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Neuroscience

ROS Imagerie des cellules vivantes au cours du développement neuronal

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62165
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

Summary

Ce protocole décrit l’utilisation d’un peroxyde d’hydrogène génétiquement codé (H2O2)-biocapteur dans les neurones et les larves de poisson zèbre cultivés pour évaluer les rôles physiologiques de signalisation deH2O2pendant le développement du système nerveux. Il peut être appliqué à différents types de cellules et modifié avec des traitements expérimentaux pour étudier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans le développement général.

Abstract

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des molécules de signalisation bien établies, qui sont importantes dans le développement normal, l’homéostasie, et la physiologie. Parmi les différents ROS,le peroxyde d’hydrogène (H2O2) est le mieux caractérisé en ce qui concerne les rôles dans la signalisation cellulaire. H2O2 a été impliqué lors du développement chez plusieurs espèces. Par exemple, une augmentation transitoire deH2O2 a été détectée chez les embryons de poissons zèbres au cours des premiers jours suivant la fécondation. En outre, l’épuisement d’une source cellulaire importante H2O2, NADPH oxydase (NOX), altère le développement du système nerveux tel que la différenciation, la croissance axonale, et le guidage des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGCs) in vivo et in vitro. Ici, nous décrivons une méthode d’imagerie des niveaux intracellulaires deH2O2 dans les neurones de poissons zèbres cultivés et les larves entières pendant le développement en utilisant le biocapteur génétiquement codéH2 O2spécifique, roGFP2-Orp1. Cette sonde peut être exprimée de manière transitoire ou stable chez les larves de poissons zèbres. En outre, la lecture ratiométrique diminue la probabilité de détecter des artefacts en raison de l’expression génique différentielle ou des effets de volume. Tout d’abord, nous démontrons comment isoler et mettre en culture des GRC dérivés d’embryons de poissons zèbres qui expriment transitoirement roGFP2-Orp1. Ensuite, nous utilisons des larves entières pour surveiller les niveauxde H2O2au niveau des tissus. Le capteur a été validé par l’ajout deH2O2. De plus, cette méthodologie pourrait être utilisée pour mesurer les niveauxde H2O2dans des types de cellules et des tissus spécifiques en générant des animaux transgéniques avec une expression de biocapteur spécifique aux tissus. Comme les poissons zèbres facilitent les manipulations génétiques et développementales, l’approche démontrée ici pourrait servir de pipeline pour tester le rôle deH2O2 au cours du développement neuronal et embryonnaire général chez les vertébrés.

Introduction

La signalisation réactive des espèces de l’oxygène (ROS) régule le développement et le fonctionnement du système nerveux1. Une source importante de ROS cellulaires sont les oxydases NADPH (NOX), quisont des protéines transmembranaires générant du superoxyde et du peroxyde d’hydrogène (H2O2)2. Les enzymes NOX se trouvent dans tout le système nerveux central (SNC), et les ROS dérivés du NOX contribuent au développement neuronal3,4,5,6. Il a été démontré que le maintien et la différenciation des cellules souches neurales, l’établissement de la polarité neuronale, l’excroissance des neurites et la plasticité synaptique nécessitent des niveaux adéquats de ROS7,8,9,10,11. D’autre part, la production incontrôlée de ROS par les NEX contribue aux troubles neurodégénératifs, y compris la maladie d’Alzheimer, la sclérose en plaques et les lésions cérébrales traumatiques12,13,14. Par conséquent, la production de ROS physiologiquement pertinents est essentielle au maintien de conditions saines.

La mise au point de biocapteurs génétiquement codés a grandement facilité la détection des ROS cellulaires. Un avantage important des biocapteurs génétiquement codés est l’augmentation de la résolution temporelle et spatiale du signal ROS, car ces capteurs peuvent être spécifiquement ciblés à des endroits distincts. Le GFP sensible aux redox (roGFP) est l’un des types de ces biocapteurs ROS. La variante roGFP2-Orp1 détecte spécifiquement H2O2à travers son domaine Orp1, qui est une protéine de la famille des glutathion peroxiredoxin de levure15,16. L’oxydation de la protéine Orp1 est transférée dans roGFP2 pour modifier sa conformation(figure 1A). La sonde présente deux pics d’excitation proches de 405 nm et 480 nm, et un seul pic d’émission à 515 nm. Lors de l’oxydation, l’intensité de fluorescence autour des pics d’excitation change: alors que l’excitation de 405 nm augmente, l’excitation de 480 nm diminue. Ainsi, roGFP2-Orp1 est un biocapteur ratiométrique,et les niveauxH2O2sont détectés par le rapport des intensités de fluorescence excitées à deux longueurs d’onde différentes(figure 1B). Dans l’ensemble, roGFP2-Orp1 est un outil polyvalent pour l’imagerie ROS qui peut être utilisé efficacement in vivo.

Figure 1
Figure 1: Spectres schématiques de représentation et d’excitation de roGFP2-Orp1. (A) Le transfert d’oxydant se produit entre Orp1 et roGFP2 en réponse àH2O2,conduisant à des changements conformationnels dans roGFP2. (B) Les spectres d’excitation du roGFP2-Orp1 présentent deux pics d’excitation à 405 nm et 480 nm et un pic d’émission unique à 515 nm. Lors de l’oxydation parH2O2,l’excitation de 405 nm augmente tandis que l’excitation de 480 nm diminue. Il en résulte une lecture ratiométrique pour la présenceH2O2. Le chiffre a été modifié à partir de Bilan et Belousov (2017)16 et Morgan et coll. (2011)25. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Le système modèle Danio rerio (poisson zèbre) présente plusieurs avantages pour l’application de biocapteurs génétiquement codés. La transparence optique des embryons et des larves permet une imagerie in vivo non invasive. De nouveaux outils d’imagerie sont en cours de développement pour atteindre une résolution plus élevée et une pénétration plus profonde17. En outre, il existe des outils établis pour la manipulation génétique (expression ectopique de l’ARNm, transgénèse Tol2, etc.) et l’édition du génome (TALENs, CRISPR/Cas9, etc.), qui favorisent la génération d’animaux transgéniques18. Au fur et à mesure que les embryons de poisson zèbre se développent à l’extérieur de la mère, ce système facilite l’accès et la manipulation des embryons. Par exemple, les injections au stade unicellulaire et les traitements médicamenteux peuvent facilement être effectués.

Ici, nous avons utilisé le poissonzèbre pour exprimer transitoirement le biocapteur roGFP2-Orp1 spécifique àH2O2en injectant de l’ARNm transcrit in vitro. Ces embryons peuvent être utilisés à la fois pour l’imagerie in vitro de neurones cultivés et pour l’imagerie in vivo (figure 2). Nous décrivons un protocole pour disséquer et plaquer les cellules rétiniennes de ganglion (RGCs) des embryons de poisson zèbre suivis d’évaluer H2O2- niveaux dans les neurones cultivés. Ensuite, nous présentons une méthode d’imagerie in vivo d’embryons et de larves exprimant roGFP2-Orp1 à l’aide de la microscopie confocale. Cette approche permet non seulement de déterminer les niveaux physiologiques deH2O2-mais aussi les changements potentiels survenant à différents stades ou conditions de développement. Dans l’ensemble, ce système fournit une méthode fiable pour détecterH2O2dans les cellules vivantes et les animaux pour étudier le rôle de H2O2 dans le développement, la santé et la maladie.

Figure 2
Figure 2. Aperçu de l’approche expérimentale. En bref, après le prélèvement d’embryons, l’ARNm roGFP2-Orp1 est injecté dans le jaune d’embryons de poisson zèbre au stade cellulaire. Les embryons en développement peuvent être utilisés à la fois pour l’imagerie in vitro (A)et(B) in vivo. (A) Les embryons GFP-positifs sont utilisés pour disséquer des rétines pour la collecte de RGC à 34 hpf. Les RGCs dissociés sont plaqués sur des lamaux de couverture enduits de PDL/laminine dans des milieux ZFCM (+). L’imagerie du cône de croissance peut être effectuée car les RGCs étendent leurs axones après 6-24 h de placage. Les cellules peuvent être soumises à différents traitements pour mesurer les changements potentiels des niveaux deH2O2. Ici, nous avons mesuréles niveaux deH2O2dans les cônes de croissance des RGCs (rouge). (B) les embryons positifs à la GFP sont utilisés pour l’imagerie in vivo. À l’âge souhaité, les embryons peuvent être anesthésiés et montés sur des plats à fond de verre de 35 mm pour l’imagerie confocale. Ici, les embryons sont montés ventralement pour l’imagerie rétinienne. Le schéma montre le développement rétinien chez le poisson zèbre. Les RGCs forment la couche cellulaire ganglionnaire (GCL), qui est la couche la plus interne de la rétine. Les axones de RGC se développent en nerf optique pour croiser le midline, formant le chiasm optique. Ensuite, les axones RGC se développent dorsalement pour faire des synapses dans le tectum optique dans le mécérine. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été examinées et approuvées sur le plan éthique par le Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), conformément aux directives des NIH avec le protocole 2006002050 approuvé le 24/07/2020.

1. Préparation des solutions

  1. Support E2 (1x)
    1. Préparer des solutions 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) et 500x E2C (100 mL) en combinant tous les composants indiqués dans le tableau 1. Solutions Autoclave E2A, E2B et E2C. Conserver à 4 °C.
    2. Pour 1x support E2 : Combinez 5 mL de 100x E2A, 1 mL de 500x E2B et 1 mL de 500x E2C. Porter le volume à 500 mL avec de l’eau stérile. Ajuster le pH à 7,0-7,5.
    3. Préparez des aliquotes de 50 mL de 1x magasin de médias E2 à -20 °C pour un stockage à long terme. Cependant, des précipitations peuvent se produire lors du dégel. Assurez-vous que la précipitation est complètement dissoute avant d’utiliser la solution mère.
solution composant quantité concentration
100X E2A (500mL)
NaCl 43,8 g 1500 mM
Kcl 1,88 g 50 mM
MgSO4 6 g 100 mM
KH2PO4 1,03 g 15 mM
Na2HPO4 0,34 g 5 mM
500X E2B (100 mL)
CaCl2 5,5 g 500 mM
E2C 500X (100 mL)
NaHCO3 3 g 350 mM
1X E2 (500 mL)
100X E2A 5 mL 1X
E2B 500X 1 mL 1X
E2C 500X 1 mL 1X

Tableau 1 : Composants de 1x milieu E2 pour la culture cellulaire du poisson zèbre.

  1. Médias E3 (1x)
    1. Dissoudre les composants dans de l’eau stérile de 1 L comme indiqué dans le tableau 2 pour faire 100x stock. Diluer le stock dans de l’eau stérile pour faire 1x support E3.
    2. Ajouter 0,2 % de bleu de méthylène. Pour 20 mL de 1x média E3, ajouter 40 μL de bleu de méthylène.
    3. Faire un autre lot sans bleu de méthylène pour l’imagerie fluorescente.
composant Montant (g) Concentration en stock 100X (mM)
NaCl 29.22 500
Kcl 1.26 17
CaCl2 2H2O 4.85 33
MgSO4 7H2O 8.13 33

Tableau 2 : Composants des milieux 100x E3 pour le maintien des embryons de poissons zèbres.

  1. Solution mère saline 80x
    1. Combinez tous les composants indiqués dans le tableau 3. Ajouter de l’eau pour faire une solution de 100 mL. Mélanger jusqu’à ce que tous les composants soient dissous. Conserver la solution à 4 °C.
composant Montant (g) Concentration en stock (mM)
glucose 1.44 80
Sodium Pyruvate 0.44 40
CaCl2 2H2O 0.148 10
HEPES 6.1 256

Tableau 3 : Composants d’une solution saline 80x pour les milieux de culture cellulaire de poisson zèbre.

  1. Milieu de culture cellulaire du poisson zèbre (ZFCM+)
    1. Combinez tous les composants indiqués dans le tableau 4 pour créer un support de 250 mL. Régler le pH à 7,5. Filtrer les milieux à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et les conserver à 4 °C.
composant Montant (mL) Volume %
Milieu L-15 (avec du rouge de phénol) 212.75 85.1
Sérum fœtal bovin (SBF) 5 2
Pénicilline/streptomycine 1 0.4
Solution saline 80X 3.125 1.25
Eau 28.125 11.25

Tableau 4 : Composants du milieu de culture cellulaire du poisson zèbre avec sérum et antibiotiques.

  1. Milieu de culture cellulaire de poisson zèbre pour l’imagerie (ZFCM-)
    1. Combinez tous les composants indiqués dans le tableau 5 pour créer un support de 250 mL. Régler le pH à 7,5. Média filtrant utilisant un filtre de 0,22 μm.
    2. Faire des aliquotes à usage unique (lots de 50 mL) pour prévenir la contamination. Conserver à 4 °C.
composant Montant (mL) Volume %
Milieu L-15 (pas de rouge de phénol) 212.75 85.1
Solution saline 80X 3.125 1.25
Eau 34.125 13.65

Tableau 5 : Composants du milieu de culture cellulaire du poisson zèbre sans sérum ni antibiotiques pour l’imagerie in vitro.

  1. Moules d’injection
    1. Dissoudre 1,5 % de l’agarose dans les milieux E3. Verser ~ 25 ml d’agarose dans une boîte de Pétri de 100 x 15 mm.
    2. Posez le moule sur le dessus de l’agarose avec un angle de 45 ° par rapport à la surface, et laissez-le flotter sur l’agarose au ralenti. Cela aidera à éviter les bulles. Laissez l’agarose refroidir et solidifier sur le dessus de la banquette.
    3. Une fois complètement solidifié, retirez le moule lentement pour éviter la rupture de l’agarose. Ajouter du support E3 frais, ajouter un film de paraffine autour du plat pour éviter les déversements et conserver à 4 °C (figure 3).

Figure 3
Figure 3: Images de moule d’injection. (A) Moule en plastique utilisé pour fabriquer des plaques d’injection. Le moule a six rampes, une à 90 ° et une côté biseauté à 45 ° pour maintenir les embryons en place. (B) La plaque d’injection après l’agarose solidifiée et le moule est retiré. Barres d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Préparation et injection d’ARNm roGFP2-Orp1

REMARQUE: la construction roGFP2-Orp1 a été obtenue auprès du Dr Tobias Dick, DKFZ, Allemagne. Il a été sous-cloné dans le vecteur pCS2+ dans le laboratoire du Dr Qing Deng de l’Université Purdue. Pour prévenir la dégradation par RNase, plusieurs précautions doivent être prises. Des réactifs et des tubes sans RNase doivent être utilisés en tout temps, des gants doivent être portés pour toutes les étapes et, alternativement, les matériaux et les surfaces peuvent être essuyés avec un agent nettoyant pour l’élimination RNase.

  1. Linéariser les 3-10 μg du vecteur pCS2+/roGFP2-Orp1 avec NotI.
  2. Purifier le plasmide linéarisé avec un kit de nettoyage PAR PCR.
  3. Transcrire in vitro l’ARNm roGFP2-Orp1 avec un kit de transcription in vitro selon les instructions fournies par le fabricant.
    1. Ensemble réaction de transcription plafonné
      1. Placer l’ARN polymérase et l’ADN linéarisé/purifié sur de la glace. Tampon de réaction Vortex 10x et 2x NTP/CAP jusqu’à ce qu’ils soient complètement en solution. Entreposer le NTP/CAP sur de la glace, mais conserver le tampon à température ambiante (RT) tout en assemblant la réaction. Touchez tous les réactifs avant d’ouvrir les tubes pour éviter la contamination.
      2. Mettre en place la réaction de synthèse de l’ARN dans l’ordre indiqué ci-dessous à RT dans un tube centrifuge de 0,5 mL sans RNase. Le volume final de la réaction est de 20 μL. La configuration de la réaction est indiquée dans le tableau 6.
      3. Ajouter 10 μL de mélange de ribonucléotide, 2x NTP/CAP et de l’eau sans nucléase, si nécessaire, dans le tube. Ajouter 2 μL de tampon de réaction 10X. Ajouter 1-1,5 μg d’ADN linéaire (jusqu’à 6 μL). Au besoin, ajouter de l’eau sans nucléase pour compléter le volume de réaction de 20 μL.
      4. Fermez le tube, le vortex brièvement et le microfuge touch-spin. Ajouter 2 μL de mélange d’enzymes 10x SP6. Fermez avec un clic de doigt et touchez-tournez dans un microfuge.
      5. Placer à 37 °C pendant 2-2,5 h (peut aller jusqu’à 18 h).
        REMARQUE: Dans l’expérience présentée pendant la nuit 16-18 h incubation à 37 °C a été effectuée pour de meilleurs résultats.
      6. Ajouter 1 μL de DNase pour enlever le gabarit d’ADN, cliquer sur le doigt, toucher la rotation et incuber à 37 °C pendant 15 min.
Réactif Volume (μL) Montant en réaction
2X NTP/CAP 10 1X
Tampon de réaction 10X 2 1X
ADN modèle Jusqu’à 6 1-1,5 μg
Eau sans nucléase Ajouter pour faire 20 μL
Mélange d’enzymes 10X SP6 2 1X

Tableau 6 : Configuration de la réaction pour la transcription in vitro de l’ARNm roGFP2-Orp1.

  1. Récupération de l’ARN
    1. Ajouter 25 μL de chlorure de lithium (LiCl) fourni dans la trousse de transcription in vitro. Placer à -20 °C dans un congélateur non gelé pendant au moins 30 min.
    2. Tourner pendant 25 min à la vitesse maximale dans une centrifugeuse de table à 4 °C. Retirez et jetez soigneusement le surnageant afin de ne pas déranger les pastilles. Ajouter 25 μL d’éthanol froid à 75 % et tourner pendant 5 min à 4 °C.
    3. Retirez soigneusement et jetez le surnageant. Laisser sécher à l’air pendant au moins 5 min à TA. Ne laissez pas sécher. Ajouter 12 μL de tampon Tris-EDTA (TE) exempt de nucléase (pH 7,0) et conserver l’échantillon sur la glace.
    4. Mesurer la concentration d’ARN avec un spectrophotomètre. On obtient habituellement 0,5 à 1 μg/μL.
    5. Préparer 100 ng/μL d’ARNm dans une solution rouge de phénol (0,5 % de rouge de phénol dans la solution saline tamponnée au phosphate -DPBS) de Dulbecco et une partie aliquote à usage unique (3-5 μL). Conserver les aliquotes de l’ARNm à - 80 °C.
  1. Microinjection de l’ARNm
    1. Le jour de l’injection, utilisez l’une des aliquotes d’ARNm et suivez le protocole d’injection d’embryons de poisson zèbre pour injecter 1 nL de l’ARNm dans les embryons au stade unicellulaire à travers leur jaune19. Une brève description est fournie ci-dessous.
    2. Élever des poissons adultes et recueillir des embryons comme décrit précédemment20.
    3. Tirez les aiguilles de microinjection avec un tireur de pipette. Coupez la pointe des aiguilles avec une pince pour créer une ouverture de pointe de 10 μm.
    4. Aligner les embryons dans un moule d’injection qui a été décrit à l’étape 1.6.
    5. Injecter 1 nL de l’ARNm dans du rouge de phénol avec une pipette de microinjection en verre.
    6. Recueillir des embryons et les conserver dans les milieux E3.
    7. Conservez les embryons dans l’incubateur à 27 °C en milieux E3 jusqu’à ce que le stade de développement souhaité soit atteint. Les embryons injectés peuvent être utilisés à la fois pour l’imagerie in vitro (section 3 et section 4) et in vivo (section 5). Les embryons exprimant roGFP2-Orp1 peuvent être présélectionnés avant les expériences avec un microscope de dissection régulier équipé de lumière fluorescente et d’un ensemble de filtres bleu/vert.

3. Culture cellulaire ganglionnaire rétinienne primaire dérivée d’embryons de poissons zèbres

Remarque : ce protocole est adapté d’une méthode précédemment publiée 21. Effectuez les étapes 3.1 et 3.2 dans une hotte à flux laminaire.

  1. Préparation des lamaux de couverture
    1. Préparer 4-6 plaques de culture dans chaque expérience. Utilisez des lamelle de couverture nettoyées à l’acide (22 x 22 mm carrés; épaisseur 0,16-0,19 mm) qui sont stockées dans de l’éthanol à 100 %.
    2. Retirez une lame de couverture du contenant d’entreposage à l’aide d’une pince et enflammez-la pour éliminer l’éthanol résiduel.
    3. Séchez complètement la lamelle à couvercle en la plaçant à un angle à l’intérieur d’un plat de culture de 35 mm.
    4. Préparer la solution de travail de poly-D-lysine (PDL) (1x) en diluant 10x stock (5 mg/mL) dans de l’eau stérile.
    5. Appliquer 100 μL de 0,5 mg/mL de PDL au centre de chaque lamelle et éviter l’étalement de la solution sur les bords.
    6. Incuber la LDO sur des lamelle pendant 20-30 min à température ambiante (RT). Assurez-vous que le PDL ne se dessèche pas.
    7. Lavez le PDL avec 0,5 mL d’eau stérile trois fois. Laissez les plaques sécher complètement.
    8. Préparer la solution de travail de laminine (1x) en diluant 50x stock (1 mg/mL) dans 1x PBS.
    9. Appliquer 100 μL de 20 μg/mL de laminine dans du PBS au centre de chaque lamelle et éviter la propagation de la solution sur les bords.
    10. Incuber les plaques à 37 °C dans un incubateur humidifié pendant 2-6 h. Évitez le séchage de la solution de laminine.
  2. Dissection embryonnaire et placage des GRC
    1. Préparer et étiqueter quatre plats de culture tissulaire de 35 mm et les remplir de 4 mL d’éthanol à 70 %, de « milieu E2 1 », « milieu E2 2 », « milieu E2 3 » le jour de la dissection. Conservez la vaisselle au réfrigérateur jusqu’aux dissections.
    2. Lorsque les embryons de poisson zèbre sont 34 heures après la fécondation (hpf), sortez les plats de culture recouverts de laminine de l’incubateur et lavez les lamaux trois fois avec 0,5 mL de PBS 1x.
    3. Après le lavage final, ajoutez 4 mL de milieu ZFCM(+) à chaque plat de culture et évitez de sécher la plaque.
    4. Récupérez les plats de culture préparés à l’étape 3.2.1. Qu’ils s’équilibrent à RT.
    5. Remplissez 4 à 6 tubes PCR avec 15 μL de milieu ZFCM(+). Un tube est nécessaire pour préparer les RGCs de 4 yeux à plaquer sur une lamelle de couverture.
    6. Récupérer des embryons de poisson zèbre de l’incubateur et immerger les embryons dans un plat de culture de tissus de 35 mm contenant 70% d’éthanol pendant 5-10 s pour stériliser.
    7. À l’aide d’une pipette de transfert, transférer les embryons dans un plat E2 Media 1 contenant un support E2 stérile pour laver l’excès d’éthanol.
    8. Transférer les embryons dans le plat E2 Media 2 et retirer leurs chorions avec une pince tranchante.
    9. Transférer les embryons dans la parabole finale E2 Media 3 pour effectuer des dissections.
    10. À l’aide d’une paire de pinces fines, disséquer les rétines comme décrit précédemment 22.
    11. Positionnez et maintenez les embryons antérieurs à leur jaune avec l’une des pinces et retirez la queue postérieure au sac vitellin avec les autres pinces.
    12. Prenez le cou avec une pince et enlevez la tête pour exposer le cerveau et les yeux aux médias E2. Évitez de couper le sac vitellin.
    13. Avec la pointe de la pince fine, rouler doucement les yeux de la tête, tout en tenant le tissu crânien vers le bas avec la deuxième pince. Gardez les yeux isolés des débris de tissu adjacents.
    14. Transférer quatre yeux sur l’un des tubes préalablement préparés contenant du ZFCM(+).
    15. Titrez doucement de haut en bas avec la pipette P20 et une pointe jaune environ 45 fois pour dissocier les cellules. Évitez les bulles d’air.
    16. Transférez le ZFCM(+) avec des cellules dissociées au centre de la lamelle. Répétez les étapes 10 à 12 pour des lamelle supplémentaires.
    17. Maintenir les cultures sur paillasse à 22 °C sur un support en mousse de polystyrène pour absorber les vibrations.
    18. Effectuer l’imagerie 6-24 h après le placage.
      REMARQUE: Utilisez la pipette de transfert pour transférer des embryons vers différents plats de culture. Changer la pipette de chaque solution pour éviter le transport de l’éthanol (étapes 6 à 8).

4. Imagerie ROS in vitro des neurones RGC cultivés

  1. Le jour de l’imagerie (généralement 6-24 h après le placage cellulaire), vérifiez les cellules au microscope pour valider la croissance des axones RGC.
  2. Pour l’imagerie à cellules vivantes, transférez les lamaux de couverture de la parabole de culture vers une chambre d’imagerie de cellules vivantes. Dans ce cas, une chambre ouverte sur mesure, qui a été précédemment décrite, a été utilisée23.
  3. Configurez le microscope pour l’imagerie. Utilisez un microscope inversé équipé d’un objectif de contraste différentiel d’interférence (DIC), d’un filtre rouge OG590 à passe longue et d’une caméra EM-CCD.
  4. Avant l’imagerie, remplacez le milieu ZFCM(+) par ZFCM(-).
  5. Une fois que les cellules sont positionnées avec un objectif 10x, acquérir des images à un grossissement de 60x à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile NA élevé. Utilisez un grossissement supplémentaire de 1,5x.
  6. Tout d’abord, acquérir des images DIC. Ensuite, image roGFP2-Orp1 à l’aide d’un jeu de filtres approprié. Exciter roGFP2-Orp1 avec des filtres d’excitation 405/20 et 480/30 nm séquentiellement et acquérir des images avec filtre d’émission 535/30 nm après que la lumière d’émission a passé le miroir dichroïque 505DCXR.
  7. Après avoir pris le premier ensemble d’images, échangez des médias avec des médias contenant différentes solutions de traitement. Les supports doivent être changés toutes les 30 minutes d’imagerie pour éviter les changements de pH et d’osmolarité.

5. Imagerie ROS in vivo d’embryons en développement

  1. Pour l’imagerie in vivo, conservez les embryons dans un milieu E3 contenant 0,003% de phénylthiourée (PTU) sans bleu de méthylène de 22 à 24 hpf. Échangez des médias et retirez quotidiennement les embryons morts.
  2. À l’âge souhaité, anesthésier les embryons dans 0,016% de tricaine. Monter des embryons anesthésiés dans de l’agarose à faible fusion à 1% sur des plats de culture de fond de verre de 35 mm. Les embryons peuvent être orientés dorsalement, ventralement ou latéralement, selon la région d’intérêt pour l’imagerie.
  3. Après solidifie l’agarose, remplissez les plats avec un support E3 sans bleu de méthylène / 0,016% de tricaine.
  4. Configurez le microscope pour l’imagerie. Utilisez un microscope confocal à balayage laser inversé. Vous pouvez également utiliser un microscope confocal vertical équipé d’une lentille d’immersion dans l’eau pour imager des embryons montés sur une goutte d’agarose.
  5. Exciter roGFP2-Orp1 avec des filtres d’excitation de 405 nm et 488 nm séquentiellement et acquérir des images correspondantes avec des filtres d’émission dans la gamme de 515-535 nm.
  6. Acquérir des z-stacks d’une épaisseur de section de 5 μm à travers la partie souhaitée des embryons. Les embryons peuvent être conservés pour l’imagerie à des stades ultérieurs de développement.
  7. Après l’imagerie, retirer les embryons de l’agarose avec une pince fine et les conserver dans l’incubateur jusqu’à l’âge souhaité dans des milieux sans bleu de méthylène avec PTU.

6. Analyse et traitement des images

  1. Mesure des niveaux deH2O2 sur la base des valeurs du rapport 405/480
    1. Utilisez un logiciel approprié pour l’analyse d’images. Le logiciel ImageJ a été utilisé ici pour l’analyse et le traitement d’images.
    2. Ouvrez les images DIC, 405/535 et 480/535 dans le logiciel ImageJ en faisant glisser les fichiers ou en cliquant sur Fichier | Ouvrez. Si ce n’est pas déjà fait, convertissez les images en 32 bits en cliquant sur Image | Type | 32 bits.
    3. Définissez la région d’intérêt (ROI) avec l’outil à main levée de la barre de contrôle (corps cellulaire, cône de croissance, rétine, etc.). Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Analyser | Outils | Gestionnaire de roi. Cliquez sur Ajouter dans l’onglet Gestionnaire de retour sur investissement pour ajouter le retour sur investissement défini.
    4. Dessinez une région proche du retour sur investissement et ajoutez-le en tant que retour sur investissement d’arrière-plan. Mesurez les valeurs d’arrière-plan moyennes en sélectionnant le retour sur investissement et en cliquant sur Mesurer dans l’onglet Gestionnaire de retour sur investissement.
    5. Notez les valeurs d’intensité moyenne de la mesure. Soustrayez la valeur de l’arrière-plan moyen des images fluorescentes en cliquant sur Traiter | | mathématiques Soustraire. Effectuez cette étape pour les images 405/535 et 480/535.
    6. Ajoutez la valeur de « 1 » à l’image fluorescente 480/535 pour éliminer les valeurs « 0 » en cliquant sur Traiter | | mathématiques Ajoutez une fonction avant le calcul du ratio.
    7. Cliquez sur Traiter | Calculatrice d’images | Diviser la fonction dans ImageJ pour diviser l’image 405/535 par 480/535 image pixel par pixel. Sélectionnez l’image 405/535 à diviser par l’image 480/535. Sélectionnez une image de sortie 32 bits.
    8. Appliquez le retour sur investissement à l’image de ratio en cliquant d’abord sur l’image de ratio, puis sur le retour sur investissement dans l’onglet Gestionnaire de retour sur investissement.
    9. Mesurez les valeurs de rapport moyennes de l’image 405/535 à l’image 480/535 en cliquant sur Mesurer dans l’onglet Gestionnaire de retour sur investissement.
    10. Effectuer les étapes 6.1.2 à 6.1.9 pour autant d’échantillons que possible afin d’effectuer l’analyse statistique appropriée.
  2. Affichage de l’image de ratio
    REMARQUE : cette procédure consiste à soustraire l’arrière-plan à l’extérieur de l’échantillon et à appliquer une table de recherche de couleur à l’image.
    1. Une fois que l’image de ratio a été créée dans ImageJ à l’étape 6.1.7., créez une image noire 32 bits en cliquant sur Fichier | Nouvelle| Image.
    2. Appliquez le retour sur investissement pour lequel vous souhaitez afficher les niveaux H2O2 à la nouvelle image en cliquant d’abord sur la nouvelle image, puis sur le retour sur investissement à partir de l’onglet Gestionnaire de retour sur investissement.
    3. Créer un masque en cliquant sur Modifier | | de sélection Créer un masque.
    4. Divisez l’image du masque par 255 pour ajuster la valeur du retour sur investissement à « 1 » et les valeurs d’arrière-plan seront « 0 ». Cliquez sur Traiter | | mathématiques Diviser et taper 255.
    5. Multipliez le masque avec l’image de ratio en cliquant sur Traiter | Calculatrice d’images | Fonction multiplier. Il en résultera une image en échelle de gris affichant uniquement le retour sur investissement.
    6. Remplacez la table de recherche par « Fire » en cliquant sur Image | Rechercher des tables | Feu.
      REMARQUE : un facteur de multiplication peut être appliqué à toutes les images pour une meilleure visualisation du ratio en cliquant sur Traiter | | d’images Multiplier.
    7. Convertissez l’image de ratio en 8 bits en cliquant sur Image | Type | 8 bits.
    8. Ajouter une barre d’étalonnage en cliquant sur Analyser | Outils | Barre d’étalonnage.

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Representative Results

Les CRG de poissons zèbres d’élevage étendent les axones à l’intérieur de 1d. Une image représentative au rapport 405/480du biocapteurH2O2est représentée sur la figure 4A. Le corps cellulaire, axone, et les cônes de croissance sont clairement visibles dans les neurones individuels. Ces neurones peuvent être soumis à différents traitements au fil du temps pour surveiller les changementsH2O2. Nous avons précédemment constaté que l’ajout de 100 μMH2O2aux milieux de culture augmente les valeurs de rapport, montrant que des changements en temps réel peuvent être détectés avec ce système (Figure 4)24.

Figure 4
Figure 4: ImagerieH2O2dans les RGCs de poissons zèbres d’élevage avec roGFP2-Orp1. (A) Images représentatives du rapport 405/480 nm de neurones RGC cultivés à partir d’embryons de poissons zèbres âgés de 34 hpf. Le neurone de gauche a été traité avec un milieu témoin sans sérum et le neurone de droite a été traité avec 100 μMH2O2pendant 30 min. Bar d’échelle = 10 μm.(B)Graphiques à barres montrant les niveaux moyens deH2O2 dans les cônes de croissance RGC de type zèbre sauvage avant et après le traitement avec un témoin ou 100 μMH2O2. Les données ont été normalisées pour contrôler le traitement. Les données sont indiquées moyennes ± SEM. Le nombre de cônes de croissance est indiqué entre parenthèses pour chaque groupe. Test de classement signé par paires appariées de Wilcoxon à deux queues; **p = 0,0009. Le chiffre a été modifié par rapport à notre précédente publication24. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Lesconcentrations de H2O2 peuvent également être déterminées chez des embryons entiers de poissons zèbres(figure 5). Lorsque l’ARNm est injecté au cours de l’étape unicellulaire, tous les tissus expriment le biocapteur roGFP2-Orp1. Dans la figure 5A,nous montrons la région de tête des larves de poissons zèbres à deux points de temps différents, en nous concentrant sur les niveaux deH2O2 dans la rétine, à titre d’exemple. Nous avons précédemment montré que l’addition deH2O2augmente les valeurs de rapport en temps réel, tandis que l’addition de l’agent réducteur TNT inverse cet effet in vivo24. Ici, nous avons mesuré les niveaux basaux deH2O2dans les mêmes embryons de poisson zèbre à 2 dpf et 5 dpf. À 2 dpf, les valeurs de rapport étaient sensiblement inférieures qu’à 5 dpf (p<0,0001 ; Figure 5B). De plus, chaque animal a montré un niveau différent d’augmentation de sa teneur rétinienne enH2O2 (figure 5C).

Figure 5
Figure 5: Imagerie in vivo H2O2 chez les larves de poissons zèbres avec roGFP2-Orp1. (A) DIC et images de rapport 405/480 nm de larves de poissons zèbres de 2 et 5 dpf. Le retour sur investissement est défini comme la rétine (lignes jaunes) pour mesurer les valeurs de rapport. Les mêmes larves ont été analysées à 2 et 5 dpf. Barres d’échelle = 50 μm. (B) Mesure des niveaux moyens deH2O2 dans les rétines de 2 et 5 dpf de poisson zèbre. À 5 dpf, les niveaux deH2O2-sont augmentés de manière significative dans la rétine par rapport à 2 dpf. (C) Graphique linéaire des mesures de poissons individuels. Chaque animal présente une augmentation des niveaux deH2O2dans sa rétine de 2 à 5 dpf. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Le nombre de larves analysées est indiqué entre parenthèses pour chaque groupe. Test de rang signé par paires appariées wilcoxon à deux queues, ****p<0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Il y a plusieurs étapes critiques qui nécessitent une attention particulière tout au long de ce protocole. Nous pensons que la prise en compte de ces points améliorera le flux expérimental. Pour la culture primaire de RGC, la stérilité du ZFCM(-) est très importante, car ce milieu de culture ne contient pas d’antibiotiques et la contamination peut survenir avant ou pendant l’imagerie. Pour l’éviter, nous vous conseillons de préparer et d’utiliser ZFCM(-) uniquement à l’intérieur d’une armoire de biosécurité et de faire régulièrement des supports ZFCM(-) frais (étape 1.5). En outre, les stocks de laminine doivent être maintenus à -80 °C. La laminine décongelée doit être conservée à 4 °C en tout temps. Ne conservez pas les solutions de laminine à température ambiante ou recongelez-les, car cela diminue l’activité favorisant l’activité de la protéine favorisant l’excroissance des nenrites.

Disséquer la rétine du poisson zèbre au bon moment est important pour produire suffisamment de RGCs qui étendent les axones. Les RGCs de poisson zèbre naissent à 28 hpf et étendent les axones hors de la rétine à partir de 32-36 hpf. Par conséquent, il est essentiel de plaquer les RGCs après 28 hpf, de préférence entre 32-36 hpf, pour permettre une différenciation complète des RGCs. Les cultures préparées à des points de temps antérieurs peuvent ne pas donner assez de RGCs ou prodonneront des RGCs qui peuvent ne pas étendre les axones dans les 24 heures suivant le placage. Il est fortement recommandé de changer le milieu ZFCM(-) lors de l’imagerie pendant plus de 30 minutes. Comme ce média manque de rouge de phénol, les changements de pH ne sont pas visibles et peuvent devoir être pris en compte. Échangez les médias très soigneusement pour éviter de dénflouer les neurones pendant le processus (étape 4.7).

Enfin, changer le support en E3 avec PTU mais sans bleu de méthylène est nécessaire de 24 hpf. PTU empêche la pigmentation pour la transparence larvaire améliorée requise pour l’imagerie par fluorescence in vivo; cependant, un traitement plus précoce avec PTU peut causer des défauts de développement26. Le bleu de méthylène est éliminé du milieux E3 pour réduire l’autofluorescence, provenant principalement du jaune (étape 5.1).

Ce procédé permet la détection cytoplasmique deH2O2. Cependant, la compartimentation subcellulaire de H2O2contribue à la signalisation locale, et les niveaux cytoplasmiquesH2O2peuvent ne pas fournir suffisamment d’informations sur les rôles de signalisation spécifiques deH2O2. Comme roGFP2-Orp1 est un biocapteur génétiquement codé, il peut être ciblé pour une expression spécifique aux tissus (p. ex. neurones, astrocytes, cellules gliales, etc.) ou des emplacements subcellulaires spécifiques (p. ex. membrane plasmique, mitochondries, noyau, etc.). Comme roGFP2-Orp1 est un biocapteur à base de GFP, la combinaison avec d’autres sondes fluorescentes est limitée aux longueurs d’onde d’émission en dehors du spectre vert. Étant donné que la GFP est largement utilisée comme marqueur de transgénèse, l’utilisation de biocapteurs à base de GFP peut être limitée. Pour relever ce défi, des protéines rouge-fluorescentes pour la détectionH2O2ont été développées récemment27. En outre, roGFP2-Orp1 est transitoirement exprimé dans la méthode présentée ici. Par conséquent, l’expression de l’ARNm et des protéines se désintègrera avec le temps. Nous étions encore en mesure de détecter le signal dans les larves de 5 dpf; cependant, des lignées de poissons transgéniques doivent être établies pour une expression stable du biocapteur tout au long du développement et à l’âge adulte.

Plusieurs essais à base de colorants sont disponibles pour détecter les ROS intracellulaires (par exemple, H2DCF-DA), ou plus précisément,H2O2 (PF6-AM)28,29. L’utilisation d’un biocapteur génétiquement codé, tel que roGFP2-Orp1, présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes à base de colorants. Tout d’abord, il permet la détection des deux changements transitoires dans le statut oxydatif en raison de la réversibilité ainsi qu’à des emplacements subcellulaires spécifiques. Par conséquent, les changements dynamiques sont bien surveillés avec un degré élevé de résolution spatiale30. Deuxièmement, il présente généralement moins de toxicité pour les cellules ou les tissus par rapport aux molécules de colorant. Enfin, le biocapteur peut encore être manipulé génétiquement pour répondre aux besoins d’expériences spécifiques31. roGFP2-Orp1 est un biocapteur ratiométrique, car il a deux excitations et un pic d’émission. Lors de l’interaction avecH2O2,l’excitation de 405 nm augmente et l’excitation de 480 nm diminue. Par conséquent, la lecture est le rapport des valeurs d’intensité acquises par excitation de 405 et 480 nm, respectivement. Étant donné que cette sonde est ratiométrique, l’application d’une deuxième sonde devient inutile pour corriger les effets de volume potentiels. De plus, comme cette sonde n’implique que l’expression d’un polypeptide, elle ne souffre pas de problèmes potentiels d’expression différentielle de plus d’une protéine, comme dans le cas du transfert d’énergie de résonance de fluorescence intermoléculaire (FRET).

La roGFP2-Orp1 est une sonde H2O2 polyvalente pour étudier la production et la signalisation des ROS. Dans les cellules vivantes, cette sonde présente une plage dynamique de 4,8 (environ 4 dans les embryons de poissons zèbres transgéniques)15,32. Cependant, l’état redox de roGFP2-Orp1 est sujet à des altérations par les systèmes endogènes de thiorédoxine et de glutaredoxine ; par conséquent, des sondes plus sensibles ont été développées en remplaçant Orp1 par une autre peroxiredoxin de levure, Tsa233,34. Bien que roGFP2-Orp1 soit utile pour détecter les changements dansH2O2dans les embryons de poissons zèbres, la sensibilité est principalement limitée à des concentrations plus élevées deH2O224,31, appliquée de manière exogène, ou à des stimuli puissants. Par exemple, le traitement slit2 a augmenté le signal roGFP2-Orp1 dans les RGCs de type sauvage, mais pas dans les RGCs nox2 mutants 35. D’autre part, il n’y avait aucune différence dans les niveaux basaux deH2O2entre les RGCs mutants de type sauvage et nox2 et les embryons de 2 dpf24,35. Par conséquent, pour détecter les niveaux basaux ou les petits changements dansH2O2,des sondes de sensibilité plus élevée seront nécessaires.

HyPer est un autre biocapteur spécifiqueH2O2spécifique à la fonction génétiquement codée et ratiométrique largement utilisée36. Les sensibilités des deux sondes sont similaires; cependant, roGFP2-Orp1 a montré une réactivité plus lente aux changementsH2O215. Par conséquent, la détection précise des modifications en temps réel peut nécessiter HyPer au lieu de roGFP2-Orp1. Alors que les versions initiales de HyPer sont affectées par les changements de pH, roGFP2-Orp1 n’est pas16,36. Par conséquent, il est essentiel d’inclure une sonde de contrôle du pH (SypHer3s) lors de l’utilisation de HyPer37. La sonde HyPer la plus récente, HyPer7, a surmonté de nombreux inconvénients des sondes H2O2 existantes: HyPer7 a une stabilité de pH plus élevée, une luminosité accrue, une cinétique plus rapide et une plage dynamique plus élevée38. Par ailleurs, HyPer7 est validé à la fois in vitro et in vivo,montrant la compartimentation subcellulaire et le suivi en temps réel deschangements H2O2dans les embryons de poissons zèbres lors de la cicatrisation des plaies38.

La méthodologie présentée ici peut être étendue pour étudier le rôle de la signalisation ROS in vitro et in vivo. roGFP2-Orp1 exprimant des neurones peuvent être soumis à différents traitements pour étudier leur effet sur la signalisationH2O2. Par exemple, nous avons montré que les RGCs répondent aux changements dans les niveaux deH2O2 en temps réel(Figure 4),ce qui suggère que le biocapteur peut détecter des changements immédiats dansH2O2. Cependant, la détermination des concentrations intracellulaires absolues deH2O22 nécessiterait un étalonnage approfondi du système. La limite de détection du biocapteur n’est pas claire non plus. En outre, la distribution spatiale détaillée du biocapteur dans la cellule n’est pas complètement connue, ce qui pourrait interférer avec l’interprétation des résultats. En outre, la détermination du signal d’emplacement exact de roGFP2-Orp1 pourrait révéler s’il existe une production H2O2 spécifique au site qui contribue à la signalisation intracellulaire localisée.

La création de poissons transgéniques exprimant roGFP2-Orp1 présente de nombreux avantages. Le biocapteur peut être exprimé de manière omniprésente, ou sous un promoteur tissulaire spécifique pour l’étude de la signalisationH2O2spécifique à la cellule en utilisant la transgénèse Tol2 chez le poisson zèbre39. Le rôle deH2O2 dans le développement peut être étudié par expression omniprésente du biocapteur. Par exemple, les embryons de poissons zèbres transgéniques peuvent être surveillés pour évaluer les changements dans les niveauxde H2O2 et comment ces changements contribuent à différents stades de développement. D’autre part, l’expression tissulaire spécifique du roGFP2-Orp1 se concentre sur les effets de la production deH2O2dans les cellules ou les tissus d’intérêt. Les promoteurs spécifiques aux tissus ou aux cellules peuvent être utilisés pour stimuler l’expression de roGFP2-Orp1 dans des cellules spécifiques. En outre, le système Gal4/UAS peut être utilisé pour l’étiquetage clairselé des neurones individuels. Par conséquent, cette approche permet de détecter les niveaux deH2O2 à une résolution cellulaire in vivo. Enfin, des lignées transgéniques stables peuvent être utilisées pour le criblage de médicaments à haut débit qui implique la signalisation ROS et le stress oxydatif dans les embryons de poissons zèbres.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (Grant R01NS117701), la National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), l’Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), la Purdue Research Foundation (Grant 209911) et le Bureau du vice-président exécutif pour la recherche et les partenariats à l’Université Purdue (Subvention 210362). Nous remercions le Dr Cory J. Weaver et Haley Roeder d’avoir établi le protocole d’élevage du poisson zèbre RGC. Nous remercions également Haley Roeder d’avoir fourni les données de la figure 4. Nous remercions Leah Biasi et Kenny Nguyen pour leur aide à la culture RGC. Nous remercions Gentry Lee d’avoir édité le texte. Nous remercions le Dr Tobias Dick d’avoir fourni roGFP2-Orp1 et le Dr Qing Deng pour le vecteur pCS2+ contenant roGFP2-Orp1. La figure 2 est créée avec Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35-mm culture dish Sarstedt 83-3900
35-mm glass bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes Sutter/Fisher Scientific NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Cover glass Corning 2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) VWR 25384-094
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 26140087
Glucose Sigma Aldich G7528
HEPES Sigma Aldich H4034
Injection Mold Adaptive Science Tools TU-1
Inverted Microscope Nikon TE2000
Laminin ThermoFisher Scientific 23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss 710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red Gibco/Fisher Scientific 11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red Gibco/Fisher Scientific 21-083-027
Low melting agarose Promega V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
PBS Hyclone/Fisher Scientific SH3025601
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
Phenol Red Sigma Aldich P0290
Phenylthiourea (PTU) Sigma Aldich P7629
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments PV820
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma Aldich P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit QIAGEN 28104
Recombinant mouse slit2 R&D Systems 5444-SL-050
Sodium Pyruvate Sigma Aldich P5280
Steritop 0.22 µm filter Millipore S2GPT05RE
TE Buffer Ambion AM9860
Tricaine Methanesulfonate Sigma Aldich E10521
Vertical Pipette Puller David Kopf Instruments 700C

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