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Neuroscience

Imaging cellulare vivo ROS durante lo sviluppo neuronale

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62165
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

Summary

Questo protocollo descrive l'uso di un perossido di idrogeno geneticamente codificato (H2O2)biosensore nei neuroni e nelle larve di zebrafish coltivati per valutare i ruoli fisiologici di segnalazione di H2O2 durante lo sviluppo del sistema nervoso. Può essere applicato a diversi tipi di cellule e modificato con trattamenti sperimentali per studiare specie reattive dell'ossigeno (ROS) in generale sviluppo.

Abstract

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole di segnalazione ben consolidate, che sono importanti nello sviluppo normale, nell'omeostasi e nella fisiologia. Tra i diversi ROS, il perossido di idrogeno (H2O2) è meglio caratterizzato rispetto ai ruoli nella segnalazione cellulare. H2O2 è stato implicato durante lo sviluppo in diverse specie. Ad esempio, un aumento transitorio di H2O2 è stato rilevato negli embrioni di zebrafish durante i primi giorni successivi alla fecondazione. Inoltre, l'esaurimento di un'importante sorgente cellulare H2O2, la NADPH ossidasi (NOX), compromette lo sviluppo del sistema nervoso come la differenziazione, la crescita assonale e la guida delle cellule gangliari retiniche (GRGC) sia in vivo che in vitro. Qui descriviamo un metodo per l'imaging dei livelli intracellulari H2O2 nei neuroni zebrafish coltivati e nelle larve intere durante lo sviluppo utilizzando il biosensore specifico di H2O2geneticamente codificato, roGFP2-Orp1. Questa sonda può essere espressa transitoriamente o stabilmente nelle larve di zebrafish. Inoltre, la lettura ratiometrica riduce la probabilità di rilevare artefatti dovuti all'espressione genica differenziale o agli effetti di volume. In primo luogo, dimostriamo come isolare e coltura le RGC derivate da embrioni di zebrafish che esprimono transitoriamente roGFP2-Orp1. Quindi, usiamo larve intere per monitorare i livelli di H2O2 a livello di tessuto. Il sensore è stato convalidato con l'aggiunta di H2O2. Inoltre, questa metodologia potrebbe essere utilizzata per misurare i livelli di H2O2 in specifici tipi cellulari e tessuti generando animali transgenici con espressione biosensore specifica del tessuto. Poiché i pesci zebra facilitano le manipolazioni genetiche e dello sviluppo, l'approccio dimostrato qui potrebbe servire come pipeline per testare il ruolo di H2O2 durante lo sviluppo embrionale neuronale e generale nei vertebrati.

Introduction

La segnalazione reattiva delle specie di ossigeno (ROS) regola lo sviluppo e il funzionamento del sistemanervoso 1. Un'importante fonte cellulare di ROS sono le ossidasi NADPH (NOX), che sono proteine transmembrana che generano superossido e perossido di idrogeno (H2O2)2. Gli enzimi NOX si trovano in tutto il sistema nervoso centrale (SNC) e il ROS derivato dal NOX contribuisce allo svilupponeuronale 3,4,5,6. Il mantenimento e la differenziazione delle cellule staminali neurali, stabilendo polarità neuronale, crescita della neurite e plasticità sinaptica hanno dimostrato di richiedere livelli adeguati di ROS7,8,9,10,11. D'altra parte, la produzione incontrollata di ROS da parte dei NOX contribuisce a disturbi neurodegenerativi tra cui il morbo di Alzheimer, la sclerosi multipla e la lesione cerebraletraumatica 12,13,14. Pertanto, la produzione di ROS fisiologicamente rilevante è fondamentale per mantenere condizioni sane.

Lo sviluppo di biosensori geneticamente codificati ha facilitato notevolmente il rilevamento del ROS cellulare. Un importante vantaggio dei biosensori geneticamente codificati è l'aumento della risoluzione temporale e spaziale del segnale ROS, poiché questi sensori possono essere specificamente mirati a posizioni distinte. La GFP sensibile ai redox (roGFP) è un tipo di biosensori ROS di questo tipo. La variante roGFP2-Orp1 rileva specificamente H2O2 attraverso il suo dominio Orp1, che è una proteina della famiglia glutatione perossiredossina dallievito 15,16. L'ossidazione della proteina Orp1 viene trasferita al roGFP2 per alterarne la conformazione (Figura 1A). La sonda presenta due picchi di eccitazione vicino a 405 nm e 480 nm e un singolo picco di emissione a 515 nm. All'ossidazione, l'intensità di fluorescenza intorno ai picchi di eccitazione cambia: mentre aumenta l'eccitazione di 405 nm, diminuisce l'eccitazione di 480 nm. Pertanto, roGFP2-Orp1 è un biosensore ratiometrico, e i livelli H2O2 sonorilevati dal rapporto di intensità di fluorescenza eccitate a due diverse lunghezze d'onda (Figura 1B). Nel complesso, roGFP2-Orp1 è uno strumento versatile per l'imaging ROS che può essere utilizzato in modo efficiente in vivo.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica e spettri di eccitazione del trasferimento ossidante roGFP2-Orp1. (A) avviene tra Orp1 e roGFP2 in risposta a H2O2,portando a cambiamenti conformazionali nel roGFP2. (B) Gli spettri di eccitazione del roGFP2-Orp1 presentano due picchi di eccitazione a 405 nm e 480 nm e un picco di emissione singola a 515 nm. All'ossidazione di H2O2, l'eccitazione di 405 nm aumenta mentre l'eccitazione di 480 nm diminuisce. Ciò si traduce in una lettura ratiometrica per la presenza di H2O2. La cifra è stata modificata da Bilan e Belousov (2017)16 e Morgan et al. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il sistema di modelli Danio rerio (zebrafish) presenta diversi vantaggi per l'applicazione di biosensori geneticamente codificati. La trasparenza ottica degli embrioni e delle larve consente l'imaging in vivo non invasivo. Sono in fase di sviluppo nuovi strumenti di imaging per ottenere una risoluzione più elevata e una penetrazionepiù profonda 17. Inoltre, esistono strumenti consolidati per la manipolazione genetica (espressione ectopica di mRNA, transgenesi Tol2, ecc.) e l'editing del genoma (TALEN, CRISPR / Cas9, ecc.), che promuove la generazione di animali transgenici18. Man mano che gli embrioni di zebrafish si sviluppano al di fuori della madre, questo sistema consente ulteriormente un accesso e una manipolazione più facili degli embrioni. Ad esempio, le iniezioni a uno stadio e i trattamenti farmacologici possono essere facilmente eseguiti.

Qui, abbiamo usato il pesce zebra per esprimere transitoriamente il biosensore specifico H2O2roGFP2-Orp1 iniettando mRNA trascritto in vitro. Questi embrioni possono essere utilizzati sia per l'imaging in vitro di neuroni coltivati che per l'imaging in vivo ( Figura2). Descriviamo un protocollo per la sezionatura e la placcatura delle cellule gangliari retiniche (GRGC) da embrioni di zebrafish seguito dalla valutazione dei livelli di H2O2nei neuroni coltivati. Quindi, presentiamo un metodo per l'imaging in vivo di embrioni e larve che esprimono roGFP2-Orp1 usando la microscopia confocale. Questo approccio non solo consente di determinare i livelli fisiologici di H2O2,ma anche i potenziali cambiamenti che si verificano in diversi stadi o condizioni di sviluppo. Nel complesso, questo sistema fornisce un metodo affidabile per rilevare H2O2 in cellule vive e animali per studiare il ruolo di H2O2 nello sviluppo, nella salute e nelle malattie.

Figure 2
Figura 2. Schema dell'approccio sperimentale. In breve, dopo la raccolta dell'embrione, l'mRNA roGFP2-Orp1 viene iniettato nel tuorlo di embrioni zebrafish a una cellula. Gli embrioni in via di sviluppo possono essere utilizzati sia perl'imaging in vitro ( A ) che perl'imaging in vivo ( B ). (A) Gli embrioni positivi alla GFP vengono utilizzati per sezionare retine per la raccolta RGC a 34 hpf. Le RGC dissociate sono placcate su coverlips rivestite in PDL/laminina in supporti ZFCM (+). L'imaging del cono di crescita può essere condotto mentre le RGC estendono i loro assoni dopo 6-24 ore di placcatura. Le cellule possono essere sottoposte a diversi trattamenti per misurare i potenziali cambiamenti nei livelli H2O2. Qui, abbiamo misurato ilivelli H 2O2nei coni di crescita delle GRGC (rosso). (B) Gli embrioni positivi alla GFP sono utilizzati per l'imaging in vivo. All'età desiderata, gli embrioni possono essere anestetizzati e montati su piatti di fondo in vetro da 35 mm per l'imaging confocale. Qui, gli embrioni sono montati ventralmente per l'imaging retinale. Schema mostra lo sviluppo retinale nel pesce zebra. Le GRGC formano lo strato cellulare ganglionale (GCL), che è lo strato più interno della retina. Gli assoni RGC si sviluppano nel nervo ottico per attraversare la linea mediana, formando chiasmo ottico. Quindi, gli assoni RGC crescono dorsalmente per fare sinapsi nel tectum ottico nel midbrain. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati eticamente dal Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), seguendo le linee guida NIH con il protocollo 2006002050 approvato il 24/07/2020.

1. Preparazione di soluzioni

  1. Supporti E2 (1x)
    1. Preparare soluzioni E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) e 500x E2C (100 mL) combinando tutti i componenti mostrati nella tabella 1. Soluzioni Autoclave E2A, E2B ed E2C. Conservare a 4 °C.
    2. Per 1 supporto E2: combinare 5 mL di 100x E2A, 1 mL di 500x E2B e 1 mL di 500x E2C. Portare il volume a 500 mL con acqua sterile. Regolare il pH a 7,0-7,5.
    3. Preparare aliquote da 50 mL di 1x E2 media store a -20 °C per lo stoccaggio a lungo termine. Tuttavia, le precipitazioni possono verificarsi al momento dello scongelamento. Assicurarsi che le precipitazioni siano completamente sciolte prima di utilizzare la soluzione stock.
soluzione componente importo concentrazione
100X E2A (500mL)
NaCl 43,8 g 1500 mM
Kcl 1,88 g 50 mM
MgSO4 6 g 100 mM
KH2PO4 1,03 g 15 mM
Na2HPO4 0,34 g 5 mM
500X E2B (100 mL)
CaCl2 5,5 g 500 mM
500X E2C (100 mL)
NaHCO3 3 g 350 mM
1X E2 (500 mL)
100X E2A 5 mL 1X
500X E2B 1 mL 1X
500X E2C 1 mL 1X

Tabella 1: Componenti di 1x E2 media per la coltura di cellule di zebrafish.

  1. E3 Media (1x)
    1. Sciogliere i componenti in acqua sterile da 1 L come mostrato nella tabella 2 per fare 100x stock. Diluire il magazzino in acqua sterile per realizzare 1x E3 media.
    2. Aggiungere lo 0,2% di blu di metilene. Per 20 mL di 1x mezzi E3, aggiungere 40 μL di blu di metilene.
    3. Fare un altro lotto senza blu di metilene per l'imaging fluorescente.
componente Importo (g) Concentrazione in stock 100X (mM)
NaCl 29.22 500
Kcl 1.26 17
CaCl2 2H2O 4.85 33
MgSO4 7H2O 8.13 33

Tabella 2: Componenti di supporti 100x E3 per il mantenimento di embrioni di zebrafish.

  1. Soluzione stock salina 80x
    1. Combinare tutti i componenti indicati nella tabella 3. Aggiungere acqua per fare una soluzione da 100 mL. Mescolare fino a quando tutti i componenti non vengono sciolti. Conservare la soluzione a 4 °C.
componente Importo (g) Concentrazione in magazzino (mM)
glucosio 1.44 80
Piruvato di sodio 0.44 40
CaCl2 2H2O 0.148 10
HEPES 6.1 256

Tabella 3: Componenti di soluzione salina 80x per supporti di coltura a cellule di zebrafish.

  1. Mezzo di coltura cellulare zebrafish (ZFCM+)
    1. Combinate tutti i componenti mostrati nella tabella 4 per realizzare supporti da 250 mL. Regolare il pH a 7,5. Filtrare i supporti utilizzando il filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.
componente Importo (mL) Volume %
Mezzo L-15 (con rosso fenolo) 212.75 85.1
Siero bovino fetale (FBS) 5 2
Penicillina/Streptomicina 1 0.4
Soluzione salina 80X 3.125 1.25
Acqua 28.125 11.25

Tabella 4: Componenti del mezzo di coltura cellulare zebrafish con siero e antibiotici.

  1. Supporto di coltura cellulare Zebrafish per l'imaging (ZFCM-)
    1. Combinate tutti i componenti mostrati nella tabella 5 per realizzare supporti da 250 mL. Regolare il pH a 7,5. Filtrare i supporti utilizzando il filtro da 0,22 μm.
    2. Effettuare aliquote single use (lotti da 50 mL) per prevenire la contaminazione. Conservare a 4 °C.
componente Importo (mL) Volume %
Mezzo L-15 (senza rosso fenolo) 212.75 85.1
Soluzione salina 80X 3.125 1.25
Acqua 34.125 13.65

Tabella 5: Componenti del mezzo di coltura cellulare zebrafish senza siero e antibiotici per l'imaging in vitro.

  1. Stampi a iniezione
    1. Sciogliere l'1,5% di agarosio nei supporti E3. Versare ~ 25 mL di agarosio in una piastra di Petri da 100 x 15 mm.
    2. Disporre lo stampo sopra l'agarosio con un angolo di 45° rispetto alla superficie e lasciarlo galleggiare sull'agarosio con un movimento lento. Questo aiuterà a evitare bolle. Lasciare raffreddare l'agarosio e solidificarsi sulla panca.
    3. Una volta completamente solidificato, rimuovere lentamente lo stampo per evitare la rottura dell'agarosio. Aggiungere supporti E3 freschi, aggiungere pellicola di paraffina intorno al piatto per evitare fuoriuscite e conservare a 4 °C (Figura 3).

Figure 3
Figura 3: Immagini dello stampo a iniezione. (A) Lo stampo di plastica utilizzato per realizzare piastre di iniezione. Lo stampo ha sei rampe, una a 90° e una a 45° smussate per contenere embrioni in posizione. (B) La piastra di iniezione dopo che l'agarosio è stata solidificata e lo stampo è stato rimosso. Barre di scala = 1 cm.

2. Preparazione e iniezione di mRNA roGFP2-Orp1

NOTA: il costrutto roGFP2-Orp1 è stato ottenuto dal Dr. Tobias Dick, DKFZ, Germania. È stato sotto-clonato nel vettore pCS2+ nel Dr. Qing Deng's Lab, Purdue University. Per prevenire la degradazione da parte della RNasi, devono essere prese diverse precauzioni. I reagenti e i tubi senza RNasi devono essere utilizzati in ogni momento, i guanti devono essere indossati per tutti i passaggi e, in alternativa, i materiali e le superfici possono essere puliti con un detergente per la rimozione della RNasi.

  1. Linearizzare i 3-10 μg del vettore pCS2+/roGFP2-Orp1 con NotI.
  2. Purificare il plasmide linearizzato con un kit di pulizia PCR.
  3. Trascrivere in vitro l'mRNA roGFP2-Orp1 con un kit di trascrizione in vitro secondo le istruzioni fornite dal produttore.
    1. Assemblaggio della reazione di trascrizione limitato
      1. Posizionare l'RNA polimerasi e il DNA linearizzato/purificato sul ghiaccio. Tampone di reazione Vortex 10x e 2x NTP/CAP fino a quando non sono completamente in soluzione. Conservare NTP/CAP sul ghiaccio ma mantenere il tampone a temperatura ambiente (RT) durante l'assemblaggio della reazione. Toccare tutti i reagenti prima di aprire i tubi per prevenire la contaminazione.
      2. Impostare la reazione di sintesi dell'RNA nell'ordine indicato di seguito a RT in un tubo di centrifuga RNasi-free da 0,5 ml. Il volume finale della reazione è di 20 μL.
      3. Aggiungere 10 μL di miscela di ribonucleotidi, 2x NTP/CAP e acqua priva di nucleasi, se necessario al tubo. Aggiungere tampone di reazione 2 μL 10X. Aggiungere 1-1,5 μg di DNA lineare (fino a 6 μL). Se necessario, aggiungere acqua priva di nucleasi per un volume di reazione di 20 μL.
      4. Chiudere brevemente il tubo, il vortice e il microfugo touch-spin. Aggiungere 2 μL di miscela enzimatica 10x SP6. Chiudi con un clic delle dita e tocca-gira in un microfugo.
      5. Mettere in 37 °C per 2-2,5 h (può salire fino a 18 ore).
        NOTA: Nell'esperimento presentato durante la notte è stata eseguita un'incubazione di 16-18 ore a 37 °C per ottenere i migliori risultati.
      6. Aggiungere 1 μL di DNA per rimuovere il modello di DNA, fare clic con le dita, toccare lo spin e incubare a 37 °C per 15 minuti.
Reagente Volume (μL) Importo in reazione
2X NTP/CAP 10 1X
Buffer di reazione 10X 2 1X
DNA modello Fino a 6 1-1,5 μg
Acqua priva di nucleasi Aggiungere per fare 20 μL
Mix enzimatico 10X SP6 2 1X

Tabella 6: Configurazione della reazione per la trascrizione in vitro di roGFP2-Orp1 mRNA.

  1. Recupero dell'RNA
    1. Aggiungere 25 μL di cloruro di litio (LiCl) fornito nel kit di trascrizione in vitro. Mettere a -20 °C in un congelatore non gelido per almeno 30 minuti.
    2. Girare per 25 minuti alla massima velocità in una centrifuga da tavolo a 4 °C. Rimuovere e scartare con attenzione il supernatante, in modo da non disturbare il pellet. Aggiungere 25 μL di etanolo freddo al 75% e girare per 5 minuti a 4 °C.
    3. Rimuovere con attenzione e scartare il supernatante. Lasciare asciugare l'aria del pellet per almeno 5 minuti a RT. Non lasciare asciugare. Aggiungere 12 μL di tampone Tris-EDTA (TE) privo di nucleasi (pH 7.0) e mantenere il campione sul ghiaccio.
    4. Misurare la concentrazione di RNA con uno spettrofotometro. Di solito si ottiene 0,5- 1 μg/μL.
    5. Preparare 100 ng/μL mRNA in soluzione rosso fenolo (0,5% rosso fenolo nella salina tamponata con fosfato -DPBS) di Dulbecco e aliquota per uso singolo (3-5 μL). Conservare le aliquote dell'mRNA a - 80 °C.
  1. Microiniezione di mRNA
    1. Il giorno dell'iniezione, utilizzare una delle aliquote dell'mRNA e seguire il protocollo di iniezione dell'embrione zebrafish per iniettare 1 nL dell'mRNA negli embrioni a uno stadio cellulare attraverso il loro tuorlo19. Di seguito viene fornita una breve descrizione.
    2. Allevare pesci adulti e raccogliere embrioni come descritto in precedenza20.
    3. Tirare aghi di microiniezione con estrattore di pipetta. Tagliare la punta degli aghi con pinze per creare un'apertura della punta di 10 μm.
    4. Allineare gli embrioni in uno stampo a iniezione descritto nel passaggio 1.6.
    5. Iniettare 1 nL dell'mRNA in rosso fenolo con una pipetta di microiniezione di vetro.
    6. Raccogli embrioni e conservali nei media E3.
    7. Conservare gli embrioni nell'incubatore di 27 °C nei mezzi E3 fino a raggiungere lo stadio di sviluppo desiderato. Gli embrioni iniettati possono essere utilizzati sia per l'imaging in vitro (sezione 3 e sezione 4) che in vivo (sezione 5). Gli embrioni che esprimono roGFP2-Orp1 possono essere preselezione prima degli esperimenti con un normale microscopio a dissezione dotato di luce fluorescente e un set di filtri blu /verde.

3. Coltura primaria delle cellule gangliari retiniche derivate da embrioni di zebrafish

NOTA: Questo protocollo è adattato da un metodo precedentemente pubblicato 21. Eseguire i passaggi 3.1 e 3.2 in una cappa di flusso laminare.

  1. Preparazione di coverlips
    1. Preparare 4-6 piastre di coltura in ogni esperimento. Utilizzare coverlips puliti con acido (22 x 22 mm quadrati; spessore 0,16-0,19 mm) conservati in etanolo al 100%.
    2. Rimuovere una coverlip dal contenitore di stoccaggio utilizzando le forcep e fiammarla per rimuovere l'etanolo residuo.
    3. Asciugare completamente il coperchio posizionandolo ad angolo all'interno di un piatto da coltura da 35 mm.
    4. Preparare la soluzione di lavoro poli-D-lysina (PDL) (1x) diluire 10x stock (5 mg/mL) in acqua sterile.
    5. Applicare 100 μL di 0,5 mg/mL PDL al centro di ogni coverlip ed evitare la diffusione della soluzione ai bordi.
    6. Incubare il PDL su coverlips per 20-30 min a temperatura ambiente (RT). Assicurarsi che il PDL non si asciughi.
    7. Lavare il PDL con acqua sterile da 0,5 mL tre volte. Lasciare asciugare completamente i piatti.
    8. Preparare la soluzione di lavoro laminina (1x) diluire 50x stock (1 mg/mL) in 1x PBS.
    9. Applicare 100 μL di laminina 20 μg/mL in PBS al centro di ogni coverlip ed evitare la diffusione della soluzione ai bordi.
    10. Incubare le piastre a 37 °C in un incubatore umidificato per 2-6 ore. Evitare l'essiccazione della soluzione laminina.
  2. Dissezione e placcatura degli embrioni RGC
    1. Preparare ed etichettare quattro piatti di coltura tissutale da 35 mm e riempire con 4 mL di: 70% etanolo, "E2 media 1", "E2 media 2", "E2 media 3" il giorno della dissezione. Conservare i piatti in frigo fino alle dissezioni.
    2. Quando gli embrioni di zebrafish sono 34 ore dopo la fecondazione (HPF), togliere i piatti di coltura rivestiti di laminina dall'incubatrice e lavare i copripazzo tre volte con 0,5 mL di 1x PBS.
    3. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 4 mL di supporti ZFCM(+) a ogni piatto di coltura ed evitare di asciugare il piatto.
    4. Recupera i piatti di coltura preparati dal passaggio 3.2.1. Lasciali equilibrare a RT.
    5. Riempire 4-6 tubi PCR con 15 μL di supporti ZFCM(+). È necessario un tubo per preparare le RGC da 4 occhi da placcare su un coperchio.
    6. Recupera embrioni di zebrafish dall'incubatrice e immergi gli embrioni in un piatto di coltura tissutale da 35 mm contenente il 70% di etanolo per 5-10 s da sterilizzare.
    7. Utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire embrioni su un piatto E2 Media 1 contenente mezzi E2 sterili per lavare l'etanolo in eccesso.
    8. Trasferire gli embrioni sul piatto E2 Media 2 e rimuovere i loro corioni con forcende affilate.
    9. Trasferire gli embrioni sul piatto finale E2 Media 3 per eseguire le dissezioni.
    10. Utilizzando una coppia di forcep fini, sezionare le retine come descritto in precedenza 22.
    11. Posizionare e tenere gli embrioni anteriori al tuorlo con una delle forcep e rimuovere la coda posteriore al sacco del tuorlo con le altre forcep.
    12. Afferra il collo con le alessa e togliti la testa per esporre cervello e occhi ai media E2. Evitare di tagliare il sacco del tuorlo.
    13. Con la punta delle forcelle fini, rotolare delicatamente gli occhi dalla testa, tenendo il tessuto cranici verso il basso con le seconde force. Tenere gli occhi isolati dai detriti tissutali adiacenti.
    14. Trasferire quattro occhi su uno dei tubi precedentemente preparati contenenti ZFCM(+).
    15. Titolare delicatamente su e giù con la pipetta P20 e una punta gialla circa 45 volte per dissociare le cellule. Evitare bolle d'aria.
    16. Trasferire lo ZFCM(+) con celle dissociate al centro del coverslip. Ripetere i passaggi da 10 a 12 per ulteriori coverlips.
    17. Mantenere le colture sul banco a 22 °C su un rack in schiuma di polistirolo per assorbire le vibrazioni.
    18. Eseguire l'imaging 6-24 ore dopo la placcatura.
      NOTA: Utilizzare pipetta di trasferimento per trasferire embrioni in diversi piatti di coltura. Cambiare la pipetta per ogni soluzione per evitare il trasporto di etanolo (passaggi 6-8).

4. Imaging ROS in vitro di neuroni RGC coltivati

  1. Il giorno dell'imaging (in genere 6-24 ore dopo la placcatura cellulare), controllare le cellule al microscopio per convalidare la crescita degli assoni RGC.
  2. Per l'imaging a cellule vive, trasferire le copertine dal piatto di coltura a una camera di imaging cellulare viva. In questo caso è stata utilizzata una camera aperta su misura, che è stata precedentemente descritta23.
  3. Impostare il microscopio per l'imaging. Utilizzare un microscopio invertito dotato di un obiettivo dic (Differential Interference Contrast), un filtro rosso passa-lungo OG590 e una fotocamera EM-CCD.
  4. Prima dell'imaging, sostituire il supporto ZFCM(+) con ZFCM(-).
  5. Una volta posizionate le celle con obiettivo 10x, acquisire immagini con ingrandimento 60x utilizzando un obiettivo di immersione dell'olio NA elevato. Utilizzare un ingrandimento aggiuntivo di 1,5x.
  6. In primo luogo, acquisire immagini DIC. Quindi, immagine roGFP2-Orp1 utilizzando un set di filtri appropriato. Eccitare roGFP2-Orp1 con filtri di eccitazione da 405/20 e 480/30 nm in sequenza e acquisire immagini con filtro di emissione da 535/30 nm dopo che la luce di emissione ha superato lo specchio dicroico 505DCXR.
  7. Dopo aver scattato la prima serie di immagini, scambia i media con supporti contenenti diverse soluzioni di trattamento. I supporti devono essere cambiati ogni 30 minuti di imaging per evitare cambiamenti di pH e osmolarità.

5. Imaging ROS in vivo di embrioni in via di sviluppo

  1. Per l'imaging in vivo, conservare gli embrioni in mezzi E3 contenenti 0,003% di feniltiourea (PTU) senza blu di metilene da 22-24 HPF. Scambiare media e rimuovere embrioni morti su base giornaliera.
  2. All'età desiderata, anestetizza gli embrioni nello 0,016% di tricaina. Montare embrioni anestetizzati in agarosio a bassa fusione all'1% su piatti di coltura del fondo di vetro da 35 mm. Gli embrioni possono essere orientati dorsalmente, ventralmente o lateralmente, a seconda della regione di interesse per l'imaging.
  3. Dopo che l'agarosio si solidifica, riempire i piatti con mezzi E3 senza metilene blu/0,016% di tricaina.
  4. Impostare il microscopio per l'imaging. Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser invertita. In alternativa, utilizzare un microscopio confocale verticale dotato di una lente ad immersione in acqua per immagini embrioni montati sopra una goccia di agarosio.
  5. Eccitare roGFP2-Orp1 con filtri di eccitazione a 405 nm e 488 nm in sequenza e acquisire immagini corrispondenti con filtri di emissione nell'intervallo di 515-535 nm.
  6. Acquisire z-stack con 5 μm di spessore della sezione attraverso la parte desiderata degli embrioni. Gli embrioni possono essere conservati per l'imaging nelle fasi successive dello sviluppo.
  7. Dopo l'imaging, rimuovere gli embrioni dall'agarosio con pini fini e conservare nell'incubatrice fino all'età desiderata in mezzi senza blu di metilene con PTU.

6. Analisi ed elaborazione delle immagini

  1. Misurazione dei livelli H2O2 in base ai valori del rapporto 405/480
    1. Utilizzare un software adatto per l'analisi delle immagini. Il software ImageJ è stato utilizzato qui per l'analisi e l'elaborazione delle immagini.
    2. Aprire le immagini DIC, 405/535 e 480/535 nel software ImageJ trascinando i file o facendo clic su File | Aprire. Se non è già stato fatto, convertire le immagini a 32 bit facendo clic su Immagine | Digitare | A 32 bit.
    3. Definire la regione di interesse (ROI) con lo strumento mano libera dalla barra di controllo (corpo cellulare, cono di crescita, retina, ecc.). Aprire il gestore del ROI facendo clic su Analizza | Strumenti | Roi Manager. Fare clic su Aggiungi nella scheda Gestione ROI per aggiungere il ROI definito.
    4. Disegna un'area vicino al ROI e aggiungila come ROI in background. Misurare i valori medi in background selezionando il ROI e facendo clic su Misura dalla scheda Gestione ROI.
    5. Si notano i valori di intensità medi della misurazione. Sottrarre il valore dello sfondo medio dalle immagini fluorescenti facendo clic su Elabora | Matematica | Sottrarre. Eseguire questo passaggio per immagini 405/535 e 480/535.
    6. Aggiungere il valore di "1" all'immagine fluorescente 480/535 per eliminare i valori "0" facendo clic su Elabora | Matematica | Aggiungere la funzione prima del calcolo del rapporto.
    7. Fare clic su Elabora | Calcolatrice immagini | Dividi la funzione in ImageJ per dividere l'immagine 405/535 per 480/535 immagini pixel per pixel. Selezionare l'immagine 405/535 da dividere per l'immagine 480/535. Selezionare un'immagine di output a 32 bit.
    8. Applicare il ROI all'immagine del rapporto facendo prima clic sull'immagine del rapporto e quindi sul ROI nella scheda Gestore del ROI.
    9. Misurare i valori medi del rapporto tra immagine 405/535 e immagine 480/535 facendo clic su Misura nella scheda Gestione ROI.
    10. Eseguire i passaggi 6.1.2-6.1.9 per il maggior numero possibile di campioni per eseguire l'analisi statistica appropriata.
  2. Immagine del rapporto di visualizzazione
    NOTA: questa procedura è per sottrarre lo sfondo all'esterno del campione e applicare una tabella di ricerca del colore all'immagine.
    1. Una volta creata l'immagine del rapporto in ImageJ nel passaggio 6.1.7., creare un'immagine nera a 32 bit facendo clic su File | Nuovo | Immagine.
    2. Applicare il ROI per cui si desidera visualizzare i livelli H2O2 alla nuova immagine facendo prima clic sulla nuova immagine e quindi sul ROI dalla scheda Gestore del ROI.
    3. Creare una maschera facendo clic su Modifica | Selezione | Creare Maschera.
    4. Dividi l'immagine della maschera per 255 per regolare il valore del ROI su "1" e i valori di sfondo saranno "0". Fare clic su Elabora | Matematica | Dividere e digitare 255.
    5. Moltiplicare la maschera con l'immagine del rapporto facendo clic su Elabora | Calcolatrice immagini | Moltiplicare la funzione. Ciò si tradurrà in un'immagine con rapporto scala di grigi che mostra solo il ROI.
    6. Modificare la tabella di ricerca in "Fuoco" facendo clic su Immagine | Cercare tabelle | Fuoco.
      NOTA: un fattore di moltiplicazione può essere applicato a tutte le immagini per una migliore visualizzazione del rapporto facendo clic su Processo | Immagine | Moltiplicare.
    7. Convertire l'immagine del rapporto in 8 bit facendo clic su Immagine | Digitare | 8 bit.
    8. Aggiungere la barra di calibrazione facendo clic su Analizza | Strumenti | Barra di calibrazione.

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Representative Results

Le RGC zebrafish coltivate estendono gli assoni entro 1 d. Un'immagine rappresentativa del rapporto 405/480 del biosensore H2O2è illustrata nella figura 4A. Il corpo cellulare, l'assone e i coni di crescita sono chiaramente visibili nei singoli neuroni. Questi neuroni possono essere sottoposti a diversi trattamenti nel tempo per monitorare i cambiamentiH 2O2. In precedenza abbiamo scoperto che l'aggiunta di 100 μM H2O 2 ai supportidi coltura aumenta i valori del rapporto, dimostrando che è possibile rilevare cambiamenti in tempo reale con questo sistema (Figura 4)24.

Figure 4
Figura 4: Imaging H2O2 in RGC zebrafish coltivati con roGFP2-Orp1. (A) Immagini rappresentative del rapporto 405/480 nm di neuroni RGC coltivati da 34 HPF vecchi embrioni di zebrafish. Il neurone a sinistra è stato trattato con un mezzo di controllo privo di siero e il neurone a destra è stato trattato con 100 μM H2O2 per 30 minuti. Barra di scala = 10 μm. (B) Grafici a barre che mostrano i livelli medi H2O2 nei coni di crescita RGC di zebrafish di tipo selvatico prima e dopo il trattamento con controllo o 100 μM H2O2. I dati sono stati normalizzati per controllare il trattamento. I dati sono mostrati ± SEM. Il numero di coni di crescita è mostrato tra parentesi per ciascun gruppo. Test di rango firmato Wilcoxon a due code; **p = 0,0009. La cifra è stata modificata rispetto alla nostra precedentepubblicazione 24. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ilivelli H 2O2 possono essere determinati anche in embrioni interi di zebrafish (Figura 5). Quando l'mRNA viene iniettato durante lo stadio di una cellula, tutti i tessuti esprimono il biosensore roGFP2-Orp1. Nella figura 5A, mostriamo la regione testa delle larve di zebrafish in due diversi punti di tempo, concentrandosi sui livelli H2O2 nella retina, come esempio. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'aggiunta di H2O 2 aumenta i valori del rapporto in tempo reale,mentre l'aggiunta dell'agente riducente DTT inverte questo effetto in vivo24. Qui, abbiamo misurato i livelli basali di H2O2 negli stessi embrioni di zebrafish a 2 dpf e 5 dpf. A 2 dpf, i valori del rapporto erano significativamente inferiori a 5 dpf (p<0,0001; Figura 5B). Inoltre, ogni animale ha mostrato un diverso livello di aumento del contenuto retinale H2O2 (figura 5C).

Figure 5
Figura 5: Imaging in vivo H2O2 nelle larve di zebrafish con roGFP2-Orp1. (A) DIC e 405/480 nm di immagini di larve di zebrafish da 2 e 5 dpf. Il ROI è definito come retina (linee gialle) per misurare i valori del rapporto. Le stesse larve sono state analizzate a 2 e 5 dpf. Barre di scala = 50 μm. (B) Misurazione dei livelli medi H2O2 nelle retine di 2 e 5 dpf zebrafish. A 5 dpf, i livelli di H2O2sono aumentati significativamente nella retina rispetto a 2 dpf. (C) Grafico di linea delle misurazioni dei singoli pesci. Ogni animale mostra un aumento dei livelli di H2O2nella loro retina da 2 a 5 dpf. I dati sono mostrati come ± sem. Il numero di larve analizzate viene visualizzato tra parentesi per ogni gruppo. Test di rango firmato Wilcoxon a due code, ****p<0.0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Ci sono diversi passaggi critici che necessitano di attenzione in tutto questo protocollo. Riteniamo che considerare questi punti migliorerà il flusso sperimentale. Per la coltura RGC primaria, la sterilità dello ZFCM(-) è molto importante, poiché questo supporto di coltura non contiene antibiotici e la contaminazione può verificarsi prima o durante l'imaging. Per evitarlo, si consiglia di preparare e utilizzare ZFCM(-) solo all'interno di un armadio di biosicurezza e realizzare regolarmente nuovi supporti ZFCM(-) (Passaggio 1.5). Inoltre, le scorte di laminina devono essere mantenute a -80 °C. La laminina scongelata deve essere conservata sempre a 4 °C. Non mantenere le soluzioni di laminina a temperatura ambiente o ricongelare, in quanto diminuisce la crescita della neurite promuovendo l'attività della proteina.

Sezionare la retina di zebrafish al momento giusto è importante per produrre abbastanza RGC che estendono gli assoni. Gli RGC Zebrafish nascono a 28 CVf ed estendono gli assoni dalla retina a partire da 32-36 HPF. Pertanto, è fondamentale placcare le RGC dopo 28 HPF, preferibilmente tra 32-36 HPF, per consentire la piena differenziazione delle RGC. Le colture preparate in momenti precedenti potrebbero non produrre abbastanza RGC o produrre RGC che potrebbero non estendere gli assoni entro 24 ore dalla placcatura. Si consiglia vivamente di cambiare il supporto ZFCM(-) durante l'imaging per più di 30 minuti. Poiché questo supporto manca di rosso fenolo, i cambiamenti di pH non sono visibili e potrebbero dover essere considerati. Scambia i supporti con molta attenzione per evitare lo slogaggio dei neuroni durante il processo (Fase 4.7).

Infine, è necessario cambiare il supporto in E3 con PTU ma senza blu di metilene di 24 HPF. La PTU previene la pigmentazione per una maggiore trasparenza larvale richiesta per l'imaging a fluorescenza in vivo; tuttavia, un trattamento precedente con PTU può causare difetti di sviluppo26. Il blu di metilene viene rimosso dai mezzi E3 per ridurre l'autofluorescenza, proveniente principalmente dal tuorlo (passaggio 5.1).

Questo metodo consente il rilevamento citoplasmatico di H2O2. Tuttavia, la compartimentazione subcellulare di H2O2 contribuisce alla segnalazione locale e i livelli citoplasmatici H2O2 potrebberonon fornire informazioni sufficienti su specifici ruoli di segnalazione di H2O2. Poiché roGFP2-Orp1 è un biosensore geneticamente codificato, può essere mirato per l'espressione specifica dei tessuti (ad esempio neuroni, astrociti, cellule gliali, ecc.) o specifiche posizioni subcellulari (ad esempio, membrana plasmatica, mitocondri, nucleo, ecc.). Poiché roGFP2-Orp1 è un biosensore basato su GFP, la combinazione con altre sonde fluorescenti è limitata alle lunghezze d'onda di emissione al di fuori dello spettro verde. Poiché la GFP è ampiamente utilizzata come marcatore di transgenesi, l'utilizzo di biosensori basati su GFP può essere limitato. Per affrontare questa sfida, le proteine rosso-fluorescenti per ilrilevamentoH2O 2 sono state sviluppate di recente27. Inoltre, roGFP2-Orp1 è espresso transitoriamente nel metodo qui presentato. Quindi, l'mRNA e l'espressione proteica decadiranno nel tempo. Eravamo ancora in grado di rilevare il segnale in 5 larve dpf; tuttavia, è necessario stabilire linee di pesce transgeniche per un'espressione stabile del biosensore durante lo sviluppo e fino all'età adulta.

Sono disponibili diversi saggi a base di colorante per il rilevamento del ROS intracellulare (ad esempio, H2DCF-DA), o in particolare, H2O2 (PF6-AM)28,29. L'uso di un biosensore geneticamente codificato, come roGFP2-Orp1, ha diversi vantaggi rispetto ai metodi a base di coloranti. In primo luogo, consente di rilevare sia i cambiamenti transitori nello stato ossidativo a causa della reversibilità che in specifiche posizioni subcellulari. Pertanto, i cambiamenti dinamici sono ben monitorati con un alto grado di risoluzionespaziale 30. In secondo luogo, generalmente mostra meno tossicità per cellule o tessuti rispetto alle molecole di colorante. Infine, il biosensore può essere ulteriormente manipolato geneticamente per soddisfare le esigenze di esperimenti specifici31. roGFP2-Orp1 è un biosensore ratiometrico, poiché ha due eccitazioni e un picco di emissione. Dopo l'interazione con H2O2, l'eccitazione di 405 nm aumenta e l'eccitazione di 480 nm diminuisce. Quindi, la lettura è il rapporto tra i valori di intensità acquisiti rispettivamente da eccitazione 405 e 480 nm. Poiché questa sonda è ratiometrica, l'applicazione di una seconda sonda diventa non necessaria per correggere potenziali effetti di volume. Inoltre, poiché questa sonda comporta solo l'espressione di un polipeptide, non soffre di potenziali problemi di espressione differenziale di più di una proteina, come nel caso del trasferimento di energia di risonanza della fluorescenza intermolecolare (FRET).

Il roGFP2-Orp1 è una sonda H2O2 versatile per studiare la produzione e la segnalazione del ROS. Nelle cellule vive, questa sonda mostra un intervallo dinamico di 4,8 (circa 4 in embrioni transgenici di zebrafish)15,32. Tuttavia, lo stato redox di roGFP2-Orp1 è soggetto ad alterazioni da parte dei sistemi endogeno tioredossina e glutaredossine; quindi, sonde più sensibili sono state sviluppate sostituendo Orp1 con un altro perossiredossina di lievito, Tsa233,34. Mentre roGFP2-Orp1 è utile per rilevare cambiamenti in H2O2 negli embrioni di zebrafish, la sensibilità è per lo più limitata a concentrazioni più elevate di H 2 O224,31o a potenti stimoli. Ad esempio, il trattamento con fessura2 ha aumentato il segnale roGFP2-Orp1 in RGC di tipo selvaggio, ma non in RGC mutanti nox2 35. D'altra parte, non c'era differenza nei livelli basali H2O2 tra RGC mutanti di tipo selvatico e nox2 e 2 embrioni dpf24,35. Pertanto, per rilevare livelli basali o piccoli cambiamenti in H2O2, saranno necessarie sonde a sensibilità più elevata.

HyPer è un altro biosensore geneticamente codificato e ratiometrico H2O236. Le sensibilità di entrambe le sonde sono simili; tuttavia, roGFP2-Orp1 ha mostrato una reattività più lenta alle modifiche H2O2 15. Pertanto, il rilevamento preciso delle modifiche in tempo reale potrebbe richiedere HyPer anziché roGFP2-Orp1. Mentre le versioni iniziali di HyPer sono influenzate da modifiche al pH, roGFP2-Orp1non è 16,36. Pertanto, è fondamentale includere una sonda di controllo del pH (SypHer3s) durante l'utilizzo di HyPer37. La più recente sonda HyPer, HyPer7, ha superato molti degli svantaggi delle sonde H2O2 esistenti: HyPer7 ha una maggiore stabilità del pH, una maggiore luminosità, una cinetica più veloce e una gamma dinamicapiù 38. Inoltre, HyPer7 viene convalidato sia in vitro che in vivo,mostrando la compartimentazione subcellulare e monitorando i cambiamenti in tempo reale H2O2 negli embrioni di zebrafish durante la guarigionedelle ferite 38.

La metodologia qui presentata può essere ampliata per studiare il ruolo della segnalazione ROS sia in vitro che in vivo. i neuroni che esprimono roGFP2-Orp1 possono essere sottoposti a diversi trattamenti per studiarne l'effetto sulla segnalazione H2O2. Ad esempio, abbiamo dimostrato che le GRGC rispondono ai cambiamenti nei livelli di H2O2 in tempo reale (Figura 4), suggerendo che il biosensore può rilevare cambiamenti immediati in H2O2. Tuttavia, determinare concentrazioni assolute intracellulari H2O2 richiederebbe un'ampia calibrazione del sistema. Anche il limite di rilevamento del biosensore non è chiaro. Inoltre, la distribuzione spaziale dettagliata del biosensore nella cella non è completamente nota, il che potrebbe interferire con l'interpretazione dei risultati. Inoltre, determinare il segnale di posizione esatto da roGFP2-Orp1 potrebbe rivelare se esiste una produzione H2O2 specifica del sito che contribuisce alla segnalazione intracellulare localizzata.

La creazione di pesci transgenici che esprimono roGFP2-Orp1 ha numerosi vantaggi. Il biosensore può essere espresso onnipresentemente, o sotto un promotore specifico del tessuto per lo studio della segnalazione H2O2 specifica della cellula utilizzando la transgenesi Tol2 in zebrafish39. Il ruolo di H2O2 nello sviluppo può essere studiato per espressione onnipresente del biosensore. Ad esempio, gli embrioni transgenici di zebrafish possono essere monitorati per valutare i cambiamenti nei livelli di H2O2 e come questi cambiamenti contribuiscono alle diverse fasi di sviluppo. D'altra parte, l'espressione tissutale specifica del roGFP2-Orp1 si concentra sugli effetti della produzione di H2O2 in cellule o tessuti di interesse. I promotori specifici dei tessuti o delle cellule possono essere utilizzati per guidare l'espressione di roGFP2-Orp1 in cellule specifiche. Inoltre, il sistema Gal4/UAS può essere utilizzato per l'etichettatura sparsa dei singoli neuroni. Pertanto, questo approccio consente di rilevare i livelli di H2O2 a una risoluzione cellulare in vivo. Infine, linee transgeniche stabili possono essere utilizzate per lo screening farmacologico ad alta produttività che comporta la segnalazione DEL ROS e lo stress ossidativo negli embrioni di zebrafish.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (Grant R01NS117701), dalla National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), dall'Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), dalla Purdue Research Foundation (Grant 209911) e dall'Ufficio del Vice Presidente Esecutivo per la Ricerca e i Partenariati presso la Purdue University (Grant 210362). Ringraziamo il Dr. Cory J. Weaver e Haley Roeder per aver stabilito il protocollo culturale RGC zebrafish. Ringraziamo inoltre Haley Roeder per aver fornito i dati della Figura 4. Ringraziamo Leah Biasi e Kenny Nguyen per l'aiuto con la cultura RGC. Ringraziamo Gentry Lee per aver modificato il testo. Ringraziamo il Dr. Tobias Dick per aver fornito roGFP2-Orp1 e Dr. Qing Deng per il vettore pCS2+ contenente roGFP2-Orp1. La figura 2 viene creata con Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35-mm culture dish Sarstedt 83-3900
35-mm glass bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes Sutter/Fisher Scientific NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Cover glass Corning 2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) VWR 25384-094
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 26140087
Glucose Sigma Aldich G7528
HEPES Sigma Aldich H4034
Injection Mold Adaptive Science Tools TU-1
Inverted Microscope Nikon TE2000
Laminin ThermoFisher Scientific 23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss 710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red Gibco/Fisher Scientific 11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red Gibco/Fisher Scientific 21-083-027
Low melting agarose Promega V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
PBS Hyclone/Fisher Scientific SH3025601
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
Phenol Red Sigma Aldich P0290
Phenylthiourea (PTU) Sigma Aldich P7629
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments PV820
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma Aldich P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit QIAGEN 28104
Recombinant mouse slit2 R&D Systems 5444-SL-050
Sodium Pyruvate Sigma Aldich P5280
Steritop 0.22 µm filter Millipore S2GPT05RE
TE Buffer Ambion AM9860
Tricaine Methanesulfonate Sigma Aldich E10521
Vertical Pipette Puller David Kopf Instruments 700C

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