Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Nöronal Gelişim Sırasında ROS Canlı Hücre Görüntüleme

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62165
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

Summary

Bu protokol, sinir sistemi gelişimi sırasında H 2 O2'ninfizyolojik sinyal rollerini değerlendirmek için kültürlü zebra balığı nöronlarında ve larvalarında genetik olarak kodlanmış bir hidrojen peroksit (H 2 O2)-biyosensör kullanımını açıklar. Farklı hücre tiplerine uygulanabilir ve genel gelişimde reaktif oksijen türlerini (ROS) incelemek için deneysel tedavilerle değiştirilebilir.

Abstract

Reaktif oksijen türleri (ROS), normal gelişim, homeostaz ve fizyolojide önemli olan iyi kurulmuş sinyal molekülleridir. Farklı ROS arasında, hidrojen peroksit (H2O2)hücresel sinyalizasyondaki rollerle karakterize edilir. H2O2, çeşitli türlerde gelişim sırasında bulaşmıştır. Örneğin, döllenmeyi takip eden ilk günlerde zebra balığı embriyolarındaH2 O2'de geçici bir artış tespit edilmiştir. Ayrıca, önemli bir hücresel H2O2 kaynağı olan NADPH oksidaz (NOX) tükendi, retinal ganglion hücrelerinin (RGC) hem in vivo hem de in vitrofarklılaşması, aksonal büyümesi ve rehberliği gibi sinir sistemi gelişimini bozar. Burada, genetik olarak kodlanmış H 2 O2 -spesifik biyosensör, roGFP2-Orp1 kullanılarak kültürlü zebra balığı nöronlarında ve tüm larvalarda hücre içi H2O2seviyelerini görüntüleme için bir yöntem açıklıyoruz. Bu prob zebra balığı larvalarında geçici veya stably olarak ifade edilebilir. Ayrıca, oranmetrik okuma, diferansiyel gen ekspresyosu veya hacim etkileri nedeniyle eserleri tespit etme olasılığını azaltır. İlk olarak, geçici olarak roGFP2-Orp1 eksprese eden zebra balığı embriyolarından elde edilen RPC'lerin nasıl izole edildiğini ve kültürlendirılacağını gösteriyoruz. Daha sonra, doku seviyesinde H2O2 seviyelerini izlemek için tüm larvaları kullanırız. Sensör H2O2ilavesi ile doğrulanmıştır. Ek olarak, bu metodoloji dokuya özgü biyosensör ekspresyörü ile transgenik hayvanlar üreterek belirli hücre tiplerinde ve dokulardaH2 O2 seviyelerini ölçmek için kullanılabilir. Zebra balığı genetik ve gelişimsel manipülasyonları kolaylaştırdığı için, burada gösterilen yaklaşım, omurgalılarda nöronal ve genel embriyonik gelişim sırasında H2O2'nin rolünü test etmek için bir boru hattı görevi görebilir.

Introduction

Reaktif oksijen türleri (ROS) sinyali sinir sisteminin gelişimini ve işleyişini düzenler1. Önemli bir hücresel ROS kaynağı, süperoksit ve hidrojen peroksit (H2O 2 )2üreten transmembran proteinleri olan NADPH oksidazlarıdır (NOX). NOX enzimleri merkezi sinir sistemi (CNS) boyunca bulunur ve NOX türevi ROS nöronal gelişime katkıda bulunur3,4,5,6. Sinirsel kök hücrelerin bakımı ve farklılaşması, nöronal polaritenin kurulması, neurit büyümesi ve sinaptik plastisitenin yeterli ROS7, 8,9,10,11seviyelerini gerektirdiği gösterilmiştir. Öte yandan, NOX'ler tarafından kontrolsüz ROS üretimi Alzheimer Hastalığı, multipl skleroz ve travmatik beyin hasarı dahil olmak üzere nörodejeneratif bozukluklara katkıda bulunur12,13,14. Bu nedenle, fizyolojik olarak ilgili ROS üretimi sağlıklı koşulların korunması için kritik öneme sahiptir.

Genetik olarak kodlanmış biyosensörlerin geliştirilmesi hücresel ROS'un tespitini büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Genetik olarak kodlanmış biyosensörlerin önemli bir avantajı, ROS sinyalinin artan zamansal ve mekansal çözünürlüğüdür, çünkü bu sensörler özellikle farklı konumlara hedeflenebilir. Redoks duyarlı GFP (roGFP) bu tür ROS biyosensörlerinin bir türüdür. RoGFP2-Orp1 varyantı özellikle Maya15,16'dan glutatyon peroksitoksin aile proteini olan Orp1 etki alanı aracılığıyla H 2 O2'yi algılar. Orp1 proteininin oksidasyonu, konformasyonunu değiştirmek için roGFP2'ye aktarılır (Şekil 1A). Prob, 405 nm ve 480 nm'ye yakın iki heyecan zirvesi ve 515 nm'de tek bir emisyon zirvesi sergiliyor. Oksidasyon üzerine, heyecan zirvesi etrafındaki floresan yoğunluğu değişir: 405 nm heyecan artarken, 480 nm heyecan azalır. Bu nedenle, roGFP2-Orp1 oranmetrik bir biyosensördür ve H2O2-seviyeleri iki farklı dalga boyunda heyecanlanan floresan yoğunluklarının oranı ile tespit edilir (Şekil 1B). Genel olarak, roGFP2-Orp1, ROS görüntüleme için verimli bir şekilde kullanılabilecek çok yönlü bir araçtır vivo.

Figure 1
Şekil 1: RoGFP2-Orp1'in şematik gösterimi ve eksitasyon spektrumları. (A) Oksidan transferi, H 2 O 2'ye yanıt olarak Orp1 ve roGFP2 arasındagerçekleşirve roGFP2'de konformasyon değişikliklerine yol meydana gelir. (B) RoGFP2-Orp1'in heyecan spektrumu, 405 nm ve 480 nm'de iki heyecan zirvesi ve 515 nm'de tek emisyon zirvesi sergiler. H 2 O2ileoksidasyonüzerine, 405 nm ekscitasyon artarken 480 nm heyecan azalır. Bu, H2O2 varlığı için oranmetrik bir okuma ile sonuçlanır. Rakam Bilan ve Belousov (2017)16 ve Morgan ve ark. (2011)25'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Danio rerio (zebra balığı) model sistemi, genetik olarak kodlanmış biyosensörleri uygulamak için çeşitli avantajlara sahiptir. Embriyoların ve larvaların optik şeffaflığı invaziv olmayan in vivo görüntülemeyi mümkün hale sağlar. Daha yüksek çözünürlük ve daha derin penetrasyon elde etmek için yeni görüntüleme araçları geliştirilmektedir17. Ayrıca, transgenik hayvanların neslini destekleyen genetik manipülasyon (ektopik mRNA ekspresyözü, Tol2 transgenez, vb.) ve genom düzenleme (TALENler, CRISPR / Cas9, vb.) için yerleşik araçlar vardır18. Zebra balığı embriyoları anne dışında geliştikçe, bu sistem embriyoların daha kolay erişmesini ve manipülasyonuna izin verir. Örneğin, tek hücreli aşama enjeksiyonları ve ilaç tedavileri kolayca yapılabilir.

Burada zebra balığını, H 2 O2'yeözgü biyosensör roGFP2-Orp1'i tüp bebekli mRNA enjekteederekgeçici olarak ifade etmek için kullandık. Bu embriyolar hem kültürlü nöronların in vitro görüntülemesi hem de in vivo görüntüleme için kullanılabilir ( Şekil2). Zebra balığı embriyolarından retinal ganglion hücrelerinin (RGC) parçalanıp kaplatılmasını ve ardından kültürlü nöronlarda H2O2seviyelerinin değerlendirilmesini içeren bir protokol açıklıyoruz. Daha sonra konfokal mikroskopi kullanarak roGFP2-Orp1 ekspresyaklı embriyo ve larvaların in vivo görüntüleme yöntemi sunuyoruz. Bu yaklaşım sadece fizyolojik H2O2seviyelerinin belirlenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda farklı gelişim aşamalarında veya koşullarında meydana gelen potansiyel değişiklikleri de belirler. Genel olarak, bu sistem H 2 O2'ningelişim, sağlık ve hastalıktaki rolünü incelemek için canlı hücrelerde ve hayvanlarda H2O2'yi tespit etmek için güvenilir bir yöntem sağlar.

Figure 2
Şekil 2. Deneysel yaklaşımın ana hatları. Kısaca embriyo toplanmasından sonra roGFP2-Orp1 mRNA tek hücreli evre zebra balığı embriyolarının sarısına enjekte edilir. Gelişmekte olan embriyolar hem (A) in vitro hem de (B) in vivo görüntüleme için kullanılabilir. (A) GFP pozitif embriyolar 34 hpf'de RGC koleksiyonu için retinaları parçalamak için kullanılır. Ayrışmış RFC'ler ZFCM (+) ortamlarında PDL/laminin kaplı coverlips üzerine kaplanmıştır. RGC'ler 6-24 saat kaplamadan sonra aksonlarını uzattıkça büyüme konisi görüntülemesi yapılabilir. Hücreler, H2O2seviyelerindeki olası değişiklikleri ölçmek için farklı tedavilere tabi tutulabilir. Burada RGC'lerin (kırmızı) büyüme konilerindeH2 O2seviyelerini ölçtük. (B) In vivo görüntüleme için GFP pozitif embriyolar kullanılır. İstenilen yaşta embriyolar uyuşturulabilir ve konfokal görüntüleme için 35 mm cam dip yemeklerine monte edilebilir. Burada embriyolar retina görüntüleme için ventral olarak monte edilir. Şematik zebra balıklarında retina gelişimini gösterir. RGC'ler retinadaki en iç katman olan ganglion hücre tabakasını (GCL) oluşturur. RGC aksonları orta çizgiyi geçmek için optik sinire dönüşür ve optik chiasm oluşturur. Daha sonra, RGC aksonları, orta beyindeki optik tectum'da sinaps yapmak için dorsally büyür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri, 07/24/2020 tarihinde onaylanan protokol 2006002050 NIH yönergelerine uyularak Purdue Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (PACUC) tarafından etik olarak gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Çözümlerin hazırlanması

  1. E2 ortam (1x)
    1. Tablo 1'de gösterilen tüm bileşenleri birleştirerek 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) ve 500x E2C (100 mL) çözümleri hazırlayın. Autoclave E2A, E2B ve E2C çözümleri. 4 °C'de saklayın.
    2. 1x E2 ortam için: 100x E2A'nın 5 mL'si, 500x E2B'nin 1 mL'si ve 500x E2C'nin 1 mL'si birleştirin. Steril su ile hacmi 500 mL'ye getirin. pH'ı 7,0-7,5 olarak ayarlayın.
    3. Uzun süreli depolama için -20 °C'de 1x E2 medya deposundan 50 mL aliquot hazırlayın. Ancak, çözülme üzerine yağışlar meydana gelebilir. Stok çözeltisini kullanmadan önce yağışın tamamen çözüldüğünden emin olun.
çözüm parça miktar konsantrasyon
100X E2A (500mL)
NaCl 43,8 g 1500 mM
Kartal 1,88 g 50 mM
MgSO4 6 g 100 mM
KH2PO4 1,03 g 15 mM
Na2HPO4 0,34 g 5 mM
500X E2B (100 mL)
CaCl2 5,5 g 500 mM
500X E2C (100 mL)
NaHCO3 3 g 350 mM
1X E2 (500 mL)
100X E2A 5 mL 1 Kat
500X E2B 1 mL 1 Kat
500X E2C 1 mL 1 Kat

Tablo 1: Zebra balığı hücre kültürü için 1x E2 ortamın bileşenleri.

  1. E3 Medya (1x)
    1. 100x stok yapmak için bileşenleri Tablo 2'de gösterildiği gibi 1 L steril suda çözün. 1x E3 ortam yapmak için stoğu steril suda seyreltin.
    2. % 0.2 metilen mavisi ekleyin. 20 mL 1x E3 ortam için 40 μL metilen mavisi ekleyin.
    3. Floresan görüntüleme için metilen mavisi olmadan başka bir parti yapın.
parça Tutar (g) 100X stokta konsantrasyon (mM)
NaCl 29.22 500
Kartal 1.26 17
CaCl2 2H2O 4.85 33
MgSO4 7H2O 8.13 33

Tablo 2: Zebra balığı embriyolarının bakımı için 100x E3 ortamın bileşenleri.

  1. 80x tuzlu su stok çözeltisi
    1. Tablo 3'te gösterilen tüm bileşenleri birleştirin. 100 mL çözelti yapmak için su ekleyin. Tüm bileşenler çözülene kadar karıştırın. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
parça Tutar (g) Stokta konsantrasyon (mM)
glikoz 1.44 80
Sodyum Piruvat 0.44 40
CaCl2 2H2O 0.148 10
HEPES 6.1 256

Tablo 3: Zebra balığı hücre kültürü ortamı için 80x tuzlu su çözeltisinin bileşenleri.

  1. Zebra balığı hücre kültürü ortamı (ZFCM+)
    1. 250 mL ortam oluşturmak için Tablo 4'te gösterilen tüm bileşenleri birleştirin. pH'ı 7,5'e ayarlayın. 0,22 μm filtre kullanarak ortamı filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
parça Tutar (mL) Birim %
L-15 orta (fenol kırmızısı ile) 212.75 85.1
Fetal Sığır Serumu (FBS) 5 2
Penisilin/Streptomisiin 1 0.4
80X Tuzlu su çözeltisi 3.125 1.25
Su 28.125 11.25

Tablo 4: Zebra balığı hücre kültürünün bileşenleri serum ve antibiyotiklerle orta.

  1. Görüntüleme için Zebra balığı hücre kültürü ortamı (ZFCM-)
    1. 250 mL ortam yapmak için Tablo 5'te gösterilen tüm bileşenleri birleştirin. pH'ı 7,5'e ayarlayın. 0,22 μm filtre kullanarak filtre ortamı.
    2. Kirlenmeyi önlemek için tek kullanımlık aliquots (50 mL partiler) yapın. 4 °C'de tutun.
parça Tutar (mL) Birim %
L-15 orta (fenol kırmızısı yok) 212.75 85.1
80X Tuzlu su çözeltisi 3.125 1.25
Su 34.125 13.65

Tablo 5: Zebra balığı hücre kültürünün bileşenleri in vitro görüntüleme için serum ve antibiyotik içermeyen ortamlar.

  1. Enjeksiyon kalıpları
    1. E3 medyasında %1,5 agarose çözün. 100 x 15 mm Petri kabına ~ 25 mL agarose dökün.
    2. Kalıbı yüzeye göre 45 ° açıyla agarose'un üzerine yerleştirin ve ağır çekimle agarose üzerinde yüzmesine izin verin. Bu kabarcıklardan kaçınmaya yardımcı olacaktır. Agarose soğumaya bırakın ve tezgah üstünde katılanın.
    3. Tamamen katılaştıktan sonra, agarose kırılmasını önlemek için kalıbı yavaşça çıkarın. Taze E3 ortamı ekleyin, dökülmeleri önlemek için yemeğin etrafına parafin filmi ekleyin ve 4 °C'de saklayın (Şekil 3).

Figure 3
Şekil 3: Enjeksiyon kalıp görüntüleri. (A) Enjeksiyon plakaları yapmak için kullanılan plastik kalıp. Kalıp, embriyoları yerinde tutmak için bir 90 ° ve bir 45 ° eğimli olmak üzere altı rampaya sahiptir. (B) Agarose katılaştıktan ve küf çıkarıldıktan sonra enjeksiyon plakası. Ölçek çubukları = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. RoGFP2-Orp1 mRNA hazırlanması ve enjeksiyonu

NOT: roGFP2-Orp1 yapısı Dr. Tobias Dick, DKFZ, Almanya'dan alınmıştır. Purdue Üniversitesi Dr. Qing Deng'in Laboratuvarı'nda pCS2+ vektörüne alt klonlanmış. RNase tarafından bozulmayı önlemek için çeşitli önlemler alınmalıdır. RNase içermeyen reaktifler ve tüpler her zaman kullanılmalı, tüm adımlar için eldiven giyilmelidir ve alternatif olarak, malzemeler ve yüzeyler RNase çıkarılması için bir temizlik maddesi ile silinebilir.

  1. 3-10 μg pCS2+/roGFP2-Orp1 vektörü NotI ile doğrusallaştırın.
  2. Doğrusallaştırılmış plazmidi PCR temizleme kiti ile arındırın.
  3. In vitro, roGFP2-Orp1 mRNA'yı üretici tarafından sağlanan talimatlara göre bir in vitro transkripsiyon kiti ile yazıya dökebilir.
    1. Kapaklı transkripsiyon reaksiyon tertibatı
      1. RNA polimeraz ve doğrusallaştırılmış/saflaştırılmış DNA'yı buza yerleştirin. Vortex 10x reaksiyon tamponu ve 2x NTP/CAP tamamen çözüme geçene kadar. NTP/CAP'i buzda saklayın, ancak reaksiyonu monte ederken tamponu oda sıcaklığında (RT) tutun. Kirlenmeyi önlemek için tüpleri açmadan önce tüm reaktiflere dokunarak çevirin.
      2. RNA sentez reaksiyonlarını RT'de RNase içermeyen 0,5 mL santrifüj tüpünde aşağıda belirtilen sırayla ayarlayın. Reaksiyonun son hacmi 20 μL'dir. Reaksiyon kurulumu Tablo 6'da gösterilmiştir.
      3. Tüpe gerekirse 10 μL ribonükleotid karışımı, 2x NTP/CAP ve çekirdeksiz su ekleyin. 2 μL 10X reaksiyon tamponu ekleyin. 1-1,5 μg doğrusal DNA (6 μL'ye kadar) ekleyin. Gerekirse, 20 μL reaksiyon hacmini oluşturan çekirdeksiz su ekleyin.
      4. Tüpü kapatın, kısa bir süre girdap ve dokunmatik dönüş mikrofuge. 2 μL 10x SP6 enzim karışımı ekleyin. Bir parmak tıklaması ile kapatın ve bir mikro yakıtta dokunmatik dönüş.
      5. 2-2,5 saat boyunca 37 °C'ye yerleştirin (18 saate kadar çıkabilir).
        NOT: Sunulan deneyde en iyi sonuçlar için 37 °C'de 16-18 saat inkübasyon yapıldı.
      6. DNA şablonunu kaldırmak, parmak tıklaması, dokunmatik döndürme ve 15 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatmak için 1 μL DNase ekleyin.
reaktif Hacim (μL) Reaksiyon miktarı
2X NTP/CAP 10 1 Kat
10X Reaksiyon Tamponu 2 1 Kat
Şablon DNA'sı 6'ya kadar 1-1,5 μg
Nükleaz içermeyen su 20 μL yapmak için ekleyin
10X SP6 enzim karışımı 2 1 Kat

Tablo 6: RoGFP2-Orp1 mRNA in vitro transkripsiyon için reaksiyon kurulumu.

  1. RNA kurtarma
    1. In vitro transkripsiyon kitine verilen 25 μL lityum klorür (LiCl) ekleyin. -20 °C'de donmayan bir dondurucuya en az 30 dakika yerleştirin.
    2. 4 °C'de masa üstü santrifüjde maksimum hızda 25 dakika döndürün. Peletin rahatsız olmaması için üstnatantları dikkatlice çıkarın ve atın. 25 μL soğuk % 75 etanol ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika döndürün.
    3. Dikkatlice çıkarın ve üstnatant atın. Pelet havanın RT'de en az 5 dakika kurumasına izin verin. Kurumaya izin vermeyin. 12 μL çekirdeksiz Tris-EDTA (TE) tamponu (pH 7.0) ekleyin ve numuneyi buzda tutun.
    4. RNA konsantrasyonunu spektrofotometre ile ölçün. Genellikle 0,5- 1 μg/μL elde edilir.
    5. Fenol kırmızısı çözeltide (Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin -DPBS'sinde %0,5 fenol kırmızısı) 100 ng/μL mRNA ve tek kullanımlık aliquot (3-5 μL) hazırlayın. mRNA aliquots'u - 80 °C'de saklayın.
  1. mRNA'nın mikroenjeksiyon
    1. Enjeksiyon gününde, mRNA aliquotlarından birini kullanın ve yumurta sarısı19aracılığıyla tek hücreli evre embriyolara 1 nL mRNA enjekte etmek için zebra balığı embriyo enjeksiyon protokolünü izleyin. Aşağıda kısa bir açıklama verilmiştir.
    2. Yetişkin balıkları yetiştirin ve daha önce açıklandığı gibi embriyoları toplayın20.
    3. Pipet çekme ile mikroenjeksiyon iğneleri çekin. 10 μm uç açıklığı oluşturmak için iğnelerin ucunu tokmaklarla kesin.
    4. Embriyoları Adım 1.6'da açıklanan bir enjeksiyon kalıbına hizalayın.
    5. MRNA'nın 1 nL'sini bir cam mikroenjeksiyon pipet ile fenol kırmızısı olarak enjekte edin.
    6. Embriyoları toplayın ve E3 medyasında tutun.
    7. embriyoları istenen gelişim aşamasına gelene kadar E3 ortamlarında 27 °C inkübatörde tutun. Enjekte edilen embriyolar hem in vitro (bölüm 3 ve bölüm 4) hem de in vivo görüntüleme (bölüm 5) için kullanılabilir. RoGFP2-Orp1'i ifade eden embriyolar, floresan ışık ve mavi/yeşil filtre seti ile donatılmış düzenli bir diseksiyon mikroskobu ile deneylerden önce ön seçim yapılabilir.

3. Zebra balığı embriyolarından elde edilen primer retinal ganglion hücre kültürü

NOT: Bu protokol daha önce yayımlanmış bir yöntem olan 21'denuyarlanmıştır. Laminer akış başlığında 3.1 ve 3.2 adımlarını gerçekleştirin.

  1. Kapak örtülerinin hazırlanması
    1. Her deneyde 4-6 kültür plakası hazırlayın. %100 etanolde depolanan asitle temizlenmiş kapak örtüleri (22 x 22 mm kare; 0,16-0,19 mm kalınlık) kullanın.
    2. Bir kapak kapağını, yedekleri kullanarak depolama kabından çıkarın ve artık etanolleri çıkarmak için alevlendirın.
    3. Kapak kapağını 35 mm'lik bir kültür çanağının içine bir açıyla yerleştirerek tamamen kurulayın.
    4. Steril suda 10x stok (5 mg/mL) seyrelterek Poli-D-Lizin (PDL) çalışma çözeltisini (1x) hazırlayın.
    5. Her kapak ucunun ortasına 100 μL 0,5 mg/mL PDL uygulayın ve çözeltinin kenarlara yayılmasını önleyin.
    6. PDL'yi kapak örtülerinde oda sıcaklığında (RT) 20-30 dakika kuluçkaya yatırın. PDL'nin kurumadığını unutmayın.
    7. PDL'yi 0,5 mL steril suyla üç kez yıkayın. Tabakların tamamen kurumasına izin verin.
    8. 50x stoku (1 mg/mL) 1x PBS'de seyrelterek laminin çalışma çözeltisi (1x) hazırlayın.
    9. PBS'de 100 μL 20 μg/mL laminin her kapak ucunun ortasına uygulayın ve çözeltinin kenarlara yayılmasını önleyin.
    10. Plakaları 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 2-6 saat kuluçkaya yatırın. Laminin çözeltisinin kurumasından kaçının.
  2. Embriyo diseksiyonu ve kaplama RGC'leri
    1. Dört adet 35 mm'lik doku kültürü yemeği hazırlayın ve etiketlenin ve 4 mL ile doldurun: %70 etanol, "E2 media 1", "E2 media 2", "E2 media 3" diseksiyon gününde. Bulaşıkları parçalara göre buzdolabında saklayın.
    2. Zebra balığı embriyoları döllenmeden (hpf) 34 saat sonra olduğunda, laminin ile kaplanmış kültür yemeklerini inkübatörden alın ve kapakları 0,5 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın.
    3. Son yıkamadan sonra, her kültür yemeğine 4 mL ZFCM (+) ortam ekleyin ve plakayı kurutmaktan kaçının.
    4. Hazırlanan kültür yemeklerini Adım 3.2.1'den alın. Rt'ye eşitlik versinler.
    5. 4-6 PCR tüpünü 15 μL ZFCM(+) ortamla doldurun. RGC'leri tek bir kapak kapağına kaplanacak şekilde 4 gözden hazırlamak için bir tüp gereklidir.
    6. Zebra balığı embriyolarını inkübatörden alın ve embriyoları sterilize etmek için 5-10 sn boyunca% 70 etanol içeren 35 mm doku kültürü kabına daldırın.
    7. Bir transfer pipet kullanarak, fazla etanol yıkamak için steril E2 ortamı içeren E2 Media 1 kabına embriyo transfer edin.
    8. Embriyoları E2 Media 2 çanağından aktarın ve keskin tokmaklarla korozyonlarını çıkarın.
    9. Diseksiyon yapmak için embriyoları son E2 Media 3 çanağından transfer edin.
    10. Bir çift ince asa kullanarak, retinaları daha önce açıklandığı gibi parçalara 22.
    11. Embriyoları ön taraftaki yumurta sarısını ön tarafa ön olarak ön tarafa yerleştirin ve ön taraflardan biriyle tutun ve kuyruk arkasını diğer önpsüklerle yumurta sarısı kesesine çıkarın.
    12. Boynunu tokmaklarla tutun ve beyni ve gözleri E2 ortamına maruz bırakmak için başını koparın. Yumurta sarısı kesesini kesmekten kaçının.
    13. İnce tokmakla, ikinci peripslerle kranial dokuyu aşağı tutarken, gözleri yavaşça kafadan yuvarlayın. Gözleri bitişik doku kalıntılarından izole edin.
    14. Dört gözü ZFCM(+) içeren önceden hazırlanmış tüplerden birine aktarın.
    15. Hücreleri ayrıştırmak için P20 pipet ve yaklaşık 45 kez sarı bir uçla hafifçe yukarı ve aşağı titratlayın. Hava kabarcıklarından kaçının.
    16. ZFCM'yi(+) ayrışmış hücrelerle kapak sapanı merkezine aktarın. Ek kapaklar için 10-12 arası adımları yineleyin.
    17. Titreşimleri emmek için bir polistiren köpük raf üzerinde 22 °C'de tezgah üstünde kültürleri koruyun.
    18. Kaplamadan sonra 6-24 saat görüntüleme gerçekleştirin.
      NOT: Embriyoları farklı kültür yemeklerine aktarmak için transfer pipeti kullanın. Etanol üzerinde taşımayı önlemek için her çözelti için pipet değiştirin (Adım 6-8).

4. Kültürlü RGC nöronlarının in vitro ROS görüntülemesi

  1. Görüntüleme gününde (hücre kaplamadan sonra tipik olarak 6-24 saat), RGC aksonlarının büyümesini doğrulamak için mikroskop altında hücreleri kontrol edin.
  2. Canlı hücre görüntüleme için, kapakları kültür çanaktan canlı hücre görüntüleme odasına aktarın. Bu durumda, daha önce açıklanan özel yapım bir açık oda23.
  3. Görüntüleme için mikroskop kurun. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) hedefi, OG590 uzun geçişli kırmızı filtre ve EM-CCD kamera ile donatılmış ters bir mikroskop kullanın.
  4. Görüntülemeden önce, ZFCM(+) ortamını ZFCM(-) ile değiştirin.
  5. Hücreler 10x hedefiyle konumlandıktan sonra, yüksek NA yağı daldırma hedefi kullanarak 60x büyütmede görüntüler elde edin. Ek bir 1,5x büyütme kullanın.
  6. İlk olarak, DIC görüntülerini edin. Ardından, uygun bir filtre kümesi kullanarak roGFP2-Orp1 görüntüsünü görüntüleyin. 405/20 ve 480/30 nm eksitasyon filtreleri ile roGFP2-Orp1'i sırayla heyecanlandırın ve emisyon ışığı dikroik ayna 505DCXR'yi geçtikten sonra 535/30 nm emisyon filtresi ile görüntüler elde edin.
  7. İlk görüntü setini aldıktan sonra, farklı tedavi çözümleri içeren medya ile medya alışverişi. pH ve osmolarite değişikliklerini önlemek için medya her 30 dakikada bir değiştirilmelidir.

5. Gelişmekte olan embriyoların in vivo ROS görüntülemesi

  1. In vivo görüntüleme için embriyoları 22-24 bgf arasında metilen mavisi olmadan %0.003 Fenilthiourea (PTU) içeren E3 ortamlarında tutun. Medya alışverişi ve ölü embriyoları günlük olarak çıkarın.
  2. İstenilen yaşta embriyoları %0.016 trikainde uyuşturun. 35 mm'lik cam dip kültürü yemeklerine %1 düşük eriyen agarose ile uyuşturulmuş embriyolar monte edin. Embriyolar, görüntüleme için ilgi alanına bağlı olarak dorsally, ventral veya yanal olarak yönlendirilebilir.
  3. Agarose katılaştıktan sonra, bulaşıkları metilen mavisi / % 0.016 trikain olmadan E3 ortamı ile doldurun.
  4. Mikroskobu görüntüleme için ayarlayın. Ters lazer tarama konfokal mikroskobu kullanın. Alternatif olarak, bir agarose damlasının üzerine monte edilmiş embriyoları görüntülemek için su daldırma lensi ile donatılmış dik bir konfokal mikroskop kullanın.
  5. 405 nm ve 488 nm eksitasyon filtreleri ile roGFP2-Orp1'i sırayla heyecanlandırın ve 515-535 nm aralığında emisyon filtreleri ile ilgili görüntüleri elde edin.
  6. Embriyoların istenen kısmı boyunca 5 μm kesit kalınlığında z-yığınları elde edin. Embriyolar gelişimin ilerleyen aşamalarında görüntüleme için tutulabilir.
  7. Görüntülemeden sonra, embriyoları ince forsepslerle agarosedan çıkarın ve PTU ile metilen mavi içermeyen medyada istenen yaşa kadar inkübatörde tutun.

6. Görüntü analizi ve işleme

  1. H 2O2 seviyelerinin 405/480 oran değerlerine göre ölçümü
    1. Görüntü analizi için uygun bir yazılım kullanın. ImageJ yazılımı burada görüntü analizi ve işlenmesi için kullanılmıştır.
    2. Dosyaları sürükleyerek veya Dosya |'na tıklayarak ImageJ yazılımında DIC, 405/535 ve 480/535 görüntülerini açın 'nin adresini açın. Henüz yapılmamışsa, Görüntü |'na tıklayarak görüntüleri 32 bit'e dönüştürün | yazın 32-bit.
    3. Kontrol çubuğundan (hücre gövdesi, büyüme konisi, retina vb.) serbest el aleti ile ilgi çekici bölgeyi (ROI) tanımlayın. Analiz |'ni tıklatarak yatırım getirisi yöneticisini açma Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi. Tanımlanan yatırım getirisini eklemek için Yatırım Getirisi Yöneticisi sekmesinde Ekle'yi tıklatın.
    4. Yatırım getirisine yakın bir bölge çizin ve arka plan yatırım getirisi olarak ekleyin. Yatırım getirisini seçip yatırım getirisi yöneticisi sekmesinden Ölç'ü tıklatarak ortalama arka plan değerlerini ölçün.
    5. Ölçümdeki ortalama yoğunluk değerlerine dikkat edin. İşlem |'na tıklayarak floresan görüntülerden ortalama arka planın değerini çıkarın Matematik | öğesini çıkarın. Bu adımı hem 405/535 hem de 480/535 görüntüler için gerçekleştirin.
    6. İşlem |'na tıklayarak "0" değerlerini ortadan kaldırmak için 480/535 floresan görüntüye "1" değeri ekleyin Matematik | Oran hesaplamadan önce işlev ekleyin.
    7. İşlem |'i tıklatın Resim Hesaplayıcı | ImageJ'deki işlevi bölerek 405/535 görüntüyü piksel piksel 480/535'e bölün. 480/535 görüntüye bölünecek 405/535 görüntüyü seçin. 32 bit çıkış görüntüsü seçin.
    8. Önce oran görüntüsünü ve ardından yatırım getirisi yöneticisi sekmesindeki yatırım getirisini tıklatarak oran görüntüsüne yatırım getirisi uygulayın.
    9. Yatırım getirisi yöneticisi sekmesinde Ölç'e tıklayarak 405/535 görüntünün ortalama oran değerlerini 480/535 görüntüye ölçün.
    10. Uygun istatistiksel analizi gerçekleştirmek için mümkün olduğunca çok örnek için 6.1.2-6.1.9 adımlarını uygulayın.
  2. Oran görüntüsünü görüntüleme
    NOT: Bu yordam, arka planı numunenin dışına çıkarmak ve görüntüye bir renk arama tablosu uygulamaktır.
    1. 6.1.7. adımda ImageJ'de oran görüntüsü oluşturulduktan sonra, Dosya |'nı tıklatarak 32 bit siyah bir görüntü oluşturun Yeni | Resim.
    2. H 2O 2seviyelerini görüntülemek istediğiniz yatırım getirisini, önce yeni görüntüye ve ardından yatırım getirisi yöneticisi sekmesinden yatırım getirisine tıklayarak yeni görüntüye uygulayın.
    3. | Düzenle'yi tıklatarak maske oluşturma Seçim | Maske Oluştur.
    4. Yatırım getirisi değerini "1" olarak ayarlamak için maske görüntüsünü 255'e bölün ve arka plan değerleri "0" olacaktır. İşlem |'i tıklatın Matematik | Böl ve 255 yaz.
    5. İşlem |'na tıklayarak maskeyi oran görüntüsüyle çarpın Resim Hesaplayıcı | Çarpma işlevi. Bu, yalnızca yatırım getirisini gösteren gri ölçekli bir oran görüntüsüne neden olur.
    6. Resim | tıklayarak tabloyu "Ateş" olarak değiştirin Tablolara | Ateş .
      NOT: İşlem | tıklatılarak oranın daha iyi görselleştirilmesi için tüm görüntülere çarpma faktörü uygulanabilir Resim | Çarpın.
    7. Görüntü |'na tıklayarak oran görüntüsünü 8 bit'e dönüştürme | yazın 8-bit.
    8. Analiz |'ne tıklayarak kalibrasyon çubuğu ekleme Araçlar | Kalibrasyon Çubuğu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kültürlü zebra balığı RGC'leri 1d içinde aksonları genişletir. H 2 O2-biosensor'un temsili405/480oranlı görüntüsü Şekil 4A'dagösterilmiştir. Hücre gövdesi, akson ve büyüme konileri bireysel nöronlarda açıkça görülebilir. Bu nöronlar H2O2 değişikliklerini izlemek için zamanla farklı tedavilere tabi tutulabilir. Daha önce kültür ortamına 100 μM H2O2 eklenmesinin oran değerlerini artırdığını ve bu sistemle gerçek zamanlı değişikliklerin tespit edilebileceğini gösterdiğini gördük (Şekil 4)24.

Figure 4
Şekil 4: RoGFP2-Orp1 ile kültürlü zebra balığı RGC'lerinde H2 O2 görüntüleme. (A) 34 hpf yaşlı zebra balığı embriyosundan kültürlü RGC nöronlarının 405/480 nm oranlı görüntüleri. Soldaki nöron serumsuz kontrol ortamı ile, sağdaki nöron ise 30 dakika boyunca 100 μM H2O2 ile tedavi edildi. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Kontrol veya 100 μM H2 O2ile tedaviden önce ve sonra vahşi tip zebra balığı RGC büyüme konilerinde ortalama H 2O2seviyelerini gösteren çubuk grafikler. Veriler tedaviyi kontrol etmek için normalleştirildi. Veriler SEM± ortalama olarak gösterilir. İki kuyruklu Wilcoxon eşleşmeli çiftler imzalı sıralama testi; **p = 0.0009. Şekil önceki yayınımızdan değiştirilmiştir24. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

H2O2 seviyeleri tüm zebra balığı embriyolarında da belirlenebilir (Şekil 5). MRNA tek hücreli aşamada enjekte edilirken, tüm dokular roGFP2-Orp1 biyosensörini ifade eder. Şekil 5A'da zebra balığı larvalarının baş bölgesini iki farklı zaman noktasında gösteriyoruz, örnek olarak retinadaki H2O2 seviyelerine odaklanıyoruz. Daha önce göstermiştik H2O2'nin eklenmesi oran değerlerini gerçek zamanlı olarak artırırken, azaltıcı ajan DTT'nineklenmesi bu etkiyi tersine çevirir vivo24. Burada aynı zebra balığı embriyolarında H 2 O2bazal seviyelerini2 dpf ve 5 dpf olarak ölçtük. 2 dpf'de oran değerleri 5 dpf'den önemli ölçüde düşüktü (p<0.0001; Şekil 5B). Ayrıca, her hayvan retina H 2O 2içeriğinde farklı bir artış gösterdi (Şekil 5C).

Figure 5
Şekil 5: Zebra balığı larvalarında roGFP2-Orp1 ile in vivo H 2 O2 görüntüleme. (A) 2 ve 5 dpf zebra balığı larvalarının DIC ve 405/480 nm oranlı görüntüleri. Yatırım getirisi, oran değerlerini ölçmek için retina (sarı çizgiler) olarak tanımlanır. Aynı larvalar 2 ve 5 dpf'de analiz edildi. Ölçek çubukları = 50 μm. (B)2ve5 dpf zebra balıklarının retinalarında ortalama H 2 O 2 seviyelerinin ölçümü. 5 dpf'de H2O2-düzeyleri retinada 2 dpf'ye göre önemli ölçüde artar. (C) Tek tek balıkların ölçümlerinin çizgi grafiği. Her hayvan retinasındaki H 2 O2seviyelerinde2ila 5 dpf arasında bir artış sergiler. Veriler SEM± ortalama olarak gösterilir. İki kuyruklu Wilcoxon eşleşmeli çiftler imzalı derece testi, **p<0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol boyunca dikkat etmeniz gereken birkaç kritik adım vardır. Bu noktaların göz önünde bulundurulmasının deneysel akışı iyileştireceğine inanıyoruz. Birincil RGC kültürü için, ZFCM'nin (-) sterilitesi çok önemlidir, çünkü bu kültür ortamı antibiyotik içermez ve görüntülemeden önce veya görüntüleme sırasında kontaminasyon oluşabilir. Bundan kaçınmak için, ZFCM'yi (-) yalnızca bir biyogüvenlik kabini içinde hazırlamanızı ve kullanmanızı ve düzenli olarak taze ZFCM (-) medyası yapmanızı tavsiye ederiz (Adım 1.5). Ek olarak, laminin stokları -80 ° C'de tutulmalıdır. Çözülen laminin her zaman 4 °C'de saklanmalıdır. Laminin çözeltilerini oda sıcaklığında tutmayın veya proteinin neurit büyümesini teşvik eden aktiviteyi azalttığı için yeniden donma.

Zebra balığı retinasının uygun zamanda parçalanması, aksonları uzatan yeterli RGC sağlamak için önemlidir. Zebrafish RGC'ler 28 hpf'de doğar ve 32-36 hpf'den başlayarak aksonları retinadan uzatır. Bu nedenle, RGC'lerin tam olarak farklılaşmasına izin vermek için 28 hpf'den sonra, tercihen 32-36 hpf arasında RGC'lerin plakalanması kritik öneme sahiptir. 30 dakikadan fazla görüntüleme yaparken ZFCM(-) ortamını değiştirmeniz önerilir. Bu ortam fenol kırmızısı olmadığından, pH değişiklikleri görünmez ve dikkate alınması gerekebilir. İşlem sırasında nöronların yerinden çıkmasını önlemek için medyayı çok dikkatli bir şekilde değiştirin (Adım 4.7).

Son olarak, medyayı PTU ile E3 olarak değiştirmek, ancak metilen mavisi olmadan 24 hpf gereklidir. PTU, in vivo floresan görüntüleme için gerekli gelişmiş larva şeffaflığı için pigmentasyonu önler; bununla birlikte, PTU ile daha erken tedavi gelişimsel kusurlara neden olabilir26. Metilen mavisi, çoğunlukla yumurta sarısından kaynaklanan otofluoresansı azaltmak için E3 medyasından çıkarılır (Adım 5.1).

Bu yöntem, H 2 O2'ninsitoplazmik olarak algılanmasını sağlar. Bununla birlikte, H 2 O2'ninhücre altı bölümlere ayırması yerel sinyalizasyona katkıda bulunur ve sitoplazmik H2O2- seviyeleri H 2O2'ninbelirli sinyal rolleri hakkında yeterli bilgi sağlamayabilir. RoGFP2-Orp1 genetik olarak kodlanmış bir biyosensör olduğundan, dokuya özgü ifade (örneğin, nöronlar, astrositler, glial hücreler vb.) veya belirli hücre altı konumlar (örneğin, plazma zarı, mitokondri, çekirdek vb.) için hedeflenebilir. RoGFP2-Orp1 GFP tabanlı bir biyosensör olduğundan, diğer floresan problarla kombinasyon yeşil spektrumun dışındaki emisyon dalga boylarıyla sınırlıdır. GFP yaygın olarak transgenez belirteci olarak kullanıldığından, GFP tabanlı biyosensörlerin kullanımı sınırlanabilir. Bu zorluğu gidermek için, H2O2 -algılama için kırmızı floresan proteinler yakın zamanda geliştirilmiştir27. Ayrıca, roGFP2-Orp1 burada sunulan yöntemde geçici olarak ifade edilir. Bu nedenle, mRNA ve protein ekspresyyürü zamanla çürüyecektir. 5 dpf larvada sinyali tespit edebildik; bununla birlikte, biyosensörün gelişim boyunca ve yetişkinliğe istikrarlı bir şekilde ifade edilmesi için transgenik balık hatlarının kurulması gerekir.

Hücre içi ROS 'u (örneğin, H2DCF-DA) veya özellikle H 2 O 2 (PF6-AM)28, 29'utespit etmek için çeşitli boya bazlı tahliller mevcuttur. RoGFP2-Orp1 gibi genetik olarak kodlanmış bir biyosensör kullanmanın boya bazlı yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, geri dönüşümlü olduğu için oksidatif durumdaki her iki geçici değişikliğin ve belirli hücre altı konumların algılanmasını sağlar. Bu nedenle, dinamik değişiklikler yüksek derecede uzamsal çözünürlük30ile iyi izlenir. İkincisi, genellikle boya moleküllerine kıyasla hücrelere veya dokulara daha az toksisite sergiler. Son olarak, biyosensör, belirli deneylerin ihtiyaçlarını karşılamak için genetik olarak daha fazla manipüle edilebilir31. roGFP2-Orp1, iki heyecan ve bir emisyon zirvesine sahip olduğu için oranmetrik bir biyosensördür. H2O2ile etkileşim üzerine 405 nm heyecan artar ve 480 nm heyecan azalır. Bu nedenle, okuma, sırasıyla 405 ve 480 nm ekscitasyon tarafından elde edilen yoğunluk değerlerinin oranıdır. Bu prob ratiometrik olduğundan, olası hacim efektleri için düzeltmek için ikinci bir prob uygulaması gereksiz hale gelir. Ayrıca, bu prob sadece bir polipeptit ekspresyonunu içerdiğinden, intermoleküler Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) durumunda olduğu gibi birden fazla proteinin diferansiyel ekspresyonunun potansiyel sorunlarından muzdarip değildir.

RoGFP2-Orp1, ROS üretimini ve sinyalini incelemek için çok yönlü birH2 O2 probudur. Canlı hücrelerde, bu prob dinamik 4.8 (transgenik zebra balığı embriyolarında yaklaşık 4)15,32. Bununla birlikte, roGFP2-Orp1'in redoks durumu endojen tiyoksin ve glutaredoksin sistemleri tarafından değişikliklere tabidir; bu nedenle, Orp1'in başka bir maya peroksitedoksin, Tsa233,34ile değiştirilmesiyle daha hassas problar geliştirilmiştir. RoGFP2-Orp1 zebra balığı embriyolarında H 2 O2'dekideğişiklikleri tespit etmek için yararlı olsa da, hassasiyet çoğunlukla daha yüksek eksojen olarak uygulanan H 2 O 2 24,31veya güçlü uyaranlarla sınırlıdır. Örneğin, slit2 tedavisi vahşi tip RGC'lerde roGFP2-Orp1 sinyalini artırdı, ancak nox2 mutant RGC35'tedeğil. Öte yandan, bazal H 2 O2seviyelerinde wildtype ve nox2 mutant RGC'ler ile 2 dpf embriyo24,35arasında fark yoktu. Bu nedenle, H 2O2'dekibazal seviyeleri veya küçük değişiklikleri tespit etmek için daha yüksek hassasiyet problarına ihtiyaç duyulacaktır.

HyPer, genetik olarak kodlanmış ve oranmetrik H2O2-spesifik biyosensör36olarak yaygın olarak kullanılan bir başkadır. Her iki probun hassasiyetleri benzerdir; ancak, roGFP2-Orp1 H 2O 2 değişiklikleri15daha yavaş yanıt verdi. Bu nedenle, gerçek zamanlı değişikliklerin tam olarak algılanmasını roGFP2-Orp1 yerine HyPer gerektirebilir. İlk HyPer sürümleri pH değişikliklerinden etkilenirken, roGFP2-Orp116,36değildir. Bu nedenle, HyPer37kullanırken bir pH kontrol probu (SypHer3s) eklemek önemlidir. En son HyPer probu, HyPer7, mevcut H2O 2 problarının dezavantajlarının çoğunu aştı: HyPer7 daha yüksek pH stabilitesi, artan parlaklık, daha hızlı kinetik ve daha yüksek dinamik aralık38. Ayrıca, HyPer7 hem in vitro hem de in vivoolarak doğrulanır, alt hücre bölmelerini gösterir ve yara iyileşmesi sırasında zebra balığı embriyolarındaki gerçek zamanlı H2O2 değişikliklerini izleme38.

Burada sunulan metodoloji, ROS sinyalinin hem in vitro hem de in vivorolünü incelemek için genişletilebilir. roGFP2-Orp1 ekspresyör nöronları H2O2 sinyali üzerindeki etkilerini incelemek için farklı tedavilere tabi tutulabilir. Örneğin, RPC'lerin H 2O 2seviyelerindeki değişikliklere gerçek zamanlı olarak yanıt verdiğini gösterdik (Şekil 4), biyosensörün H2O2'deki hemen değişiklikleri algılayabileceğini öne sürdük. Bununla birlikte, mutlak hücre içi H2O2 konsantrasyonlarının belirlenmesi, sistemin kapsamlı kalibrasyonunu gerektirir. Biyosensörün algılama sınırı da belirsizdir. Ek olarak, hücredeki biyosensörün ayrıntılı mekansal dağılımı tam olarak bilinmemektedir, bu da sonuçların yorumlanmasını engelleyebilir. Ayrıca, roGFP2-Orp1'den gelen tam konum sinyalinin belirlenmesi, lokalize hücre içi sinyalizasyona katkıda bulunan cilde özgüH2 O 2 üretimiolup olmadığını ortaya açabilir.

RoGFP2-Orp1'i ifade eden transgenik balık oluşturmanın sayısız avantajı vardır. Biyosensör her yerde veya zebra balığı39'daTol2 transgenez kullanılarak hücreye özgü H2O2 sinyalini incelemek için dokuya özgü bir promotör altında ifade edilebilir. H 2 O2'nin gelişimdeki rolü biyosensörün her yerde ekspresyoni ile incelenebilir. Örneğin, transgenik zebra balığı embriyoları, H2O2 seviyelerindeki değişiklikleri ve bu değişikliklerin farklı gelişim aşamalarına nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek için izlenebilir. Öte yandan, roGFP2-Orp1'in dokuya özgü ifadesi, H2O2 üretiminin hücrelerde veya ilgi çekici dokularda etkilerine odaklanır. Doku veya hücreye özgü promotörler, belirli hücrelerde roGFP2-Orp1 ekspresyonunun yönlendirilmesi için kullanılabilir. Ayrıca, Gal4/UAS sistemi bireysel nöronların seyrek etiketlenebilmesi için kullanılabilir. Bu nedenle, bu yaklaşım H2O2 seviyelerinin bir hücresel çözünürlüktetespitine izin verir vivo . Son olarak, zebra balığı embriyolarında ROS sinyali ve oksidatif stres içeren yüksek verimli ilaç taraması için stabil transgenik çizgiler kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (Grant R01NS117701), Ulusal Bilim Vakfı (Grant 1146944-IOS), Indiana Travmatik Omurilik ve Beyin Hasarı Araştırma Fonu (Grant 20000289), Purdue Araştırma Vakfı (Grant 209911) ve Purdue Üniversitesi Araştırma ve Ortaklıklardan Sorumlu Başkan Yardımcısı Ofisi (Grant 210362) tarafından desteklendi. Dr. Cory J. Weaver ve Haley Roeder'a zebra balığı RGC kültür protokolünü oluşturdukları için teşekkür ederiz. Haley Roeder'a Şekil 4'ün verilerini sağladığı için ayrıca teşekkür ederiz. Leah Biasi ve Kenny Nguyen'e RGC kültürüne yardımları için teşekkür ederiz. Gentry Lee'ye metni düzenlediği için teşekkür ederiz. RoGFP2-Orp1 içeren pCS2+ vektörü için roGFP2-Orp1 ve Dr. Qing Deng sağladığı için Dr. Tobias Dick'e teşekkür ederiz. Şekil 2 Biorender.com ile oluşturulur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35-mm culture dish Sarstedt 83-3900
35-mm glass bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes Sutter/Fisher Scientific NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Cover glass Corning 2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) VWR 25384-094
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 26140087
Glucose Sigma Aldich G7528
HEPES Sigma Aldich H4034
Injection Mold Adaptive Science Tools TU-1
Inverted Microscope Nikon TE2000
Laminin ThermoFisher Scientific 23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss 710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red Gibco/Fisher Scientific 11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red Gibco/Fisher Scientific 21-083-027
Low melting agarose Promega V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
PBS Hyclone/Fisher Scientific SH3025601
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
Phenol Red Sigma Aldich P0290
Phenylthiourea (PTU) Sigma Aldich P7629
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments PV820
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma Aldich P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit QIAGEN 28104
Recombinant mouse slit2 R&D Systems 5444-SL-050
Sodium Pyruvate Sigma Aldich P5280
Steritop 0.22 µm filter Millipore S2GPT05RE
TE Buffer Ambion AM9860
Tricaine Methanesulfonate Sigma Aldich E10521
Vertical Pipette Puller David Kopf Instruments 700C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
  2. Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
  3. Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development. Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).
  4. Terzi, A., Suter, D. M. The role of NADPH oxidases in neuronal development. Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).
  5. Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).
  6. Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum. Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).
  7. Le Belle, J. E., et al. Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
  8. Nayernia, Z., et al. Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC. Redox Biology. 13, 82-93 (2017).
  9. Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture. Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).
  10. Munnamalai, V., et al. Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones. Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).
  11. Kishida, K. T., et al. Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease. Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).
  12. Ravelli, K. G., et al. Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis. Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).
  13. Park, L., et al. Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).
  14. Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence. Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).
  15. Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
  16. Bilan, D. S., Belousov, V. V. New tools for redox biology: from imaging to manipulation. Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).
  17. Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology. Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).
  18. Sassen, W. A., Koster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).
  19. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  20. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  21. Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).
  22. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).
  23. Suter, D. M. Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro. Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).
  24. Weaver, C. J., et al. nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity. Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).
  25. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).
  26. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).
  27. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
  28. Oparka, M., et al. Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer. Methods. 109, 3-11 (2016).
  29. Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain. Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).
  30. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).
  31. Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
  32. Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues. Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).
  33. Breus, O., Dickmeis, T. Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration. Biological Chemistry. , (2020).
  34. Morgan, B., et al. Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes. Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).
  35. Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Bilan, D. S., Belousov, V. V. HyPer family probes: State of the art. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).
  37. Ermankova, Y. G., et al. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range. Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).
  38. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  39. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).

Tags

Nörobilim Sayı 168 ROS hidrojen peroksit roGFP2-Orp1 biyosensör RGC zebra balığı nöronal gelişim
Nöronal Gelişim Sırasında ROS Canlı Hücre Görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. … More

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development. J. Vis. Exp. (168), e62165, doi:10.3791/62165 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter