Summary
Здесь мы представляем метод изображения эмбрионального мозга рыбок данио in vivo вплоть до личиночной и ювенильной стадий. Эта микроинвазивная процедура, адаптированная из электрофизиологических подходов, обеспечивает доступ к клеточным и субклеточным деталям зрелого нейрона и может сочетаться с оптогенетическими и нейрофармакологическими исследованиями для характеристики функции мозга и лекарственного вмешательства.
Abstract
Понимание эфемерных изменений, которые происходят во время развития и созревания мозга, требует детальной визуализации высокого разрешения в пространстве и времени с клеточным и субклеточным разрешением. Достижения в области молекулярных технологий и технологий визуализации позволили нам получить множество подробных сведений о клеточных и молекулярных механизмах развития мозга у прозрачного эмбриона рыбки данио. В последнее время процессы уточнения нейронной связности, которые происходят на более поздних личиночных стадиях через несколько недель после оплодотворения, которые, например, являются контролем социального поведения, принятием решений или поведением, основанным на мотивации, переместились в фокус исследований. На этих стадиях пигментация кожи рыбок данио препятствует проникновению света в ткани мозга, и растворы для эмбриональных стадий, например, фармакологическое ингибирование пигментации, больше не осуществимы.
Поэтому предоставляется минимально инвазивное хирургическое решение для микроскопии доступа к мозгу бодрствующих рыбок данио, которое получено из электрофизиологических подходов. В телеостах кожа и мягкий хрящ черепа могут быть аккуратно удалены путем микрочистки этих слоев, обнажая нижележащие нейроны и аксональные тракты без повреждений. Это позволяет регистрировать морфологию нейронов, включая синаптические структуры и их молекулярное содержимое, а также наблюдать физиологические изменения, такие как переходные процессы Ca2 + или внутриклеточные транспортные события. Кроме того, возможно опрашивание этих процессов с помощью фармакологического торможения или оптогенетических манипуляций. Этот подход к воздействию на мозг предоставляет информацию о структурных и физиологических изменениях в нейронах, а также о корреляции и взаимозависимости этих событий в живой ткани мозга в диапазоне минут или часов. Этот метод подходит для визуализации мозга in vivo личинок рыбок данио в течение 30 дней после оплодотворения, последнего этапа развития, проверенного до сих пор. Он, таким образом, обеспечивает доступ к таким важным вопросам, как синаптическая очистка и масштабирование, аксональный и дендритный транспорт, синаптическое нацеливание цитоскелетного груза или локальная активность-зависимая экспрессия. Таким образом, можно ожидать широкого использования этого подхода к монтажу и визуализации.
Introduction
За последние десятилетия рыбка данио(Danio rerio)эволюционировала как один из самых популярных модельных организмов позвоночных для эмбриональных и личиночных исследований развития. Большая плодовитость самок рыбок данио в сочетании с быстрым ex utero развитием эмбриона и его прозрачностью на ранних эмбриональных стадиях развития являются лишь несколькими ключевыми факторами, которые делают рыбок данио мощным модельным организмом для решения вопросов развития1. Достижения в области молекулярно-генетических технологий в сочетании с исследованиями изображений in vivo с высоким разрешением позволили обратиться к клеточным биологическим механизмам, лежащим в основе процессов развития2. В частности, в области дифференцировки нейронов, физиологии, связности и функции рыбки данио пролили свет на взаимодействие молекулярной динамики, функций мозга и поведения организма в беспрецедентных деталях.
Тем не менее, большинство из этих исследований ограничены эмбриональной и ранней личиночной стадиями в течение первой недели развития, поскольку прозрачность ткани нервной системы постепенно теряется. На этих этапах ткани мозга не доступ к микроскопии высокого разрешения, которые защищаются дифференцировка черепа и пигментацией3.
Поэтому ключевые вопросы дифференцировки нейронов, созревания и пластичности, такие как уточнение нейронной связности или синаптическое масштабирование, трудно изучать. Эти клеточные процессы важны для того, чтобы определить клеточные механизмы, управляющие, например, социальным поведением, принятием решений или поведением, основанным на мотивации, областями, в которые исследования рыбок данио на личинках в возрасте нескольких недель недавно внесли ключевые выводы, основанные на поведенческих исследованиях4.
Фармакологические подходы к ингибированию пигментации у личинок рыбок данио в течение нескольких недель едва осуществимы или могут даже вызвать пагубные последствия5,6,7,8. Двойные или тройные мутантные штаммы со специфическими дефектами пигментации, такие как каспер9 или кристалл10,стали чрезвычайно ценными инструментами, но трудоемки в разведении, дают мало потомства и представляют опасность накопления генетических пороков развития из-за чрезмерного инбридинга.
Здесь предусмотрена минимально инвазивная процедура в качестве альтернативы, которая применима к любому штамму рыбок данио. Эта процедура была адаптирована из электрофизиологических исследований для регистрации активности нейронов у живых и бодрствующий личинок рыбок данио. При телеостах кожа и мягкий хрящ черепа могут быть аккуратно удалены путем микроочистки этих слоев, поскольку они не плотно переплетаются с сосудистой оболочкой головного мозга. Это позволяет подвергать воздействию ткани мозга, содержащей нейроны и аксональные тракты, без повреждений и регистрировать морфологию нейронов, включая синаптические структуры и их молекулярное содержимое, которые, в свою очередь, включают наблюдение физиологических изменений, таких как переходные процессы Ca2 + или внутриклеточные транспортные события в течение нескольких часов. Более того, помимо описательных характеристик, прямой доступ к мозговой ткани позволяет исследовать зрелые нейронные функции с помощью введения нейрофармакологических веществ и оптогенетических подходов. Таким образом, истинные структурные функциональные отношения могут быть выявлены в мозге ювенильных рыбок данио, используя эту стратегию воздействия на мозг.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все работы с животными, описанные здесь, соответствуют правовым нормам (Директива ЕС 2010/63). Содержание и обращение с рыбой были одобрены местными властями и представителем по защите животных Технического университета Брауншвейга.
1. Препарат искусственной спинномозговой жидкости головного мозга (АКФС), низкоплавкой агарозы и острых стеклянных игл
- Приготовьте ACSF, растворив перечисленные химические вещества в следующих концентрациях в дистиллированной воде. 134 мМ NaCl (58,44 г/моль), 2,9 мМ KCl (74,55 г/моль), 2,1 мМ CaCl2 (110,99 г/моль), 1,2 мМ MgCl2 6x H2O (203,3 г/моль), 10 мМ HEPES (238,31 г/моль) и 10 мМ d-глюкозы (180,16 г/моль).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для MgCl2,CaCl2и KCl 1 M стоковые растворы получают в обессоленной стерильной воде и хранят при 4 °C для последующего приготовления свежего ACSF. Глюкоза, HEPES и NaCl растворяются в виде твердых соединений в свежем растворе ACSF. Для растворения химических веществ следуйте инструкциям производителя. - Отрегулируйте pH ACSF до 7,8 с 10 M NaOH. Приготовление ACSF требует точного измерения химических веществ и тонкой корректировки рН, поскольку он заменяет спинномозговую жидкость и поддерживает физиологические условия, необходимые для того, чтобы нейроны были полностью функциональными, иначе это может привести к неправильной работе мозга и гибели нейронов.
- Храните свежеприготовленный ACSF при 4 °C в течение максимум 4 недель. Для условий работы аликвотировать необходимый объем ACSF для дня/эксперимента и предпледий при 25-28 °C (и опционально насытить его кислородом, шаг 2.5)
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеприготовленный ASCF хорош в течение 1 дня. Если планируется использовать его в течение нескольких дней, ACSF необходимо стерильно отфильтровать. - Для последующей анестезии личинок готовят 50 мМ запасной раствор d-тубокурарина в дистиллированной воде и хранят раствор при -20 °C в виде 100 мкл аликвот в морозильной камере до тех пор, пока это не понадобится.
- Для встраивания рыбы готовят 2,5% низкоплавящую (ЛМ) агарозу путем растворения 1,25 г ЛМ-агарозы(Таблица материалов)в 50 мл ACSF и кипятят до полного растворения агарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, более высокие или более низкие концентрации LM-агарозы могут быть использованы в зависимости от экспериментальной установки. Однако, если агароза слишком мягкая, она не сможет удержать рыбу в положении при вскрытии черепа. - Храните агарозу при 37 °C водяной бани, чтобы избежать затвердевания и потому такая температура также не повредит личинок при встраиваниях. После того, как кипяченая агароза остынет до 37 °C в водяной бане, добавьте необходимое количество d-тубокурарина к аликвоцитированной агарозе, необходимой в течение дня, чтобы достичь рабочей концентрации 10 мкМ. Для будущего использования храните оставшуюся агарозу при 4 °C, чтобы избежать загрязнения.
- Подготовьте острые и тонкие стеклянные иглы из стеклянных капилляров(Дополнительный рисунок 1)с помощью съемника микропипетки со следующими настройками.
- Съемник I, Капиллярный тип 1: Тепло 1: 65,8; Тепло 2: 55,1; 2-ступенчатая тяга
Съемник II, капиллярный тип 2: Тепло = 700; Фил = 4; Вел = 55; Дел = 130; Пул = 55; 1-ступенчатое вытягивание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Единицы измерения специфичны для каждого съемника и стеклянного капилляра, используемых здесь, соответственно (см. Таблицу материалов). Другие капилляры и съемники также могут быть использованы для приготовления стеклянных игл. Но стеклянные иглы не должны быть слишком тонкими, так как они могут сломаться при контакте с черепом. Капилляр: длина: 100 мм (4 дюйма); OD: 1,5 мм; ID: 0,84 мм; нить накаливания: Да
- Съемник I, Капиллярный тип 1: Тепло 1: 65,8; Тепло 2: 55,1; 2-ступенчатая тяга
2. Анестезия личинок и препараты для встраивания
- Начиная эксперимент в течение дня, перенесите животных, которые необходимы с пластиковой пипеткой Пастера, в чашку Петри диаметром 90 мм, которая заполнена либо Данио (для личинок, которые все еще содержатся в чашке Петри с Данио), либо водой из рыбного хозяйства (для личинок, которые старше 7 dpf и содержатся в рыбной установке).
- При пипетке рыб старше 2 недель убедитесь, что отверстие пипетки достаточно велико, чтобы избежать травмирования рыбы при их переносе. Не используйте сетку, потому что она физически повредит, особенно молодых личинок.
- Добавьте коловратку или artemia nauplii, подходящую для размеров личинок, хранящихся в чашке Петри, чтобы обеспечить свободный доступ к пище и максимальное состояние здоровья личинок и уменьшить стресс.
- Для встраивания переложите отобранных личинок на чашку Петри диаметром 35 мм, заполненную ACSF. Добавьте необходимый объем d-тубокурарина для достижения рабочей концентрации/эффективной дозы 10 мкМ и подождите несколько минут, пока личинки полностью не обездвижены11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда рыба становится старше или если требуется более быстрая полная анестезия (менее 5 мин), можно увеличить концентрацию d-тубокурарина (LD50 для мышей составляет 0,13 мг/ кг внутривенно12). Также возможно использование другого анестетика, такого как α-бунгаротоксин (рабочая концентрация: 1 мг/мл), который обладает тем же эффектом, что и кураре, а также сохраняет мозг полностью активным13. Если полностью активный мозг не нужен интересующего субъекту, трикаин в нелетальной дозе (0,02%) также является вариантом полного обезболивать личинок. Однако трикаин блокирует натриевые каналы, тем самым ухудшая мозговую деятельность14. - Подготовьте монтажную камеру, взяв крышку чашки Петри диаметром 35 мм, переверните крышку вверх ногами и поместите квадратную стеклянную крышку (24 x 24 мм) на дно крышки. Схематические описания этих шагов см. на рисунке 1 (верхняя часть). Более гладкая поверхность стекла предотвращает ускользание от блока агарозы, который содержит личинки во время процедуры вскрытия черепа.
- Аликвот на количество ACSF, необходимое в течение дня, в соответствующем флаконе (например, 50 мл пробирки, бикер, бутылка Шотта и т.д.) и насыжают его карбогеном (5% CO2,95% O2). Если визуализация только морфологии (например, флуоресцентных паттернов), ACSF по-прежнему необходим для обеспечения целостности мозга и того, что на клетки не оказывают негативного влияния эффекты осмолярности, но оксигенация ACSF не нужна. Этот шаг необходимо выполнять только тогда, когда для визуализации необходима полная активность мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального насыщения среды кислородом добавьте воздушный камень в конец карбогенной трубки. Чтобы гарантировать достаточно высокий уровень кислорода, необходимо обменивать ACSF в камерах визуализации со свеженасыщенной кислородом ACSF каждые 20-60 мин, в зависимости от количества и возраста личинок, встроенных в одну и ту же камеру визуализации (например, для одной внедренной личинки acSF обмена каждый час достаточно. Для шести личинок старше 14 dpf встроен параллельно, необходим обмен ACSF каждые 20 мин), поэтому планируйте необходимое количество насыщенных кислородом ACSF в соответствии с запланированным экспериментом.
3. Встраивание личинок
- Перенесите полностью обезболенные личинки пластиковой пипеткой Пастера в (на этапе 2.4) подготовленную монтажную камеру. Затем осторожно удалите лишнюю среду, чтобы избежать разбавления LM-агарозы. Все следующие этапы следует выполнять под стереомикроскопом с достаточным увеличением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наклон монтажной камеры может помочь полностью удалить среду. - Приступайте сразу к следующему шагу, добавляя достаточно крупную каплю LM-агарозы поверх личинок (около 1 мл, в зависимости от размера личинок), чтобы защитить животных от пересыхания и уменьшить ненужный стресс.
- Ориентируйте личинок в положение до того, как агароза затвердеет. Следите за тем, чтобы дорсальная часть личинок была направлена вверх. Кроме того, убедитесь, что личинки встраиваются как можно ближе к поверхности агарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера и количества личинок, планируемых к одновременному встраивать, можно регулировать концентрацию агарозы. Например, для 1-3 личинок, которым 30 dpf, рекомендуется концентрация 1,8%-2% LM-агарозы. Для 1-4 личинок, которым 7 dpf, наиболее целесообразно использовать 2,5% LM-агарозы, тогда как для 5-8 личинок больше подходит 2%. Если требуется полностью активный мозг, рекомендуется одновременно встраивать только трех рыб, чтобы сократить время, необходимое для работы личинок. В целом, рекомендуется использовать более низкие концентрации (1,8%-2%), чем старше становятся личинки или тем больше личинок планируется встраивать одновременно. - Если изображения будут записаны с помощью перевернутого микроскопа, обрежьте блок агарозы, содержащий личинок, в небольшую кубоидную форму. Это важно для переноса личинок в камеру визуализации в дальнейшем. При использовании вертикального микроскопа такая обрезка не нужна, поскольку монтажная камера также может использоваться в качестве камеры визуализации. На рисунке 1 (верхняя часть) можно найти схематическое описание этих шагов.
4. Обнажение мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги должны быть выполнены с максимальной осторожностью, чтобы не травмировать личинок без необходимости. Если для эксперимента требуется полностью активный мозг, имейте в виду, что с каждой секундой, которая проходит, пока рыба все еще полностью вмонтирована в агарозу и имеет открытый череп без насыщенного кислородом ACSF, мозг будет страдать от недостатка кислорода и также высыхать. Последствия дефицита кислорода станут еще более драматичными, чем старше внедренные личинки. Поэтому важно выполнить операцию не только в кратчайшие сроки, но и с максимальной точностью, чтобы не вызвать механического повреждения головного мозга иглой. При обучении шаги 4.2-4.4 не должны занимать более 30 с на рыбу.
- Начинают операцию, как только агароза затвердеет. Во-первых, обрежьте всю избыточную агарозу над интересующим мозгом районом, чтобы получить свободный доступ к голове и свободное рабочее пространство. Если дорсальная часть головки уже торчит из агарозы, пропустите этот шаг.
- В зависимости от интересующей вас области, выберите место для начала операции. Возьмите стеклянную иглу и сделайте небольшой разрез через кожу, но не проникая слишком глубоко в ткань. Это станет отправной точкой для отслаивания наложенной кожи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов никогда не начинайте непосредственно над интересуемым регионом, чтобы снизить риск повреждения важных структур. При необходимости можно даже начать заднюю часть заднего мозга и оттуда работать вперед, пока нежелательный участок кожи не будет отшелушен. - Продолжайте с очень маленькими порезами вдоль части кожи, чтобы удалить, едва перемещая иглу прямо под поверхностью. Большую часть времени не нужно полностью перемещаться по мозгу и вырезать кругоподобный кусок кожи и черепа, а просто сделать два разреза вдоль головы, а затем отодвинуть кожу в одну или другую сторону. На рисунке 2 показано схематическое представление оптимальной стратегии резки для получения свободного доступа к мозжечку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта микрохирургия является деликатной процедурой, и, скорее всего, потребуется некоторая подготовка, чтобы идеально удалить кожу, не повреждая основной мозг. Также рекомендуется выяснить оптимальную стратегию резки для интересуемой области мозга и придерживаться ее на период эксперимента. - Сразу после удаления кожи со всех внедренных личинок приступайте к заливке (насыщенной кислородом) ОКСФ над агарозой, чтобы затопить нежелательные частицы кожи и кровь и сохранить мозг полностью активным и защитить его от высыхания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если для эксперимента нужен здоровый мозг, рекомендуется употреблять максимум три рыбы за раз. - Если вы используете вертикальный микроскоп, начните непосредственно с визуализации.
- При использовании перевернутого микроскопа сдвиньте небольшой шпатель под кубовидный блок агарозы (шаг 3.4).
- Добавьте небольшую каплю LM-агарозы на дно камеры визуализации (например, стеклянную нижнюю чашку) и немедленно переверните блок агарозы, содержащий личинки, шпателем на 180° и осторожно протолкните его на дно камеры визуализации, в то время как капля агарозы жидкости действует как клей.
- Когда агароза затвердеет, заполните камеру визуализации (насыщенной кислородом) ACSF, затем начните визуализацию. См. рисунок 1 (нижняя часть) для описания схемы.
- Когда для эксперимента требуется полная активность мозга, всегда следите за тем, чтобы ACSF в камере визуализации имеет достаточно высокий уровень кислорода. Чтобы обеспечить это, тщательно обменивайте среду со свеженасыщенной кислородом ACSF, когда это возможно, каждые 20-60 минут (в зависимости от количества и размера рыбы, размера и поверхности камеры визуализации и продолжительности визуализации).
Рисунок 1:Схематическая процедура подготовки открытого черепа рыбки данио к визуализации in vivo поэтапно. Рабочие инструкции для различных этапов можно найти на самом рисунке. Графика разработана Флорианом Хетчем и адаптирована Паулем Шраммом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Подробное схематическое изображение микрохирургии, выполненной для удаления кусочков кожи и черепа над интересуемой областью мозга. Красный круг отмечает место, где необходимо сделать первый срез. Красно-пунктирная линия очерчивает оптимальный путь для разреза вместе с иглой, чтобы получить свободный доступ к мозжечку, не повреждая его. Зеленая стрелка отмечает направление, в котором можно легко оттолкнуть излишнюю кожу и куски черепа. Убедитесь, что вы никогда не проникаете в ткани мозга в течение всей процедуры. После успешного отшелушивания кожи интересующая область мозга (здесь мозжечок) будет свободно доступна для любого вида визуализации in vivo с высоким разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 3A,С показать 14 dpf личинку трансгенной линии Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] с черепом, все еще неповрежденным. Пигментные клетки в накладной коже распределяются по всей голове и мешают сигналу флуоресценции в интересующей области (здесь мозжечок). С личинкой в таком состоянии невозможно получить изображения мозга с высоким разрешением. Рисунок 3B показывает личинку той же трансгенной линии после выполнения операции на открытом черепе. Область интереса теперь находится в свободном доступе для лазера возбуждения и излучаемого флуоресцентного света, чтобы проникнуть в ткань, не рассеиваясь и не отражаясь. Снимки, записанные этой личинки, приведут к получению подробных изображений с высоким разрешением (Рисунок 3D), сравнимые с изображениями изолированного мозга, но с тем преимуществом, что мозг все еще полностью активен. Кроме того, мозг не теряет интенсивность флуоресценции, которая обычно вызвана фиксацией параформальдегидом, как это было бы в случае с фиксированным и эксплантированным мозгом. У личинки с открытым черепом и, следовательно, свободно доступным мозгом с полностью активными нейронами, который по-прежнему обладает всеми физиологическими связями и получает нормальный вход от сенсорной системы, также можно будет наблюдать краткосрочные события, например, синаптогенез, рост позвоночника, дендритную / аксональную миграцию или локальную экспрессию мРНК.16 в физиологических условиях. Еще одним преимуществом этого метода является то, что он подходит для применения различных фармакологических веществ для исследования воздействия на живую личинку без проблем диффузии, вызванных кожей и черепом или гематоэнцефалическим барьером, которые обычно препятствуют проникновению веществ в мозг (Рисунок 3E). Чтобы продемонстрировать это, личинку 14 dpf с открытым черепом инкубировали с Hoechst-33342 (5 мкг/мл в ACSF) в течение 10 мин, а затем визуалировали (Рисунок 3F-Я). Рисунок 4A,Б показывают 30 dpf старых личинок до и после вскрытия черепа. Это самая продвинутая временная точка, проверенная до сих пор для этого метода. Даже на этой стадии развития личинки можно получить изображения с высоким разрешением одиночных нейронов, а также субклеточных компартментов с помощью метода, описанного здесь (Рисунок 4C,Д). Эти старые личинки с 30 dpf не проявляли дефицита активности после 1 ч визуализации. Этот метод также используется для электрофизиологического анализа зажимов пластырей старых личинок 30 dpf, и нет никаких признаков потери нейронной активности в клетках Пуркинье (но клетки, близкие к поверхности, являются деликатными и уязвимыми) в течение первых 60 минут после внедрения в открытый череп. Регулярно проверяя количество кровотока, можно подтвердить, что личинка все еще находится в здоровом состоянии. Этот статус можно поддерживать, регулярно обмениваясь или насыщая кислородом ACSF во время долгосрочной записи изображения. Поэтому довольно просто проверить, подходит ли личинка для функциональных исследований мозга. Доказать, что во время микрохирургии не повреждаются важные кровеносные сосуды, а также показать, что этот метод позволяет гораздо глубже проникать возбуждающим лазерным светом в ткани мозга и отражению-пониженного излучения фотонов, старая личинка трансгенного штамма Tg(flk1:mCherry)y206Тг17 был проанализирован этим методом. Эти рыбы содержат флуоресцентную сосудистую процедуру в головном мозге из-за экспрессии красного флуоресцентного белка mCherry в эндотелиальных клетках. Проекция максимальной интенсивности стека изображений, охватывающего глубину 245 мкм, выявляет сложную сеть кровеносных сосудов, извивающихся через средний и задворный мозг (Рисунок 5А). Кроме того, цветовое кодирование значений глубины стека изображений показывает, что даже кровеносные сосуды, глубоко зарытые в мозг почти на 250 мкм, хорошо видны и прослеживаются (Рисунок 5B). Дополнительное видео 1A показывает здоровый мозг с достаточным кровоснабжением, в то время как Дополнительное видео 1B показывает мозг с нарушенным кровотоком из-за отсутствия обмена ACSF и отсутствия средней оксигенации.
Рисунок 3:Шелушение кожи у личинок рыбок данио обеспечивает оптимальный доступ для визуализации мозга in vivo. Конфокальный микроскопический анализ 14 dpf старых трансгенных Tg(-7.5ca8:GFP]bz12 личинок. Обзор средне- и задворных неочищеных(A,C)и очищенных кожей(B,D)образцов при 20-кратном и 40-кратном увеличении соответственно. В последнем случае отсутствие пигмента явно улучшает качество изображения и позволяет детально записывать изображения флуоресцентных клеток Пуркинье в мозжечке. Субклеточная визуализация и простота введения соединений в мозг демонстрируют 10-минутный инкубационный период с флуоресцентным окрашиванием нуклеиновых кислот с использованием Hoechst-33342 (5 мкг/мл в ACSF). В то время как только клетки кожи включают этот краситель в неочищенные личинки(E),образцы с поднятой кожей демонстрируют интенсивную маркировку своих ядер по всему мозгу(F),что позволяет визуализировать отдельные ядра(G)GFP-флуоресцентных нейронов Пуркинье(H,объединенное изображение, показанное в I,63x оптическом и 4-кратном цифровом увеличении). Шкала: A-F: 100 мкм, G-I: 5 мкм. Личинки были встроены головой влево, дорсальная часть вверх. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Пилинг кожи расширяет доступ для визуализации мозга in vivo к молоди рыбок данио. Конфокальный микроскопический анализ 30 dpf старых трансгенных Tg(-7.5ca8:GFP]bz12Tg молоди. Обзор средне- и задворенов неочищеных(A)и очищенных кожей образцов при 10x(B)и 40x(C)и 63x оптическом увеличении с 4-кратным цифровым зумом(D)соответственно. Удаление пигментированной кожи позволяет визуализировать клеточную организацию непрерывного слоя клеток мозжечка Пуркинье и изобразить проекции отдельных нейронов(D,белые стрелки). Шкала стержней: A-C: 100 мкм, D: 5 мкм. Личинки были встроены головой влево, дорсальная часть вверх. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Удаление кожи позволяет реконструировать сосудистую азочку мозга на увеличенной глубине у 10 dpf старой Tg(flk1:mCherry)y206Tg личинки рыбок данио. (A)Проекция максимальной интенсивности стека изображений (245 изображений толщиной 1 мкм на общем расстоянии 245 мкм, 20-кратное оптическое увеличение) отображает непрерывную сеть кровеносных сосудов по всей этой области мозга. (B)Цветовое кодирование глубины показывает, что эта сеть кровеносных сосудов может контролироваться на глубине 200 мкм и выше. Чтобы убрать автофлуоресценцию и отражение, глаза маскировали черным цветом. Шкала: 100 мкм. Личинки были встроены головой влево, дорсальная часть вверх. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1:Иглы из стеклянных капилляров. (A)Показаны два типа игл, полученных из двух различных съемников игл. Важно, чтобы наконечники не были слишком длинными, чтобы обеспечить ему достаточную устойчивость и избежать их разрушения при соприкосновения с кожей/черепом. Тем не менее, достаточная резкость необходима, чтобы можно было делать разрезы с чистыми краями. (B)Показано изображение капилляра, который загружается в съемники игл. Шкала шкалы составляет 250 мкм. Длина капилляра: 100 мм; OD: 1,5 мм: ID: 0,84 мм; нить: да. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительное видео 1: Визуализация старой личинки 7dpf. (A)Запись видео в реальном времени (30 кадров в секунду) со старой личинки 7 dpf через 10 минут после удаления кожи над мозгом. Яркий кровоток свидетельствует о здоровом состоянии с достаточным кровоснабжением. (B) Запись видео в реальном времени (30 кадров в секунду) с той же старой личинки 7 dpf, показанной в дополнительном видео 1A, через 2 ч после микрохирургии без обмена ACSF и отсутствия оксигенации среды. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный способ обеспечивает альтернативный подход к выделению мозга или обработке личинок рыбок данио фармацевтическими препаратами, ингибируя пигментацию для записи изображений нейронов с высоким разрешением в их среде in vivo. Качество изображений, записанных с помощью этого метода, сопоставимо с изображениями из эксплантированного мозга, но в естественных условиях.
Кроме того, предотвращается потеря интенсивности флуоресценции, поскольку нет необходимости в лечении фиксаторами18. Кроме того, этот метод не так инвазивн, как изоляция мозга, и он состоит только из одного важного шага, который может привести к неудаче, поэтому шансы на успешную подготовку выше по сравнению с эксплантацией мозга. Наиболее важным преимуществом является то, что этот метод подходит для записи изображений in vivo. При условии, что вскрытие черепа выполняется точно, быстро и успешно, а насыщение кислородом ACSF контролируется регулярно, мозг должен быть полностью функциональным и жизнеспособным в течение нескольких часов. Основываясь на электрофизиологических записях, кровообращении, дыхании и выживании рыб в течение дополнительных дней, мы считаем вероятным, что удаление кожи и черепа не наносит большого степени мусора общему здоровью. Таким образом, этот метод может быть использован для визуализации в режиме реального времени клеточных и субклеточных процессов в здоровом и функциональном мозге без пигментации, нарушающих имидж. Этот метод является стандартной процедурой, используемой для электрофизиологических записей активности нейронов in vivo в нашей лаборатории, а также хорошо зарекомендовал себя в других электрофизиологических лабораториях по всему миру19,20, 21,22,доказывая, что функция мозга не нарушается микрохирургией. Одним из недостатков, который необходимо упомянуть, является то, что этот подход подходит только для визуализации дорсальных и боковых областей мозга и не может быть выполнен повторно с одним и тем же образцом.
Однако, если для эксперимента необходим полностью функциональный мозг, насыщение кислородом должно контролироваться постоянно, и, при необходимости, ACSF в камере визуализации должен быть обменен на свежеоксигенированный ACSF. Это означает, что для долгосрочных записей должна быть возможность обмена используемого ACSF на насыщенный кислородом ACSF, не нарушая процедуру визуализации, которая может быть решена с помощью миниатюрного насоса.
Следует отметить, что если микрооперационная операция не выполнена правильно или неточно, это приведет к травме головного мозга или кровоизлиянию в мозг, что приведет к нарушению физиологии мозга. Кроме того, низкое насыщение кислородом в ACSF (см. Дополнительное видео 1)или слишком большой стресс для личинок во время всей этой процедуры может негативно повлиять на мозг23,24. Поэтому этот метод не подходит для высокопроизводительного анализа, а скорее для продольной или высокодетализированной записи изображений только нескольких личинок за точку времени. Поэтому этот метод не должен быть направлен на скрининг лекарств с высокой пропускной способностью, но он может быть использован для характеристики или детальной проверки перспективных фармакологических соединений, где визуализация с высоким разрешением является информативной и необходимой. Для обеспечения надлежащего состояния здоровья мозга рекомендуется не превышать количество трех личинок за испытание.
Через открытый череп можно даже непосредственно наносить вещества на ткани мозга, не пропуская их через гематоэнцефалический барьер. В целом, метод, описанный здесь, в настоящее время применяемый для электрофизиологии in vivo, является методом с высоким потенциалом в очень широкой области визуализации мозга in vivo и оптогенетики у личинок рыбок данио и молоди и может сочетаться с нейрофармакологическими подходами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы особенно благодарим Тимо Фрича за отличный уход за животными и Германа Дёринга, Мохамеда Эльсея, Сола Позе-Мендеса, Якоба фон Троту, Комали Валишетти и Барбару Винтер за их полезную поддержку. Мы также благодарны всем остальным сотрудникам лаборатории Köster за их отзывы. Проект частично финансировался Немецким исследовательским фондом (DFG, KO1949/7-2), проектом 241961032 (RWK) и Бундесминистериумом для Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS project 01EW1520 to JCM) признан.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish 'affective' behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
