Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

न्यूरॉनल विकास के दौरान रोस लाइव सेल इमेजिंग

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62165
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

Summary

यह प्रोटोकॉल तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान एच2ओ2की शारीरिक सिग्नलिंग भूमिकाओं का आकलन करने के लिए सुसंस्कृत जेब्राफिश न्यूरॉन्स और लार्वा में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) के उपयोग का वर्णन करता है। इसे विभिन्न सेल प्रकारों पर लागू किया जा सकता है और सामान्य विकास में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक उपचारों के साथ संशोधित किया जा सकता है।

Abstract

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) अच्छी तरह से स्थापित सिग्नलिंग अणु हैं, जो सामान्य विकास, हो्योस्टेसिस और फिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण हैं। विभिन्न आरओएस में, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)सेलुलर सिग्नलिंग में भूमिकाओं के संबंध में सबसे अच्छी विशेषता है। एच2ओ 2 को कई प्रजातियों में विकास केदौरान फंसाया गया है। उदाहरण के लिए, निषेचन के बाद पहले दिनों केदौरानजेब्राफिश भ्रूण में एच 2 O2 में क्षणिक वृद्धि का पता चला है । इसकेअलावा, एक महत्वपूर्ण सेलुलर एच 2 ओ2 स्रोत, एनएडीपीएच ऑक्सीडेस (एनओएक्स) घटता है, जो विवो और इन विट्रोदोनों में रेटिना गैंगलियन कोशिकाओं (आरजीसी) के मार्गदर्शन जैसे तंत्रिका तंत्र के विकास को ख़राब करता है। यहां, हम आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एच 2 ओ2- विशिष्ट बायोसेंसर, roGFP2-Orp1 का उपयोग करके विकास के दौरान सुसंस्कृत जेब्राफिश न्यूरॉन्स और पूरे लार्वा में इमेजिंग इंट्रासेलुलर एच2ओ 2स्तरों के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। यह जांच ज़ेब्राफिश लार्वा में क्षणिक रूप से या स्थिर रूप से व्यक्त की जा सकती है। इसके अलावा, अनुपातमेट्रिक रीडआउट अंतर जीन अभिव्यक्ति या मात्रा प्रभाव के कारण कलाकृतियों का पता लगाने की संभावना कम हो जाती है। सबसे पहले, हम प्रदर्शित करते हैं कि ज़ेब्राफ़िश भ्रूण से प्राप्त आरजीसी को कैसे अलग और संस्कृति से प्राप्त किया जाए जो क्षणिक रूप से roGFP2-Orp1 व्यक्त करते हैं। फिर, हम ऊतक स्तर पर एच 2O 2के स्तर की निगरानी के लिए पूरे लार्वा का उपयोग करते हैं। सेंसर को एच2ओ2के अलावा मान्य किया गया है । इसकेअतिरिक्त, इस पद्धति का उपयोग ऊतक-विशिष्ट बायोसेंसर अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक जानवरों को उत्पन्न करके विशिष्ट कोशिका प्रकारों और ऊतकों में एच 2 ओ2 के स्तर को मापने के लिए किया जा सकता है। चूंकि जेब्राफिश आनुवंशिक और विकासात्मक जोड़तोड़ की सुविधा प्रदान करता है, इसलिए यहां प्रदर्शित दृष्टिकोण कशेरुकी में न्यूरोनल और सामान्य भ्रूणीय विकास के दौरान एच2ओ2 की भूमिका का परीक्षण करने के लिए एक पाइपलाइन के रूप में काम कर सकता है।

Introduction

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) सिग्नलिंग तंत्रिका तंत्र के विकास और कार्यप्रणाली को नियंत्रित करती है1। एक महत्वपूर्ण सेलुलर आरओएस स्रोत एनएडीपीएच ऑक्सीडेस (एनओएक्स) हैं, जो ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन हैं जो सुपरऑक्साइड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)2)उत्पन्न करते हैं। एनओएक्स एंजाइम पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में पाए जाते हैं, और एनओएक्स-व्युत्पन्न आरओ न्यूरोनलविकास3,4,5, 6में योगदानदेतेहैं। तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव और भेदभाव, न्यूरोनल ध्रुवता की स्थापना, न्यूराइट आउटग्रोथ, और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी कोआरओ7, 8, 9,10, 11के पर्याप्त स्तर की आवश्यकता होती दिखाई गईहै। दूसरी ओर, एनओएक्स द्वारा आरओएस का अनियंत्रित उत्पादन अल्जाइमर रोग, मल्टीपल स्क्लेरोसिस और दर्दनाक मस्तिष्क चोट12, 13, 14सहित न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में योगदान देता है। इसलिए, शारीरिक रूप से प्रासंगिक ROS का उत्पादन स्वस्थ परिस्थितियों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर के विकास ने सेलुलर आरओएस का पता लगाने में बहुत मदद की। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर का एक महत्वपूर्ण लाभ आरओएस सिग्नल का बढ़ा हुआ लौकिक और स्थानिक समाधान है, क्योंकि इन सेंसरों को विशेष रूप से अलग स्थानों पर लक्षित किया जा सकता है। रेडॉक्स-सेंसिटिव जीएफपी (roGFP) इस तरह के आरओएस बायोसेंसर का एक प्रकार है। roGFP2-Orp1 संस्करण विशेष रूप से अपने Orp1 डोमेन के माध्यम से एच2O2 का पता लगाता है, जो खमीर15,16से एक ग्लूटाथिएक पेरोक्सीरॉक्सिन परिवार प्रोटीन है । Orp1 प्रोटीन का ऑक्सीकरण roGFP2 को हस्तांतरित किया जाता है ताकि इसकी संरचना(चित्रा 1A)को बदल दिया जा सके। जांच में 405 एनएम और 480 एनएम के पास दो उत्तेजन चोटियों और 515 एनएम पर एक उत्सर्जन शिखर प्रदर्शित किया गया है। ऑक्सीकरण पर, उत्तेजन चोटियों के आसपास फ्लोरेसेंस तीव्रता बदलती है: जबकि 405 एनएम उत्तेजन बढ़ जाती है, 480 एनएम उत्तेजन कम हो जाती है। इस प्रकार, roGFP2-Orp1 एक अनुपातमेट्रिक बायोसेंसर है, और एच2ओ2-स्तरदो अलग-अलग तरंगदैर्ध्य(चित्रा 1 बी)पर उत्साहित फ्लोरेसेंस तीव्रता के अनुपात से पता लगाया जाता है। कुल मिलाकर, roGFP2-Orp1 रोस इमेजिंग के लिए एक बहुमुखी उपकरण है जिसका उपयोग वीवो मेंकुशलतापूर्वक किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1:रोगएफपी2-ऑर्प 1 का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और उत्तेजन स्पेक्ट्रा। (ए)ऑक्सीडेंट ट्रांसफर एच 2 ओ2 केजवाब में ऑर्प 1 और roGFP2 के बीच होता है, जिससे roGFP2 में अनुरूप परिवर्तन होते हैं। (ख)रोगएफपी2-ऑर्प1 का एक्सट्रक्टेशन स्पेक्ट्रा 405 एनएम पर दो एक्सटिटेशन चोटियों और 515 एनएम पर 480 एनएम और सिंगल एमिशन पीक को प्रदर्शित करता है। एच 2ओ2द्वारा ऑक्सीकरण पर, 405 एनएम उत्तेजन बढ़ जाता है जबकि 480 एनएम उत्तेजन कम हो जाता है। इसके परिणामस्वरूप एच 2ओ 2उपस्थिति के लिए एक अनुपातमेट्रिक रीडआउट होता है। यह आंकड़ा बिलन और बेलोसोव (२०१७)16 और मॉर्गन एट अल (२०११)25से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

दानियो रेरियो (जेब्राफिश) मॉडल सिस्टम में जेनेटिकली इनकोडेड बायोसेंसर लगाने के कई फायदे हैं। भ्रूण और लार्वा की ऑप्टिकल पारदर्शिता वीवो इमेजिंग में गैर-आक्रामक सक्षम बनाती है। उच्च संकल्प और गहरी पैठ17को प्राप्त करने के लिए नए इमेजिंग उपकरण विकसित किए जा रहे हैं । इसके अलावा, आनुवंशिक हेरफेर (एक्टोपिक एमआरएनए अभिव्यक्ति, टोल 2 ट्रांसजेनेसिस, आदि) और जीनोम संपादन (टैलेन्स, CRISPR/Cas9, आदि) के लिए स्थापित उपकरण हैं, जो ट्रांसजेनिक जानवरों की पीढ़ी को बढ़ावा देता है18। के रूप में जेब्राफिश भ्रूण मां के बाहर विकसित, इस प्रणाली को आगे आसान पहुंच और भ्रूण के हेरफेर की अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, एक सेल चरण इंजेक्शन और दवा उपचार आसानी से किया जा सकता है।

यहां, हमने जेब्राफ़िश का उपयोग वीइट्रो-लिखित एमआरएनए में इंजेक्शन देकर एच2ओ-विशिष्टबायोसेंसर roGFP2-Orp1 को स्थानांतरित करने के लिए किया। इन भ्रूणों का उपयोग सुसंस्कृत न्यूरॉन्स के विट्रो इमेजिंग और वीवो इमेजिंग(चित्रा 2)दोनों के लिए किया जा सकता है। हम जेब्राफिश भ्रूण से रेटिना गैंगलियन कोशिकाओं (आरजीसी) को विच्छेदन और चढ़ाना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसके बाद सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में एच2ओ2-स्तरोंका आकलन किया जाता है। फिर, हम कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके roGFP2-Orp1-व्यक्त भ्रूण और लार्वा के वीवो इमेजिंग में एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह दृष्टिकोण न केवल शारीरिक एच2 ओ-2-स्तरोंको निर्धारित करने की अनुमति देता है बल्कि विभिन्न विकासात्मक चरणों या स्थितियों में होने वाले संभावित परिवर्तनों को भी इंगित करता है। कुल मिलाकर, यह प्रणाली विकास, स्वास्थ्य और रोग में एच2ओ2 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए जीवित कोशिकाओं और जानवरों में एच2ओ2 का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रदान करती है।

Figure 2
चित्रा 2। प्रायोगिक दृष्टिकोण की रूपरेखा। संक्षेप में, भ्रूण संग्रह के बाद, roGFP2-Orp1 mRNA एक सेल चरण जेब्राफिश भ्रूण की जर्दी में इंजेक्शन है । विकसित भ्रूण दोनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है(ए) इन विट्रो और(बी) वीवो इमेजिंग में । (A)जीएफपी पॉजिटिव भ्रूण का उपयोग 34 एचपीएफ पर आरजीसी संग्रह के लिए रेटिना को विच्छेदन करने के लिए किया जाता है। ZFCM (+) मीडिया में पीडीएल/लैमिनिन-लेपित कवरस्लिप पर अलग-अलग आरजीसी चढ़ाया जाता है। विकास शंकु इमेजिंग आयोजित किया जा सकता है के रूप में RGCs चढ़ाना के 6-24 घंटे के बाद अपने अक्षों का विस्तार । कोशिकाओं को एच2O 2-स्तरों में संभावित परिवर्तनों को मापने के लिए विभिन्नउपचारोंके अधीन किया जा सकता है। यहां, हमने आरजीसी (लाल) के विकास शंकु मेंएच2 ओ2-स्तरों को मापा। (ख)जीएफपी पॉजिटिव भ्रूण का उपयोग वीवो इमेजिंग में किया जाता है। वांछित उम्र में, भ्रूण को एनेस्थेटाइज्ड किया जा सकता है और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए 35 मिमी ग्लास बॉटम व्यंजनों पर रखा जा सकता है। यहां, भ्रूण रेटिना इमेजिंग के लिए वेंट्रेली मुहिम शुरू की जाती है। योजनाबद्ध जेब्राफिश में रेटिना विकास दिखाता है। आरजीसी गैंगलियन सेल लेयर (जीसीएल) बनाते हैं, जो रेटिना में अंतरतम परत है। आरजीसी एक्सन्स ऑप्टिक चियाम बनाते हुए मिडलाइन को पार करने के लिए ऑप्टिक नर्व में विकसित होते हैं। फिर, आरजीसी एक्सॉन मिडब्रेन में ऑप्टिक टेक्टम में सिनेप्स बनाने के लिए पृष्ठीय रूप से बढ़ते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों की नैतिकता की समीक्षा की गई और पर्ड्यू एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (PACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था, प्रोटोकॉल के साथ NIH दिशा निर्देशों का पालन 2006002050 07/24/2020 को मंजूरी दे दी ।

1. समाधान की तैयारी

  1. E2 मीडिया (1x)
    1. तालिका 1 में दिखाए गए सभी घटकों को मिलाकर 100x E2A (500 एमएल), 500x E2B (100 एमएल) और 500x E2C (100एमएल) समाधान तैयार करें। ऑटोक्लेव E2A, E2B और E2C समाधान। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. 1x E2 मीडिया के लिए: 100x E2A के 5 एमएल, 500x E2B के 1 मिलियन और 500x E2C के 1 मिलियन एमएल को मिलाएं। बाँझ पानी के साथ 500 एमएल तक मात्रा लाएं। पीएच को 7.0-7.5 पर समायोजित करें।
    3. लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 1x E2 मीडिया स्टोर के 50 एमएल एलिकोट तैयार करें। हालांकि, विगलन पर वर्षा हो सकती है। सुनिश्चित करें कि स्टॉक समाधान का उपयोग करने से पहले वर्षा पूरी तरह से भंग हो जाती है।
विलयन घटक कुल धनराशि एकाग्रता
100X E2A (500mL)
नैक 43.8 ग्राम 1500 एमएमएम
केसीएल 1.88 ग्राम 50 एमएमएम
एमजीएसओ4 6 ग्राम 100 एमएमएम
KH2PO4 1.03 ग्राम 15 एमएमएम
Na2HPO4 0.34 ग्राम 5 एमएमएम
500X E2B (100 एमएल)
CaCl2 5.5 ग्राम 500 एमएमएम
500X E2C (100 एमएल)
नाहको3 3 ग्राम 350 एमएमएम
1X E2 (500 एमएल)
100X E2A 5 एमएल 1X
500X E2B 1 एमएल 1X
500X E2C 1 एमएल 1X

तालिका 1: जेब्राफिश सेल संस्कृति के लिए 1x E2 मीडिया के घटक।

  1. E3 मीडिया (1x)
    1. 100x स्टॉक बनाने के लिए टेबल 2 में दिखाए गए 1 एल बाँझ पानी में घटकों को भंग करें। बाँझ पानी में स्टॉक पतला करने के लिए 1x E3 मीडिया बनाते हैं ।
    2. 0.2% मेथिलीन ब्लू जोड़ें। 1x E3 मीडिया के 20 एमएल के लिए, मेथिलीन ब्लू के 40 माइक्रोन जोड़ें।
    3. फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए मेथिलीन नीले बिना एक और बैच बनाएं।
घटक राशि (जी) 100X स्टॉक (एमएम) में एकाग्रता
नैक 29.22 500
केसीएल 1.26 17
CaCl2 2H2O 4.85 33
MgSO4 7H2O 8.13 33

तालिका 2: जेब्राफिश भ्रूण को बनाए रखने के लिए 100x E3 मीडिया के घटक।

  1. 80x नमकीन स्टॉक समाधान
    1. तालिका 3 में दिखाए गए सभी घटकों को मिलाएं। 100 एमएल घोल बनाने के लिए पानी डालें। मिश्रण तब तक करें जब तक कि सभी घटक भंग न हो जाएं। समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
घटक राशि (जी) स्टॉक में एकाग्रता (एमएम)
ग्‍लूकोज़ 1.44 80
सोडियम पाइरुवेट 0.44 40
CaCl2 2H2O 0.148 10
हेपेस 6.1 256

तालिका 3: जेब्राफिश सेल कल्चर मीडिया के लिए 80x नमकीन समाधान के घटक।

  1. जेब्राफिश सेल कल्चर मीडियम (जेडएफसीएम +)
    1. 250 एमएल मीडिया बनाने के लिए टेबल 4 में दिखाए गए सभी घटकों को मिलाएं। पीएच को 7.5 पर समायोजित करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके मीडिया को फ़िल्टर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
घटक राशि (एमएल) वॉल्यूम %
एल-15 माध्यम (फिनॉल लाल के साथ) 212.75 85.1
भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 5 2
पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन 1 0.4
80X नमकीन समाधान 3.125 1.25
पानी 28.125 11.25

तालिका 4: सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ जेब्राफिश सेल संस्कृति माध्यम के घटक।

  1. इमेजिंग के लिए ज़ेब्राफ़िश सेल संस्कृति माध्यम (जेडएफसीएम-)
    1. 250 एमएल मीडिया बनाने के लिए टेबल 5 में दिखाए गए सभी घटकों को मिलाएं। पीएच को 7.5 पर समायोजित करें। 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके मीडिया फ़िल्टर करें।
    2. संदूषण को रोकने के लिए एकल उपयोग एलिकोट (50 एमएल बैच) बनाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
घटक राशि (एमएल) वॉल्यूम %
एल-15 माध्यम (कोई फिनॉल लाल) 212.75 85.1
80X नमकीन समाधान 3.125 1.25
पानी 34.125 13.65

तालिका 5: इन विट्रो इमेजिंग के लिए सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना जेब्राफिश सेल संस्कृति माध्यम के घटक।

  1. इंजेक्शन मोल्ड्स
    1. 1.5% E3 मीडिया में agarose भंग. एक 100 x 15 मिमी पेट्री डिश में agarose के ~ 25 एमएल डालो।
    2. सतह के संबंध में 45 डिग्री कोण के साथ एग्राज के शीर्ष पर मोल्ड बिछाएं, और इसे धीमी गति के साथ एग्राम पर तैरने दें। इससे बुलबुले से बचने में मदद मिलेगी। अगेस को ठंडा होने दें और बेंच टॉप पर जमें ।
    3. एक बार पूरी तरह से जम जाने के बाद, एगर उठे को तोड़ने से रोकने के लिए धीरे-धीरे मोल्ड को हटा दें। ताजा E3 मीडिया जोड़ें, फैल को रोकने के लिए पकवान के चारों ओर पैराफिन फिल्म जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3)पर स्टोर करें।

Figure 3
चित्र 3:इंजेक्शन मोल्ड छवियां। (A)प्लास्टिक मोल्ड जिसका उपयोग इंजेक्शन प्लेट बनाने के लिए किया जाता है। मोल्ड में छह रैंप, एक 90 डिग्री और एक 45 ° जगह में भ्रूण रखने के लिए beveled पक्ष है। (ख)एगरेग्लंप जम जाने और मोल्ड लगाने के बाद इंजेक्शन प्लेट को हटा दिया जाता है। स्केल बार = 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. roGFP2-Orp1 mRNA की तैयारी और इंजेक्शन

नोट: roGFP2-Orp1 निर्माण डॉ टोबीस डिक, DKFZ, जर्मनी से प्राप्त किया गया था । यह डॉ किंग देंग की लैब, पर्ड्यू विश्वविद्यालय में pCS2 + वेक्टर में उप क्लोन किया गया था । RNase द्वारा गिरावट को रोकने के लिए, कई सावधानियां बरती जानी चाहिए। RNase मुक्त अभिकर्दक और ट्यूबों हर समय इस्तेमाल किया जाना चाहिए, दस्ताने सभी चरणों के लिए पहना जाना चाहिए, और, वैकल्पिक रूप से, सामग्री और सतहों RNase हटाने के लिए एक सफाई एजेंट के साथ मिटा दिया जा सकता है ।

  1. नोटी के साथ पीसी2 +/roGFP2-Orp1 वेक्टर के 3-10 माइक्रोग्राम को रैखिक करें।
  2. एक पीसीआर सफाई किट के साथ रैखिक प्लाज्मिड शुद्ध।
  3. इन विट्रो निर्माता द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों के अनुसार इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट के साथ roGFP2-Orp1 mRNA को टाइप करें।
    1. कैप्ड ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन असेंबली
      1. बर्फ पर आरएनए पॉलीमरेज और रैखिक/शुद्ध डीएनए रखें । भंवर 10x प्रतिक्रिया बफर और 2x NTP/CAP जब तक वे समाधान में पूरी तरह से कर रहे हैं । बर्फ पर NTP/CAP स्टोर लेकिन कमरे के तापमान (आरटी) पर बफर रखने के लिए, जबकि प्रतिक्रिया कोडांतरण । संदूषण को रोकने के लिए ट्यूब खोलने से पहले सभी अभिकर् ते को टच-स्पिन करें।
      2. आरएनएज़-मुक्त 0.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में आरटी में नीचे दिए गए आदेश में आरएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया की स्थापना करें। प्रतिक्रिया की अंतिम मात्रा 20 माइक्रोल है। रिएक्शन सेटअप तालिका 6में दिखाया गया है।
      3. ट्यूब के लिए आवश्यक होने पर 10 माइक्रोल रिबोन्यूक्लियोटाइड मिक्स, 2x एनटीपी/कैप, और नाभिक मुक्त पानी जोड़ें। 2 माइक्रोन 10X रिएक्शन बफर जोड़ें। रैखिक डीएनए (6 माइक्रोन तक) के 1-1.5 माइक्रोन जोड़ें। यदि आवश्यक हो, तो 20 माइक्रोन रिएक्शन वॉल्यूम बनाने के लिए नाभिक मुक्त पानी जोड़ें।
      4. ट्यूब, भंवर संक्षेप में और टच-स्पिन माइक्रोफ्यूज बंद करें। 10x SP6 एंजाइम मिश्रण के 2 μL जोड़ें। एक माइक्रोफ्यूज में एक उंगली क्लिक और टच-स्पिन के साथ बंद करें।
      5. 2-2.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में रखें (18 घंटे तक जा सकते हैं)।
        नोट: प्रस्तुत प्रयोग में रातोंरात 16-18 घंटे इनक्यूबेशन ३७ डिग्री सेल्सियस पर सर्वश्रेष्ठ परिणाम के लिए प्रदर्शन किया गया था ।
      6. डीएनए टेम्पलेट, फिंगर क्लिक, टच स्पिन और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट को हटाने के लिए डीएनए टेम्पलेट, फिंगर क्लिक, टच स्पिन और इनक्यूबेट को हटाने के लिए डीएनएन्स का 1 माइक्रोन जोड़ें।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम (माइक्रोन) प्रतिक्रिया में राशि
2X एनटीपी/कैप 10 1X
10X रिएक्शन बफर 2 1X
टेम्पलेट डीएनए 6 तक 1-1.5 माइक्रोन
नाभिक मुक्त पानी 20 μL बनाने के लिए जोड़ें
10X SP6 एंजाइम मिश्रण 2 1X

तालिका 6: विट्रो ट्रांसक्रिप्शन में roGFP2-Orp1 mRNA के लिए रिएक्शन सेटअप।

  1. आरएनए वसूली
    1. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट में आपूर्ति की गई लिथियम क्लोराइड (एलसीएल) के 25 माइक्रोल जोड़ें। कम से कम 30 मिनट के लिए एक गैर-ठंढ फ्रीजर में -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में अधिकतम गति से 25 मिनट के लिए स्पिन। सुपरनेट को सावधानी से निकालें और त्यागें, ताकि गोली को परेशान न किया जा सके। 25 माइक्रोन ठंड 75% इथेनॉल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें।
    3. ध्यान से निकालें और सुपरनिटेंट को त्यागें। आरटी में कम से कम 5 मिनट के लिए गोली हवा सूखी चलो। अधिक सूखने न दें। नाभिक मुक्त Tris-EDTA (टीई) बफर (पीएच 7.0) के 12 μL जोड़ें और बर्फ पर नमूना रखें।
    4. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ आरएनए एकाग्रता को मापें। 0.5- 1 μg/μL आमतौर पर प्राप्त किया जाता है।
    5. फिनोल रेड सॉल्यूशन में 100 एनजी/μL mRNA (Dulbecco के फॉस्फेट-बफर खारा -DPBS) में 0.5% फिनोल लाल और एकल उपयोग (3-5 माइक्रोन) के लिए अलीकोट तैयार करें। एमआरएनए एलिकोट्स को 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  1. एमआरएनए का माइक्रोइंजेक्शन
    1. इंजेक्शन के दिन, एमआरएनए एलिकोट्स में से एक का उपयोग करें और जेब्राफिश भ्रूण इंजेक्शन प्रोटोकॉल का पालन करें ताकि उनकी जर्दी 19 के माध्यम से एक-सेल चरण भ्रूण में एमआरएनए के1एनएल इंजेक्ट किया जा सके। नीचे एक संक्षिप्त विवरण प्रदान किया गया है।
    2. वयस्क मछली नस्ल और भ्रूण इकट्ठा के रूप में पहले20वर्णित है ।
    3. पिपेट खींचने के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को खींचें। 10 माइक्रोन टिप खोलने बनाने के लिए संदंश के साथ सुइयों की नोक काटें।
    4. एक इंजेक्शन मोल्ड में भ्रूण को संरेखित करें जिसे चरण 1.6 में वर्णित किया गया था।
    5. फिनॉल रेड में एमआरएनए के 1 एनएल को ग्लास माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के साथ इंजेक्ट करें।
    6. भ्रूण ले लीजिए और उन्हें E3 मीडिया में रखें।
    7. वांछित विकास चरण प्राप्त होने तक ई 3 मीडिया में 27 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में भ्रूण रखें। इंजेक्शन भ्रूण दोनों इन विट्रो (धारा 3 और धारा 4) और वीवो इमेजिंग (धारा 5) में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। roGFP2-Orp1 व्यक्त भ्रूण पूर्व एक नियमित विच्छेदन माइक्रोस्कोप फ्लोरोसेंट प्रकाश और एक नीले/हरे फिल्टर सेट से लैस के साथ प्रयोगों से पहले चयनित किया जा सकता है ।

3. जेब्राफिश भ्रूण से प्राप्त प्राथमिक रेटिना गैंगलियन सेल संस्कृति

नोट: यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित विधि 21से अनुकूलित किया गया है । एक लैमिनार प्रवाह हुड में चरण 3.1 और 3.2 करें।

  1. कवरस्लिप की तैयारी
    1. हर प्रयोग में 4-6 कल्चर प्लेट तैयार करें। एसिड-साफ कवर्लिप्स (22 x 22 मिमी वर्ग; 0.16-0.19 मिमी मोटाई) का उपयोग करें जो 100% इथेनॉल में संग्रहीत होते हैं।
    2. संदंश का उपयोग करके भंडारण कंटेनर से एक कवरस्लिप निकालें और अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए इसे लौ करें।
    3. हवा एक ३५-मिमी संस्कृति पकवान के अंदर एक कोण पर रखकर कवरलिप पूरी तरह से सूखी ।
    4. बाँझ पानी में 10x स्टॉक (5 मिलीग्राम/एमएल) को पतला करके पॉली-डी-Lysine (पीडीएल) वर्किंग सॉल्यूशन (1x) तैयार करें।
    5. प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र में 0.5 मिलीग्राम/एमएल पीडीएल के 100 माइक्रोन लागू करें और किनारों के समाधान के प्रसार से बचें।
    6. कमरे के तापमान (आरटी) पर 20-30 मिनट के लिए कवरस्लिप पर पीडीएल को इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि पीडीएल सूख नहींता है।
    7. पीडीएल को 05 एमएल बाँझ पानी से तीन बार धोएं। प्लेटों को पूरी तरह सूखने दें।
    8. 1x पीबीएस में 50x स्टॉक (1 मिलीग्राम/एमएल) को कमजोर करके लैमिनिन वर्किंग सॉल्यूशन (1x) तैयार करें।
    9. प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र में पीबीएस में 20 माइक्रोन/एमएल लैमिनिन के 100 माइक्रोन लागू करें और किनारों के समाधान के प्रसार से बचें।
    10. 2-6 घंटे के लिए एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। लेमिनिन घोल को सुखाने से बचें।
  2. भ्रूण विच्छेदन और चढ़ाना आरजीसी
    1. चार 35-मिमी ऊतक संस्कृति व्यंजन तैयार करें और लेबल करें और 4 मिलील के साथ भरें: 70% इथेनॉल, "ई 2 मीडिया 1", "ई 2 मीडिया 2", "ई 2 मीडिया 3" विच्छेदन के दिन। विच्छेदन तक बर्तन फ्रिज में रखें।
    2. जब जेब्राफिश भ्रूण निषेचन (एचपीएफ) के बाद 34 घंटे होते हैं, तो इनक्यूबेटर से बाहर लेमिनिन के साथ लेपित संस्कृति व्यंजन लें और 1x पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ तीन बार कवरस्लिप धोएं।
    3. अंतिम धोने के बाद, प्रत्येक संस्कृति पकवान में ZFCM (+) मीडिया के 4 एमएल जोड़ें और प्लेट सुखाने से बचें।
    4. चरण 3.2.1 से तैयार संस्कृति व्यंजनों को पुनः प्राप्त करें। उन्हें आरटी के लिए बराबरी करते हैं ।
    5. ZFCM (+) मीडिया के 15 माइक्रोन के साथ 4-6 पीसीआर ट्यूब भरें। एक ट्यूब 4 आंखों से RGCs तैयार करने के लिए एक कवरस्लिप पर चढ़ाया जा करने की जरूरत है ।
    6. इनक्यूबेटर से जेब्राफिश भ्रूण को पुनः प्राप्त करें और 35 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान में भ्रूण विसर्जित करें जिसमें 5-10 एस के लिए 70% इथेनॉल होता है।
    7. एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, अतिरिक्त इथेनॉल धोने के लिए बाँझ E2 मीडिया युक्त E2 मीडिया 1 डिश के लिए भ्रूण हस्तांतरण।
    8. E2 मीडिया 2 डिश के लिए भ्रूण हस्तांतरण और तेज संदंश के साथ उनके chorions हटा दें ।
    9. विच्छेदन करने के लिए अंतिम E2 मीडिया 3 पकवान के लिए भ्रूण हस्तांतरण।
    10. ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, रेटिना को काटना जैसा कि पहले 22वर्णित है।
    11. एक संदंश के साथ उनकी जर्दी में भ्रूण को रखें और अन्य संदंश के साथ जर्दी थैली के पीछे पूंछ को हटा दें।
    12. संदंश के साथ गर्दन पकड़ो और E2 मीडिया के लिए मस्तिष्क और आंखों का पर्दाफाश करने के लिए सिर से दूर ले। जर्दी थैली काटने से बचें।
    13. ठीक संदंश की नोक के साथ, धीरे से आंखों को सिर से बंद करें, जबकि कपाल ऊतक को दूसरे संदंश के साथ नीचे रखें। आंखों को बगल के ऊतक मलबे से अलग रखें।
    14. ZFCM (+) युक्त पहले से तैयार ट्यूबों में से एक के लिए चार आंखें स्थानांतरित करें ।
    15. धीरे-धीरे ऊपर और नीचे P20 पिपेट और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 45 बार के बारे में एक पीले टिप के साथ नीचे। किसी भी हवा के बुलबुले से बचें।
    16. ZFCM (+) को अलग कोशिकाओं के साथ कवरस्लिप के केंद्र में स्थानांतरित करें। अतिरिक्त कवर्लिप्स के लिए 10-12 चरण दोहराएं।
    17. कंपन को अवशोषित करने के लिए पॉलीस्टीरिन फोम रैक पर 22 डिग्री सेल्सियस पर बेंचटॉप पर संस्कृतियों को बनाए रखें।
    18. चढ़ाना के बाद इमेजिंग 6-24 घंटे प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: विभिन्न संस्कृति व्यंजनों में भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें। इथेनॉल (चरण 6-8) पर ले जाने से रोकने के लिए प्रत्येक समाधान के लिए पिपेट बदलें।

4. सुसंस्कृत आरजीसी न्यूरॉन्स के इन विट्रो रोस इमेजिंग

  1. इमेजिंग के दिन (आमतौर पर सेल प्लेटिंग के बाद 6-24 घंटे), आरजीसी एक्सॉन के विकास को मान्य करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जांच करें।
  2. लाइव-सेल इमेजिंग के लिए, कल्चर डिश से एक लाइव सेल इमेजिंग चैंबर में कवरस्लिप ट्रांसफर करें। इस मामले में एक कस्टम निर्मित खुला कक्ष है, जो पहले वर्णित किया गया है23इस्तेमाल किया गया था ।
  3. इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें। अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) उद्देश्य, OG590 लंबे समय से पास लाल फिल्टर, और एक ईएम-सीसीडी कैमरे से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  4. इमेजिंग से पहले, जेडएफसीएम (+) माध्यम को जेडएफसीएम (-) के साथ बदलें।
  5. एक बार कोशिकाओं को 10x उद्देश्य के साथ तैनात कर रहे हैं, एक उच्च एनए तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर 60x आवर्धन पर छवियों का अधिग्रहण । अतिरिक्त 1.5x आवर्धन का उपयोग करें।
  6. सबसे पहले, डीआईसी छवियों को प्राप्त करें। फिर, एक उपयुक्त फ़िल्टर सेट का उपयोग करके छवि roGFP2-Orp1। 405/20 और 480/30 एनएम उत्तेजन फिल्टर के साथ उत्तेजित roGFP2-Orp1 क्रमिक रूप से और उत्सर्जन प्रकाश के बाद 535/30 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ छवियों को प्राप्त करने के बाद dichroic दर्पण 505DCXR पारित कर दिया है ।
  7. छवियों का पहला सेट लेने के बाद, विभिन्न उपचार समाधानों वाले मीडिया के साथ मीडिया का आदान-प्रदान करें। मीडिया को पीएच और ऑस्मोलैरिटी परिवर्तन से बचने के लिए इमेजिंग के हर 30 मिनट में बदला जाना चाहिए।

5. भ्रूण के विकास के वीवो रोस इमेजिंग में

  1. वीवो इमेजिंग में के लिए, 22-24 एचपीएफ से मेथिलीन ब्लू के बिना 0.003% फिनाइलथिओरिया (पीटीयू) वाले ई 3 मीडिया में भ्रूण रखें। मीडिया का आदान-प्रदान करें और दैनिक आधार पर मृत भ्रूण को हटा दें।
  2. वांछित उम्र में, 0.016% ट्राइकेन में भ्रूण को एनेस्थेटाइज करें। 1% कम पिघलने वाले एग्रेमिंग में माउंट एनेस्थेटाइज्ड भ्रूण 35-मिमी ग्लास बॉटम कल्चर व्यंजन पर उठे। इमेजिंग के लिए ब्याज के क्षेत्र के आधार पर भ्रूण को पृष्ठीय, वेंट्रेल या पार्श्व रूप से उन्मुख किया जा सकता है।
  3. अगर उठे जमने के बाद, मेथिलीन ब्लू/0.016% ट्राइकेन के बिना E3 मीडिया के साथ व्यंजन भरें।
  4. इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें। उल्टे लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करें। वैकल्पिक रूप से, एक सीधे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें जो एक एगरेज़ ड्रॉप के शीर्ष पर चढ़कर छवि भ्रूण के लिए पानी विसर्जन लेंस से लैस है।
  5. 405 एनएम और 488 एनएम उत्तेजन फिल्टर के साथ roGFP2-Orp1 क्रमिक रूप से और 515-535 एनएम की सीमा में उत्सर्जन फिल्टर के साथ इसी छवियों को प्राप्त करते हैं।
  6. भ्रूण के वांछित भाग के माध्यम से 5 माइक्रोन अनुभाग मोटाई के साथ जेड-स्टैक प्राप्त करें। भ्रूण विकास के बाद के चरणों में इमेजिंग के लिए रखा जा सकता है।
  7. इमेजिंग के बाद, ठीक संदंश के साथ agarose से भ्रूण को हटा दें और पीटीयू के साथ मेथिलीन ब्लू-फ्री मीडिया में वांछित उम्र तक इनक्यूबेटर में रखें।

6. छवि विश्लेषण और प्रसंस्करण

  1. 405/480अनुपात मूल्यों के आधार पर एच 2 O2 स्तरों का मापन
    1. छवि विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग यहां छवि विश्लेषण और प्रसंस्करण के लिए किया गया था।
    2. ओपन डीआईसी, 405/535 और ImageJ सॉफ्टवेयर में 480/535 छवियों या तो फ़ाइलों को खींचकर या फ़ाइल | पर क्लिक करके खुला। यदि पहले से नहीं किया गया है, तो इमेज | पर क्लिक करके छवियों को 32-बिट में परिवर्तित करें | टाइप करें ३२-बिट।
    3. नियंत्रण पट्टी (सेल बॉडी, ग्रोथ कोन, रेटिना, आदि) से मुक्त हाथ उपकरण के साथ ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) को परिभाषित करें। विश्लेषण | पर क्लिक करके आरओआई प्रबंधक खोलें उपकरण | आरओआई मैनेजर। परिभाषित आरओआई जोड़ने के लिए आरओआई मैनेजर टैब में जोड़ें क्लिक करें।
    4. आरओआई के करीब एक क्षेत्र ड्रा और पृष्ठभूमि रॉय के रूप में जोड़ें। आरओआई का चयन करके औसत पृष्ठभूमि मूल्यों को मापें और आरओआई प्रबंधक टैब से उपाय पर क्लिक करें।
    5. माप से औसत तीव्रता मानों पर ध्यान दें। प्रक्रिया | पर क्लिक करके फ्लोरोसेंट छवियों से औसत पृष्ठभूमि के मूल्य को घटाना गणित | घटाना। दोनों 405/535 और 480/535 छवियों के लिए इस कदम को अंजाम ।
    6. प्रक्रिया | पर क्लिक करके "0" मूल्यों को खत्म करने के लिए 480/535 फ्लोरोसेंट छवि के लिए "1" का मूल्य जोड़ें गणित | अनुपात गणना से पहले फ़ंक्शन जोड़ें।
    7. क्लिक प्रक्रिया | इमेज कैलकुलेटर | इमेजजे में फ़ंक्शन को 480/535 इमेज पिक्सेल-बाय-पिक्सल द्वारा विभाजित करने के लिए विभाजित करें। 480/535 छवि द्वारा विभाजित होने के लिए 405/535 छवि का चयन करें । 32-बिट आउटपुट इमेज चुनें।
    8. आरओआई को पहले रेशियो इमेज पर क्लिक करके रेशियो इमेज पर लागू करें और फिर आरओआई मैनेजर टैब में आरओआई।
    9. आरओआई प्रबंधक टैब में उपाय पर क्लिक करके 480/535 छवि के लिए 405/535 छवि के औसत अनुपात मूल्यों को मापने ।
    10. उचित सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए जितना संभव हो उतने नमूनों के लिए कदम 6.1.2-6.1.9 करें।
  2. अनुपात छवि प्रदर्शित करना
    नोट: यह प्रक्रिया नमूने के बाहर पृष्ठभूमि को घटाना और छवि पर एक रंग लुक-अप टेबल लागू करना है।
    1. एक बार चरण 6.1.7 में ImageJ में अनुपात छवि बनाई गई है, तो फ़ाइल | पर क्लिक करके 32-बिट काली छवि बनाएं नई | छवि।
    2. आरओआई लागू करें आप पहले नई इमेज पर क्लिक करके नई इमेज के लिए एच2ओ2 लेवल प्रदर्शित करना चाहते हैं और फिर आरओआई मैनेजर टैब से आरओआई।
    3. एडिट | पर क्लिक करके एक मास्क बनाएं चयन | मास्क बनाएं।
    4. "1" और पृष्ठभूमि मूल्यों के लिए आरओआई मूल्य को समायोजित करने के लिए मुखौटा छवि को 255 से विभाजित करें "0" होगा। क्लिक प्रक्रिया | गणित | फूट डालो और टाइप 255।
    5. प्रोसेस | पर क्लिक करके अनुपात छवि के साथ मुखौटा गुणा करें इमेज कैलकुलेटर | गुणा समारोह। इसके परिणामस्वरूप ग्रे-स्केल अनुपात छवि केवल आरओआई दिखाई देगी।
    6. इमेज | पर क्लिक करके टेबल को "फायर" में बदलें टेबल | देखो आग।
      नोट: प्रक्रिया | पर क्लिक करके अनुपात के बेहतर दृश्य के लिए सभी छवियों पर एक गुणा कारक लागू किया जा सकता | इमेज | गुणाकरें ।
    7. इमेज | पर क्लिक करके अनुपात छवि को 8-बिट में परिवर्तित करें | टाइप करें 8-बिट।
    8. विश्लेषण | पर क्लिक करके अंशांकन बार जोड़ें उपकरण | अंशांकन बार।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सुसंस्कृत जेब्राफिश आरजीसी 1डी के भीतर एक्सॉन का विस्तार करते हैं। एच2ओ -बायोसेंसर की एक प्रतिनिधि 405/480 अनुपात छवि चित्र 4एमें दिखाई गई है । कोशिका शरीर, अक्षतंश, और विकास शंकु व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। इन न्यूरॉन्स एच 2 O2परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए समय के साथ विभिन्न उपचार के अधीन किया जासकता है। हमने पहले पाया कि संस्कृति मीडिया में 100 माइक्रोन एच2ओ2 जोड़ने से अनुपात मूल्य बढ़ जाता है, जिससे यह दर्शाया जा सकता है कि इस प्रणाली(चित्रा 4) 24के साथ वास्तविक समय में परिवर्तन का पता लगाया जा सकता है।

Figure 4
चित्रा 4:h2O2 roGFP2-Orp1 के साथ सुसंस्कृत जेब्राफिश आरजीसी में इमेजिंग । (A)प्रतिनिधि 405/480 एनएम अनुपात 34 एचपीएफ पुराने जेब्राफिश भ्रूण से सुसंस्कृत आरजीसी न्यूरॉन्स की छवियां । बाईं ओर न्यूरॉन सीरम मुक्त नियंत्रण माध्यम के साथ इलाज किया गया था और दाईं ओर न्यूरॉन 30 मिनट के लिए १०० μM एच2O2 के साथ इलाज किया गया । स्केल बार = 10 माइक्रोन.(बी)बार रेखांकन जंगली प्रकार जेब्राफिश आरजीसी विकास शंकु में औसत एच2O2 के स्तर को दिखाते हुए या तो नियंत्रण या 100 माइक्रोन एच2ओ2के साथ उपचार से पहले और बाद में शंकु। उपचार को नियंत्रित करने के लिए डेटा को सामान्य किया गया। डेटा एसईएम ± मतलब दिखाया गया है । प्रत्येक समूह के लिए कोष्ठक में विकास शंकु की संख्या दिखाई जाती है । दो पूंछ वाले विलकॉक्सन मिलान-जोड़े रैंक परीक्षण पर हस्ताक्षर किए; **p = 0.0009। यह आंकड़ा हमारे पिछले प्रकाशन24से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एच2O2 के स्तर को पूरे जेब्राफिश भ्रूण(चित्रा 5)में भी निर्धारित किया जा सकता है। चूंकि एमआरएनए को एक-सेल चरण के दौरान इंजेक्ट किया जाता है, इसलिए सभी ऊतक roGFP2-Orp1 बायोसेंसर व्यक्त करते हैं। चित्रा 5Aमें, हम दो अलग-अलग समय बिंदुओं पर जेब्राफिश लार्वा के प्रमुख क्षेत्र को दिखाते हैं, जो एक उदाहरण के रूप में रेटिना में एच2ओ2 के स्तर पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हमने पहले दिखाया है कि एच2ओ2 के अलावा वास्तविक समय में अनुपात मूल्यों को बढ़ाता है, जबकि कम करने वाले एजेंट डीटीटी के अलावा वीवो24में इस प्रभाव को उलट देता है। यहां हमने इसी जेब्राफिश भ्रूण में एच2ओ 2 के बेसल लेवल को2 डीपीएफ और 5 डीपीएफ में मापा । 2 डीपीएफ पर, अनुपात मान 5 डीपीएफ (पी<0.0001 की तुलना में काफी कम थे; चित्रा 5B)। इसके अलावा, प्रत्येक जानवर ने अपने रेटिना एच 2 ओ2सामग्री(चित्रा 5C)में वृद्धि का एक अलग स्तर दिखाया।

Figure 5
चित्रा 5: वीवो एच 2 ओ2इमेजिंग में रोगएफपी2-ऑर्प 1 के साथ जेब्राफिश लार्वा में। (A)डीआईसी और 405/480 एनएम अनुपात 2 और 5 डीपीएफ जेब्राफिश लार्वा की छवियां । आरओआई को अनुपात मूल्यों को मापने के लिए रेटिना (पीली रेखाएं) के रूप में परिभाषित किया गया है। इसी लार्वा का विश्लेषण 2 और 5 डीपीएफ में किया गया। स्केल बार = 50 माइक्रोन.(ख)2और5 डीपीएफ जेब्राफिश के रेटिना में औसत एच 2 ओ 2 स्तरों का मापन। 5 डीपीएफ पर, एच 2 ओ2- रेटिना में2डीपीएफ की तुलना में काफी बढ़ जाता है। (ग)अलग-अलग मछलियों के माप का रेखा ग्राफ। प्रत्येक जानवर अपने रेटिना में एच 2 ओ2-स्तरों में2से 5 डीपीएफ तक की वृद्धि प्रदर्शित करता है। डेटा को एसईएम ± मतलब के रूप में दिखाया गया है। प्रत्येक समूह के लिए कोष्ठक में विश्लेषण किए गए लार्वा की संख्या दिखाई जाती है। दो पूंछ वाले विलकॉक्सन मिलान-जोड़े रैंक परीक्षण पर हस्ताक्षर किए, ****p<0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन पर ध्यान देने की आवश्यकता है। हमारा मानना है कि इन बिंदुओं पर विचार करने से प्रायोगिक प्रवाह में सुधार होगा । प्राथमिक आरजीसी संस्कृति के लिए, ZFCM (-) की बंध्याकरण बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि इस संस्कृति मीडिया में एंटीबायोटिक्स नहीं होते हैं और संदूषण इमेजिंग से पहले या उसके दौरान हो सकता है। इससे बचने के लिए, हम केवल जैवसेफ्टी कैबिनेट के अंदर ZFCM (-) का उपयोग करने और नियमित रूप से नए ZFCM (-) मीडिया बनाने की सलाह देते हैं (चरण 1.5)। इसके अलावा लैमिनिन स्टॉक्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखना चाहिए। गल्ड लैमिनिन को हर समय 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए। कमरे के तापमान पर लैमिनिन समाधान न रखें या फिर से फ्रीज न करें, क्योंकि यह प्रोटीन की गतिविधि को बढ़ावा देने वाले न्यूराइट आउटग्रोथ को कम करता है।

उचित समय पर जेब्राफिश रेटिना विच्छेदन पर्याप्त आरजीसी है कि अक्षतं का विस्तार उपज के लिए महत्वपूर्ण है। जेब्राफिश आरजीसी का जन्म 28 एचपीएफ में होता है और 32-36 एचपीएफ से शुरू होने वाले रेटिना से बाहर एक्सॉन का विस्तार होता है। इसलिए, आरजीएफसी को 28 एचपीएफ के बाद प्लेट करना महत्वपूर्ण है, अधिमानतः 32-36 एचपीएफ के बीच, आरजीसी के पूर्ण विभेदन के लिए अनुमति देने के लिए । पहले के समय बिंदुओं पर तैयार संस्कृतियों पर्याप्त आरजीसी उपज नहीं हो सकता है या आरजीसी निकलेगा जो चढ़ाना के बाद 24 घंटे के भीतर अक्षतंमास का विस्तार नहीं कर सकता है । 30 मिनट से अधिक के लिए इमेजिंग करते समय ZFCM (-) मीडिया को बदलने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। चूंकि इस मीडिया में फिनोल लाल का अभाव है, पीएच परिवर्तन दिखाई नहीं दे रहे हैं और इस पर विचार करने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रक्रिया (चरण 4.7) के दौरान न्यूरॉन्स को विस्थापित करने से बचने के लिए मीडिया का आदान-प्रदान करें।

अंत में, पीटीयू के साथ E3 के लिए मीडिया को बदलने लेकिन मेथिलीन नीले बिना 24 एचपीएफ द्वारा आवश्यक है । पीटीयू वीवो फ्लोरेसेंस इमेजिंग में आवश्यक लार्वा पारदर्शिता के लिए पिगमेंटेशन को रोकता है; हालांकि, पीटीयू के साथ पहले उपचार विकास दोष26पैदा कर सकता है . मेथिलीन ब्लू को ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने के लिए E3 मीडिया से हटा दिया जाता है, जो मुख्य रूप से जर्दी (चरण 5.1) से उत्पन्न होता है।

यह विधि एच 2ओ2के साइटोप्लाज्मिक डिटेक्शन की अनुमति देती है। हालांकि, एच2ओ2 का उपकोशिकीय विभाजन स्थानीय सिग्नलिंग में योगदान देता है, और साइटोप्लाज्मिक एच2ओ2-स्तर एच2ओ2की विशिष्ट सिग्नलिंग भूमिकाओं के बारे में पर्याप्त जानकारी प्रदान नहीं कर सकते हैं। चूंकि roGFP2-Orp1 एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर है, इसलिए इसे ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति (जैसे, न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स, ग्लियल कोशिकाओं, आदि) या विशिष्ट उपकोशिकीय स्थानों (जैसे, प्लाज्मा झिल्ली, माइटोकॉन्ड्रिया, नाभिक आदि) के लिए लक्षित किया जा सकता है। चूंकि roGFP2-Orp1 एक जीएफपी-आधारित बायोसेंसर है, अन्य फ्लोरोसेंट जांच के साथ संयोजन हरे स्पेक्ट्रम के बाहर उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य तक सीमित है। चूंकि जीएफपी का व्यापक रूप से ट्रांसजेनेसिस मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है, इसलिए जीएफपी-आधारित बायोसेंसर का उपयोग सीमित किया जा सकता है। इस चुनौती से निपटने के लिए, एच 2ओ2-डिटेक्शनके लिए लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन हाल ही में27विकसित किए गए हैं । इसके अलावा, roGFP2-Orp1 क्षणिक यहां प्रस्तुत विधि में व्यक्त की है । इसलिए, एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति समय के साथ क्षय हो जाएगी। हम अभी भी 5 डीपीएफ लार्वा में संकेत का पता लगाने में सक्षम थे; हालांकि, ट्रांसजेनिक मछली लाइनों को पूरे विकास और वयस्कता में बायोसेंसर की स्थिर अभिव्यक्ति के लिए स्थापित करने की आवश्यकता है।

इंट्रासेलुलर आरओएस (जैसे, एच2डीसीएफ-डीए), या विशेष रूप से, एच 2 ओ2(पीएफ 6-एएम)28,29 का पता लगाने के लिए कई डाई-आधारित परख उपलब्ध हैं। इस तरह के roGFP2-Orp1 के रूप में एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर का उपयोग करना, डाई आधारित तरीकों पर कई फायदे हैं । सबसे पहले, यह रिवर्सिबिलिटी के साथ-साथ विशिष्ट उपकोशिकीय स्थानों पर ऑक्सीडेटिव स्थिति में दोनों क्षणिक परिवर्तनों का पता लगाने की अनुमति देता है। इसलिए, गतिशील परिवर्तनों को उच्च स्तर के स्थानिक संकल्प30के साथ अच्छी तरह से निगरानी की जाती है। दूसरा, यह आम तौर पर डाई अणुओं की तुलना में कोशिकाओं या ऊतकों के लिए कम विषाक्तता प्रदर्शित करता है । अंत में, विशिष्ट प्रयोगों की जरूरतों को पूरा करने के लिए बायोसेंसर को आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है31. roGFP2-Orp1 एक रेशियोमेट्रिक बायोसेंसर है, क्योंकि इसमें दो उत्तेजन और एक उत्सर्जन चोटी है। एच2O2के साथ बातचीत पर, 405 एनएम उत्तेजन बढ़ जाती है, और 480 एनएम उत्तेजन कम हो जाती है। इसलिए, रीडआउट क्रमशः 405 और 480 एनएम उत्तेजन द्वारा प्राप्त तीव्रता मूल्यों का अनुपात है। क्योंकि यह जांच अनुपातमेट्रिक है, एक दूसरी जांच के आवेदन संभावित मात्रा प्रभाव के लिए सही करने के लिए अनावश्यक हो जाता है । इसके अलावा, चूंकि इस जांच में केवल एक पॉलीपेप्टाइड की अभिव्यक्ति शामिल है, इसलिए यह एक से अधिक प्रोटीन की अंतर अभिव्यक्ति की संभावित समस्याओं से पीड़ित नहीं है, जैसे कि इंटरमॉलिकुलर फ्लोरेसेंस रेसेंस एनर्जी ट्रांसफर (FRET) के मामले में।

roGFP2-Orp1 ROS उत्पादन और संकेत का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखीएच2 O2 जांच है । जीवित कोशिकाओं में, यह जांच 4.8 (ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में लगभग 4)15,32की गतिशील सीमा प्रदर्शित करती है। हालांकि, roGFP2-Orp1 की रेडॉक्स स्थिति अंतर्जात थिओरडोक्सिन और ग्लूटारेडोक्सिन सिस्टम द्वारा परिवर्तन के अधीन है; इसलिए, ऑर्प 1 को एक और खमीर पेरोक्सिरडॉक्सिन, Tsa233, 34के साथ बदलकर अधिक संवेदनशील जांच विकसित की गई थी। जबकि roGFP2-Orp1 जेब्राफिश भ्रूण में एच2O2 में परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपयोगी है, संवेदनशीलता ज्यादातर बहिर्जात रूप से लागू एच 2 O24,31,या शक्तिशाली उत्तेजनाओं की उच्च सांद्रता तक ही सीमित है। उदाहरण के लिए, slit2 उपचार जंगली प्रकार आरजीसी में roGFP2-Orp1 संकेत में वृद्धि हुई है, लेकिन Nox2 उत्परिवर्ती आरजीसी35में नहीं। दूसरी ओर, वाइल्डटाइप औरनोक्स 2उत्परिवर्ती आरजीसी और 2 डीपीएफ भ्रूण24, 35के बीच बेसल एच 2 ओ2 केस्तर में कोई अंतर नहीं था। इसलिए, एच 2ओ2में बेसल स्तर या छोटे परिवर्तनों का पता लगाने के लिए, उच्च संवेदनशीलता जांच की आवश्यकता होगी।

हाइपर एक और व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला आनुवंशिक रूप से इनकोडेड और अनुपातमेट्रिक एच2ओ2- विशिष्ट बायोसेंसर36है। दोनों जांचों की संवेदनशीलता समान है; हालांकि, roGFP2-Orp1 एच 2 O2परिवर्तन15के लिए धीमी जवाबदेही का प्रदर्शन किया । इसलिए, वास्तविक समय में परिवर्तनों का सटीक पता लगाने के लिए roGFP2-Orp1 के बजाय HyPer की आवश्यकता हो सकती है। जबकि प्रारंभिक हाइपर संस्करण पीएच परिवर्तनों से प्रभावित होते हैं, roGFP2-Orp116,36नहीं है। इसलिए, हाइपर37का उपयोग करते समय पीएच नियंत्रण जांच (SypHer3s) को शामिल करना महत्वपूर्ण है। सबसे हाल ही में HyPer जांच, HyPer7, मौजूदा एच 2 O2जांच की कमियों के कई ओवरआया: HyPer7 एक उच्च पीएचस्थिरता, वृद्धि हुई चमक, तेजी से गतिज और उच्च गतिशील रेंज३८है । इसके अलावा, HyPer7 को विट्रो और वीवोदोनों में मान्य किया जाता है, जिसमें उपकोशिकीय विभाजन और निगरानी वास्तविक समय एच2ओ 2 घाव भरनेके दौरान जेब्राफिश भ्रूण में परिवर्तन38को दिखाया गया है।

यहां प्रस्तुत पद्धति का विस्तार किया जा सकता है ताकि आईट्रो और वीवोदोनों में संकेत देने वाले आरओएस की भूमिका का अध्ययन किया जा सके । roGFP2-Orp1 व्यक्त न्यूरॉन्स एच2O2 सिग्नलिंग पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विभिन्न उपचार के अधीन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमने दिखाया कि आरजीसी वास्तविक समय(चित्रा 4)में एच2ओ2 के स्तर में परिवर्तन का जवाब देते हैं, जिससे यह सुझाव दिया जाता है कि बायोसेंसर एच2ओ2में तत्काल परिवर्तन का पता लगा सकता है। हालांकि, पूर्ण इंट्रासेलुलर एच2ओ2 सांद्रता का निर्धारण करने के लिए सिस्टम के व्यापक अंशांकन की आवश्यकता होगी। बायोसेंसर की डिटेक्शन लिमिट भी अस्पष्ट है । इसके अतिरिक्त, सेल में बायोसेंसर का विस्तृत स्थानिक वितरण पूरी तरह से ज्ञात नहीं है, जो परिणामों की व्याख्या में हस्तक्षेप कर सकता है। इसके अलावा, roGFP2-Orp1 से सटीक स्थान संकेत का निर्धारण पता चलता है कि क्या साइट विशिष्ट एच2O2 उत्पादन है कि स्थानीयकृत इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग में योगदान देता है ।

roGFP2-Orp1 व्यक्त ट्रांसजेनिक मछली बनाने के कई फायदे हैं। बायोसेंसर को सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किया जा सकता है, या जेब्राफिश39में टोल2 ट्रांसजेनेसिस का उपयोग करके सेल-विशिष्ट एच2ओ2 सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए ऊतक-विशिष्ट प्रमोटर के तहत। विकास में एच2ओ2 की भूमिका का अध्ययन बायोसेंसर की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति द्वारा किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफिश भ्रूण की निगरानी की जा सकती है ताकि एच2ओ2 के स्तर में परिवर्तन का आकलन किया जा सके और ये परिवर्तन विभिन्न विकासात्मक चरणों में कैसे योगदान देते हैं । दूसरी ओर, roGFP2-Orp1 के ऊतकों विशिष्ट अभिव्यक्ति कोशिकाओं या ब्याज के ऊतकों में एच2O2 उत्पादन के प्रभाव पर केंद्रित है । ऊतक या सेल-विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग विशिष्ट कोशिकाओं में roGFP2-Orp1 की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, Gal4/UAS प्रणाली व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की विरल लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसलिए, यह दृष्टिकोण वीवो मेंसेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर एच2ओ2 के स्तर का पता लगाने की अनुमति देता है। अंत में, स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है जिसमें जेब्राफिश भ्रूण में आरओएस सिग्नलिंग और ऑक्सीडेटिव तनाव शामिल है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ (ग्रांट R01NS117701), नेशनल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट ११४६९४४-आईओएस), इंडियाना ट्रॉमेटिक स्पाइनल कॉर्ड एंड ब्रेन इंजरी रिसर्च फंड (ग्रांट 20000289), पर्ड्यू रिसर्च फाउंडेशन (ग्रांट 209911) और पर्ड्यू यूनिवर्सिटी (ग्रांट 210362) में रिसर्च एंड पार्टनरशिप के लिए एग्जीक्यूटिव वाइस प्रेसिडेंट का ऑफिस ने सपोर्ट किया । हम जेब्राफिश आरजीसी कल्चर प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए डॉ कोरी जे वीवर और हेली रोडर को धन्यवाद देते हैं । हम चित्रा 4 का डेटा उपलब्ध कराने के लिए इसके अतिरिक्त हेली रोडर को धन्यवाद देते हैं । हम आरजीसी संस्कृति के साथ मदद के लिए लिआ बायसी और केनी गुयेन को धन्यवाद देते हैं। हम पाठ संपादन के लिए गेंट्री ली का शुक्रिया अदा करते हैं । हम रोगFP2-Orp1 और डॉ किंग देंग को pCS2+ वेक्टर के लिए roGFP2-Orp1 प्रदान करने के लिए डॉ टोबीस डिक को धन्यवाद देते हैं। चित्रा 2 Biorender.com के साथ बनाया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35-mm culture dish Sarstedt 83-3900
35-mm glass bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes Sutter/Fisher Scientific NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Cover glass Corning 2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) VWR 25384-094
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 26140087
Glucose Sigma Aldich G7528
HEPES Sigma Aldich H4034
Injection Mold Adaptive Science Tools TU-1
Inverted Microscope Nikon TE2000
Laminin ThermoFisher Scientific 23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss 710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red Gibco/Fisher Scientific 11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red Gibco/Fisher Scientific 21-083-027
Low melting agarose Promega V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
PBS Hyclone/Fisher Scientific SH3025601
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
Phenol Red Sigma Aldich P0290
Phenylthiourea (PTU) Sigma Aldich P7629
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments PV820
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma Aldich P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit QIAGEN 28104
Recombinant mouse slit2 R&D Systems 5444-SL-050
Sodium Pyruvate Sigma Aldich P5280
Steritop 0.22 µm filter Millipore S2GPT05RE
TE Buffer Ambion AM9860
Tricaine Methanesulfonate Sigma Aldich E10521
Vertical Pipette Puller David Kopf Instruments 700C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
  2. Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
  3. Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development. Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).
  4. Terzi, A., Suter, D. M. The role of NADPH oxidases in neuronal development. Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).
  5. Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).
  6. Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum. Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).
  7. Le Belle, J. E., et al. Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
  8. Nayernia, Z., et al. Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC. Redox Biology. 13, 82-93 (2017).
  9. Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture. Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).
  10. Munnamalai, V., et al. Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones. Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).
  11. Kishida, K. T., et al. Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease. Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).
  12. Ravelli, K. G., et al. Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis. Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).
  13. Park, L., et al. Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).
  14. Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence. Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).
  15. Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
  16. Bilan, D. S., Belousov, V. V. New tools for redox biology: from imaging to manipulation. Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).
  17. Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology. Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).
  18. Sassen, W. A., Koster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).
  19. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  20. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  21. Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).
  22. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).
  23. Suter, D. M. Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro. Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).
  24. Weaver, C. J., et al. nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity. Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).
  25. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).
  26. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).
  27. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
  28. Oparka, M., et al. Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer. Methods. 109, 3-11 (2016).
  29. Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain. Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).
  30. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).
  31. Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
  32. Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues. Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).
  33. Breus, O., Dickmeis, T. Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration. Biological Chemistry. , (2020).
  34. Morgan, B., et al. Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes. Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).
  35. Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Bilan, D. S., Belousov, V. V. HyPer family probes: State of the art. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).
  37. Ermankova, Y. G., et al. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range. Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).
  38. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  39. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).

Tags

न्यूरोसाइंस अंक 168 आरओएस हाइड्रोजन पेरोक्साइड रोगएफपी2-ऑर्प 1 बायोसेंसर आरजीसी जेब्राफिश न्यूरोनल विकास
न्यूरॉनल विकास के दौरान रोस लाइव सेल इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. … More

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development. J. Vis. Exp. (168), e62165, doi:10.3791/62165 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter