophila melanogaster، استهداف الحمض النووي الريبي في كل مكان، استهداف الحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة
استهداف الحمض النووي الريبي في كل مكان والأنسجة محددة في <em>Drosophila Melanogaster</em> باستخدام CRISPR / CasRx
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, R., Brogan, D., Buchman, A.,… More

Sun, R., Brogan, D., Buchman, A., Yang, T., Akbari, O. S. Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx. J. Vis. Exp. (168), e62154, doi:10.3791/62154 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter