Summary
Nous présentons ici une méthode pour imager le cerveau embryonnaire du poisson-zèbre in vivo jusqu’aux stades larvaire et juvénile. Cette procédure micro-invasive, adaptée des approches électrophysiologiques, donne accès aux détails cellulaires et subcellulaires des neurones matures et peut être combinée avec des études optogénétiques et neuropharmacologiques pour caractériser la fonction cérébrale et l’intervention médicamenteuse.
Abstract
Comprendre les changements éphémères qui se produisent au cours du développement et de la maturation du cerveau nécessite une imagerie détaillée à haute résolution dans l’espace et le temps à la résolution cellulaire et subcellulaire. Les progrès des technologies moléculaires et d’imagerie nous ont permis d’acquérir de nombreuses connaissances détaillées sur les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement du cerveau dans l’embryon transparent de poisson-zèbre. Récemment, les processus de raffinement de la connectivité neuronale qui se produisent à des stades larvaires ultérieurs plusieurs semaines après la fécondation, qui sont par exemple le contrôle du comportement social, la prise de décision ou le comportement motivé par la motivation, sont passés au centre de la recherche. À ces stades, la pigmentation de la peau du poisson-zèbre interfère avec la pénétration de la lumière dans le tissu cérébral et les solutions pour les stades embryonnaires, par exemple l’inhibition pharmacologique de la pigmentation, ne sont plus réalisables.
Par conséquent, une solution chirurgicale mini-invasive pour l’accès microscopique au cerveau du poisson-zèbre éveillé est fournie qui est dérivée d’approches électrophysiologiques. Dans les téléostéens, la peau et le cartilage mou du crâne peuvent être soigneusement enlevés en micro-pelant ces couches, exposant les neurones sous-jacents et les voies axonales sans dommage. Cela permet d’enregistrer la morphologie neuronale, y compris les structures synaptiques et leur contenu moléculaire, et d’observer les changements physiologiques tels que les transitoires Ca2+ ou les événements de transport intracellulaire. En outre, l’interrogation de ces processus au moyen d’une inhibition pharmacologique ou d’une manipulation optogénétique est possible. Cette approche d’exposition cérébrale fournit des informations sur les changements structurels et physiologiques dans les neurones ainsi que sur la corrélation et l’interdépendance de ces événements dans les tissus cérébraux vivants de l’ordre de quelques minutes ou heures. La technique convient à l’imagerie cérébrale in vivo des larves de poisson zèbre jusqu’à 30 jours après la fécondation, le dernier stade de développement testé jusqu’à présent. Il donne ainsi accès à des questions aussi importantes que le raffinement et la mise à l’échelle synaptiques, le transport axonal et dendritique, le ciblage synaptique de la cargaison cytosquelettique ou l’expression dépendante de l’activité locale. Par conséquent, une large utilisation de cette approche de montage et d’imagerie peut être anticipée.
Introduction
Au cours des dernières décennies, le poisson-zèbre (Danio rerio) a évolué comme l’un des organismes modèles de vertébrés les plus populaires pour les études de développement embryonnaire et larvaire. La grande fécondité des femelles de poisson zèbre associée au développement rapide ex utero de l’embryon et à sa transparence au début du développement embryonnaire ne sont que quelques facteurs clés qui font du poisson-zèbre un organisme modèle puissant pour répondre aux questions de développement1. Les progrès des technologies de génétique moléculaire combinés à des études d’imagerie in vivo à haute résolution ont permis d’aborder les mécanismes biologiques cellulaires sous-jacents aux processus de développement2. En particulier, dans le domaine de la différenciation neuronale, de la physiologie, de la connectivité et de la fonction, le poisson-zèbre a mis en lumière l’interaction de la dynamique moléculaire, des fonctions cérébrales et du comportement de l’organisme avec des détails sans précédent.
Pourtant, la plupart de ces études sont limitées aux stades embryonnaires et larvaires précoces au cours de la première semaine de développement, car la transparence du tissu du système nerveux est progressivement perdue. À ces stades, le tissu cérébral est empêché d’y accéder par des approches de microscopie à haute résolution qui sont protégées par la différenciation et la pigmentation du crâne3.
Par conséquent, les questions clés de la différenciation neuronale, de la maturation et de la plasticité telles que le raffinement de la connectivité neuronale ou la mise à l’échelle synaptique sont difficiles à étudier. Ces processus cellulaires sont importants afin de définir les mécanismes cellulaires qui conduisent, par exemple, le comportement social, la prise de décision ou le comportement basé sur la motivation, domaines dans lesquels la recherche sur les larves de plusieurs semaines a récemment contribué à des résultats clés basés sur des études comportementales4.
Les approches pharmacologiques pour inhiber la pigmentation chez les larves de poisson zèbre pendant plusieurs semaines sont à peine réalisables ou peuvent même causer des effets néfastes5,6,7,8. Les souches doubles ou triples mutantes avec des défauts de pigmentation spécifiques, telles que le casper9 ou le cristal10,sont devenues des outils extrêmement précieux, mais sont laborieuses dans la reproduction, fournissent peu de progéniture et présentent le danger d’accumuler des malformations génétiques dues à une consanguinité excessive.
Ici, une procédure invasive minimale comme alternative est fournie qui est applicable à toute souche de poisson zèbre. Cette procédure a été adaptée à partir d’études électrophysiologiques pour enregistrer l’activité neuronale chez les larves de poisson zèbre vivantes et éveillées. Dans les téléostéens, la peau et le cartilage mou du crâne peuvent être soigneusement enlevés en micro-pelant ces couches, car elles ne sont pas étroitement imbriquées avec le système vasculaire cérébral. Cela permet d’exposer les tissus cérébraux contenant des neurones et des voies axonales sans dommage et d’enregistrer la morphologie neuronale, y compris les structures synaptiques et leur contenu moléculaire, qui à leur tour incluent l’observation de changements physiologiques tels que les transitoires Ca2+ ou les événements de transport intracellulaire pendant plusieurs heures. De plus, au-delà des caractérisations descriptives, l’accès direct au tissu cérébral permet d’interroger les fonctions neuronales matures au moyen de l’administration de substances neuropharmacologiques et d’approches optogénétiques. Par conséquent, de véritables relations structure-fonction peuvent être révélées dans le cerveau du poisson zèbre juvénile en utilisant cette stratégie d’exposition cérébrale.
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Protocol
Tous les travaux d’animaux décrits ici sont conformes aux réglementations légales (directive européenne 2010/63). L’entretien et la manipulation du poisson ont été approuvés par les autorités locales et par le représentant du bien-être animal de la Technische Universität Braunschweig.
1. Préparation de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF), d’agarose à faible fusion et d’aiguilles de verre pointues
- Préparer le FSA en dissolvant les produits chimiques énumérés aux concentrations suivantes dans l’eau distillée. 134 mM de NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM de KCl (74,55 g/mol), 2,1 mM de CaCl2 (110,99 g/mol), 1,2 mM de MgCl2 6xH2O (203,3 g/mol), 10 mM de HEPES (238,31 g/mol) et 10 mM de d-glucose (180,16 g/mol).
REMARQUE: Pour MgCl2, CaCl2et KCl, des solutions de 1 M sont préparées dans de l’eau stérile dessalée et stockées à 4 °C pour la préparation ultérieure de l’ACSF frais. Le glucose, l’HEPES et le NaCl sont dissous sous forme de composés solides dans la solution fraîche d’ACSF. Pour dissoudre les produits chimiques, suivez les instructions du fabricant. - Ajuster le pH de l’ACSF à 7,8 avec 10 M NaOH. La préparation du LCRS nécessite une mesure précise des produits chimiques et un ajustement fin du pH car il remplace le liquide céphalo-rachidien et maintient les conditions physiologiques requises pour que les neurones soient pleinement fonctionnels, sinon il pourrait causer un dysfonctionnement cérébral et la mort neuronale.
- Conserver le FSC fraîchement préparé à 4 °C pendant un maximum de 4 semaines. Pour les conditions de travail, aliquoter le volume requis d’ACSF pour la journée/l’expérience et pré-pré-température à 25-28 °C (et éventuellement l’oxygéner, étape 2.5)
REMARQUE: L’ASCF fraîchement préparée est bonne pour 1 jour. Si vous prévoyez de l’utiliser sur plusieurs jours, ACSF doit être filtré stérile. - Pour une anesthésie ultérieure des larves, préparer une solution mère de 50 mM de d-tubocurarine dans de l’eau distillée et conserver la solution à -20 °C sous forme d’aliquotes de 100 μL au congélateur jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
- Pour incorporer le poisson, préparer 2,5 % d’agarose à faible fusion (LM) en dissolvant 1,25 g de LM-agarose (Table des matières) dans 50 mL ACSF et faire bouillir jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
REMARQUE: Alternativement, des concentrations plus élevées ou plus faibles de LM-agarose peuvent être utilisées en fonction de la configuration expérimentale. Cependant, si l’agarose est trop molle, elle ne pourra pas maintenir le poisson en position lors de l’ouverture du crâne. - Conservez l’agarose à 37 °C au bain-marie, pour éviter la solidification et parce que cette température ne nuira pas non plus aux larves lors de l’incorporation. Une fois l’agarose bouillie refroidie à 37 °C dans le bain-marie, ajoutez la quantité nécessaire de d-tubocurarine à l’agarose aliquote nécessaire pour que la journée atteigne une concentration de travail de 10 μM. Pour une utilisation future, conserver les restes d’agarose à 4 °C pour éviter toute contamination.
- Préparer des aiguilles de verre pointues et minces à partir de capillaires en verre(figure supplémentaire 1)à l’aide d’un tireur de micropipette avec les réglages suivants.
- Puller I, capillaire type 1: Chaleur 1: 65,8; Chaleur 2: 55,1; Traction en 2 étapes
Puller II, capillaire de type 2 : Chaleur = 700 ; Fil = 4; Vel = 55; Del = 130; Pul = 55; Traction en 1 étape.
REMARQUE: Les unités sont spécifiques pour chaque arracheur et capillaire en verre utilisés ici, respectivement (voir tableau des matériaux). D’autres capillaires et arracheurs peuvent également être utilisés pour préparer les aiguilles en verre. Mais les aiguilles en verre ne doivent pas être trop minces car elles pourraient se briser au contact du crâne. Capillaire: longueur: 100 mm (4 pouces); OD: 1,5 mm; ID: 0,84 mm; filament: Oui
- Puller I, capillaire type 1: Chaleur 1: 65,8; Chaleur 2: 55,1; Traction en 2 étapes
2. Anesthésie des larves et préparations pour l’incorporation
- Lorsque vous commencez l’expérience pour la journée, transférez les animaux nécessaires avec une pipette Pasteur en plastique dans une boîte de Petri de 90 mm de diamètre, qui est remplie soit de Danieau (pour les larves qui sont encore conservées dans une boîte de Petri avec Danieau), soit d’eau de l’installation de pêche (pour les larves âgées de plus de 7 dpf et conservées dans l’installation de pêche).
- Lorsque vous pipetez des poissons âgés de plus de 2 semaines, assurez-vous que l’ouverture de la pipette est suffisamment grande pour éviter de blesser les poissons lors de leur transfert. N’utilisez pas de filet car il endommagera physiquement en particulier les larves plus jeunes.
- Ajouter rotifera ou artemia nauplii adapté à la taille des larves conservées dans la boîte de Pétri, pour assurer le libre accès à la nourriture et l’état de santé maximal des larves et pour réduire le stress.
- Pour l’encastrement, transférer les larves sélectionnées dans une boîte de Petri de 35 mm de diamètre remplie de LCRS. Ajouter le volume nécessaire de d-tubocurarine pour atteindre une concentration de travail/dose efficace de 10 μM et attendre quelques minutes jusqu’à ce que les larves soient complètement immobilisées11.
REMARQUE: Lorsque le poisson vieillit ou si une anesthésie complète plus rapide est nécessaire (moins de 5 min), il est possible d’augmenter la concentration de d-tubocurarine (DL50 pour les souris est de 0,13 mg / kg par voie intraveineuse12). Il est également possible d’utiliser un anesthésique différent, tel que la α-bungarotoxine (concentration de travail: 1 mg / mL), qui a le même effet que le curare et maintient également le cerveau pleinement actif13. Si un cerveau pleinement actif n’est pas nécessaire pour le sujet d’intérêt, Tricaine à une dose non létale (0,02%) est également une option pour anesthésier complètement les larves. Cependant, la tricaïne bloque les canaux sodiques, altérant ainsi l’activité cérébrale14. - Préparez la chambre de montage en prenant le couvercle de la boîte de Petri de 35 mm de diamètre, retournez le couvercle à l’envers et placez un couvercle carré en verre (24 x 24 mm) sur le fond du couvercle. Reportez-vous à la figure 1 (partie supérieure) pour une description schématique de ces étapes. La surface plus lisse du verre empêche de glisser du bloc d’agarose, qui contient les larves pendant la procédure d’ouverture du crâne.
- Aliquotez la quantité d’ACSF nécessaire pour la journée dans un flacon approprié (par exemple, tube de 50 mL, bécher, bouteille Schott, etc.) et oxygénez-la avec du carbogène (5% CO2,95% O2). Si l’imagerie uniquement la morphologie (par exemple, les modèles de fluorescence), ACSF est toujours nécessaire pour assurer l’intégrité du cerveau et que les cellules ne sont pas influencées négativement par les effets d’osmolarité, mais l’oxygénation de l’ACSF n’est pas nécessaire. Cette étape ne doit être effectuée que lorsque l’activité cérébrale complète est nécessaire pour l’imagerie.
REMARQUE: Pour une saturation optimale en oxygène du milieu, ajoutez une pierre à air à l’extrémité du tube carbogène. Pour garantir un niveau d’oxygène suffisamment élevé, il est nécessaire d’échanger l’ACSF dans les chambres d’imagerie avec de l’ACSF fraîchement oxygéné toutes les 20 à 60 minutes, en fonction du nombre et de l’âge des larves intégrées dans la même chambre d’imagerie (par exemple, pour une seule larve intégrée, un échange ACSF toutes les heures est suffisant. Pour six larves de plus de 14 dpf intégrées en parallèle, l’échange d’ACSF toutes les 20 minutes est nécessaire) alors planifiez la quantité nécessaire d’ACSF saturé d’oxygène en fonction de l’expérience prévue.
3. Intégration des larves
- Transférer les larves entièrement anesthésisées avec une pipette Pasteur en plastique dans la chambre de montage préparée (à l’étape 2.4). Ensuite, retirez soigneusement l’excès de milieu pour éviter la dilution de la LM-agarose. Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées sous un stéréomicroscope avec un grossissement suffisant.
REMARQUE: L’inclinaison de la chambre de montage peut aider à retirer complètement le support. - Passez immédiatement à l’étape suivante, en ajoutant une goutte de LM-agarose suffisamment importante sur le dessus des larves (environ 1 mL, selon la taille des larves) pour protéger les animaux du dessèchement et réduire le stress inutile.
- Orientez les larves en position avant que l’agarose ne se solidifie. Assurez-vous que la partie dorsale des larves est dirigée vers le haut. Assurez-vous également d’intégrer les larves aussi près que possible de la surface de l’agarose.
REMARQUE: Selon la taille et le nombre de larves prévues pour intégrer en même temps, il est possible d’ajuster la concentration d’agarose. Par exemple, pour 1 à 3 larves âgées de 30 dpf, une concentration de 1,8% à 2% de LM-agarose est recommandée. Pour 1 à 4 larves âgées de 7 dpf, il est plus pratique d’utiliser 2,5% de LM-agarose, tandis que, pour 5 à 8 larves, 2% est plus adapté. Si un cerveau pleinement actif est nécessaire, il est recommandé de n’intégrer que trois poissons en même temps pour réduire le temps nécessaire au fonctionnement des larves. En général, il est recommandé d’utiliser des concentrations plus faibles (1,8% à 2%) plus les larves vieillissent ou plus il est prévu d’incruster de larves en même temps. - Si les images sont enregistrées à l’aide d’un microscope inversé, coupez le bloc d’agarose contenant les larves en une petite forme cuboïde. Ceci est important pour transférer les larves dans la chambre d’imagerie plus tard. Si vous utilisez un microscope vertical, un tel rognage n’est pas nécessaire, car la chambre de montage peut également être utilisée comme chambre d’imagerie. Dans la figure 1 (partie supérieure), on peut trouver une description schématique de ces étapes.
4. Exposer le cerveau
REMARQUE: Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées avec le plus grand soin pour ne pas blesser inutilement les larves. Si un cerveau pleinement actif est nécessaire pour l’expérience, gardez à l’esprit qu’à chaque seconde qui passe, alors que le poisson est encore entièrement monté dans l’agarose et a un crâne ouvert sans ACSF oxygéné, le cerveau souffrira d’un manque d’oxygène et se dessèchera également. Les effets de la carence en oxygène deviendront encore plus dramatiques, plus les larves incorporées sont âgées. Par conséquent, il est important d’effectuer la chirurgie non seulement dans les plus brefs délais, mais aussi avec une précision maximale pour ne pas évoquer de lésions cérébrales mécaniques avec l’aiguille. Une fois formés, les étapes 4.2 à 4.4 ne devraient pas prendre plus de 30 s par poisson.
- Commencez la chirurgie dès que l’agarose s’est solidifiée. Tout d’abord, coupez tout l’excès d’agarose au-dessus de la région du cerveau d’intérêt pour obtenir un accès libre à la tête et un espace de travail dégagé. Si la partie dorsale de la tête dépasse déjà de l’agarose, sautez cette étape.
- Selon la région d’intérêt, choisissez un endroit pour commencer la chirurgie. Prenez l’aiguille en verre et faites une petite incision à travers la peau, mais sans pénétrer trop profondément dans le tissu. Ce sera le point de départ pour décoller la peau superposée.
REMARQUE: Pour des résultats optimaux, ne commencez jamais directement au-dessus de la région d’intérêt pour réduire le risque d’endommager des structures importantes. Si nécessaire, il est possible de commencer même postérieurement au cerveau postérieur et de là travailler vers l’avant jusqu’à ce que la zone indésirable de la peau soit pelée. - Continuez avec de très petites coupures le long de la partie de la peau visant à enlever en déplaçant à peine l’aiguille juste sous la surface. La plupart du temps, il n’est pas nécessaire de se déplacer complètement autour du cerveau et de découper un morceau de peau et de crâne en forme de cercle, mais plutôt de faire deux incisions le long de la tête, puis de repousser la peau de l’un ou l’autre côté. La figure 2 montre une représentation schématique de la stratégie de coupe optimale pour obtenir un accès libre au cervelet.
REMARQUE: Cette micro-chirurgie est une procédure délicate et elle nécessitera probablement un peu d’entraînement pour enlever parfaitement la peau sans endommager le cerveau sous-jacent. Il est également recommandé de trouver la stratégie de coupe optimale pour la région du cerveau d’intérêt et de s’y tenir pendant la période de l’expérience. - Immédiatement après avoir retiré la peau de toutes les larves incrustées, versez du LCR (oxygéné) sur l’agarose pour inonder les particules de peau et le sang indésirables et pour garder le cerveau pleinement actif et le protéger du dessèchement.
REMARQUE: Si un cerveau sain est nécessaire pour l’expérience, il est recommandé d’aller pour un maximum de trois poissons à la fois. - Si vous utilisez un microscope vertical, commencez directement par l’imagerie.
- Lorsque vous utilisez un microscope inversé, faites glisser une petite spatule sous le bloc d’agarose cuboïde (étape 3.4).
- Ajouter une petite goutte de LM-agarose au fond de la chambre d’imagerie (par exemple, une boîte à fond de verre) et retourner immédiatement le bloc d’agarose contenant les larves avec la spatule à 180 ° et le pousser doucement au fond de la chambre d’imagerie, tandis que la goutte d’agarose liquide agit comme de la colle.
- Lorsque l’agarose s’est solidifiée, remplissez la chambre d’imagerie avec de l’ACSF (oxygéné), puis commencez l’imagerie. Voir la figure 1 (partie inférieure) pour une description schématique.
- Lorsque l’activité cérébrale complète est requise pour l’expérience, assurez-vous toujours que l’ACSF dans la chambre d’imagerie a un niveau d’oxygène suffisamment élevé. Pour ce faire, échangez soigneusement le milieu avec de l’ACSF fraîchement oxygéné lorsque cela est possible toutes les 20 à 60 minutes (en fonction du nombre et de la taille du poisson, de la taille et de la surface de la chambre d’imagerie et de la durée de l’imagerie).
Figure 1: Procédure schématique pour la préparation du poisson-zèbre à crâne ouvert pour l’imagerie in vivo de manière progressive. Les instructions de travail pour les différentes étapes peuvent être trouvées dans le graphique lui-même. Graphique conçu par Florian Hetsch et adapté par Paul Schramm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Représentation schématique détaillée de la micro-chirurgie réalisée pour enlever des morceaux de peau et de crâne au-dessus de la région cérébrale d’intérêt. Le cercle rouge marque l’endroit où la première coupe doit être faite. La ligne pointillée rouge délimite le chemin optimal pour couper avec l’aiguille afin d’obtenir un accès libre au cervelet sans l’endommager. La flèche verte marque la direction dans laquelle les morceaux excessifs de peau et de crâne peuvent facilement être repoussés. Assurez-vous de ne jamais pénétrer dans le tissu cérébral pendant toute la procédure. Après avoir réussi à décoller la peau, la région cérébrale d’intérêt (ici, le cervelet) sera librement accessible pour tout type d’imagerie in vivo à haute résolution. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
Graphique 3A,C montrent une larve de 14 dpf de la lignée transgénique Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] avec le crâne encore intact. Les cellules pigmentaires de la peau superposée sont réparties sur toute la tête et interfèrent avec le signal de fluorescence dans la région d’intérêt (ici, le cervelet). Avec la larve dans cette condition, il n’est pas possible d’obtenir des images haute résolution du cerveau. Graphique 3B montre une larve de la même lignée transgénique après avoir effectué la chirurgie du crâne ouvert. La zone d’intérêt est maintenant librement accessible pour le laser d’excitation et la lumière de fluorescence émise pour pénétrer dans le tissu sans être dispersée et réfléchie. Les images enregistrées de cette larve donneront lieu à des images détaillées à haute résolution (Figure 3D), comparable aux images d’un cerveau isolé, mais avec l’avantage que le cerveau est toujours pleinement actif. De plus, le cerveau ne perd aucune intensité de fluorescence qui serait normalement causée par la fixation avec du para-formaldéhyde, comme ce serait le cas pour un cerveau fixe et explanté. Chez une larve avec un crâne ouvert et, par conséquent, un cerveau librement accessible avec des neurones pleinement actifs, qui possède encore toutes les connexions physiologiques et reçoit une entrée normale du système sensoriel, il sera également possible d’observer des événements à court terme, par exemple la synaptogenèse, la croissance de la colonne vertébrale, la migration dendritique / axonale ou l’expression locale de l’ARNm16 dans des conditions physiologiques. Un autre avantage de cette méthode est qu’elle convient à l’application de différentes substances pharmacologiques pour étudier les effets sur la larve vivante sans les problèmes de diffusion causés par la peau et le crâne ou la barrière hémato-encéphalique, ce qui empêcherait normalement les substances de pénétrer dans le cerveau (Graphique 3E). Pour démontrer cela, une larve de 14 dpf avec un crâne ouvert a été incubée avec Hoechst-33342 (5 μg/mL dans ACSF) pendant 10 min, puis imagée (Graphique 3F-Je). Graphique 4A,B montrer 30 dpf vieilles larves avant et après l’ouverture du crâne. C’est le point temporel le plus avancé testé jusqu’à présent pour cette méthode. Même à ce stade de développement de la larve, il est possible d’obtenir des images à haute résolution de neurones individuels et de compartiments subcellulaires en utilisant la méthode décrite ici (Graphique 4C,D). Ces anciennes larves de 30 dpf ne présentaient pas de déficits d’activité après 1 h d’imagerie. Cette méthode est également utilisée pour l’analyse électrophysiologique des vieilles larves de 30 dpf et il n’y a aucun signe de perte d’activité neuronale dans les cellules de Purkinje (mais les cellules proches de la surface sont délicates et vulnérables) pendant les 60 premières minutes d’intégration avec un crâne ouvert. En inspectant régulièrement la quantité de flux sanguin, il est possible de valider que la larve est toujours en bonne santé. Cet état peut être maintenu, en échangeant ou oxygénant régulièrement ACSF lors de l’enregistrement d’images à long terme. Il est donc assez simple de valider si une larve est encore adaptée aux études cérébrales fonctionnelles. Pour prouver, qu’aucun vaisseau sanguin important n’est endommagé pendant la micro-chirurgie et aussi pour montrer que cette méthode permet une pénétration beaucoup plus profonde de la lumière laser d’excitation dans le tissu cérébral et l’émission réduite par réflexion de photons, une vieille larve de 10 dpf de la souche transgénique Tg(flk1:mCherry)y206Tg17 a été analysée par cette méthode. Ces poissons contiennent une vascularisation fluorescente dans le cerveau en raison de l’expression de la protéine fluorescente rouge mCherry dans les cellules endothéliales. Une projection d’intensité maximale d’une pile d’images couvrant 245 μm de profondeur révèle le réseau complexe des vaisseaux sanguins serpentant à travers le cerveau moyen et postérieur (Graphique 5A). De plus, le codage couleur des valeurs de profondeur de la pile d’images démontre que même les vaisseaux sanguins enfouis profondément dans le cerveau à près de 250 μm sont clairement visibles et traçables (Graphique 5B). Vidéo supplémentaire 1A montre un cerveau en bonne santé avec un apport sanguin suffisant, tandis que Vidéo supplémentaire 1B montre un cerveau avec un flux sanguin compromis en raison du manque d’échange de LF ACS et du manque d’oxygénation moyenne.
Figure 3: Le pelage de la peau chez les larves de poisson zèbre offre un accès optimal pour l’imagerie cérébrale in vivo. Analyse par microscopie confocale de 14 anciennes larves transgéniques Tg(-7.5ca8:GFP)bz12 dpf. Vue d’ensemble du cerveau moyen et postérieur des échantillons non pelés(A, C)et pelés(B, D)à grossissement de 20x et 40x respectivement. Dans ce dernier cas, l’absence de pigment améliore clairement la qualité de l’image et permet un enregistrement détaillé des images des cellules fluorescentes de Purkinje dans le cervelet. L’imagerie subcellulaire et la facilité d’administration de composés au cerveau sont démontrées par une période d’incubation de 10 minutes avec la coloration fluorescente de l’acide nucléique à l’aide de Hoechst-33342 (5 μg / mL dans ACSF). Alors que seules les cellules de la peau incorporent ce colorant dans les larves non pelées (E), les spécimens à peau soulevée présentent un marquage intense de leurs noyaux dans tout le cerveau (F) permettant de visualiser des noyaux individuels (G) de neurones de Purkinje fluorescents GFP (H, image fusionnée montrée en I, grossissement optique 63x et 4x numérique). Barres d’échelle: A-F: 100 μm, G-I: 5 μm. Les larves ont été incrustées avec leur tête vers la gauche, la dorsale est en haut. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Le pelage de la peau étend l’accès à l’imagerie cérébrale in vivo aux poissons zèbres juvéniles. Analyse par microscopie confocale de 30 dpf vieux Tg transgéniques (-7.5ca8: GFP]bz12Tg juvéniles. Vue d’ensemble du mésencéphale et du cerveau postérieur des spécimens non pelés (A) et pelés de la peau à 10x (B) et 40x (C) et 63x grossissement optique avec zoom numérique 4x (D), respectivement. L’élimination de la peau pigmentée permet de visualiser l’organisation cellulaire de la couche cellulaire cérébelleuse continue de Purkinje et de représenter les projections de neurones individuels(D,flèches blanches). Barres d’échelle: A-C: 100 μm, D: 5 μm. Les larves ont été incrustées avec leur tête vers la gauche, la dorsale est en haut. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: L’ablation de la peau permet la reconstruction du système vasculaire cérébral à une profondeur prolongée chez une larve de poisson zèbre ancienne de 10 dpf Tg(flk1:mCherry)y206Tg. (A) La projection d’intensité maximale d’une pile d’images (245 images d’une épaisseur de 1 μm à une distance totale de 245 μm, grossissement optique 20x) affiche un réseau continu de vaisseaux sanguins dans toutes ces zones du cerveau. (B) Le codage couleur de profondeur révèle que ce réseau de vaisseaux sanguins peut être surveillé à une profondeur de 200 μm et au-delà. Pour éliminer l’autofluorescence et la réflexion, les yeux ont été masqués par une couleur noire. Barre d’échelle: 100 μm. Les larves ont été incrustées avec leur tête vers la gauche, la dorsale est en haut. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1: Aiguilles fabriquées à partir de capillaires en verre. (A) Deux types d’aiguilles obtenues à partir de deux arracheurs d’aiguilles différents sont indiqués. Il est important que la pointe ne soit pas trop longue pour lui fournir une stabilité suffisante et éviter qu’ils ne se cassent au contact de la peau / du crâne. Pourtant, une netteté suffisante est nécessaire pour permettre de faire des coupes avec des bords propres. (B) Une image du capillaire chargé dans les tireurs d’aiguilles est montrée. La barre d’échelle est de 250 μm. Longueur capillaire: 100 mm; OD: 1,5 mm: ID: 0,84 mm; filament : oui. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Vidéo supplémentaire 1: Imagerie d’une vieille larve de 7dpf. (A) Enregistrement vidéo en temps réel (30 ips) d’une vieille larve de 7 dpf 10 min après que la peau au-dessus du cerveau a été enlevée. Le flux sanguin vif indique un état sain avec un apport sanguin suffisant. (B) Enregistrement vidéo en temps réel (30 ips) de la même vieille larve de 7 dpf montrée dans la vidéo supplémentaire 1A, 2 h après la microchirurgie sans échange de l’ACSF et sans oxygénation moyenne. Barre d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
La méthode présentée fournit une approche alternative à l’isolement cérébral ou au traitement des larves de poisson zèbre avec des produits pharmaceutiques inhibant la pigmentation pour enregistrer des images à haute résolution des neurones dans leur environnement in vivo. La qualité des images enregistrées avec cette méthode est comparable aux images de cerveaux explantés, mais dans des conditions naturelles.
De plus, une perte d’intensité de fluorescence est évitée, car il n’est pas nécessaire de traiter avec des fixateurs18. En outre, cette méthode n’est pas aussi invasive que l’isolement d’un cerveau et ne consiste qu’en une étape cruciale qui pourrait conduire à l’échec, de sorte que les chances d’une préparation réussie sont plus élevées que l’explantation cérébrale. L’avantage le plus important est que cette méthode est adaptée à l’enregistrement d’images in vivo. À condition que l’ouverture du crâne soit effectuée avec précision, rapidité et succès, et que la saturation en oxygène du LCR soit surveillée régulièrement, le cerveau doit être pleinement fonctionnel et viable pendant des heures. Sur la base des enregistrements électrophysiologiques, de la circulation sanguine, de la respiration et de la survie des poissons pendant des jours supplémentaires, nous considérons qu’il est probable que l’ablation de la peau et du crâne ne soit pas très préjudiciable à la santé globale. Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour l’imagerie en temps réel des processus cellulaires et subcellulaires dans un cerveau sain et fonctionnel sans pigmentation perturbatrice de l’image. Cette méthode est une procédure standard utilisée pour les enregistrements électrophysiologiques de l’activité neuronale in vivo dans notre laboratoire et est également bien établie dans d’autres laboratoires d’électrophysiologie à travers le monde19,20,21,22, prouvant que la fonction du cerveau n’est pas altérée par la micro-chirurgie. Un inconvénient qui doit être mentionné est que cette approche ne convient qu’à l’imagerie des régions dorsales et latérales du cerveau et ne peut pas être effectuée à plusieurs reprises avec le même échantillon.
Cependant, si un cerveau entièrement fonctionnel est nécessaire pour l’expérience, la saturation en oxygène doit être surveillée en permanence et, si nécessaire, l’ACSF dans la chambre d’imagerie doit être échangé avec de l’ACSF fraîchement oxygéné. Cela signifie que, pour les enregistrements à long terme, il doit y avoir une option pour échanger l’ACSF utilisé avec l’ACSF saturé d’oxygène sans perturber la procédure d’imagerie qui pourrait être traitée à l’aide d’une pompe miniature.
Il est à noter que si la microchir chirurgie n’est pas effectuée correctement ou imprécisement, elle entraînera une lésion cérébrale ou une hémorragie cérébrale entraînant une physiologie cérébrale compromise. En outre, une faible saturation en oxygène dans l’ACSF (voir vidéo supplémentaire 1) ou trop de stress pour les larves pendant toute cette procédure peut avoir un impact négatif sur le cerveau23,24. Par conséquent, cette méthode n’est pas adaptée à l’analyse à haut débit, mais plutôt à l’enregistrement d’images longitudinales ou très détaillées de seulement quelques larves par point temporel. Par conséquent, cette méthode ne devrait pas être destinée au dépistage de médicaments à haut débit, mais elle pourrait être utilisée pour caractériser ou valider en détail des composés pharmacologiques prometteurs, lorsque l’imagerie à haute résolution est informative et nécessaire. Pour assurer un bon état de santé du cerveau, il est recommandé de ne pas dépasser le nombre de trois larves par essai.
Grâce au crâne ouvert, il est même possible d’appliquer directement des substances sur le tissu cérébral sans les faire passer à travers la barrière hémato-encéphalique. Dans l’ensemble, la méthode décrite ici - actuellement appliquée à l’électrophysiologie in vivo - est une technique à fort potentiel dans un très large domaine de l’imagerie cérébrale in vivo et de l’optogénétique chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre et peut être couplée à des approches neuropharmacologiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions tout particulièrement Timo Fritsch pour les excellents soins aux animaux et Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti et Barbara Winter pour leur soutien utile. Nous remercions également tous les autres membres du laboratoire Köster pour leurs commentaires. Le projet a été financé en partie par le projet 241961032 de la Fondation allemande pour la recherche (DFG, KO1949/7-2) (à RWK) et le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS project 01EW1520 to JCM) est reconnu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish 'affective' behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
