Summary
Her præsenterer vi en metode til at forestille zebrafisk embryonale hjerne in vivo op til larve og unge stadier. Denne mikroinvasive procedure, der er tilpasset fra elektrofysiologiske tilgange, giver adgang til cellulære og subcellulære detaljer om moden neuron og kan kombineres med optogenetik og neurofarmakologiske undersøgelser til karakterisering af hjernefunktion og lægemiddelintervention.
Abstract
Forståelse af de kortvarige ændringer, der opstår under hjernens udvikling og modning kræver detaljeret høj opløsning billeddannelse i tid og rum på cellulære og subcellulære opløsning. Fremskridt inden for molekylære og billeddannelsesteknologier har gjort det muligt for os at få mange detaljerede indsigter i cellulære og molekylære mekanismer i hjernens udvikling i det gennemsigtige zebrafiskembryo. For nylig er processer til raffinement af neuronal forbindelse, der forekommer på senere larvestadier flere uger efter befrugtning, som for eksempel er kontrol over social adfærd, beslutningstagning eller motivationsdrevet adfærd, flyttet i fokus for forskning. På disse stadier forstyrrer pigmentering af zebrafiskhuden lysindtrængning i hjernevævet, og løsninger til embryonale stadier, f.eks. farmakologisk hæmning af pigmentering, er ikke længere mulige.
Derfor gives en minimalt invasiv kirurgisk løsning til mikroskopiadgang til hjernen af vågen zebrafisk, der stammer fra elektrofysiologiske tilgange. I teleosts, hud og bløde kraniet brusk kan forsigtigt fjernes ved mikro-peeling disse lag, udsætter underliggende neuroner og axonale skrifter uden skader. Dette giver mulighed for registrering af neuronal morfologi, herunder synaptiske strukturer og deres molekylære indhold, og observation af fysiologiske ændringer såsom Ca2 + transienter eller intracellulære transporthændelser. Desuden er det muligt at forhøre disse processer ved hjælp af farmakologisk hæmning eller optogenetisk manipulation. Denne hjerneeksponeringsmetode giver information om strukturelle og fysiologiske ændringer i neuroner samt sammenhængen og den indbyrdes afhængighed mellem disse hændelser i levende hjernevæv inden for få minutter eller timer. Teknikken er velegnet til in vivo hjernescanning af zebrafisk larver op til 30 dage efter befrugtning, den seneste udviklingsstadie testet hidtil. Det giver således adgang til så vigtige spørgsmål som synaptisk raffinement og skalering, axonal og dendritisk transport, synaptisk målretning af cytoskeletal last eller lokalt aktivitetsafhængigt udtryk. Derfor kan der forventes en bred anvendelse af denne monterings- og billedbehandlingsmetode.
Introduction
I løbet af de seneste årtier har zebrafisken (Danio rerio) udviklet sig som en af de mest populære hvirveldyrmodelorganismer til embryonale og larveudviklingsundersøgelser. Zebrafiskhunnernes store fecundity kombineret med embryoets hurtige udvikling og dets gennemsigtighed i de tidlige embryonale udviklingsstadier er blot nogle få nøglefaktorer, der gør zebrafisk til en stærk modelorganisme til at løse udviklingsmæssige spørgsmål1. Fremskridt inden for molekylære genteknologier kombineret med undersøgelser med høj opløsning in vivo-billeddannelse gjorde det muligt at behandle cellebiologiske mekanismer, der ligger til grund for udviklingsprocesser2. Især inden for neuronal differentiering, fysiologi, forbindelse og funktion har zebrafisk kastet lys over samspillet mellem molekylær dynamik, hjernefunktioner og organismeadfærd i hidtil usete detaljer.
Men de fleste af disse undersøgelser er begrænset til embryonale og tidlige larvestadier i løbet af den første uge af udviklingen, da gennemsigtigheden af nervesystemvævet gradvist går tabt. På disse stadier forhindres hjernevæv fra adgang ved højopløsningsmikroskopimetoder, der bliver afskærmet af kraniedifferentiering og pigmentering3.
Derfor er centrale spørgsmål om neuronal differentiering, modning og plasticitet såsom forfinelse af neuronal forbindelse eller synaptisk skalering vanskelige at studere. Disse cellulære processer er vigtige for at definere cellulære mekanismer, der kører, for eksempel social adfærd, beslutningstagning eller motivationsbaseret adfærd, områder, som zebrafisk forsker i flere ugers gamle larver for nylig har bidraget med nøgleresultater baseret på adfærdsundersøgelser4.
Farmakologiske metoder til at hæmme pigmentering i zebrafisklarver i flere uger er næppe gennemførlige eller kan endda forårsage skadelige virkninger5,6,7,8. Dobbelt eller tredobbelt mutant stammer med specifikke pigmenteringsdefekter, såsom casper9 eller krystal10, er blevet enormt værdifulde værktøjer, men er besværlige i avl, giver få afkom og udgør faren for at akkumulere genetiske misdannelser på grund af overdreven indavl.
Her gives en minimal invasiv procedure som et alternativ, der gælder for enhver zebrafiskstamme. Denne procedure blev tilpasset fra elektrofysiologiske undersøgelser for at registrere neuronal aktivitet i levende og vågne zebrafisklarver. I teleosts, hud og bløde kraniet brusk kan forsigtigt fjernes ved mikro-peeling disse lag, fordi de ikke er tæt sammenvævet med hjernen vaskulatur. Dette giver mulighed for at udsætte hjernevæv, der indeholder neuroner og axonale skrifter uden skader og til registrering af neuronal morfologi, herunder synaptiske strukturer og deres molekylære indhold, som igen omfatter observation af fysiologiske ændringer som Ca2 + transienter eller intracellulære transporthændelser i op til flere timer. Ud over beskrivende karakteristik muliggør den direkte adgang til hjernevæv desuden forhør af modne neuronale funktioner ved hjælp af neurofarmakologisk stofbrug og optogenetiske tilgange. Derfor kan ægte strukturfunktionsforhold afsløres i den unge zebrafiskhjerne ved hjælp af denne hjerneeksponeringsstrategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt dyrearbejde, der beskrives her, er i overensstemmelse med lovbestemmelser (EU-direktiv 2010/63). Vedligeholdelse og håndtering af fisk er blevet godkendt af de lokale myndigheder og af dyrevelfærdsrepræsentanten for Technische Universität Braunschweig.
1. Fremstilling af kunstig cerebro spinalvæske (ACSF), lavt smeltende agarose og skarpe glasnåle
- Forbered ACSF ved at opløse de anførte kemikalier ved følgende koncentrationer i destilleret vand. 134 mM NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM KCl (74,55 g/mol), 2,1 mM CaCl2 (110,99 g/mol), 1,2 mM MgCl2 6x H2O (203,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,31 g/mol) og 10 mM d-glucose (180,16 g/mol).
BEMÆRK: For mgcl2-, CaCl2-og KCl-opløsninger fremstilles 1 M lageropløsninger i afsaltet sterilt vand og opbevares ved 4 °C til efterfølgende tilberedning af frisk ACSF. Glukose, HEPES og NaCl opløses som faste forbindelser i den friske ACSF-opløsning. For opløsning af kemikalier skal du følge producentens anvisninger. - Acsf's pH-kel justeres til 7,8 med 10 M NaOH. Forberedelse af ACSF kræver præcis måling af kemikalier og finjustering af pH, da det erstatter cerebro spinalvæsken og opretholder de fysiologiske forhold, der kræves for neuroner at være fuldt funktionelle ellers kan det forårsage hjernens fejlfunktion og neuronale død.
- Den frisklavede ACSF opbevares ved 4 °C i højst 4 uger. For så arbejdsvilkårenes vedkommende skal den krævede mængde ACSF for dagen/eksperimentet og forvarmme ved 25-28 °C (og eventuelt oxygenere den, trin 2.5)
BEMÆRK: Frisklavet ASCF er fint i 1 dag. Hvis du planlægger at bruge det over flere dage, skal ACSF sterilt filtreres. - Til senere anæstesi af larverne skal du forberede en 50 mM lageropløsning d-Tubocurarine i destilleret vand og opbevare opløsningen ved -20 °C som 100 μL aliquots i fryseren, indtil det er nødvendigt.
- For at integrere fisken skal fisken tilberedes 2,5% lavt smeltende (LM) agarose ved at opløse 1,25 g LM-agarose(Table of Materials)i 50 mL ACSF og kog, indtil agarose er helt opløst.
BEMÆRK: Alternativt kan højere eller lavere koncentrationer af LM-agarose anvendes afhængigt af forsøgsopsætningen. Men hvis agarose er for blød, vil den ikke være i stand til at holde fisken på plads, når du åbner kraniet. - Agarose opbevares ved 37 °C vandbad for at undgå størkning, og fordi denne temperatur heller ikke vil skade larverne ved indlejring. Efter at den kogte agarose er afkølet til 37 °C i vandbadet, tilsættes den nødvendige mængde d-Tubocurarine til den aliquoted agarose, der er nødvendig for dagen for at nå en arbejdskoncentration på 10 μM. Til fremtidig brug opbevares den rekrede agarose ved 4 °C for at undgå kontaminering.
- Forbered skarpe og tynde glasnåle af glaskapillærer (supplerende figur 1) ved hjælp af en mikropipettetrækker med følgende indstillinger.
- Puller I, Kapillær type 1: Varme 1: 65.8; Varme 2: 55.1; 2-trins træk
Puller II, Kapillær type 2: Varme = 700; Fil = 4; Vel = 55; Del = 130; Pul = 55; 1-trins træk.
BEMÆRK: Enhederne er specifikke for hver puller og glaskapillær, der anvendes her ( se materialetabel). Andre kapillærer og pullere kan også bruges til at forberede glasnålene. Men glasnålene bør ikke være for tynde, da de kan gå i stykker, når de kommer i kontakt med kraniet. Kapillær: længde: 100 mm; OD: 1,5 mm; ID: 0,84 mm; Filament: Ja
- Puller I, Kapillær type 1: Varme 1: 65.8; Varme 2: 55.1; 2-trins træk
2. Anæstesi af larver og præparater til indlejring
- Når du starter eksperimentet for dagen, skal du overføre de dyr, der er nødvendige med en plast Pasteur pipette, til en petriskål med en diameter på 90 mm, som er fyldt med enten Danieau (for larver, der stadig opbevares i en petriskål med Danieau) eller vand fra fiskefaciliteten (for larver, der er ældre end 7 dpf og opbevares i fiskefaciliteten).
- Når du pipetter fisk ældre end 2 uger, skal du sørge for, at åbningen af pipetten er stor nok til at undgå at skade fisken, når du overfører dem. Brug ikke et net, fordi det fysisk vil skade især de yngre larver.
- Tilsæt rotifera eller artemia nauplii, der passer til størrelsen af larverne, der holdes i petriskålen, for at sikre fri adgang til mad og maksimal sundhedsstatus for larverne og for at reducere stress.
- Til indlejring overføres de udvalgte larver til en petriskål med en diameter på 35 mm fyldt med ACSF. Tilsæt den nødvendige mængde d-Tubocurarine for at opnå en arbejdskoncentration/effektiv dosis på 10 μM og vent et par minutter, indtil larverne er helt immobiliseret11.
BEMÆRK: Når fisken bliver ældre, eller hvis der er behov for en hurtigere fuld anæstesi (under 5 min),er det muligt at øge koncentrationen af d-Tubocurarine (LD50 for mus er 0,13 mg/kg intravenøst12). Det er også muligt at bruge et andet bedøvelsesmiddel, såsom α-bungarotoxin (arbejdskoncentration: 1 mg / mL), som har samme virkning som curare og også holder hjernen fuldt aktiv13. Hvis en fuldt aktiv hjerne ikke er nødvendig for emnet interesse, Tricaine i en ikke-dødelig dosis (0,02%) er også en mulighed for fuldt ud at bedøve larverne. Tricaine blokerer dog natriumkanaler og derved svækker hjernens aktivitet14. - Forbered monteringskammeret ved at tage låget på petriskålen med en diameter på 35 mm, vend låget på hovedet, og placer en firkantet glasovertrækssklip (24 x 24 mm) på bunden af låget. Se figur 1 (øverste del) for at få en skematisk beskrivelse af disse trin. Glassets glattere overflade forhindrer, at den glider væk fra agaroseblokken, som indeholder larverne under kranieåbningsproceduren.
- Aliquot mængden af ACSF er nødvendig for dagen i et passende hætteglas (f.eks 50 mL rør, bægerglas, Schott flaske, osv.) og oxygenat det med carbogen (5% CO2, 95% O2). Hvis billeddannelse kun er morfologi (f.eks. fluorescensmønstre) er ACSF stadig nødvendig for at sikre hjernens integritet, og at cellerne ikke påvirkes negativt af osmolaritetseffekter, men at iltning af ACSF ikke er nødvendig. Dette trin skal kun udføres, når fuld hjerneaktivitet er nødvendig for billeddannelse.
BEMÆRK: For optimal iltmætning af mediet tilsættes en luftsten til enden af carbogenrøret. For at sikre et tilstrækkeligt højt iltniveau er det nødvendigt at udskifte ACSF i billeddannelseskamrene med frisk iltet ACSF hvert 20.-60. minut, afhængigt af antallet og alderen af larver indlejret i samme billeddannelseskammer (f.eks. er det tilstrækkeligt for en enkelt indlejret larve ACSF-udveksling hver time. For seks larver ældre end 14 dpf indlejret parallelt er det nødvendigt at udskifte ACSF hvert 20. minut), så planlæg den nødvendige mængde iltmættet ACSF i henhold til det planlagte eksperiment.
3. Indlejring af larverne
- Overfør de fuldt bedøvede larver med en plast Pasteur pipette til (i trin 2.4) forberedt monteringskammer. Fjern derefter forsigtigt det overskydende medium for at undgå fortynding af LM-agarose. Alle følgende trin skal udføres under et stereomikroskop med tilstrækkelig forstørrelse.
BEMÆRK: Vippe monteringskammeret kan hjælpe med at fjerne mediet helt. - Fortsæt straks til næste trin ved at tilføje et tilstrækkeligt stort LM-agarose-fald oven på larverne (ca. 1 mL afhængigt af larvernes størrelse) for at beskytte dyrene mod udtørring og for at reducere unødvendig stress.
- Orientere larverne på plads, før agarose størkner. Sørg for, at den dorsale del af larverne er rettet opad. Sørg også for at integrere larverne så tæt på overfladen af agarose som muligt.
BEMÆRK: Afhængigt af størrelsen og antallet af larver, der er planlagt til at integrere på samme tid, er det muligt at justere agarosekoncentrationen. For eksempel anbefales en koncentration på 1,8%-2% LM-agarose for 1-3 larver, der er 30 dpf gamle. For 1-4 larver, der er 7 dpf gamle, er det mest praktisk muligt at bruge 2,5% LM-agarose, mens 2% er mere egnet til 5-8 larver. Hvis en fuldt aktiv hjerne er påkrævet, anbefales det kun at integrere tre fisk på samme tid for at reducere den tid, der er nødvendig for at betjene larverne. Generelt anbefales det at bruge lavere koncentrationer (1,8%-2%), jo ældre larverne bliver, eller jo flere larver der er planlagt at blive indlejret på samme tid. - Hvis billeder vil blive optaget ved hjælp af et omvendt mikroskop, skal du trimme agaroseblokken, der indeholder larverne, til en lille kasseform. Dette er vigtigt for at overføre larverne til billedkammeret senere. Hvis du bruger et opretstående mikroskop, er en sådan trimning ikke nødvendig, fordi monteringskammeret også kan bruges som billedkammer. I figur 1 (øverste del) kan man finde en skematisk beskrivelse af disse trin.
4. Afsløring af hjernen
BEMÆRK: Alle følgende trin skal udføres med størst omhu for ikke unødigt at skade larverne. Hvis en fuldt aktiv hjerne er nødvendig for eksperimentet, skal du huske, at med hvert sekund, der passerer, mens fisken stadig er fuldt monteret i agarose og har et åbent kranium uden iltet ACSF, vil hjernen lide af mangel på ilt og også tørre ud. Virkningerne af iltmangel bliver endnu mere dramatiske, jo ældre de indlejrede larver er. Derfor er det vigtigt at udføre operationen ikke kun inden for den kortest mulige tid, men også med maksimal præcision for ikke at fremkalde mekanisk hjerneskade med nålen. Når trin 4.2-4.4 trænes, bør det ikke tage mere end 30 s pr. fisk.
- Begynd operationen, så snart agarose har størknet. For det første trimme væk alle de overskydende agarose over hjernen region af interesse for at få fri adgang til hovedet og et klart arbejdsområde. Hvis den dorsale del af hovedet allerede stikker ud af agarose, skal du springe over dette trin.
- Afhængigt af interesseregionen skal du vælge et sted til at begynde med operationen. Tag glasnålen og lav et lille snit gennem huden, men uden at trænge for dybt ind i vævet. Dette vil være udgangspunktet for peeling væk overlaying huden.
BEMÆRK: For at opnå optimale resultater skal du aldrig starte direkte over interesseområdet for at mindske risikoen for at beskadige vigtige strukturer. Om nødvendigt er det muligt at endda starte posterior til baghjernen og derfra arbejde fremad, indtil det uønskede hudområde er skrællet væk. - Fortsæt med meget små snit langs den del af huden, der sigter mod at fjerne ved knap at flytte nålen lige under overfladen. Det meste af tiden er det ikke nødvendigt at bevæge sig helt rundt i hjernen og skære et cirkellignende stykke hud og kranium ud, men snarere bare lave to snit langs hovedet og derefter skubbe huden væk til den ene eller den anden side. Figur 2 viser en skematisk gengivelse af den optimale skærestrategi for at få fri adgang til lillehjernen.
BEMÆRK: Denne mikrokirurgi er en delikat procedure, og det vil højst sandsynligt brug for en vis træning for perfekt at fjerne huden uden at beskadige den underliggende hjerne. Det anbefales også at finde ud af den optimale skærestrategi for hjernens interesseregion og holde sig til den i eksperimentperioden. - Umiddelbart efter at have fjernet huden fra alle indlejrede larver, fortsæt med at hælde (iltet) ACSF over agarose for at oversvømme uønskede hudpartikler og blod og holde hjernen fuldt aktiv og beskytte den mod udtørring.
BEMÆRK: Hvis der er behov for en sund hjerne til forsøget, anbefales det at gå efter maksimalt tre fisk ad gangen. - Hvis du bruger et opretstående mikroskop, skal du starte direkte med billedbehandling.
- Når du bruger et omvendt mikroskop, skal du skubbe en lille spatel under cuboid agaroseblokken (trin 3.4).
- Tilsæt en lille dråbe LM-agarose til bunden af billedkammeret (f.eks. glasbundsskål), og vend straks agaroseblokken, der indeholder larverne, med spatelen i 180° og skub den forsigtigt til bunden af billedkammeret, mens den flydende agarosedråbe fungerer som lim.
- Når agarose har størknet, fylde billeddannelse kammer med (iltet) ACSF, derefter begynde billeddannelse. Se figur 1 (nederste del) for at få en skematisk beskrivelse.
- Når fuld hjerneaktivitet er påkrævet for eksperimentet, skal du altid sørge for, at ACSF i billedkammeret har et tilstrækkeligt højt iltniveau. For at sikre dette skal mediet udskiftes forsigtigt med frisk iltet ACSF, når det er muligt hvert 20.-60. minut (afhængigt af antallet og størrelsen af fisken, størrelsen og overfladen af billedkammeret og billedtiden).
Figur 1:Skematisk procedure for forberedelse af åbne kranie zebrafisk til in vivo billeddannelse på en trinvis måde. Arbejdsinstruktionerne for de forskellige trin findes i selve grafikken. Grafisk designet af Florian Hetsch og tilpasset af Paul Schramm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Detaljeret skematisk repræsentation af den mikrokirurgi, der udføres for at fjerne stykker hud og kranium over den interesseregion, der er i hjernen. Den røde cirkel markerer det sted, hvor det første snit skal foretages. Den rød-stilagte linje afgrænser den optimale vej til at skære sammen med nålen for at få fri adgang til lillehjernen uden at beskadige den. Den grønne pil markerer den retning, hvor den overdrevne hud og kraniet stykker let kan skubbes væk. Sørg for aldrig at trænge ind i hjernevævet under hele proceduren. Efter held peeling væk huden, hjernen region af interesse (her, cerebellum) vil være frit tilgængelig for enhver form for høj opløsning in vivo imaging. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3AC viser en 14 dpf larve af den transgene linje Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] med kraniet stadig intakt. Pigmentcellerne i den overlejrende hud fordeles over hele hovedet og forstyrrer fluorescenssignalet i interesseområdet (her lillehjernen). Med larven i denne tilstand er det ikke muligt at opnå billeder i høj opløsning af hjernen. Figur 3B viser en larve af samme transgene linje efter at have udført den åbne kranieoperation. Interesseområdet er nu frit tilgængeligt for excitationslaseren og udsendte fluorescenslys for at trænge ind i vævet uden at blive spredt og reflekteret. Billeder optaget af denne larve vil resultere i detaljerede billeder i høj opløsning (Figur 3D), der kan sammenlignes med billeder af en isoleret hjerne, men med den fordel, at hjernen stadig er fuldt aktiv. Derudover er hjernen ikke mister nogen fluorescens intensitet, der normalt ville være forårsaget af fiksering med para-formaldehyd, som det ville være tilfældet for en fast og udplantet hjerne. I en larve med et åbent kranium og derfor en frit tilgængelig hjerne med fuldt aktive neuroner, som stadig besidder alle fysiologiske forbindelser og modtager normal input fra sensorsystemet, vil det også være muligt at observere kortsigtede begivenheder, f.eks. synaptogenese, rygsøjlevækst, dendritisk / axonal migration eller lokalt mRNA-udtryk16 under fysiologiske forhold. En anden fordel ved denne metode er, at den er egnet til anvendelse af forskellige farmakologiske stoffer til at undersøge virkningerne på den levende larve uden diffusionsproblemer forårsaget af hud og kranium eller blodhjernebarrieren, hvilket normalt ville hindre stoffer i at trænge ind i hjernen (Figur 3E). For at påvise dette blev en 14 dpf larve med et åbent kranium inkuberet med Hoechst-33342 (5 μg/mL i ACSF) i 10 min og derefter afbildet (Figur 3F-Jeg). Figur 4AB viser 30 dpf gamle larver før og efter åbning af kraniet. Det er det mest avancerede tidspunkt, der hidtil er testet for denne metode. Selv på dette udviklingsstadium af larven er det muligt at opnå billeder i høj opløsning af enkelte neuroner og også subcellulære rum ved hjælp af den metode, der er beskrevet her (Figur 4CD). Disse 30 dpf gamle larver viste ikke aktivitetsunderskud efter 1 time billeddannelse. Denne metode bruges også til elektrofysiologisk patch clamp analyse af 30 dpf gamle larver, og der er ingen tegn på tab af neuronal aktivitet i Purkinje celler (men celler tæt på overfladen er sarte og sårbare) i løbet af de første 60 minutter af at være indlejret med et åbent kranium. Ved regelmæssigt at inspicere mængden af blodgennemstrømning er det muligt at validere, at larven stadig er i en sund tilstand. Denne status kan opretholdes ved regelmæssigt at udskifte eller ilte ACSF under langsigtet billedoptagelse. Det er derfor ret simpelt at validere, om en larve stadig er egnet til funktionelle hjerneundersøgelser. For at bevise, at ingen vigtige blodkar er beskadiget under mikro-kirurgi og også for at vise, at denne metode giver meget dybere indtrængen af excitation laserlys i hjernevæv og refleksion-reduceret emission af fotoner, en 10 dpf gamle larve af den transgene stamme Tg (flk1:mCherry)y206Tg17 blev analyseret ved denne metode. Disse fisk indeholder en fluorescerende vaskulatur i hjernen på grund af udtrykket af det røde fluorescerende protein mCherry i endotelceller. En maksimal intensitetsprojektion af en billedstak, der dækker 245 μm i dybden, afslører det indviklede netværk af blodkar, der bugter sig gennem mellem- og baghjernen (Figur 5A). Desuden viser farvekodning af dybdeværdier i billedstakken, at selv blodkar dybt begravet i hjernen ved næsten 250 μm er tydeligt synlige og sporbare (Figur 5B). Supplerende Video 1A viser en sund hjerne med tilstrækkelig blodforsyning, mens Supplerende video 1B viser en hjerne med kompromitteret blodgennemstrømning på grund af manglende udveksling af ACSF og manglende medium iltning.
Figur 3: Hudskræller i zebrafisklarver giver optimal adgang til in vivo hjernescanning. Konfokal mikroskopi analyse af 14 dpf gamle transgene Tg(-7.5ca8:GFP]bz12 larver. Oversigt over mellem- og baghjernen af ikke-skrællede (A,C) og hudpillede (B,D) prøver ved henholdsvis 20x og 40x forstørrelse. I sidstnævnte forbedrer manglen på pigment klart billedkvaliteten og giver mulighed for detaljeret billedoptagelse af fluorescerende Purkinje-celler i lillehjernen. Subcellulær billeddannelse og let sammensatte indgift til hjernen er påvist ved en 10 min inkubationsperiode med nukleinsyre fluorescerende farvning ved hjælp af Hoechst-33342 (5 μg/mL i ACSF). Mens kun hudceller indarbejde dette farvestof i ikke-skrællede larver (E), prøver med løftet hud viser intens mærkning af deres kerner i hele hjernen (F) giver mulighed for at visualisere de enkelte kerner (G) af GFP-fluorescerende Purkinje neuroner (H, fusioneret billede vist i I, 63x optisk og 4x digital forstørrelse). Skalastænger: A-F: 100 μm, G-I: 5 μm. Larver blev indlejret med hovedet til venstre, dorsal er op. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:Hudafskalning udvider adgangen til in vivo-hjernescanning til unge zebrafisk. Konfokal mikroskopi analyse af 30 dpf gamle transgene Tg(-7.5ca8:GFP]bz12Tg unge. Oversigt over mellem- og baghjernen af ikke-skrællede (A) og og hudpillede prøver ved henholdsvis 10x (B) og 40x (C) og 63x optisk forstørrelse med 4x digital zoom (D). Fjernelsen af pigmenteret hud gør det muligt at visualisering af den cellulære organisering af det kontinuerlige cerebellar Purkinje cellelag og at skildre fremskrivninger af individuelle neuroner (D, hvide pile). Skalastænger: A-C: 100 μm, D: 5 μm. Larver blev indlejret med hovedet til venstre, dorsal er op. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Fjernelse af huden tillader rekonstruktion af hjernevakulaturen ved udvidet dybde i en 10 dpf gammel Tg(flk1:mCherry)y206Tg zebrafisk larve. (A) Maksimal intensitetsprojektion af en stak billeder (245 billeder af en tykkelse på 1 μm i samlet afstand på 245 μm, 20x optisk forstørrelse) viser et kontinuerligt netværk af blodkar i disse hjerneområder. (B) Dybde farvekodning viser, at dette netværk af blodkar kan overvåges på dybde af 200 μm og derefter. For at fjerne autofluorescens og refleksion blev øjnene maskeret af sort farve. Skalastang: 100 μm. Larver blev indlejret med hovedet til venstre, dorsal er op. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1:Nåle fremstillet af kapillærer af glas. (a)Der vises to nåletyper fra to forskellige nåletrækere. Det er vigtigt, at spidsen ikke er for lang til at give den tilstrækkelig stabilitet og for at undgå, at de går i stykker, når de kommer i kontakt med huden/kraniet. Men en tilstrækkelig skarphed er nødvendig for at give mulighed for at foretage nedskæringer med rene kanter. (B) Der vises et billede af kapillæren, der er lastet i nåleskøjterne. Skalabjælken er 250 μm. Kapillærlængde: 100 mm; OD: 1,5 mm: ID: 0,84 mm; filament: Ja. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende Video 1: Imaging 7dpf gamle larve. (A)Real-time Movie optagelse (30 fps) fra en 7 dpf gamle larve 10 min efter huden over hjernen er blevet fjernet. Den levende blodgennemstrømning indikerer en sund tilstand med tilstrækkelig blodforsyning. (B) Real-time Movie optagelse (30 fps) fra samme 7 dpf gamle larve vist i Supplerende Video 1A, 2 timer efter mikrokirurgi uden udveksling af ACSF og mangel på medium iltning. Skala bar: 100 μm. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede metode giver en alternativ tilgang til hjerneisolation eller behandling af zebrafisklarver med lægemidler, der hæmmer pigmentering til optagelse af billeder i høj opløsning af neuroner i deres in vivo-miljø. Kvaliteten af billeder optaget med denne metode kan sammenlignes med billeder fra udplantede hjerner, men under naturlige forhold.
Desuden undgås et tab i intensiteten af fluorescens, fordi der ikke er behov for behandling med fikseringsmidler18. Denne metode er heller ikke så invasiv som at isolere en hjerne, og den består kun af et afgørende skridt, der kan føre til fiasko, så chancerne for en vellykket forberedelse er højere sammenlignet med hjernefrelse. Den vigtigste fordel er, at denne metode er egnet til in vivo billedoptagelse. Forudsat at kranieåbningen udføres præcist, hurtigt og vellykket, og iltmætning af ACSF overvåges regelmæssigt, skal hjernen være fuldt funktionel og levedygtig i timevis. Baseret på elektrofysiologiske optagelser, blodcirkulation, vejrtrækning og overlevelse af fisk i yderligere dage, anser vi det for sandsynligt, at fjernelse af hud og kranium ikke er særlig skadelig for den generelle sundhed. Således kan denne metode bruges til realtidsbilleddannelse af cellulære og subcellulære processer i en sund og funktionel hjerne uden billedforsyrende pigmentering. Denne metode er en standardprocedure, der anvendes til elektrofysiologiske optagelser af neuronal aktivitet in vivo i vores laboratorium og er også veletableret i andre elektrofysiologilaboratorier rundt om i verden19,20,21,22, der beviser, at hjernens funktion ikke forringes af mikrokirurgi. En ulempe, der skal nævnes, er, at denne tilgang kun er egnet til billeddannelse af dorsale og laterale hjerneområder og ikke kan udføres gentagne gange med den samme prøve.
Men hvis en fuldt funktionel hjerne er nødvendig for forsøget, skal iltmætningen overvåges permanent, og om nødvendigt skal ACSF i billedkammeret udskiftes med frisk iltet ACSF. Det betyder, at der for langsigtede optagelser skal være en mulighed for at udveksle den anvendte ACSF med iltmættet ACSF uden at forstyrre billeddannelsesproceduren, som kunne løses ved hjælp af en miniaturepumpe.
Bemærk, at hvis mikrokirurgi ikke udføres korrekt eller upræcist, vil det føre til hjerneskade eller hjerneblødning, hvilket resulterer i kompromitteret hjernefysiologi. Også en lav iltmætning i ACSF (se Supplerende Video 1)eller for meget stress for larverne under hele denne procedure kan have en negativ indvirkning på hjernen23,24. Derfor er denne metode ikke egnet til analyse af høj gennemløb, men snarere til langsgående eller meget detaljeret billedoptagelse af kun få larver pr. Timepoint. Derfor bør denne metode ikke være rettet mod lægemiddelscreening ved høj gennemstrømning, men den kan bruges til at karakterisere eller validere lovende farmakologiske forbindelser i detaljer, hvor billeddannelse i høj opløsning er informativ og nødvendig. For at sikre korrekt hjernesundhedstilstand anbefales det ikke at overstige antallet af tre larver pr. Forsøg.
Gennem det åbne kranium er det endda muligt at anvende stoffer direkte på hjernevævet uden at have dem til at passere gennem blod-hjerne barrieren. Samlet set er den metode, der er beskrevet her - i øjeblikket ansøgt om in vivo elektrofysiologi - en teknik med et stort potentiale inden for et meget bredt felt af in vivo hjernescanning og optogenetics i zebrafisk larver og unge og kan kombineres med neurofarmakologiske tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker især Timo Fritsch for fremragende dyrepleje og Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti og Barbara Winter for deres hjælpsomme støtte. Vi er også taknemmelige for alle de andre medlemmer af Köster lab for deres feedback. Projektet blev delvist finansieret af det tyske forskningsfond (DFG, KO1949/7-2) projekt 241961032 (til RWK) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS projekt 01EW1520 til JCM) er anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish 'affective' behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
