Summary
Här presenterar vi en metod för att avbilda zebrafiskens embryonala hjärna in vivo upp till larv och ungdomsstadier. Detta mikroinvasiva förfarande, anpassat från elektrofysiologiska metoder, ger tillgång till cellulära och subcellulära detaljer om mogen neuron och kan kombineras med optogenetik och neurofarmakologiska studier för karakterisering av hjärnans funktion och läkemedelsintervention.
Abstract
Att förstå de tillfälliga förändringar som uppstår under hjärnans utveckling och mognad kräver detaljerad högupplöst avbildning i tid och rum vid cellulär och subcellulär upplösning. Framsteg inom molekylär och bildteknik har gjort det möjligt för oss att få många detaljerade insikter om cellulära och molekylära mekanismer för hjärnans utveckling i det transparenta zebrafiskembryon. Nyligen har processer för förfining av neuronal anslutning som uppstår vid senare larvstadier flera veckor efter befruktning, som till exempel är kontroll över socialt beteende, beslutsfattande eller motivationsdrivet beteende, flyttats till fokus för forskning. I dessa skeden stör pigmentering av zebrafiskhuden ljuspenetration i hjärnvävnaden, och lösningar för embryonala stadier, t.ex. farmakologisk hämning av pigmentering, är inte längre genomförbara.
Därför tillhandahålls en minimalt invasiv kirurgisk lösning för mikroskopiåtkomst till hjärnan hos vaken zebrafisk som härrör från elektrofysiologiska metoder. I teleoster kan hud och mjuk skallebrosk försiktigt avlägsnas genom att mikroskala dessa lager och exponera underliggande nervceller och axonalområden utan skador. Detta möjliggör registrering av neuronal morfologi, inklusive synaptiska strukturer och deras molekylära innehåll, och observation av fysiologiska förändringar som Ca2 + transienter eller intracellulära transporthändelser. Dessutom är förhör av dessa processer med hjälp av farmakologisk hämning eller optogenetisk manipulering genomförbart. Denna hjärnexponeringsmetod ger information om strukturella och fysiologiska förändringar i nervceller samt korrelationen och det ömsesidiga beroendet av dessa händelser i levande hjärnvävnad inom intervallet minuter eller timmar. Tekniken är lämplig för in vivo hjärnavbildning av zebrafisk larver upp till 30 dagar efter befruktning, det senaste utvecklingsstadiet som testats hittills. Det ger således tillgång till så viktiga frågor som synaptisk förfining och skalning, axonal och dendritisk transport, synaptisk inriktning av cytoskeletal last eller lokalt aktivitetsberoende uttryck. Därför kan en bred användning för denna monterings- och bildbehandlingsmetod förväntas.
Introduction
Under de senaste decennierna har zebrafisken (Danio rerio) utvecklats som en av de mest populära ryggradsdjur modellorganismerna för embryonala och larv utvecklingsstudier. Den stora fecundity av zebrafisk honor i kombination med den snabba ex utero utvecklingen av embryot och dess öppenhet under tidiga embryonala utvecklingsstadier är bara några nyckelfaktorer som gör zebrafisk till en kraftfull modellorganism för att ta itu med utvecklingsfrågor1. Framsteg inom molekylärgenetisk teknik i kombination med högupplösta in vivo-avbildningsstudier som är tillåtna för att ta itu med cellbiologiska mekanismer som ligger till grund förutvecklingsprocesser 2. I synnerhet inom området neuronal differentiering, fysiologi, anslutning och funktion har zebrafisk kastat ljus över samspelet mellan molekylär dynamik, hjärnfunktioner och organismiskt beteende i oöverträffad detalj.
Ändå är de flesta av dessa studier begränsade till embryonala och tidiga larvstadier under den första utvecklingsveckan eftersom transparensen i nervsystemets vävnad gradvis går förlorad. I dessa skeden förhindras hjärnvävnad från åtkomst genom högupplösta mikroskopimetoder som blir avskärmade av skalle differentiering och pigmentering3.
Därför är viktiga frågor om neuronal differentiering, mognad och plasticitet såsom förfining av neuronal anslutning eller synaptisk skalning svåra att studera. Dessa cellulära processer är viktiga för att definiera cellulära mekanismer som driver till exempel socialt beteende, beslutsfattande eller motivationsbaserat beteende, områden till vilka zebrafiskforskning på flera veckors gamla larver nyligen har bidragit med viktiga resultat baserade på beteendestudier4.
Farmakologiska metoder för att hämma pigmentering i zebrafisklarver i flera veckor är knappt genomförbara eller kan till och med orsaka skadligaeffekter 5,6,7,8. Dubbla eller tredubbla mutantstammar med specifika pigmenteringsdefekter, såsom casper9 eller kristall10, har blivit oerhört värdefulla verktyg, men är mödosamma i avel, ger få avkommor och utgör risken för att ackumulera genetiska missbildningar på grund av överdriven inavel.
Här tillhandahålls ett minimalt invasivt förfarande som ett alternativ som är tillämpligt på alla zebrafiskstammar. Detta förfarande anpassades från elektrofysiologiska studier för att registrera neuronal aktivitet i levande och vakna zebrafisk larver. I teleoster kan hud och mjuk skallebrosk försiktigt avlägsnas genom att mikroskala dessa lager, eftersom de inte är tätt sammanvävda med hjärnans vaskulatur. Detta gör det möjligt att exponera hjärnvävnad som innehåller nervceller och axonal skrifter utan skador och för registrering av neuronal morfologi, inklusive synaptiska strukturer och deras molekylära innehåll, vilket i sin tur inkluderar observation av fysiologiska förändringar som Ca2 + transienter eller intracellulära transporthändelser i upp till flera timmar. Dessutom, utöver beskrivande karakteriseringar, möjliggör den direkta tillgången till hjärnvävnad förhör av mogna neuronala funktioner med hjälp av neurofarmakologiska substans administration och optogenetiska metoder. Därför kan sanna strukturfunktionsrelationer avslöjas i den unga zebrafiskhjärnan med hjälp av denna hjärnexponeringsstrategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt djurarbete som beskrivs här är förenligt med rättsliga bestämmelser (EU-direktiv 2010/63). Underhåll och hantering av fisk har godkänts av lokala myndigheter och av djurskyddsrepresentanten för Technische Universität Braunschweig.
1. Beredning av konstgjord cerebro spinalvätska (ACSF), lågsmält agarosa och vassa glasnålar
- Förbered ACSF genom att lösa upp de listade kemikalierna vid följande koncentrationer i destillerat vatten. 134 mM NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM KCl (74,55 g/mol), 2,1 mM CaCl2 (110,99 g/mol), 1,1 mM CaCl 2 (110,99 g/mol), 1,1 m2 mM MgCl2 6x H2O (203,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,31 g/mol) och 10 mM d-Glukos (180,16 g/mol).
OBS: För MgCl2,CaCl2och KCl bereds 1 M stamlösningar i avsaltat sterilt vatten och lagras vid 4 °C för att därefter förbereda färsk ACSF. Glukos, HEPES och NaCl löses upp som fasta föreningar i den färska ACSF-lösningen. För att lösa upp kemikalier, följ tillverkarens instruktioner. - Justera ACSF:s pH-tal till 7,8 med 10 M NaOH. Beredning av ACSF kräver noggrann mätning av kemikalier och finjustering av pH eftersom det ersätter cerebro spinalvätska och upprätthåller de fysiologiska tillstånd som krävs för att nervceller ska vara fullt funktionella annars kan det orsaka hjärnans felfunktion och neuronal död.
- Förvara den nyberedda ACSF vid 4 °C i högst 4 veckor. För arbetsförhållanden, alikvot den erforderliga volymen acsf för dag/experiment och förvärmning vid 25-28 °C (och eventuellt syresätta den, steg 2.5)
OBS: Nylagad ASCF är bra i 1 dag. Om du planerar att använda den under flera dagar måste ACSF sterilt filtreras. - För senare anestesi av larverna, förbered en 50 mM stamlösning av d-tubokurarin i destillerat vatten och lagra lösningen vid -20 °C som 100 μL alikvoter i frysen tills det behövs.
- För att bädda in fisken, förbered 2,5% låg smältning (LM) agarose genom att lösa upp 1,25 g LM-agarose(Materialförteckning)i 50 ml ACSF och koka tills agarosen är helt upplöst.
OBS: Alternativt kan högre eller lägre koncentrationer av LM-agarose användas beroende på den experimentella uppsättningen. Men om agarosen är för mjuk kommer den inte att kunna hålla fisken på plats när du öppnar skallen. - Förvara agarosen vid 37 °C vattenbad, för att undvika stelning och eftersom denna temperatur inte heller kommer att skada larverna vid inbäddning. När den kokta agarosen har svalnat till 37 °C i vattenbadet, tillsätt den nödvändiga mängden d-tubokurarin till den alikvoterade agarosa som behövs för dagen för att nå en arbetskoncentration på 10 μM. För framtida användning, förvara den överbåriga agarosen vid 4 °C för att undvika förorening.
- Förbered vassa och tunna glasnålar från glaskapillärer(kompletterande figur 1) med hjälp av en mikropipettedragare med följande inställningar.
- Puller I, Kapillär typ 1: Värme 1: 65,8; Värme 2: 55,1; 2-stegs drag
Puller II, Kapillär typ 2: Värme = 700; Fil = 4; Vel = 55; Del = 130; Pul = 55; 1-stegs drag.
OBS: Enheterna är specifika för varje dragkrok respektive glaskapillary som används här (se Materialförteckning ). Andra kapillärer och pullers kan också användas för att förbereda glasnålarna. Men glasnålarna ska inte vara för tunna eftersom de kan gå sönder när de kommer i kontakt med skallen. Kapillär: längd: 100 mm (4 tum); OD: 1,5 mm; ID: 0,84 mm; glödtråd: Ja
- Puller I, Kapillär typ 1: Värme 1: 65,8; Värme 2: 55,1; 2-stegs drag
2. Anestesi av larver och preparat för inbäddning
- När du startar experimentet för dagen, överför de djur som behövs med en plast Pasteur-pipett till en petriskål med 90 mm diameter, som är fylld med antingen Danieau (för larver som fortfarande hålls i en Petri-maträtt med Danieau) eller vatten från fiskanläggningen (för larver som är äldre än 7 dpf och hålls i fiskanläggningen).
- När pipettering fisk äldre än 2 veckor, se till att öppningen av pipetten är tillräckligt stor för att undvika att skada fisken när du överför dem. Använd inte ett nät eftersom det fysiskt kommer att skada speciellt de yngre larverna.
- Tillsätt rotifera eller artemia nauplii som passar storleken på larverna som hålls i Petri-skålen, för att säkerställa fri tillgång till mat och maximal hälsostatus för larverna och för att minska stress.
- För inbäddning, överför de valda larverna till en petriskål med 35 mm diameter fylld med ACSF. Tillsätt den nödvändiga volymen d-tubokurarin för att nå en fungerande koncentration/ effektiv dos på 10 μM och vänta i några minuter tills larverna är helt immobiliserade11.
OBS: När fisken blir äldre eller om en snabbare full anestesi behövs (under 5 min) är det möjligt att öka koncentrationen av d-tubokurarin (LD50 för möss är 0,13 mg/kg intravenöst12). Det är också möjligt att använda en annan bedövningsmedel, såsom α-bungarotoxin (arbetskoncentration: 1 mg/ml), som har samma effekt som curare och håller också hjärnan fullt aktiv13. Om en fullt aktiv hjärna inte är nödvändig för ämnet av intresse, trikain i en icke-dödlig dos (0,02%) är också ett alternativ att helt bedöva larverna. Tricaine blockerar dock natriumkanaler, vilket försämrar hjärnaktiviteten14. - Förbered monteringskammaren genom att ta locket på petriskålen med diametern 35 mm, vänd locket upp och ner och placera ett fyrkantigt glaslock (24 x 24 mm) på lockets botten. Se figur 1 (övre delen) för en schematisk beskrivning av dessa steg. Glasets jämnare yta förhindrar att man glider bort från agarosblocket, som innehåller larverna under skallöppningsproceduren.
- Alikvot mängden ACSF som behövs för dagen i en lämplig injektionsflaska (t.ex. 50 ml rör, bägare, Schott-flaska etc.) och syresätta den med karbon (5% CO2,95% O2). Om avbildning endast morfologi (t.ex. fluorescens mönster) ACSF fortfarande är nödvändigt för att säkerställa hjärnans integritet och att celler inte påverkas negativt av osmolaritet effekter men syresättning av ACSF behövs inte. Detta steg behöver bara utföras när full hjärnaktivitet är nödvändig för avbildning.
OBS: För optimal syremättnad av mediet, tillsätt en luftsten i änden av karbagenröret. För att garantera en tillräckligt hög syrenivå är det nödvändigt att byta acsf i bildkamrarna mot nyförsydd ACSF var 20-60:e minut, beroende på antalet och åldern på larver inbäddade i samma bildkammare (t.ex. för ett enda inbäddat larva ACSF-utbyte varje timme är tillräckligt. För sex larver äldre än 14 dpf inbäddade parallellt är utbyte av ACSF var 20: e minut nödvändigt) så planera den nödvändiga mängden syremättad ACSF enligt det planerade experimentet.
3. Inbäddning av larverna
- Överför de helt sövda larverna med en pastörpipett av plast till den (i steg 2.4) förberedda monteringskammaren. Ta sedan försiktigt bort överskottsmediet för att undvika utspädning av LM-agarose. Alla följande steg bör utföras under ett stereomikroskop med tillräcklig förstoring.
OBS: Om monteringskammaren lutas kan mediet tas bort helt. - Fortsätt omedelbart till nästa steg genom att lägga till en tillräckligt stor LM-agarose droppe ovanpå larverna (ca 1 ml, beroende på larvernas storlek) för att skydda djuren från att torka ut och för att minska onödig stress.
- Orientera larverna på plats innan agarosen stelnar. Se till att den dorsala delen av larverna riktas uppåt. Se också till att bädda in larverna så nära agaroseytan som möjligt.
OBS: Beroende på storleken och antalet larver som planeras att bädda in samtidigt är det möjligt att justera agaroskoncentrationen. Till exempel, för 1-3 larver som är 30 dpf gamla, rekommenderas en koncentration på 1,8%-2% LM-agarose. För 1-4 larver som är 7 dpf gamla är det mest praktiskt möjligt att använda 2,5% LM-agarose, medan 2% är mer lämpad för 5-8 larver. Om en fullt aktiv hjärna krävs, rekommenderas att bara bädda in tre fiskar samtidigt för att minska den tid som behövs för att driva larverna. I allmänhet rekommenderas att använda lägre koncentrationer (1,8%-2%) ju äldre larverna blir eller desto fler larver planeras att bäddas in samtidigt. - Om bilder kommer att registreras med ett inverterat mikroskop, trimma agarosblocket som innehåller larverna till en liten kuboidform. Detta är viktigt för att överföra larverna till bildkammaren senare. Om du använder ett upprätt mikroskop är sådan trimning inte nödvändig, eftersom monteringskammaren också kan användas som bildkammare. I figur 1 (övre delen) kan man hitta en schematisk beskrivning av dessa steg.
4. Exponera hjärnan
OBS: Alla följande steg bör utföras med största försiktighet för att inte skada larverna i onödan. Om en fullt aktiv hjärna krävs för experimentet, kom ihåg att med varje sekund som passerar, medan fisken fortfarande är helt monterad i agarose och har en öppen skalle utan syresatt ACSF, kommer hjärnan att lida av syrebrist och också torka ut. Effekterna av syrebrist blir ännu mer dramatiska, ju äldre de inbäddade larverna är. Därför är det viktigt att utföra operationen inte bara på kortast möjliga tid, men också med maximal precision för att inte framkalla mekanisk hjärnskada med nålen. När steg 4.2-4.4 tränas bör de inte ta mer än 30 s per fisk.
- Påbörja operationen så snart agarosen har stelnat. Först trimma bort all överskott av agarose ovanför hjärnans region av intresse för att få fri tillgång till huvudet och ett tydligt arbetsutrymme. Om den dorsala delen av huvudet redan sticker ut ur agarosen, hoppa över det här steget.
- Beroende på intresseregion, välj en plats till att börja med operationen. Ta glasnålen och gör ett litet snitt genom huden men utan att penetrera för djupt in i vävnaden. Detta kommer att vara utgångspunkten för att skala bort den överläggande huden.
OBS: För optimala resultat, börja aldrig direkt ovanför den region där det är av intresse för att minska risken för att skada viktiga strukturer. Vid behov är det möjligt att till och med starta bakre till bakhjärnan och därifrån arbeta framåt tills det oönskade hudområdet skalas bort. - Fortsätt med mycket små skär längs den del av huden som syftar till att ta bort genom att knappt flytta nålen precis under ytan. För det mesta är det inte nödvändigt att röra sig helt runt hjärnan och skära ut en cirkelliknande bit hud och skalle, utan snarare bara göra två snitt längs huvudet och sedan skjuta bort huden till en eller annan sida. Figur 2 visar en schematisk representation av den optimala skärstrategin för att få fri tillgång till lillhjärnan.
OBS: Denna mikrokirurgi är ett känsligt förfarande och det kommer sannolikt att behöva lite träning för att perfekt ta bort huden utan att skada den underliggande hjärnan. Det rekommenderas också att ta reda på den optimala skärstrategin för hjärnans intresseregion och hålla fast vid den under experimentperioden. - Omedelbart efter att du har tagit bort huden från alla inbäddade larver, fortsätt genom att hälla (syresatt) ACSF över agarosen för att översvämma oönskade hudpartiklar och blod och för att hålla hjärnan fullt aktiv och skydda den från att torka ut.
OBS: Om en frisk hjärna behövs för experimentet, rekommenderas att gå för högst tre fiskar åt gången. - Om du använder ett upprätt mikroskop, börja direkt med avbildning.
- När du använder ett inverterat mikroskop, skjut en liten spatel under det kuboida agarosblocket (steg 3.4).
- Tillsätt en liten droppe LM-agarose till botten av bildkammaren (t.ex. glasbotten) och vänd omedelbart agarosblocket som innehåller larverna med spateln i 180° och tryck försiktigt den till botten av bildkammaren, medan vätskeagarosdropgen fungerar som lim.
- När agarosen har stelnat, fyll upp bildkammaren med (syresatt) ACSF och börja sedan avbildningen. Se figur 1 (nedre delen) för en schematisk beskrivning.
- När full hjärnaktivitet krävs för experimentet, se alltid till att ACSF i bildkammaren har en tillräckligt hög syrenivå. För att säkerställa detta, byt ut mediet försiktigt mot nysyrenad ACSF när det är möjligt var 20-60:e minut (beroende på fiskens antal och storlek, storlek och yta samt bildbehandlingstid).
Figur 1:Schematiskt förfarande för beredning av zebrafisk med öppen skalle för in vivo-avbildning stegvis. Arbetsinstruktionerna för de olika stegen finns i själva grafiken. Grafik designad av Florian Hetsch och anpassad av Paul Schramm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Detaljerad schematisk representation av mikrokirurgin som utförs för att ta bort bitar av hud och skalle ovanför hjärnans intresseområde. Den röda cirkeln markerar den plats där det första snittet måste göras. Den rödprydda linjen avgränsar den optimala vägen att skära tillsammans med nålen för att få fri tillgång till lillhjärnan utan att skada den. Den gröna pilen markerar i vilken riktning de överdrivna hud- och skallbitarna lätt kan skjutas bort. Se till att aldrig tränga in i hjärnvävnaden under hela proceduren. Efter att framgångsrikt ha skalat bort huden kommer hjärnans region av intresse (här, lillhjärna) att vara fritt tillgänglig för alla typer av högupplöst in vivo-avbildning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3A, C visa en 14 dpf larva av den transgena linjen Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] med skallen intakt. Pigmentcellerna i den överläggande huden fördelas över hela huvudet och stör fluorescenssignalen i intresseområdet (här, lillhjärnan). Med larven i detta tillstånd är det inte möjligt att få högupplösta bilder av hjärnan. Figur 3B visar en larva av samma transgena linje efter att ha utfört den öppna skalloperationen. Intresseområdet är nu fritt tillgängligt för excitationslasern och avgivet fluorescensljus för att tränga in i vävnaden utan att spridas och reflekteras. Bilder inspelade av denna larva kommer att resultera i detaljerade högupplösta bilder (Figur 3D), jämförbar med bilder av en isolerad hjärna, men med fördelen att hjärnan fortfarande är fullt aktiv. Dessutom förlorar hjärnan inte någon fluorescensintensitet som normalt skulle orsakas av fixering med paraformalitetdehyd, vilket skulle vara fallet för en fast och explanterad hjärna. I en larva med öppen skalle och därmed en fritt tillgänglig hjärna med fullt aktiva nervceller, som fortfarande har alla fysiologiska anslutningar och får normal input från det sensoriska systemet, kommer det också att vara möjligt att observera kortsiktiga händelser, t.ex. synaptogenes, ryggradstillväxt, dendritisk/axonal migration eller lokalt mRNA-uttryck16 under fysiologiska förhållanden. En annan fördel med denna metod är att den är lämplig för applicering av olika farmakologiska ämnen för att undersöka effekterna på den levande larven utan diffusionsproblem orsakade av hud och skalle eller blodhjärnbarriären, vilket normalt skulle hindra ämnen att tränga in i hjärnan (Figur 3E). För att visa att en 14 dpf larva med öppen skalle inkuberades med Hoechst-33342 (5 μg/mL i ACSF) i 10 min och sedan avbildas (Figur 3F-Jag). Figur 4A, B visa 30 dpf gamla larver före och efter öppning av skallen. Det är den mest avancerade tidspunkten som testats hittills för den här metoden. Även i detta utvecklingsstadium av larven är det möjligt att få högupplösta bilder av enstaka nervceller och även subcellulära fack med den metod som beskrivs här (Figur 4C, D). Dessa 30 dpf gamla larver visade inte aktivitet underskott efter 1 h avbildning. Denna metod används också för elektrofysiologisk patchklämmaanalys av 30 dpf gamla larver och det finns inga tecken på förlust av neuronal aktivitet i Purkinje-celler (men celler nära ytan är känsliga och sårbara) under de första 60 minuter som bäddas in med en öppen skalle. Genom att regelbundet inspektera mängden blodflöde är det möjligt att validera att larven fortfarande är i en hälsosam status. Denna status kan bibehållas genom att regelbundet utbyta eller syresätta ACSF under långsiktig bildinspelning. Det är därför ganska enkelt att validera om en larva fortfarande är lämplig för funktionella hjärnstudier. För att bevisa att inga viktiga blodkärl skadas under mikrokirurgin och även för att visa att denna metod möjliggör mycket djupare penetration av excitationslaserljuset i hjärnvävnaden och reflektionsreduktionen av fotoner, en 10 dpf gammal larva av den transgena stammen Tg (flk1:mCherry)y206Tg (206Tg)17 analyserades med denna metod. Dessa fiskar innehåller en fluorescerande vaskulatur i hjärnan på grund av uttrycket av det röda fluorescerande proteinet mCherry i endotelceller. En maximal intensitetsprojektion av en bildstapel som täcker 245 μm på djupet avslöjar det invecklade nätverket av blodkärlen som slingrar sig genom mitten och bakhjärnan (Figur 5A). Dessutom visar färgkodning av bildstapelns djupvärden att även blodkärl djupt begravda i hjärnan vid nästan 250 μm är tydligt synliga och spårbara (Figur 5B). Kompletterande video 1A visar en frisk hjärna med tillräcklig blodtillförsel, medan Kompletterande video 1B visar en hjärna med komprometterat blodflöde på grund av bristen på utbyte av ACSF och brist på medelsyre.
Figur 3:Hudskalning i zebrafisklarver ger optimal åtkomst för hjärnavbildning in vivo. Konfokal mikroskopi analys av 14 dpf gamla transgena Tg(-7.5ca8:GFP]bz12 larver. Översikt över mellan- och bakhjärnor av icke-skalade(A,C)ochhudskalade (B,D)exemplar vid 20x respektive 40x förstoring. I det senare förbättrar bristen på pigment tydligt bildkvaliteten och möjliggör detaljerad bildinspelning av fluorescerande Purkinje-celler i lillhjärnan. Subcellulär avbildning och enkel sammansatt administrering till hjärnan demonstreras genom en inkubationstid på 10 min med nukleinsyra fluorescerande färgning med Hoechst-33342 (5 μg/mL i ACSF). Medan endast hudceller innehåller detta färgämne i icke-skalade larver (E), visar exemplar med lyft hud intensiv märkning av deras atomkärnor i helahjärnan( F ) vilket möjliggör visualisering av enskilda atomkärnor (G) av GFP-fluorescerande Purkinje-nervceller (H, sammanslagen bild som visas i I, 63x optisk och 4x digital förstoring). Skalstänger: A-F: 100 μm, G-I: 5 μm. Larver var inbäddade med huvudet till vänster, dorsal är uppe. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Hudskalning utökar tillgången för in vivo-hjärnavbildning till ung zebrafisk. Konfokal mikroskopi analys av 30 dpf gamla transgena Tg(-7.5ca8:GFP]bz12Tg ungdomar. Översikt över mid- och bakbrain av icke-skalade (A) och hudskalade exemplar vid 10x (B) respektive 40x (C) respektive 63x optisk förstoring med 4x digital zoom (D), . Avlägsnandet av pigmenterad hud möjliggör visualisering av cellulära organisationen av det kontinuerliga cerebellar Purkinje cellskiktet och att skildra projektioner av enskilda nervceller (D, vita pilar). Skalstänger: A-C: 100 μm, D: 5 μm. Larver var inbäddade med huvudet till vänster, dorsal är uppe. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Hudborttagning tillåter hjärnvaskulaturrekonstruktion på utökat djup i en 10 dpf gammal Tg(flk1:mCherry)y206Tg zebrafisk larva. (A) Maximal intensitetsprojektion av en hög med bilder (245 bilder med en tjocklek av 1 μm på totalt avstånd av 245 μm, 20x optisk förstoring) visar ett kontinuerligt nätverk av blodkärl i dessa hjärnområden. (B) Djupfärgkodning visar att detta nätverk av blodkärl kan övervakas på 200 μm och därefter. För att ta bort autofluorescens och reflektion maskerades ögonen av svart färg. Skalstång: 100 μm. Larver var inbäddade med huvudet till vänster, dorsal är uppe. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1:Nålar tillverkade av glas kapillärer. A)Två nåltyper som erhålls från två olika nåldragare visas. Det är viktigt att spetsen inte är för lång för att ge den tillräcklig stabilitet och för att undvika att den går sönder när den kommer i kontakt med huden/skallen. Ändå behövs en tillräcklig skärpa för att göra nedskärningar med rena kanter. B)En bild av kapillären som är laddad i nåldragarna visas. Skalstången är 250 μm. Kapillärlängd: 100 mm; OD: 1,5 mm: ID: 0,84 mm; filament: ja. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande video 1: Bildbehandling 7dpf gammal larva. (A) Realtid Filminspelning (30 fps) från en 7 dpf gammal larva 10 min efter att huden ovanför hjärnan har tagits bort. Det livliga blodflödet indikerar ett hälsosamt tillstånd med tillräcklig blodtillförsel. (B) Filminspelning i realtid (30 fps) från samma 7 dpf gamla larva som visas i kompletterande video 1A, 2 timmar efter mikrokirurgin utan utbyte av ACSF och brist på medelsyre. Skala bar: 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterade metoden ger ett alternativt tillvägagångssätt för hjärnisolering eller behandling av zebrafisklarver med läkemedel som hämmar pigmentering för registrering av högupplösta bilder av nervceller i deras in vivo-miljö. Kvaliteten på bilder som registreras med denna metod är jämförbar med bilder från explanterade hjärnor, men under naturliga förhållanden.
Dessutom undviks en förlust av intensiteten i fluorescens, eftersom det inte finns något behov av behandling med fixativ18. Denna metod är inte heller lika invasiv som att isolera en hjärna och den består bara av ett avgörande steg som kan leda till misslyckande, så chanserna för ett framgångsrikt preparat är högre jämfört med hjärnans explantation. Den viktigaste fördelen är att denna metod är lämplig för in vivo-bildinspelning. Förutsatt att skallöppningen utförs exakt, snabbt och framgångsrikt, och syremättnaden hos ACSF övervakas regelbundet, bör hjärnan vara fullt funktionell och livskraftig i timmar. Baserat på elektrofysiologiska inspelningar, blodcirkulation, andning och överlevnad av fisk i ytterligare dagar, anser vi att det är troligt att hud- och skallborttagning inte är allvarligt skadligt för den allmänna hälsan. Således kan denna metod användas för realtidsavbildning av cellulära och subcellulära processer i en frisk och funktionell hjärna utan bild-störande pigmentering. Denna metod är ett standardförfarande som används för elektrofysiologiska inspelningar av neuronal aktivitet in vivo i vårt labb och är också väl etablerad i andra elektrofysiologiska laboratorierrunt om i världen 19,20,21,22, vilket bevisar att hjärnans funktion inte försämras av mikrokirurgin. En nackdel som måste nämnas är att detta tillvägagångssätt endast är lämpligt för avbildning av dorsala och laterala hjärnregioner och inte kan utföras upprepade gånger med samma prov.
Men om en fullt fungerande hjärna är nödvändig för experimentet, bör syremättnaden övervakas permanent, och vid behov bör ACSF i bildkammaren bytas ut mot nysyreerad ACSF. Detta innebär att det för långtidsinspelningar måste finnas möjlighet att byta ut den använda ACSF med syremättad ACSF utan att störa avbildningsförfarandet som kan åtgärdas med hjälp av en miniatyrpump.
Observera, om mikrokirurgin inte utförs korrekt eller oprecist, kommer det att leda till hjärnskada eller hjärnblödning som resulterar i komprometterad hjärnfysiologi. Dessutom kan en låg syremättnad i ACSF (se kompletterande video 1) eller för mycket stress för larverna under hela detta förfarande påverka hjärnannegativt 23,24. Därför är denna metod inte lämplig för hög genomströmningsanalys, utan snarare för longitudinell eller mycket detaljerad bildinspelning av endast några larver per tidpunkt. Därför bör denna metod inte syfta till läkemedelsscreening vid hög genomströmning, men den kan användas för att karakterisera eller validera lovande farmakologiska föreningar i detalj, där högupplöst bildbehandling är informativ och nödvändig. För att säkerställa korrekt hjärnhälsostatus rekommenderas att inte överstiga antalet tre larver per studie.
Genom den öppna skallen är det till och med möjligt att direkt applicera ämnen på hjärnvävnaden utan att ha dem att passera genom blod - hjärnbarriären. Sammantaget är den metod som beskrivs här - för närvarande tillämpad för in vivo-elektrofysiologi - en teknik med hög potential inom ett mycket brett fält av in vivo-hjärnavbildning och optogenetik i zebrafisklarver och ungfåglar och kan kopplas till neurofarmakologiska metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar särskilt Timo Fritsch för utmärkt djurvård och Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti och Barbara Winter för deras hjälpsamma stöd. Vi är också tacksamma mot alla andra medlemmar i Kösterlabbet för deras feedback. Projektet finansierades delvis av det tyska forskningsstiftelsen (DFG, KO1949/7-2) projekt 241961032 (till RWK) och Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS projekt 01EW1520 till JCM) bekräftas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish 'affective' behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
