Summary
هنا نقدم طريقة لتصوير الدماغ الجنيني حمار وحشي في الجسم الحي حتى اليرقات ومراحل الأحداث. هذا الإجراء المجهري، مقتبس من النهج الكهربية، ويوفر الوصول إلى التفاصيل الخلوية ودون الخلوية من الخلايا العصبية الناضجة ويمكن الجمع بينها وبين علم الوراثة البصرية والدراسات الدوائية العصبية لتوصيف وظائف الدماغ والتدخل المخدرات.
Abstract
يتطلب فهم التغيرات الزائلة التي تحدث أثناء نمو الدماغ ونضوجه تصويرا مفصلا عالي الدقة في المكان والزمان بدقة خلوية ودون خلايا. وقد سمح لنا التقدم في التقنيات الجزيئية والتصويرية بالحصول على العديد من الأفكار التفصيلية حول الآليات الخلوية والجزيئية لنمو الدماغ في جنين سمك الحمار الوحشي الشفاف. في الآونة الأخيرة ، انتقلت عمليات صقل الاتصال العصبي التي تحدث في مراحل اليرقات اللاحقة بعد عدة أسابيع من الإخصاب ، والتي هي على سبيل المثال التحكم في السلوك الاجتماعي أو صنع القرار أو السلوك القائم على التحفيز ، إلى تركيز البحث. في هذه المراحل ، يتداخل تصبغ جلد حمار وحشي مع اختراق الضوء في أنسجة الدماغ ، ولم تعد حلول المراحل الجنينية ، على سبيل المثال ، التثبيط الدوائي للتصبغ ، مجدية بعد الآن.
لذلك ، يتم توفير حل جراحي طفيف التوغل للوصول إلى المجهر إلى دماغ حمار وحشي مستيقظ مشتق من النهج الكهربية. في teleosts، يمكن إزالة الجلد وغضاريف الجمجمة الناعمة بعناية عن طريق تقشير هذه الطبقات، وفضح الخلايا العصبية الكامنة ومسالك أكسنال دون ضرر. وهذا يسمح لتسجيل مورفولوجيا الخلايا العصبية، بما في ذلك الهياكل متشابك ومحتوياتها الجزيئية، ومراقبة التغيرات الفسيولوجية مثل Ca2 + العابرين أو أحداث النقل داخل الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التحقيق في هذه العمليات عن طريق التثبيط الدوائي أو التلاعب البصري الوراثي أمر ممكن. يوفر نهج التعرض للدماغ هذا معلومات حول التغيرات الهيكلية والفسيولوجية في الخلايا العصبية وكذلك ارتباط وترابط هذه الأحداث في أنسجة الدماغ الحية في نطاق دقائق أو ساعات. هذه التقنية مناسبة لتصوير الدماغ في الجسم الحي ليرقات حمار وحشي لمدة تصل إلى 30 يوما بعد الإخصاب ، وهي أحدث مرحلة تنموية تم اختبارها حتى الآن. وبالتالي، فإنه يوفر الوصول إلى أسئلة هامة مثل صقل متشابك والتحجيم، والنقل المحوري والتشجر، واستهداف متشابك من البضائع الهيكل الخلوي أو التعبير المحلي تعتمد على النشاط. لذلك ، يمكن توقع استخدام واسع لهذا النهج المتصاعد والتصوير.
Introduction
على مدى العقود الأخيرة ، تطورت سمكة الحمار الوحشي(Danio rerio)كواحدة من الكائنات الحية النموذجية الفقارية الأكثر شعبية للدراسات التنموية الجنينية واليرقات. البراز الكبير للإناث حمار وحشي إلى جانب التطور السريع السابق الرحمي للجنين وشفافيته خلال مراحل النمو الجنينية المبكرة ليست سوى عدد قليل من العوامل الرئيسية التي تجعل حمار وحشي كائن حي نموذج قوي لأسئلة النموadress 1. التقدم في التقنيات الوراثية الجزيئية جنبا إلى جنب مع ارتفاع القرار في دراسات التصوير في الجسم الحي يسمح لمعالجة الآليات البيولوجية الخلية الكامنة وراء عمليات التنمية2. على وجه الخصوص ، في مجال التمايز العصبي ، وعلم وظائف الأعضاء ، والاتصال ، والوظيفة ، ألقت سمكة الحمار الوحشي الضوء على التفاعل بين الديناميات الجزيئية ووظائف الدماغ والسلوك الحي بتفاصيل غير مسبوقة.
ومع ذلك ، فإن معظم هذه الدراسات تقتصر على المراحل الجنينية واليرقات المبكرة خلال الأسبوع الأول من التطور حيث تضيع شفافية أنسجة الجهاز العصبي تدريجيا. في هذه المراحل، يتم منع أنسجة الدماغ من الوصول عن طريق نهج المجهر عالية الدقة تصبح محمية من قبل تمايز الجمجمة وتصبغ3.
لذلك ، من الصعب دراسة الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالتمايز العصبي والنضج واللدونة مثل صقل الاتصال العصبي أو التحجيم المتشابك. هذه العمليات الخلوية مهمة من أجل تحديد الآليات الخلوية التي تقود ، على سبيل المثال ، السلوك الاجتماعي ، صنع القرار ، أو السلوك القائم على التحفيز ، وهي المجالات التي ساهمت فيها أبحاث حمار وحشي على يرقات عمرها عدة أسابيع مؤخرا في النتائج الرئيسية استنادا إلى الدراسات السلوكية4.
النهج الدوائية لمنع تصبغ في يرقات حمار وحشي لعدة أسابيع هي بالكاد ممكنة أو قد تسبب حتى آثار ضارة5،6،7،8. سلالات متحولة مزدوجة أو ثلاثية مع عيوب تصبغ محددة، مثل كاسبر9 أو الكريستال10،أصبحت أدوات قيمة للغاية، ولكن شاقة في تربية، وتوفير عدد قليل من النسل، وتشكل خطر تراكم التشوهات الوراثية بسبب التكاثر المفرط.
هنا، يتم توفير إجراء الحد الأدنى الغازية كبديل التي تنطبق على أي سلالة حمار وحشي. تم تكييف هذا الإجراء من الدراسات الكهربية لتسجيل نشاط الخلايا العصبية في يرقات حمار وحشي حية ومستيقظة. في teleosts، يمكن إزالة الجلد وغضاريف الجمجمة الناعمة بعناية عن طريق تقشير هذه الطبقات الصغيرة، لأنها ليست متشابكة بإحكام مع الأوعية الدموية في الدماغ. وهذا يسمح لكشف أنسجة الدماغ التي تحتوي على الخلايا العصبية والمسالك المحورية دون ضرر وتسجيل مورفولوجيا الخلايا العصبية، بما في ذلك الهياكل متشابك ومحتوياتها الجزيئية، والتي بدورها تشمل مراقبة التغيرات الفسيولوجية مثل Ca2 + العابرين أو أحداث النقل داخل الخلايا لمدة تصل إلى عدة ساعات. وعلاوة على ذلك، وإلى جانب الأوصاف الوصفية، يتيح الوصول المباشر إلى أنسجة الدماغ استجواب وظائف الخلايا العصبية الناضجة عن طريق إدارة المواد العصبية الدوائية والنهج البصرية. لذلك ، يمكن الكشف عن علاقات وظيفة الهيكل الحقيقي في دماغ حمار وحشي صغير باستخدام استراتيجية التعرض للدماغ هذه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الأعمال الحيوانية الموصوفة هنا وفقا للوائح القانونية (الاتحاد الأوروبي التوجيه 2010/63). وقد وافقت السلطات المحلية وممثل رعاية الحيوان في جامعة تكنيش براونشفايغ على صيانة الأسماك والتعامل معها.
1. إعداد السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (ACSF) ، وانخفاض ذوبان الآغاروز والإبر الزجاجية الحادة
- إعداد ACSF عن طريق حل المواد الكيميائية المدرجة في التركيزات التالية في الماء المقطر. 134 مللي متر كلوريد كلوريد الناكل (58.44 جم/مول)، 2.9 مللي متر كلكل (74.55 جم/مول)، 2.1 مللي متر كليل2 (110.99 جم/مول)، 1.2 mM MgCl2 6x H2O (203.3 غرام/مول)، 10 مللي متر HEPES (238.31 غرام/مول)، و10 مللي متر د-جلوكوز (180.16 غرام/مول).
ملاحظة: بالنسبة ل MgCl2وCaCl2وKCl ، يتم إعداد حلول مخزون 1 M في مياه معقمة مجففة وتخزينها عند 4 درجات مئوية لإعداد ACSF الطازج لاحقا. يتم إذابة الجلوكوز، HEPES، وNaCl كمركبات صلبة في محلول ACSF الطازج. لحل المواد الكيميائية، اتبع تعليمات الشركة المصنعة. - ضبط درجة الحموضة من ACSF إلى 7.8 مع 10 M NaOH. إعداد ACSF يتطلب قياس دقيق للمواد الكيميائية والتكيف الدقيق من الحموضة لأنها تحل محل السائل الشوكي الدماغي ويحافظ على الظروف الفسيولوجية المطلوبة للخلايا العصبية لتكون وظيفية بالكامل وإلا فإنه قد يسبب سوء وظائف الدماغ والموت العصبي.
- تخزين ACSF الطازجة في 4 درجة مئوية لمدة أقصاها 4 أسابيع. لظروف العمل، aliquot الحجم المطلوب من ACSF ليوم / تجربة وprewarm في 25-28 درجة مئوية (والأوكسيجين اختياريا، الخطوة 2.5)
ملاحظة: ASCF أعدت حديثا على ما يرام لمدة 1 يوم. إذا كان التخطيط لاستخدامه على مدى عدة أيام، ACSF يحتاج إلى تصفية عقيمة. - للتخدير اللاحق لليرقات ، قم بإعداد محلول مخزون 50 mM من د-توبوكورين في الماء المقطر وتخزين المحلول عند -20 درجة مئوية ك 100 ميكرولتر من المغذيات في الثلاجة حتى الحاجة.
- لتضمين الأسماك، وإعداد 2.5٪ ذوبان منخفض (LM) agarose عن طريق حل 1.25 غرام LM-agarose(جدول المواد)في 50 مل ACSF ويغلي حتى يذوب تماما agarose.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام تركيزات أعلى أو أقل من LM-agarose اعتمادا على الإعداد التجريبي. ومع ذلك، إذا كان الآغاروز لينة جدا، فإنه لن تكون قادرة على عقد الأسماك في موقف عند فتح الجمجمة. - تخزين agarose في حمام مائي 37 درجة مئوية ، لتجنب التجسيد ولأن درجة الحرارة هذه لن تضر أيضا اليرقات عند التضمين. بعد تبريد الآغاروز المسلوق إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء ، أضف الكمية اللازمة من د-توبوكورين إلى الآغاروز المقتبس اللازم لهذا اليوم للوصول إلى تركيز عمل قدره 10 ميكرومتر. للاستخدام في المستقبل، قم بتخزين الآغاروز المتبقي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لتجنب التلوث.
- إعداد الإبر الزجاجية حادة ورقيقة من الشعيرات الدموية الزجاج (الشكل التكميلي 1) باستخدام سحب micropipette مع الإعدادات التالية.
- بولر الأول، نوع الشعيرات الدموية 1: الحرارة 1: 65.8؛ الحرارة 2: 55.1; سحب بخطوين
بولر الثاني، نوع الشعيرات الدموية 2: الحرارة = 700؛ = 4; = 55؛ ديل = 130؛ Pul = 55؛ سحب خطوة واحدة.
ملاحظة: الوحدات هي محددة لكل سحب والزجاج الشعيرات الدموية المستخدمة هنا، على التوالي (انظر جدول المواد). ويمكن أيضا استخدام الشعيرات الدموية وسحب أخرى لإعداد الإبر الزجاجية. ولكن الإبر الزجاجية لا ينبغي أن تكون رقيقة جدا لأنها قد كسر عند الاتصال مع الجمجمة. الشعيرات الدموية: الطول: 100 مم (4 بوصات)؛ OD: 1.5 مم; رقم 0.84 مم؛ خيوط: نعم
- بولر الأول، نوع الشعيرات الدموية 1: الحرارة 1: 65.8؛ الحرارة 2: 55.1; سحب بخطوين
2. تخدير اليرقات والاستعدادات للتضمين
- عند بدء التجربة لهذا اليوم ، قم بنقل الحيوانات اللازمة مع ماصة باستور بلاستيكية إلى طبق بيتري قطره 90 مم ، والذي يمتلئ إما دانيو (لليرقات التي لا تزال محفوظة في طبق بيتري مع دانيو) أو الماء من منشأة الأسماك (لليرقات التي يزيد عمرها عن 7 ديسيبل ويتم الاحتفاظ بها في منشأة الأسماك).
- عند ماصة الأسماك أقدم من 2 أسابيع، تأكد من فتح ماصة كبيرة بما يكفي لتجنب إصابة الأسماك عند نقلها. لا تستخدم شبكة لأنها ستلحق ضررا جسديا وخاصة اليرقات الأصغر سنا.
- أضف روتيفيرا أو أرتيميا ناوبلي مناسب لحجم اليرقات المحفوظة في طبق بيتري ، لضمان حرية الحصول على الطعام والحد الأقصى من الحالة الصحية لليرقات والحد من الإجهاد.
- للدمج ، قم بنقل اليرقات المختارة إلى طبق بيتري قطره 35 مم مليء ب ACSF. أضف الحجم اللازم من د-توبوكورين للوصول إلى تركيز العمل / جرعة فعالة من 10 ميكرومتر وانتظر لبضع دقائق حتى يتم شل حركة اليرقات تماما11.
ملاحظة: عندما تنمو الأسماك كبار السن أو إذا كان هناك حاجة إلى تخدير كامل أسرع (أقل من 5 دقائق), فمن الممكن لزيادة تركيز د-توبوكورين (LD50 للفئران هو 0.13 ملغ / كغ عن طريق الوريد12). ومن الممكن أيضا استخدام مخدر مختلف، مثل α-bungarotoxin (تركيز العمل: 1 ملغم / مل)، والتي لها نفس تأثير كوراري وأيضا يحافظ على الدماغ نشطة تماما13. إذا لم يكن الدماغ النشط تماما ضروريا لموضوع الاهتمام ، فإن Tricaine بجرعة غير قاتلة (0.02٪) هو أيضا خيار لتخدير اليرقات بالكامل. ومع ذلك، كتل Tricaine الصوديوم قنوات، وبالتالي إضعاف نشاط الدماغ14. - قم بإعداد غرفة التركيب عن طريق أخذ غطاء طبق بيتري قطره 35 مم، وقلب الغطاء رأسا على عقب، ووضع غطاء زجاجي مربع (24 × 24 مم) في الجزء السفلي من الغطاء. راجع الشكل 1 (الجزء العلوي) للحصول على وصف تخطيطي لهذه الخطوات. يمنع السطح الأكثر سلاسة للزجاج الانزلاق بعيدا عن كتلة الآغروز ، التي تحتوي على اليرقات أثناء إجراء فتح الجمجمة.
- Aliquot كمية ACSF اللازمة لهذا اليوم في قارورة مناسبة (على سبيل المثال، 50 مل أنبوب، كوب، زجاجة شوت، الخ) والأوكسيجين مع كاربوجين (5٪ CO2، 95٪ O2). إذا كان التصوير فقط مورفولوجيا (على سبيل المثال، أنماط الفلورسينس) ACSF لا يزال ضروريا لضمان سلامة الدماغ وأن الخلايا لا تتأثر سلبا بآثار التناضح ولكن لا حاجة إلى الأوكسجين من ACSF. هذه الخطوة تحتاج فقط إلى القيام بها عندما يكون نشاط الدماغ الكامل ضروريا للتصوير.
ملاحظة: للحصول على تشبع الأكسجين الأمثل للوسط، أضف حجر الهواء إلى نهاية أنبوب كاربوجين. لضمان مستوى أكسجين مرتفع بما فيه الكفاية ، من الضروري تبادل ACSF في غرف التصوير مع ACSF المؤسج حديثا كل 20-60 دقيقة ، اعتمادا على عدد وعمر اليرقات المضمنة في غرفة التصوير نفسها (على سبيل المثال ، لتبادل اليرقات المضمنة كل ساعة كافية. بالنسبة لست يرقات أكبر من 14 ديسف في الفلور في موازاة ذلك ، من الضروري تبادل ACSF كل 20 دقيقة) لذلك خطط للكمية الضرورية من الأكسجين المشبع ACSF وفقا للتجربة المخطط لها.
3. تضمين اليرقات
- نقل اليرقات تخدير بالكامل مع ماصة باستور البلاستيك إلى (في الخطوة 2.4) أعدت غرفة التركيب. ثم، وإزالة بعناية المتوسطة الزائدة لتجنب تخفيف LM-agarose. وينبغي تنفيذ جميع الخطوات التالية تحت مجهر ستيريو مع التكبير كافية.
ملاحظة: يمكن أن يساعد إمالة غرفة التركيب على إزالة الوسيطة بالكامل. - انتقل على الفور إلى الخطوة التالية ، عن طريق إضافة قطرة LM-agarose كبيرة بما فيه الكفاية فوق اليرقات (حوالي 1 مل ، اعتمادا على حجم اليرقات) لحماية الحيوانات من الجفاف والحد من الإجهاد غير الضروري.
- توجيه اليرقات في موقف قبل agarose يتماسك. تأكد من توجيه الجزء الظهري من اليرقات إلى الأعلى. أيضا ، تأكد من تضمين اليرقات أقرب ما يمكن إلى سطح الآغروز.
ملاحظة: اعتمادا على حجم وعدد اليرقات المخطط لتضمينها في نفس الوقت ، من الممكن ضبط تركيز الآغروز. على سبيل المثال ، بالنسبة ليرقات 1-3 التي يبلغ عمرها 30 ديس بي في ال ، يوصى بتركيز 1.8٪ -2٪ LM-agarose. بالنسبة ليرقات 1-4 التي يبلغ عمرها 7 ديسبف في الولائم ، من العملي استخدام 2.5٪ LM-agarose ، في حين أن 2٪ أكثر ملاءمة ل 5-8 يرقات. إذا كان هناك حاجة إلى دماغ نشط تماما ، فمن المستحسن تضمين ثلاثة أسماك فقط في نفس الوقت لتقليل الوقت اللازم لتشغيل اليرقات. بشكل عام ، يوصى باستخدام تركيزات أقل (1.8٪ -2٪) كلما كبرت اليرقات أو زاد عدد اليرقات المخطط لها في نفس الوقت. - إذا تم تسجيل الصور باستخدام مجهر مقلوب ، فتقليم كتلة الآغاروز التي تحتوي على اليرقات إلى شكل مكعب صغير. وهذا أمر مهم لنقل اليرقات إلى غرفة التصوير في وقت لاحق. إذا كان استخدام المجهر تستقيم، مثل هذا التشذيب ليست ضرورية، لأن غرفة تصاعد يمكن أيضا أن تستخدم كغرفة التصوير. في الشكل 1 (الجزء العلوي) ، يمكن للمرء أن يجد وصفا تخطيطي لهذه الخطوات.
4. تعريض الدماغ
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية بأكبر قدر من العناية لعدم إصابة اليرقات دون داع. إذا كان هناك حاجة إلى دماغ نشط تماما للتجربة ، ضع في اعتبارك أنه مع كل ثانية تمر ، في حين أن الأسماك لا تزال مثبتة بالكامل في agarose ولها جمجمة مفتوحة بدون أكسجين ACSF ، فإن الدماغ سيعاني من نقص الأكسجين والجفاف أيضا. ستصبح آثار نقص الأكسجين أكثر دراماتيكية ، كلما كبرت اليرقات المضمنة. لذلك، من المهم إجراء الجراحة ليس فقط في أقصر وقت ممكن، ولكن أيضا مع أقصى قدر من الدقة لعدم استحضار تلف الدماغ الميكانيكية مع الإبرة. عند التدريب، يجب ألا تستغرق الخطوات من 4.2 إلى 4.4 أكثر من 30 ثانية لكل سمكة.
- بدء الجراحة بمجرد أن توطدت agarose. أولا، تقليم بعيدا كل من agarose الزائدة فوق منطقة الدماغ من الفائدة للحصول على حرية الوصول إلى الرأس ومساحة عمل واضحة. إذا كان الجزء الظهري من الرأس يخرج بالفعل من الآغروز ، فتخطى هذه الخطوة.
- اعتمادا على المنطقة ذات الاهتمام، اختر مكانا لتبدأ الجراحة. خذ الإبرة الزجاجية واصنع شقا صغيرا عبر الجلد ولكن دون اختراق عميق جدا في الأنسجة. وستكون هذه نقطة البداية لتقشير الجلد المتراكب.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، ابدأ ابدأ مباشرة فوق المنطقة ذات الأهمية لتقليل خطر إتلاف الهياكل الهامة. إذا لزم الأمر، فمن الممكن أن تبدأ حتى الخلفي إلى الدماغ الخلفي ومن هناك العمل إلى الأمام حتى يتم تقشير المنطقة غير المرغوب فيها من الجلد بعيدا. - الاستمرار مع تخفيضات صغيرة جدا على طول الجزء من الجلد تهدف إلى إزالة عن طريق تحريك بالكاد الإبرة فقط تحت السطح. معظم الوقت ليس من الضروري التحرك تماما في جميع أنحاء الدماغ وقطع قطعة تشبه دائرة من الجلد والجمجمة، ولكن بدلا من ذلك مجرد إجراء شقين على طول الرأس ومن ثم دفع الجلد بعيدا إلى جانب واحد أو الجانب الآخر. ويبين الشكل 2 تمثيلا تخطيطيا لاستراتيجية القطع المثلى للحصول على حرية الوصول إلى المخيخ.
ملاحظة: هذه الجراحة الدقيقة هي إجراء دقيق، وسوف تحتاج على الأرجح إلى بعض التدريب لإزالة الجلد تماما دون الإضرار بالدماغ الأساسي. كما يوصى بالعثور على استراتيجية القطع المثلى لمنطقة الدماغ ذات الاهتمام والتمسك بها لفترة التجربة. - مباشرة بعد إزالة الجلد من جميع اليرقات المضمنة ، تابع بصب ACSF (المؤكسيج) فوق الآغروز لإغراق جزيئات الجلد غير المرغوب فيها والدم والحفاظ على الدماغ نشطا تماما وحمايته من الجفاف.
ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى دماغ سليم للتجربة، فمن المستحسن أن تذهب لمدة أقصاها ثلاثة أسماك في وقت واحد. - إذا كنت تستخدم مجهر مستقيم، فابدأ التصوير مباشرة.
- عند استخدام المجهر المقلوب، قم بتمرير ملعقة صغيرة تحت كتلة الآجاروز المكعبة (الخطوة 3.4).
- أضف قطرة صغيرة من LM-agarose إلى الجزء السفلي من غرفة التصوير (على سبيل المثال ، طبق الزجاج السفلي) وقلب كتلة الآغروز التي تحتوي على اليرقات مع ملعقة لمدة 180 درجة ودفعها بلطف إلى أسفل غرفة التصوير ، في حين يعمل قطرة الآغروز السائلة كغراء.
- عندما توطد agarose، ملء غرفة التصوير مع (المؤوكسجين) ACSF، ثم تبدأ التصوير. راجع الشكل 1 (الجزء السفلي) للحصول على وصف تخطيطي.
- عندما يكون النشاط الدماغي الكامل مطلوبا للتجربة ، تأكد دائما من أن ACSF في غرفة التصوير لديه مستوى أكسجين مرتفع بما فيه الكفاية. لضمان ذلك، تبادل المتوسط بعناية مع ACSF المؤوكسجين حديثا عندما يكون ذلك ممكنا كل 20-60 دقيقة (اعتمادا على عدد وحجم الأسماك وحجم وسطح غرفة التصوير، ومدة التصوير).
الشكل 1: إجراء تخطيطي لإعداد حمار وحشي الجمجمة مفتوحة للتصوير في الجسم الحي بطريقة تدريجية. يمكن العثور على إرشادات العمل للخطوات المختلفة في الرسم نفسه. رسم صممه فلوريان هيتش وتكييفها من قبل بول شرام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:تمثيل تخطيطي مفصل للجراحة الدقيقة التي أجريت لإزالة قطع من الجلد والجمجمة فوق منطقة الدماغ ذات الاهتمام. الدائرة الحمراء تمثل المكان الذي يجب أن يتم فيه القطع الأول. يحدد الخط الأحمر المنقط المسار الأمثل لقطع جنبا إلى جنب مع الإبرة للحصول على حرية الوصول إلى المخيخ دون الإضرار به. السهم الأخضر علامات الاتجاه الذي الجلد المفرط وقطع الجمجمة يمكن بسهولة أن تدفع بعيدا. تأكد من عدم اختراق أنسجة الدماغ خلال العملية بأكملها. بعد تقشير الجلد بنجاح ، ستكون منطقة الدماغ ذات الأهمية (هنا ، المخيخ) متاحة بحرية لأي نوع من التصوير عالي الدقة في الجسم الحي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 3A,C تظهر يرقة 14 ديسف في الطور من خط المعدلة وراثيا TG [-7.5Ca8:GFP]bz12 [15] مع الجمجمة لا تزال سليمة. يتم توزيع الخلايا الصباغية في الجلد المتراكب في جميع أنحاء الرأس وتتداخل مع إشارة الفلورسينس في المنطقة ذات الاهتمام (هنا ، المخيخ). مع وجود اليرقة في هذه الحالة ، لا يمكن الحصول على صور عالية الدقة للدماغ. الشكل 3ب يظهر يرقة من نفس الخط المعدلة وراثيا بعد إجراء جراحة الجمجمة المفتوحة. منطقة الاهتمام الآن بحرية الوصول إليها لليزر الإثارة والضوء الفلوري المنبعث لاختراق الأنسجة دون الحصول على متناثرة وينعكس. الصور المسجلة لهذه اليرقة سوف تؤدي إلى صور مفصلة عالية الدقة (الشكل 3D) ، قابلة للمقارنة مع صور الدماغ المعزول ، ولكن مع ميزة أن الدماغ لا يزال نشطا تماما. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الدماغ لا يفقد أي كثافة مضانة من شأنها أن تكون عادة بسبب التثبيت مع شبه الفورمالديهايد ، كما سيكون الحال بالنسبة للدماغ الثابت والمزلق. في اليرقة ذات الجمجمة المفتوحة ، وبالتالي ، الدماغ الذي يمكن الوصول إليه بحرية مع خلايا عصبية نشطة تماما ، والتي لا تزال تمتلك جميع الاتصالات الفسيولوجية وتتلقى مدخلات طبيعية من النظام الحسي ، سيكون من الممكن أيضا مراقبة الأحداث قصيرة الأجل ، على سبيل المثال ، تولد ال سينابتوجيني ، نمو العمود الفقري ، الهجرة التكفيرية / المحورية أو التعبير المحلي عن الحمض النووي الريبي16 في ظل الظروف الفسيولوجية. ميزة أخرى لهذه الطريقة هي أنها مناسبة لتطبيق مواد دوائية مختلفة للتحقيق في الآثار على اليرقة الحية دون مشاكل الانتشار الناجمة عن الجلد والجمجمة أو حاجز الدم في الدماغ ، والتي عادة ما تعيق المواد لاختراق الدماغ (الشكل 3E). لإثبات ذلك ، تم احتضان يرقة 14 dpf مع جمجمة مفتوحة مع Hoechst-33342 (5 ميكروغرام / مل في ACSF) لمدة 10 دقائق ثم صورت (الشكل 3F-أنا). الشكل 4A,B تظهر 30 dpf اليرقات القديمة قبل وبعد فتح الجمجمة. وهي النقطة الزمنية الأكثر تقدما اختبارها حتى الآن لهذا الأسلوب. حتى في هذه المرحلة التنموية من اليرقة ، من الممكن الحصول على صور عالية الدقة للخلايا العصبية الفردية وكذلك مقصورات دون الخلوية باستخدام الطريقة الموصوفة هنا (الشكل 4C, D). لم تظهر هذه اليرقات القديمة البالغ عددها 30 ديسف في الوورة عجزا في النشاط بعد ساعة واحدة من التصوير. وتستخدم هذه الطريقة أيضا لتحليل المشبك التصحيح الكهربية من 30 يرقات dpf القديمة وليس هناك علامة على فقدان نشاط الخلايا العصبية في خلايا بوركينجي (بعد الخلايا القريبة من السطح حساسة وضعيفة) خلال أول 60 دقيقة من كونها جزءا لا يتجزأ من جمجمة مفتوحة. من خلال الفحص المنتظم لكمية تدفق الدم ، من الممكن التحقق من أن اليرقة لا تزال في حالة صحية جيدة. يمكن الحفاظ على هذه الحالة، من خلال تبادل أو أكسجة ACSF بانتظام أثناء تسجيل الصور على المدى الطويل. لذلك من السهل إلى حد ما التحقق مما إذا كانت اليرقة لا تزال مناسبة لدراسات الدماغ الوظيفية. لإثبات ذلك ، لا تتلف أي أوعية دموية مهمة أثناء الجراحة الدقيقة وأيضا لإظهار أن هذه الطريقة تسمح باختراق أعمق بكثير لضوء الليزر المثير في أنسجة الدماغ وانبعاث الفوتونات المنخفض الانعكاس ، وهي يرقة قديمة 10 dpf من سلالة Tg (flk1:mCherry) المعدلة وراثياy206Tg17 تم تحليلها بواسطة هذه الطريقة. هذه الأسماك تحتوي على الأوعية الفلورية في الدماغ بسبب التعبير عن mCherry البروتين الفلوري الأحمر في الخلايا البطانية. كشف الإسقاط الأقصى للكثافة لكومة صور تغطي عمق 245 ميكرومتر عن الشبكة المعقدة للأوعية الدموية التي تتعرج عبر منتصف وهندبراين (الشكل 5A). وعلاوة على ذلك، ترميز اللون من قيم عمق كومة الصورة يدل على أنه حتى الأوعية الدموية مطهرة بعمق في الدماغ في ما يقرب من 250 ميكرومتر واضحة للعيان ويمكن تتبعها (الشكل 5ب). فيديو تكميلي 1A يظهر الدماغ السليم مع إمدادات كافية من الدم، في حين فيديو تكميلي 1B يظهر الدماغ مع تدفق الدم للخطر بسبب عدم تبادل ACSF وعدم وجود الأوكسجين المتوسطة.
الشكل 3:تقشير الجلد في يرقات حمار وحشي يوفر الوصول الأمثل للتصوير في الدماغ في الجسم الحي. تحليل المجهر Confocal من 14 dpf القديمة المعدلة وراثيا Tg(-7.5ca8:GFP]bz12 اليرقات. نظرة عامة على منتصف و hindbrain من غير مقشر (A , C) والجلد مقشر ( B ,D) عينات في 20x و 40x التكبير على التوالي. في هذا الأخير ، فإن عدم وجود صبغة يحسن بوضوح جودة الصورة ويسمح بتسجيل صورة مفصلة لخلايا Purkinje الفلورية في المخيخ. يظهر التصوير دون الخلوي وسهولة الإدارة المركبة للدماغ من خلال فترة حضانة مدتها 10 دقائق مع تلطيخ الفلورسنت الحمضي النووي باستخدام Hoechst-33342 (5 ميكروغرام / مل في ACSF). في حين أن خلايا الجلد فقط دمج هذه الصبغة في اليرقات غير مقشر (ه) ، والعينات مع رفع الجلد عرض وضع العلامات مكثفة من نواتها في جميع أنحاء الدماغ(F)السماح لتصور نواة الفردية (G) من الخلايا العصبية بوركينجي GFP الفلورسنت (H، صورة مدمجة هو مبين في I، 63x التكبير البصري والرقمي 4x). أشرطة المقياس: A-F: 100 ميكرومتر، G-I: 5 ميكرومتر. كانت اليرقات مضمنة ورأسها إلى اليسار ، الظهرية فوق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:تقشير الجلد يوسع الوصول إلى تصوير الدماغ في الجسم الحي لسمك الحمار الوحشي الأحداث. تحليل المجهر Confocal من 30 dpf القديمة المعدلة وراثيا Tg(-7.5ca8:GFP]bz12Tg الأحداث. نظرة عامة على منتصف و hindbrain من غير مقشر (A) و عينات مقشرة الجلد في 10x (ب) و 40x (C) و 63x التكبير البصري مع 4x التكبير الرقمي (D) ، على التوالي. إزالة الجلد المصطبغة تمكن التصور للتنظيم الخلوي للطبقة الخلية المخيخية المستمر Purkinje وتصوير إسقاطات الخلايا العصبية الفردية(D، السهام البيضاء). أشرطة المقياس: A-C: 100 ميكرومتر، D: 5 ميكرومتر. كانت اليرقات مضمنة ورأسها إلى اليسار ، الظهرية فوق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: إزالة الجلد يسمح إعادة بناء الأوعية الدموية في الدماغ على عمق موسع في 10 dpf القديمة TG (flk1:mCherry)y206Tg حمار وحشي يرقة. (أ) عرض كثافة قصوى من كومة من الصور (245 صور سمك 1 ميكرومتر على مسافة إجمالية قدرها 245 ميكرومتر، 20x التكبير البصري) يعرض شبكة مستمرة من الأوعية الدموية في جميع أنحاء هذه المناطق الدماغ. (ب)عمق لون الترميز يكشف أن هذه الشبكة من الأوعية الدموية يمكن رصدها على عمق 200 ميكرومتر وما بعدها. لإزالة الفلورة التلقائية والتأمل ، كانت العينان ملثمتين باللون الأسود. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. كانت اليرقات مضمنة ورأسها إلى اليسار ، الظهرية فوق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: الإبر المصنوعة من الشعيرات الدموية الزجاجية. (أ)يظهر نوعان من الإبر تم الحصول عليها من اثنين من سحب إبرة مختلفة. من المهم أن الطرف ليست طويلة جدا لتوفير الاستقرار الكافي وتجنب كسر عند الاتصال مع الجلد / الجمجمة. ومع ذلك هناك حاجة إلى الحدة الكافية للسماح بإجراء تخفيضات مع حواف نظيفة. (ب)تظهر صورة للشعيرات الدموية التي يتم تحميلها في سحب الإبرة. شريط المقياس هو 250 ميكرومتر. طول الشعرية: 100 مم; OD: 1.5 مم: معرف: 0.84 مم؛ خيوط: نعم. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
فيديو تكميلي 1: تصوير يرقة 7dpf القديمة. (أ) تسجيل فيلم في الوقت الحقيقي (30 إطارا في الثانية) من يرقة قديمة 7 dpf 10 دقيقة بعد إزالة الجلد فوق الدماغ. تدفق الدم حية تشير إلى حالة صحية مع إمدادات كافية من الدم. (ب) تسجيل الفيلم في الوقت الحقيقي (30 إطارا في الثانية) من نفس اليرقة القديمة 7 dpf هو مبين في الفيديو التكميلي 1A، 2 ساعة بعد الجراحة الدقيقة دون تبادل ACSF وعدم وجود الأوكسجين المتوسطة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر الطريقة المقدمة نهجا بديلا لعزل الدماغ أو علاج يرقات حمار وحشي مع الأدوية التي تمنع التصبغ لتسجيل صور عالية الدقة للخلايا العصبية في بيئتها في الجسم الحي. نوعية الصور المسجلة مع هذه الطريقة مماثلة للصور من العقول المخططة، ولكن في ظل الظروف الطبيعية.
وعلاوة على ذلك، يتم تجنب فقدان في شدة الفلورسينس، لأنه ليست هناك حاجة للعلاج مع المثبتات18. أيضا، هذه الطريقة ليست الغازية مثل عزل الدماغ ويتكون فقط من خطوة واحدة حاسمة يمكن أن تؤدي إلى الفشل، وبالتالي فإن فرص إعداد ناجحة هي أعلى بالمقارنة مع إزالة الدماغ. الميزة الأكثر أهمية هي أن هذه الطريقة مناسبة لتسجيل الصور في الجسم الحي. شريطة أن يتم فتح الجمجمة بدقة وسرعة ونجاح ، ويتم رصد تشبع الأكسجين من ACSF بانتظام ، يجب أن يكون الدماغ يعمل بكامل طاقته وقابلة للحياة لساعات. واستنادا إلى التسجيلات الكهربية والدورة الدموية والتنفس وبقاء الأسماك لأيام إضافية، فإننا نعتبر من المرجح أن إزالة الجلد والجمجمة ليست ضارة بشكل كبير بالصحة العامة. وهكذا، يمكن استخدام هذه الطريقة للتصوير في الوقت الحقيقي من العمليات الخلوية ودون الخلوية في الدماغ صحية ووظيفية دون تصبغ الصورة المزعجة. هذه الطريقة هي إجراء قياسي يستخدم للتسجيلات الكهربية للنشاط العصبي في الجسم الحي في مختبرنا ، وهي راسخة أيضا في مختبرات الفيزيولوجيا الكهربية الأخرى في جميع أنحاء العالم19،20،21،22، مما يثبت أن وظيفة الدماغ لا تضعفها الجراحة الدقيقة. أحد العيوب التي تحتاج إلى ذكرها هو أن هذا النهج مناسب فقط لتصوير مناطق الدماغ الظهرية والظريلية ولا يمكن إجراؤه مرارا وتكرارا بنفس العينة.
ومع ذلك ، إذا كان الدماغ يعمل بكامل طاقته ضروريا للتجربة ، فيجب مراقبة تشبع الأكسجين بشكل دائم ، وإذا لزم الأمر ، يجب تبادل ACSF في غرفة التصوير مع ACSF المؤكسيج حديثا. وهذا يعني، بالنسبة للتسجيلات طويلة الأجل، يجب أن يكون هناك خيار لتبادل ACSF المستخدمة مع ACSF المشبعة بالأوكسجين دون إزعاج إجراء التصوير الذي يمكن معالجته باستخدام مضخة مصغرة.
وتجدر الإشارة إلى أنه إذا لم يتم إجراء الجراحة الدقيقة بشكل صحيح أو غير دقيق، فإنها ستؤدي إلى إصابة في الدماغ أو نزيف دماغي يؤدي إلى ضعف في فسيولوجيا الدماغ. أيضا ، يمكن أن يؤثر تشبع الأكسجين المنخفض في ACSF (انظر الفيديو التكميلي 1)أو الكثير من الإجهاد لليرقات خلال هذا الإجراء بأكمله سلبا على الدماغ23و24. لذلك ، فإن هذه الطريقة ليست مناسبة لتحليل الإنتاجية العالية ، بل لتسجيل صورة طولية أو مفصلة للغاية لعدد قليل فقط من اليرقات في كل نقطة زمنية. لذلك ، لا ينبغي أن تهدف هذه الطريقة لفحص الأدوية في الإنتاجية العالية ، ولكن يمكن استخدامها لتوصيف أو التحقق من صحة المركبات الدوائية الواعدة بالتفصيل ، حيث يكون التصوير عالي الدقة مفيدا وضروريا. لضمان الحالة الصحية السليمة للدماغ ، يوصى بعدم تجاوز عدد اليرقات الثلاث لكل تجربة.
من خلال الجمجمة المفتوحة ، من الممكن حتى تطبيق المواد مباشرة على أنسجة الدماغ دون الحاجة إلى مرورها عبر حاجز الدم في الدماغ. بشكل عام ، فإن الطريقة الموصوفة هنا - المطبقة حاليا في الفيزيولوجيا الكهربية الحية - هي تقنية ذات إمكانات عالية في مجال واسع جدا من تصوير الدماغ الحي وعلم البصريات في يرقات سمك الحمار الوحشي والأحداث ويمكن أن تقترن بنهج الأدوية العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر تيمو فريتش بشكل خاص على الرعاية الممتازة للحيوانات وهيرمان دورينغ ومحمد إلساي وسول بوز منديز وجاكوب فون تروتا وكومالي فاليشيتي وباربرا وينتر على دعمهم المفيد. كما أننا ممتنون لجميع الأعضاء الآخرين في مختبر كوستر على ملاحظاتهم. وتم تمويل المشروع جزئيا من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (إلى RWK) و Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; ومن المسلم به عصر صافي NEURON الثاني CIPRESS المشروع 01EW1520 إلى JCM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish 'affective' behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
