Summary
在这里，我们提出了一种方法，以图像斑马鱼胚胎大脑在体内到幼虫和幼年阶段。这种微创程序，根据电生理学方法改编，提供成熟神经元的细胞和亚细胞细节，并可与光遗传学和神经药理学研究相结合，以描述大脑功能和药物干预。
Abstract
了解大脑发育和成熟过程中发生的短暂变化需要在空间和时间上以细胞和亚细胞分辨率进行详细的高分辨率成像。分子和成像技术的进步使我们能够对透明斑马鱼胚胎中大脑发育的细胞和分子机制获得许多详细的见解。最近，在受精几周后的幼虫阶段发生的神经元连接的细化过程，例如控制社会行为、决策或动机驱动行为，已经进入研究重点。在这些阶段，斑马鱼皮肤的色素沉着会干扰光线渗透到脑组织，胚胎阶段的解决方案，例如，药理抑制色素沉着，已经不可行了。
因此，提供微创手术解决方案，用于通过微观镜进入清醒斑马鱼的大脑，该解决方案源自电生理方法。在电传中，皮肤和柔软的头骨软骨可以通过微皮这些层，暴露潜在的神经元和轴向而不损坏仔细去除。这允许记录神经元形态，包括突触结构及其分子含量，以及观察生理变化，如Ca2+ 瞬态或细胞内传输事件。此外，通过药理抑制或光遗传学操作来审讯这些过程是可行的。这种大脑暴露方法提供有关神经元结构和生理变化的信息，以及这些事件在几分钟或几小时内在活脑组织中的相关性和相互依存性。该技术适用于斑马鱼幼虫在受精后长达30天的体内脑成像，这是迄今为止测试的最新发育阶段。因此，它提供了诸如突触细化和缩放、轴突和树突运输、细胞骨骼货物突触靶向或当地活动依赖表达等重要问题。因此，可以预见这种安装和成像方法的广泛应用。
Introduction
近几十年来，斑马鱼（Danio rerio）已发展成为胚胎和幼虫发育研究中最受欢迎的脊椎动物模型生物之一。斑马鱼雌性的巨大雌性，加上胚胎 的快速前子宫 发育及其在早期胚胎发育阶段的透明度，只是使斑马鱼成为解决发育问题的强大模型有机体的几个关键因素。分子遗传技术的进步与体内成像研究 的高 分辨率相结合，使得解决细胞生物学机制基础发育过程2。特别是在神经元分化、生理学、连通性和功能领域，斑马鱼以前所未有的细节揭示了分子动力学、大脑功能和有机体行为的相互作用。
然而，由于神经系统组织的透明度逐渐丧失，这些研究大多局限于发育第一周的胚胎和早期幼虫阶段。在这些阶段，脑组织被高分辨率显微镜方法阻止进入，从而被头骨分化和色素沉着3所屏蔽。
因此，神经元分化、成熟度和可塑性等关键问题，如神经元连接性或突触缩放的细化，都难以研究。这些细胞过程对于定义细胞机制驱动非常重要，例如，社会行为、决策或基于动机的行为，斑马鱼对数周幼虫的研究最近根据行为研究贡献了关键发现。
药理学方法抑制斑马鱼幼虫色素的色素消耗几个星期是几乎不可行，甚至可能造成有害影响5，6，7，8。具有特定色素沉着缺陷的双突变株（如casper9或晶体10）已成为极其有价值的工具，但在育种方面非常费力，提供很少的后代，并且由于近亲繁殖过度而造成遗传畸形的积累危险。
在这里，提供最小侵入性程序作为替代，适用于任何斑马鱼菌株。这个程序是从电生理学研究中改编而来，记录活的和清醒的斑马鱼幼虫的神经元活动。在电传中，皮肤和柔软的头骨软骨可以通过微皮仔细去除这些层，因为它们没有与大脑血管紧密交织。这允许暴露含有神经元和轴突的脑组织而不造成损伤，并记录神经元形态，包括突触结构及其分子含量，这反过来又包括观察生理变化，如Ca2+ 瞬态或细胞内传输事件长达数小时。此外，除了描述性特征外，直接接触脑组织还可以通过神经药物管理和光遗传学方法对成熟的神经元功能进行审讯。因此，使用这种大脑暴露策略，可以在幼斑马脑中揭示出真正的结构功能关系。
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Protocol
此处描述的所有动物工作均符合法律规定（欧盟指令 2010/63）。养护和处理鱼类已得到地方当局和布劳恩施魏格技术大学动物福利代表的批准。
1. 准备人工脑脊液（ACSF）、低熔化藻和锋利的玻璃针
- 通过溶解蒸馏水中的以下浓度溶解所列化学品，准备 ACSF。134 m M NaCl （58.44 克/摩尔）， 2.9 mM KCl （74.55 克/摩尔）， 2.1 m CaCl2 （110.99 克/摩尔）， 1.2 mM MgCl2 6x H2O （203.3 克/摩尔）、10 mM HEPES （238.31 克/摩尔） 和 10 mM d-葡萄糖（180.16 克/摩尔）。
注：对于MgCl2、CaCl2和 KCl，100 万库存溶液在脱盐无菌水中准备，并储存在 4 °C 下，以便随后准备新的 ACSF。葡萄糖、HEPES 和 NaCl 作为固体化合物溶解在新鲜的 ACSF 溶液中。对于溶解化学品，请按照制造商的说明操作。 - 将 ACSF 的 pH 值调整为 7.8，配备 10 M NaOH。ACSF的制备需要精确测量化学物质和pH值的微调，因为它取代了脑脊髓液，并维持神经元完全正常运作所需的生理条件，否则可能导致大脑功能失调和神经元死亡。
- 将新准备的 ACSF 存储在 4 °C 下，最长 4 周。对于工作条件，在 25-28 °C 下，将当天/实验和预温所需的 ACSF 体积（并可选地将其氧化，步骤 2.5）
注：新准备的ASCF可以 1 天。如果计划使用几天，ACSF 需要无菌过滤。 - 对于幼虫的麻醉，在蒸馏水中准备 50 mM 的 d-Tubocurarine 库存溶液，并将溶液存储在 -20 °C 作为 100 μL 的阿利奎特在冰箱中，直到需要为止。
- 要嵌入鱼，准备2.5%低熔化（LM）的玫瑰溶解1.25克LM-阿加罗斯（材料表）在50ml ACSF和煮沸，直到阿加罗斯完全溶解。
注意：或者，根据实验设置，可以使用更高或更低浓度的LM-agarose。然而，如果玫瑰太软，它将无法举行鱼的位置时，打开头骨。 - 将藻子储存在37°C的水浴中，以避免凝固，因为这种温度也不会在嵌入时伤害幼虫。在水浴中将煮沸的阿加罗斯冷却到 37 °C 后，在当天所需的藻类中加入必要的 d-Tubocurarine，以达到 10 μM 的工作浓度。供将来使用时，将剩余的藻子储存在 4 °C 处，以避免污染。
- 使用具有以下设置的微管拉拔器，从玻璃毛细血管中准备锋利而薄的玻璃针（补充图1）。
- 拉力I，毛细电类型1：热1：65.8：热 2： 55.1：2 步拉力
拉拔器 II， 毛细电类型 2： 热 + 700;菲尔 = 4;维尔 = 55;德尔 = 130;脉冲 = 55;1 步拉力。
注：这些装置分别用于此处使用的每个拉拔器和玻璃毛细圈（参见 材料表）。其他毛细血管和拉拔器也可用于准备玻璃针。但是玻璃针不应该太薄，因为它们在与头骨接触时可能会断裂。毛细电：长度：100毫米（4英寸）：OD： 1.5 毫米;ID： 0.84 毫米：灯丝：是的
- 拉力I，毛细电类型1：热1：65.8：热 2： 55.1：2 步拉力
2. 幼虫麻醉和嵌入准备
- 当开始当天的实验时，将用塑料巴斯德移液器需要的动物转移到直径为 90 mm 的培养皿中，里面装满了 Danieau（对于仍然与 Danieau 一起保存在培养皿中的幼虫）或来自鱼类设施的水（对于年龄超过 7 dpf 且保存在鱼类设施中的幼虫）。
- 当管道鱼超过2周时，确保移液器的开口足够大，以避免在转移鱼时伤害它们。不要使用网，因为它会身体伤害，特别是年轻的幼虫。
- 加入适合培养皿中幼虫大小的 罗蒂费拉 或 艺术性纳 普利，以确保幼虫免费获得食物和最大健康状况，并减轻压力。
- 要嵌入，将选定的幼虫转移到一个直径为 35 mm 的培养皿中，该盘中充满了 ACSF。加入必要的量d-Tubocurarine，以达到工作浓度/有效剂量10μM，并等待几分钟，直到幼虫完全固定11。
注：当鱼变老或需要更快的全身麻醉（5分钟以下），有可能增加d-Tubocurarine的浓度（小鼠的LD50是0.13毫克/千克静脉注射12）。也可以使用不同的麻醉剂，如α-bungarotoxin（工作浓度：1毫克/毫升），它具有与库拉雷相同的效果，也保持大脑充分活跃13。如果一个完全活跃的大脑是没有必要的兴趣对象，特里卡因在非致命剂量（0.02%）也是一个选项，完全麻醉幼虫。然而，三卡因阻断钠通道，从而损害大脑活动14。 - 将直径为 35 mm 的 Petri 盘盖上盖子，倒置盖子，并将方形玻璃盖片（24 x 24 mm）放在盖子底部，从而准备安装室。有关这些步骤的示意图描述，请参阅 图 1（ 上半部分）。玻璃表面更光滑，可防止从头骨开启过程中含有幼虫的玫瑰块中滑落。
- 在适当的小瓶（例如，50 mL 管、烧杯、肖特瓶等）中，将当天所需的 ACSF 量进行氧化，并将其与卡博根（5% CO 2、95% O2）进行氧合。如果成像只是形态学（例如荧光模式）ACSF仍然是必要的，以确保大脑的完整性，并确保细胞不受渗透效应的负面影响，但不需要ACSF的氧合。此步骤仅在成像所需的全脑活动时执行。
注：为了最佳的介质氧饱和度，在卡博根管的末端添加一块空气石。为了保证足够高的氧气水平，有必要每20-60分钟在成像室中用新鲜含氧的ACSF交换一次ACSF，这取决于嵌入在同一成像室中的幼虫的数量和年龄（例如，每小时交换一个嵌入式幼虫ACSF就足够了。对于平行嵌入的6只14分以上的幼虫，每20分钟交换一次ACSF是必要的），因此根据计划的实验计划必要的氧饱和ACSF量。
3. 幼虫的嵌入
- 将完全麻醉的幼虫用塑料巴斯德移液器转移到（第 2.4 步）准备好的安装室。然后，小心地去除多余的介质，以避免 LM-agarose 稀释。所有以下步骤应在具有足够放大的立体显微镜下执行。
注意：倾斜安装室有助于完全移除介质。 - 立即进入下一步，在幼虫（约1mL，取决于幼虫的大小）上添加足够大的LM-agarose下降，以保护动物不干涸，并减少不必要的压力。
- 在阿加罗斯凝固之前，将幼虫定向在位置。确保幼虫的正点部分向上定向。此外，请务必尽可能靠近幼虫表面嵌入幼虫。
注：根据计划同时嵌入的幼虫的大小和数量，可以调整藻糖浓度。例如，对于 1-3 幼虫是 30 dpf 老， 建议浓度 1.8%-2% LM-阿加罗斯.对于 1-4 幼虫是 7 dpf 老， 这是最可行的使用 2.5% LM - 阿加罗斯， 而， 对于 5-8 幼虫， 2% 更适合.如果需要一个完全活跃的大脑，建议只嵌入三条鱼在同一时间，以减少所需的时间操作幼虫。一般来说，建议使用浓度较低的（1.8%-2%），幼虫越老，或计划同时嵌入更多的幼虫。 - 如果图像将使用倒置显微镜记录，将含有幼虫的阿加罗斯块修剪成一个小的幼崽形状。这对于以后将幼虫转移到成像室非常重要。如果使用直立显微镜，则不需要进行这种修剪，因为安装室也可以用作成像室。在 图 1（ 上半部分）中，可以找到这些步骤的示意图描述。
4. 暴露大脑
注意：应非常小心地执行以下所有步骤，不要不必要地伤害幼虫。如果实验需要一个完全活跃的大脑，请记住，每过一秒，鱼仍然完全安装在阿加罗斯，有一个开放的头骨没有氧化ACSF，大脑将遭受缺氧，也干涸。缺氧的影响将变得更加戏剧化，嵌入幼虫越老。因此，重要的是不仅在尽可能短的时间内进行手术，而且要以最大的精度，不要引起机械脑损伤与针头。训练时，步骤 4.2-4.4 每条鱼不应超过 30 秒。
- 一旦玫瑰凝固，就开始手术。首先，修剪掉大脑感兴趣的区域上方的所有多余的气喘，以获得头部和清晰的工作空间。如果头部的正点部分已经伸出了腹膜，请跳过此步骤。
- 根据感兴趣的区域，选择一个点开始手术。拿玻璃针，在皮肤上做一个小切口，但不会穿透组织太深。这将是剥去覆盖皮肤的起点。
注：为了获得最佳结果，切勿直接从感兴趣区域上方开始，以降低损坏重要结构的风险。如有必要，甚至可以开始后脑后脑，并从那里向前工作，直到皮肤的不需要的区域被剥去。 - 继续沿着皮肤的一部分非常小的切口，旨在通过在表面下方几乎移动针头来去除。大多数时候，没有必要完全围绕大脑移动，切出一块圆形的皮肤和头骨，而只需沿着头部做两个切口，然后把皮肤推到一边或另一边。 图2 显示了获得小脑自由访问的优化切割策略的示意图。
注：这种微手术是一个微妙的过程，它很可能需要一些培训，以完美地去除皮肤，而不会损害潜在的大脑。建议找出大脑感兴趣区域的最佳切割策略，并在实验期间坚持使用。 - 立即从所有嵌入的幼虫中去除皮肤后，立即将（含氧的）ACSF倒在玫瑰上，以冲走不需要的皮肤颗粒和血液，保持大脑充分活跃，并保护大脑不干涸。
注意：如果实验需要一个健康的大脑，建议每次最多吃三条鱼。 - 如果使用直立显微镜，则直接从成像开始。
- 使用倒置显微镜时，将一个小铲子滑到库博伊德玫瑰块（第 3.4 步）下面。
- 在成像室底部（例如玻璃底盘）上加入一小滴LM-agarose，然后立即用铲子翻转含有幼虫的阿加罗斯块180°，轻轻将其推到成像室底部，而液体气垫则充当胶水。
- 当气融凝固后，将成像室装满（含氧的）ACSF，然后开始成像。有关示意图描述，请参阅 图 1（ 下半部分）。
- 当实验需要全脑活动时，始终确保成像室中的 ACSF 具有足够高的氧气水平。为了确保这一点，每20-60分钟（取决于鱼的数量和大小，成像室的大小和表面，以及成像持续时间），尽可能小心地与新鲜含氧的ACSF交换介质。
图1：为开放头骨斑马鱼的分步成像准备的示意图程序。不同步骤的工作说明可在图形本身中找到。图形由弗洛里安·赫奇设计，保罗·施拉姆改编。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：为去除大脑区域上方的皮肤和头骨碎片而进行的微手术的详细示意图。 红色圆圈标记了需要进行第一次切割的位置。红点线划出最佳路径，与针头一起切割，以获得免费进入小脑，而不会损坏它。绿色箭头标记了过度的皮肤和头骨碎片很容易被推开的方向。在整个过程中，确保不要渗透到脑组织中。成功剥去皮肤后，感兴趣的大脑区域（这里，小脑）将可自由访问任何类型的高分辨率 活体 成像。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Representative Results
图3A， C 显示转基因线 Tg [-7.5Ca8：GFP] 的 14 dpf 幼虫bz12]15] 头骨仍然完好无损覆盖皮肤中的色素细胞分布在头部，并干扰感兴趣的区域（这里，小脑）的荧光信号。在这种情况下，幼虫不可能获得大脑的高分辨率图像。 图 3B 在进行开放性头骨手术后，显示同一转基因线的幼虫。现在，激发激光可以自由进入感兴趣的区域，并发射荧光来穿透组织，而不会散射和反射。记录这种幼虫的图片将导致详细的高分辨率图像 （图 3D），可与孤立的大脑图像相媲美，但具有大脑仍然完全活跃的优势。此外，大脑不会失去任何荧光强度，通常是由甲醛固定引起的，就像固定和植入的大脑一样。在一个有开放头骨的幼虫中，因此，一个具有完全活跃神经元的自由进入的大脑中，它仍然拥有所有生理连接，并从感官系统接收正常输入，也能够观察短期事件，例如，突触发生、脊柱生长、树突/轴向迁移或局部mRNA表达16 在生理条件下。这种方法的另一个优点是，它适合应用不同的药理物质来研究对活幼虫的影响，而不会引起皮肤和头骨或血脑屏障的扩散问题，这通常会阻碍物质穿透大脑（图 3E).为了证明这一点，一个14dpf幼虫与开放的头骨孵育与霍奇斯特-33342（5微克/mL在ACSF）10分钟，然后成像（图 3F-我). 图4A， B 显示 30 dpf 老幼虫打开头骨前后。这是迄今为止测试该方法的最先进时间点。即使在幼虫的这个发育阶段，也有可能使用本文所述方法获得单个神经元和亚细胞舱的高分辨率图像（图4C， D).这30头老幼虫在1小时成像后没有表现出活动缺陷。该方法还用于电生理贴片夹分析30 dpf老幼虫，没有迹象表明在Purkinje细胞（但靠近表面的细胞是微妙和脆弱的）的神经元活动损失的头60分钟嵌入一个开放的头骨。通过定期检查血流量，可以验证幼虫是否仍然处于健康状态。通过在长期图像录制期间定期交换或氧化 ACSF，可以保持此状态。因此，验证幼虫是否仍然适合功能性大脑研究是相当简单的。为了证明，在微手术过程中没有重要的血管受损，也表明这种方法允许激发激光深入渗透到脑组织和光子的反射减少发射，光子是转基因菌株Tg的10dpf老幼虫（flk1：mCherry）y206Tg17 用这种方法进行分析。由于内皮细胞中红色荧光蛋白mCherry的表达，这些鱼在大脑中含有荧光血管。图像堆栈的最大强度投影深度为 245 μm，揭示了血管在中脑和后脑中蜿蜒的复杂网络（图5A).此外，图像堆栈深度值的颜色编码表明，即使是在近 250 μm 下深埋在大脑中的血管也清晰可见且可追溯（图 5B). 补充视频 1A 显示一个健康的大脑有足够的血液供应，而 补充视频 1B 显示由于缺乏 ACSF 的交换和缺乏中氧，大脑的血液流动受损。
图3：斑马鱼幼虫的皮肤剥落为活体脑成像提供了最佳途径。对14 dpf旧转基因Tg（-7.5ca8：GFP）bz12幼虫的共聚焦显微镜分析。中脑和后脑的中皮（A、C）和皮皮（B、D）标本的放大倍数分别为20倍和40倍。在后者中，缺乏色素可以明显改善图像质量，并允许对小脑中的荧光Purkinje细胞进行详细的图像记录。使用霍奇斯特-33342（ACSF中的5微克/mL）使用核酸荧光染色，通过10分钟的潜伏期，可以证明亚细胞成像和大脑复合管理的易用性。虽然只有皮肤细胞将这种染料融入非剥皮幼虫（E），但带提升皮肤的标本在整个大脑（F）中显示其核的强烈标记，从而能够可视化GFP荧光Purkinje神经元（H，合并图像，显示在I，63倍光学和4倍数字放大）。 秤杆： A-F： 100 μm， G-I： 5 μm.幼虫被嵌入他们的头向左， 多萨尔是向上。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：皮肤剥落为幼斑鱼提供体内脑成像服务。对30 dpf旧转基因Tg（-7.5ca8：GFP）bz12Tg幼童的聚焦显微镜分析。概述非剥皮（A） 和皮肤剥落标本的中脑和后脑，分别位于 10 倍（B） 和 40 倍（C）和 63 倍光学放大与 4 倍数字变焦（D）。去除色素皮肤使连续小脑Purkinje细胞层的细胞组织可视化，并描绘单个神经元（D，白箭头）的投影。秤杆： A-C： 100 μm， D： 5 μm.幼虫被嵌入他们的头向左， 多萨尔是向上。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：皮肤去除允许大脑血管重建在10 dpf旧Tg（flk1：mCherry）y206Tg斑马鱼幼虫的扩展深度。（A） 一叠图像的最大强度投影（245 张厚度为 1 μm 的图像，总距离为 245 μm，光学放大倍数为 20 倍）显示这些大脑区域的血管连续网络。（B） 深度颜色编码显示，这种血管网络可以在200μm及以上深度进行监测。为了去除自发光和反射，眼睛被黑色遮盖。秤吧：100μm。幼虫被嵌入他们的头向左， 多萨尔是向上。请单击此处查看此图的较大版本。
补充 图1：用玻璃毛细血管制成的针头。（A） 显示从两种不同的针拔器中获取的两种针头类型。重要的是，尖端不会太长，以提供足够的稳定性，并避免他们打破时，接触皮肤/骷髅。然而，需要足够的锐度，以允许与干净的边缘削减。（B） 显示在针拔器中装载的毛细细圈的图像。秤杆为 250 μm。毛细长：100毫米：OD： 1.5 毫米： ID： 0.84 毫米：灯丝：是的。请点击这里下载此图。
补充视频1：成像7dpf老幼虫。 （A） 实时电影记录 （30 fps） 从 7 dpf 老幼虫 10 分钟后， 大脑上方的皮肤已被删除。生动的血液流动表明血液供应充足的健康状态。（B） 实时电影记录 （30 fps） 从相同的 7 dpf 老幼虫显示在补充视频 1A， 2 小时后， 显微外科没有交换 ACSF 和缺乏中氧。比例栏： 100 μm.请点击这里下载此视频。
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Discussion
提出的方法提供了一种替代方法，大脑隔离或斑马鱼幼虫的治疗与药物抑制色素干扰记录高分辨率图像的神经元在其 体内 环境。使用这种方法记录的图像质量可与从外生大脑中拍摄的图像相媲美，但在自然条件下。
此外，避免了荧光强度的损失，因为没有必要用固定剂18治疗。此外，这种方法不像隔离大脑那样具有侵入性，它只包括可能导致失败的一个关键步骤，因此与大脑外植相比，成功制备的可能性更高。最重要的优点是，这种方法适用于活体图像记录。只要头骨开口精确、快速、成功，并定期监测ACSF的氧饱和度，大脑应功能齐全，存活数小时。根据电生理记录、血液循环、呼吸和鱼类存活数天，我们认为皮肤和头骨切除可能对整体健康没有重大危害。因此，这种方法可用于在健康且功能良好的大脑中实时成像细胞和亚细胞过程，而无需进行图像干扰色素沉着。这种方法是用于我们实验室体内神经元活动的电生理记录的标准程序，也在全球其他电生理实验室中得到了很好的证实，证明大脑的功能不会因微手术而受损。需要提及的一个缺点是，这种方法仅适用于脊周和横向大脑区域的成像，不能用同一标本反复执行。
但是，如果实验需要功能齐全的大脑，则应永久监测氧饱和度，如果需要，应与新鲜含氧的 ACSF 交换成像室中的 ACSF。这意味着，对于长期录音，需要有一个选项来将使用的 ACSF 与氧饱和 ACSF 进行交换，而不会干扰可使用微型泵解决的成像过程。
值得注意的是，如果微手术不能正确或不精确地进行，它将导致脑损伤或脑出血，导致大脑生理受损。此外，在ACSF（见补充视频1）低氧饱和度或太多的压力的幼虫在这整个过程中可以负面影响大脑23，24。因此，这种方法不适合高通量分析，而是适用于每个时间点只有几只幼虫的纵向或高度详细的图像记录。因此，这种方法不应用于高吞吐量的药物筛选，但它可用于详细描述或验证有前途的药理化合物，其中高分辨率成像是信息丰富和必要的。为了确保适当的大脑健康状况，建议每次试验不超过三只幼虫的数量。
通过开放的头骨，甚至有可能直接将物质应用于脑组织，而无需它们通过血脑屏障。总的来说，这里描述的方法 - 目前应用于 体内 电生理学 - 是一种技术，具有很高的潜力，在非常广泛的 领域，在体内 脑成像和光遗传学在斑马鱼幼虫和青少年，可以与神经药理学方法相结合。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们特别感谢蒂莫·弗里奇出色的动物护理，赫尔曼·德林、穆罕默德·艾尔赛、索尔·波塞-门德斯、雅各布·冯·特罗塔、科马利·瓦利谢蒂和芭芭拉·温特给予我们帮助的支持。我们还感谢科斯特实验室的所有其他成员的反馈。该项目部分由德国研究基金会（DFG，KO1949/7-2）项目241961032（到RWK）和德国联邦委员会（BMBF）资助。时代网神经NII CIPRESS项目01EW1520到JCM）得到认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
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