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Biology

टेलोमेरेस पर रासायनिक डामरीकरण-प्रेरित प्रोटीन संघनित

Published: April 12, 2021 doi: 10.3791/62173
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

Summary

यह प्रोटोकॉल क्रोमेटिन पर संघनन बनाने के लिए रासायनिक रूप से प्रेरित प्रोटीन डिमराइजेशन सिस्टम दिखाता है।  रासायनिक डिमेराइजर्स के साथ टेलोमेरेस पर प्रोमाइलोसाइटिक ल्यूकेमिया (पीएमएल) परमाणु निकाय के गठन का प्रदर्शन किया जाता है। ड्रॉपलेट ग्रोथ, विघटन, स्थानीयकरण और संरचना की निगरानी लाइव सेल इमेजिंग, इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरेसेंस के साथ की जाती है।

Abstract

क्रोमेटिन से जुड़े संघनन कई परमाणु प्रक्रियाओं में फंसाया जाता है, लेकिन अंतर्निहित तंत्र मायावी रहते हैं । यह प्रोटोकॉल टेलोमेरेस पर संघनित बनाने के लिए रासायनिक रूप से प्रेरित प्रोटीन डिमेराइजेशन सिस्टम का वर्णन करता है। रासायनिक डिमराइजर में दो लिंक्ड लिगांड होते हैं जो प्रत्येक प्रोटीन से बांध सकते हैं: हेलो लिगांड से हेलो-एंजाइम और ट्राइमेथोप्रिम (टीएमपी) से ई. कोलाई डिडड्रोफोलेट रिडक्टेज (ईएचडीएफआर) क्रमशः। हेलो एंजाइम का फ्यूजन एक टेलोमेरे प्रोटीन एंकर को सहसंयोजक हेलो लिगांड-एंजाइम बाइंडिंग के माध्यम से टेलोमेरेस के लिए डिमेराइजर्स। ईएचडीएफआर के लिए टीएमपी का बाध्यकारी ईडीएचएफआर-फ्यूज्ड चरण टेलोमेरेस को प्रोटीन को अलग करता है और संघनित गठन को प्रेरित करता है। चूंकि टीएमपी-ईडीएचएफआर इंटरैक्शन गैर-सहसंयोजक है, इसलिए ईडीएचएफआर बाध्यकारी के लिए डिमराइजर के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए अतिरिक्त मुक्त टीएमपी का उपयोग करके संघनन को उलट दिया जा सकता है। टेलोमेरेस पर प्रोमाइलोसिटिक ल्यूकेमिया (पीएमएल) परमाणु शरीर के गठन को प्रेरित करने और संघनित विकास, विघटन, स्थानीयकरण और संरचना का निर्धारण करने का एक उदाहरण दिखाया गया है। इस विधि को आसानी से एक प्रोटीन है कि सीधे स्थानीय क्रोमेटिन या dCas9 है कि एक गाइड आरएनए के साथ जीनोमिक लोकस के लिए लक्षित है के लिए बांधता है करने के लिए हेलो fusing द्वारा अंय जीनोमिक स्थानों पर संघनित प्रेरित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । जैव रासायनिक परख के लिए कोशिकाओं की आबादी में चरण जुदाई को बनाए रखते हुए एकल कोशिका लाइव इमेजिंग के लिए आवश्यक लौकिक संकल्प की पेशकश करके, यह विधि क्रोमेटिन से जुड़े संघनकों के गठन और कार्य दोनों की जांच के लिए उपयुक्त है।

Introduction

कई प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड तरल-तरल चरण पृथक्करण (एलएलपी) से गुजरते हैं और कोशिकाओं में जैव रसायन को व्यवस्थित करने के लिए बायोमॉलिक्यूलर संघनित में स्वयं को इकट्ठा करते हैं1,2। क्रोमेटिन-बाइंडिंग प्रोटीन के एलएलपी संघनितों के गठन की ओर ले जाते हैं जो विशिष्ट जीनोमिक लोकी से जुड़े होते हैं और विभिन्न स्थानीय क्रोमेटिन कार्यों में फंसाए जाते हैं3। उदाहरण के लिए, एचपी 1 प्रोटीन के एलएलपी जीनोम4, 5,ट्रांसक्रिप्शन कारकों के एलएलपी को व्यवस्थित करने के लिए हेट्रोक्रोमेटिन डोमेन केगठनको रेखांकित करते हैं, ट्रांसक्रिप्शन6को विनियमित करने के लिए ट्रांसक्रिप्शन केंद्र बनाता है, नवजात एमएचएनए के एलएलपी और मल्टी-सेक्स कॉम्ब्स प्रोटीन हाईस्टोन एमआरएएनए7के ट्रांसक्रिप्शन और प्रसंस्करण को विनियमित करने के लिए हाईस्टोन लोकस निकायों को उत्पन्न करता है।  हालांकि, क्रोमेटिन से जुड़े संघननों की खोज के कई उदाहरणों के बावजूद, संघनित गठन, विनियमन और कार्य के अंतर्निहित तंत्र खराब समझ में आते हैं। विशेष रूप से, एलएलपी के माध्यम से सभी क्रोमेटिन से जुड़े संघनन नहीं बनते हैं और जीवित कोशिकाओं में संघनित गठन के सावधानीपूर्वक मूल्यांकन अभी भी8,9की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, माउस में एचपी1 प्रोटीन में जीवित कोशिकाओं में तरल बूंदों को बनाने के लिए केवल एक कमजोर क्षमता है और हेट्रोक्रोमेटिन फोसी ढह बहुलक ग्लोब्यूल्स10के रूप में व्यवहार करते हैं। इसलिए, जीवित कोशिकाओं में क्रोमेटिन पर डी नोवो संघनन को प्रेरित करने के लिए उपकरण वांछनीय हैं, विशेष रूप से वे जो लाइव इमेजिंग और बायोकेमिकल परख के उपयोग को संघनित गठन के काइनेटिक्स, परिणामी संघननों के भौतिक और रासायनिक गुणों और संघनित गठन के सेलुलर परिणामों की निगरानी करने की अनुमति देते हैं।

यह प्रोटोकॉल क्रोमेटिन11 (चित्रा1 ए) पर प्रोटीन संघनन को प्रेरित करने के लिए एक रासायनिक डामरीकरण प्रणाली की रिपोर्ट करता है। डिमराइजर में दो लिंक्ड प्रोटीन-इंटरैक्टिंग लिगांड होते हैं: ट्राइमेटहोप्रिम (टीएमपी) और हेलो लिगांड और कॉग्नेट रिसेप्टर्स से जुड़े प्रोटीन को डिमराइज कर सकते हैं: एस्चेरिचिया कोलाई डिाइडड्रोफोलेट रिडेक्टेज (ईडीएचएफआर) और एक बैक्टीरियल एल्किलिडेलोजेनेज एंजाइम (हेलो एंजाइम), क्रमशः12। हेलो लिगांड और हेलो एंजाइम के बीच बातचीत सहसंयोजक है, जिससे हेलो एंजाइम को एक लंगर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो इसे क्रोमेटिन-बाइंडिंग प्रोटीन के लिए फ्यूज करके एक चरण-अलग प्रोटीन की भर्ती करने के लिए है जो क्रोमेटिन के लिए ईएचएफआर को फ्यूज किया गया है । प्रारंभिक भर्ती के बाद, प्रोटीन को अलग करने वाले चरण की स्थानीय एकाग्रता में वृद्धि चरण अलगाव के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण एकाग्रता से गुजरती है और इस प्रकार एंकर(चित्रा 1B)में एक संघनित हो जाती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे एमएचएचएफआर और हेलो) को फ्यूज करके, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ वास्तविक समय में नाभिक और संघनन के विकास की कल्पना की जा सकती है। क्योंकि ईडीएचएफआर और टीएमपी के बीच बातचीत गैर-सहसंयोजक है, इसलिए ईडीएचएफआर बाध्यकारी के लिए डिमराइजर के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए अतिरिक्त मुक्त टीएमपी जोड़ा जा सकता है। इसके बाद एंकर से फेज सेपरेशन प्रोटीन रिलीज होगा और क्रोमेटिन से जुड़े कंडेनसेट को भंग कर देगा ।

हमने टेलोमेराज़-नकारात्मक कैंसर कोशिकाओं में टेलोमेरेस पर डी नोवो प्रोमाइलोसिटिक ल्यूकेमिया (पीएमएल) परमाणु शरीर के गठन को प्रेरित करने के लिए इस उपकरण का उपयोग किया जो टेलोमेरे रखरखाव13, 14के लिए टेलोमेरेस (एएलटी) मार्ग के वैकल्पिक लंबे होने का उपयोग करते हैं।  पीएमएल परमाणु निकाय झिल्ली-कम डिब्बे हैं जो कई परमाणु प्रक्रियाओं15, 16में शामिल हैं और एएलटी टेलोमेरे से जुड़े पीएमएल निकायों17,18 के लिए एपीबी बनाने के लिए एएलटी टेलोमेरेस के लिए विशिष्ट रूप से स्थानीयकृत हैं। एपीबी के भीतर टेलोमेरेस क्लस्टर, संभवतः एएलटी19में होमोलॉजी-निर्देशित टेलोमेरे डीएनए संश्लेषण के लिए मरम्मत टेम्पलेट्स प्रदान करने के लिए। दरअसल , एपीबी में टेलोमेरे डीएनए संश्लेषण का पता चला है और एपीबी20 , 21के टेलोमेरेस 20,21पर डीएनए मरम्मत कारकों को समृद्ध करने में आवश्यक भूमिकाएं निभाते हैं । हालांकि, एपीबी असेंबली और एपीबी के भीतर टेलोमेरे क्लस्टरिंग अंतर्निहित तंत्र अज्ञात थे। चूंकि एएलटी कोशिकाओं में टेलोमेरे प्रोटीन को छोटे सर्वव्यापकता जैसे संशोधक (यूमो)22द्वारा विशिष्ट रूप से संशोधित किया जाता है, इसलिए कई एपीबी घटकों में सूमोइलेशन साइटें 22,23,24,25 और/ या सूमो-इंटरैक्टिंग रूपांकनों (सिम)26,27 और सूमो-सिम इंटरैक्शन ड्राइव चरण जुदाई28,हम परिकल्पना है कि telomeres पर सुमोइलेशन सुमो/सिम प्रोटीन युक्त संवर्धन की ओर जाता है और उन प्रोटीनों के बीच सुमो-सिम इंटरैक्शन चरण जुदाई का कारण बनते हैं।  पीएमएल प्रोटीन, जिसमें तीन सूमोइलेशन साइट और एक सिम साइट है, को APBs बनाने के लिए सूमोयलेटेड टेलोमेरेस में भर्ती किया जा सकता है और तरल एपीबी का मिलन टेलोमेरेस क्लस्टरिंग की ओर जाता है । इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हमने तेलोमेरेस(चित्रा 2 ए)11को सिम की भर्ती करके सुमोइलेशन-प्रेरित एपीबी गठन की नकल करने के लिए रासायनिक डामरीकरण प्रणाली का उपयोग किया। जीएफपी को दृश्य के लिए हेलोएंजाइम और टेलोमेरे-बाइंडिंग प्रोटीन TRF1 को टेलीमेरेस में डाइमेराइजर को एंकर करने के लिए जोड़ा जाता है। सिम ईडीएचएफआर और एमएचरी से जुड़ा हुआ है। संघनित गठन और बूंद संलयन प्रेरित टेलोमेरे क्लस्टरिंग के काइनेटिक्स लाइव सेल इमेजिंग के साथ पीछा किया जाता है।  चरण जुदाई को ईडीएचएफआर बाध्यकारी के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए अतिरिक्त मुक्त टीएमपी जोड़कर उलट दिया जाता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरेसेंस का उपयोग संघनन संरचना और टेलोमेरिक संघ निर्धारित करने के लिए किया जाता है। भर्ती सिम टेलोमेरेस पर सुमो को समृद्ध करता है और प्रेरित संघनकों में पीएमएल होता है और इसलिए एपीबी होते हैं। एक सिम उत्परिवर्ती की भर्ती जो सुमो के साथ बातचीत नहीं कर सकता है, टेलोमेरेस पर सुमो को समृद्ध नहीं करता है या चरण पृथक्करण को प्रेरित करता है, यह दर्शाता है कि एपीबी संघनन के लिए मौलिक प्रेरक बल सुमो-सिम इंटरैक्शन है। इस अवलोकन से सहमत होकर, पॉलीसुमो-पॉलीसिम पॉलिमर जो TRF2 बाध्यकारी कारक RAP1 से जुड़े हैं, एपीबीगठन 29को भी प्रेरित कर सकते हैं। पॉलीसुमो-पॉलीसिम फ्यूजन सिस्टम की तुलना में जहां चरण पृथक्करण तब तक होता है जब तक पर्याप्त प्रोटीन का उत्पादन होता है, यहां प्रस्तुत रासायनिक डामरीकरण दृष्टिकोण मांग पर चरण पृथक्करण को प्रेरित करता है और इस प्रकार चरण पृथक्करण और टेलोमेरे क्लस्टरिंग प्रक्रिया के काइनेटिक्स की निगरानी के लिए बेहतर लौकिक संकल्प प्रदान करता है। इसके अलावा, यह रासायनिक डामरीकरण प्रणाली अन्य प्रोटीन की भर्ती को चरण पृथक्करण और टेलोमेरे क्लस्टरिंग को प्रेरित करने में उनकी क्षमता का आकलन करने की अनुमति देती है। उदाहरण के लिए, टेलोमेरेस के लिए भर्ती किया गया एक अव्यवस्थित प्रोटीन एपीबी गठन को प्रेरित किए बिना बूंदों और क्लस्टर टेलोमेरेस का भी निर्माण कर सकता है, टेलोमेरे क्लस्टरिंग का सुझाव एपीबी रसायन शास्त्र से स्वतंत्र है और केवल एपीबी तरल संपत्ति11पर निर्भर करता है।

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Protocol

1. क्षणिक सेल लाइनों का उत्पादन

  1. 22 x 22 मिमी ग्लास कवरलिप (लाइव इमेजिंग के लिए) या 12 मिमी व्यास परिपत्र कवरलिप (आईएफ या मछली के लिए) पर संस्कृति U2OS स्वीकार्य कोशिकाएं पॉली-डी-लिसिन के साथ लेपित हैं 6- डीएमईएम में ग्रोथ मीडियम (10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन सॉल्यूशन) के साथ वेल प्लेट जब तक वे 60-70% तक नहीं पहुंच जाते।
  2. ट्रांसफेक्शन से पहले ग्रोथ मीडियम को 1 एमएल ट्रांसफैक्शन मीडियम (पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन सॉल्यूशन के बिना ग्रोथ मीडियम) से बदलें।
  3. प्रत्येक ट्रांसफेक्शन के लिए अच्छी तरह से, 150 माइक्रोन कम सीरम मीडिया, 10 सेकंड के लिए भंवर और फिर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए 4 μL ट्रांसफैक्शन रिएजेंट जोड़ें।
  4. प्रत्येक कुएं के लिए, हेलो निर्माण प्लाज्मिड (हेलो-जीएफपी-टीआरएफ 1 या हेलो-टीआरएफ 1) जोड़ें और ईडीएचएफआर प्लाज्मिड (एमएचरी-ईएचडीएफआर-सिम या एमएचरी-ईएचएफआर-सिम म्यूट) का निर्माण करें 1:1 द्रव्यमान अनुपात पर (0.5 माइक्रोन हेलो निर्माण प्लाज्मिड के साथ 0.5 μg eDHFR निर्माण प्लाज्मिड) 150 माइक्रोन कम सीरम मीडिया के लिए, ड्रॉपवाइज, पाइपिंग से मिलाएं।
    नोट: टैग अपेक्षाकृत छोटे हैं (हेलो 33 केडी, ईएचएचएफआर 28 केडी, एमएचरी 30 केडी, ईजीएफपी 27 केडी) और चरण पृथक्करण पर कोई प्रभाव नहीं देखा गया। हालांकि, सिम म्यूटेंट जैसे म्यूटेंट का उपयोग करके यह सुनिश्चित करने के लिए कि चरण व्यवहार म्यूटेशन के प्रति संवेदनशील है, टैग की सलाह नहीं दी जाती है। सिम PIASx28,30से है । सिम अनुक्रम AAAGTCGATGATGATTAATTACTACGATCGATATTAGCAGGATagaagaTCCCCCCCCTAAACACGT है । सिम उत्परिवर्ती सिम अमीनो एसिड VIDL को वडा28में म्यूट करके उत्पन्न किया जाता है, और अनुक्रम AAAGTCGATGTAGCCGATGATCGATCAGGATAGAAGAAGATCCACCCCACACACGGGGGGGATTCCCCCCCCCACACGGTT है। हमने ऐडजीन के लिए अपने प्लाज्मिड जमा किए: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-सिम; #164649 mCherry-eDHFR-सिम उत्परिवर्ती ।
  5. ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के 150 माइक्रोन जोड़ें - कम सीरम मीडिया मिश्रण डीएनए के साथ 150 माइक्रोन कम सीरम मीडिया, ड्रॉपवाइज, पाइपिंग द्वारा मिश्रण, 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  6. कोशिकाओं, ड्रॉपवाइज में ट्रांसफैक्शन रीएजेंट-डीएनए मिश्रण के 300 माइक्रोन जोड़ें और फिर कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  7. लाइव इमेजिंग, इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) या सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरेसेंस से पहले 24-48 घंटे इंतजार करें।

2. टेलोमेरेस पर डामरीकरण

  1. 10 एमएम में डाइमेथाइल सल्फॉक्साइड में डाइमेराइजर्स को भंग करें और लॉन्ग टर्म स्टोरेज के लिए −80 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब्स में स्टोर करें ।
    नोट: टीएमपी और हेलोलीगंड के बीच सीधे हेलो (टीएमपी-हेलो, टीएच) से जुड़े टीएमपी के साथ डिमराइजर का उपयोग करने के बजाय, डिमेराइजर टीएमपी-एनवीओसी-हेलो (टीएनएच) जिसमें एक फोटोसेंसिटिव लिंकर, 6-नाइट्रोवेरेल ऑक्सीकार्बोनिल (एनवीओसी) है, का उपयोग31किया जाता है। इसका कारण यह है कि टीएनएच (~ 5 मिनट) के लिए टीएच (~ 20 मिनट) की तुलना में सेल में फैलाना कम समय लगता है। यहां दिखाए गए परिणाम भी टीएच का उपयोग करके प्राप्त किए जा सकते हैं। टीएनएच का उपयोग करते समय, सावधान रहें कि NOVC दरार से बचने के लिए डिमराइजर को प्रकाश में बेनकाब न करें। एक मंद लाल बत्ती दीपक के साथ एक अंधेरे कमरे में टीएनएच संभालें, एम्बर प्लास्टिक ट्यूबों में डिमराइजर स्टोर करें और एल्यूमीनियम फॉयल के साथ टीएनएच या इलाज कोशिकाओं वाले कंटेनर को लपेटें। डीआईसी के साथ इमेजिंग टीएनएच सुरक्षित है।
  2. −80 डिग्री सेल्सियस से 10 एमएम डिमराइजर का एलिकोट लें और इमेजिंग मीडियम में पतला कर 10 माइक्रोएम की स्टॉक कंसंट्रेशन करें और −20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  3. उपयोग करने के लिए तैयार होने पर, विकास माध्यम (फिक्स्ड इमेजिंग के लिए) या इमेजिंग माध्यम में 100 एनएम की अंतिम कार्य एकाग्रता के लिए 10 माइक्रोन स्टॉक समाधान से डिमराइजर को पतला करें। लाइव इमेजिंग के लिए मंच पर 100 एनएम डाइम्बराइजर (अंतिम एकाग्रता) के साथ कोशिकाओं का इलाज करें या इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरेसेंस के लिए 4-5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: उपयोग किए जाने वाले डिमराइजर्स की एकाग्रता डामरीकरण दक्षता को प्रभावित करती है और इस प्रकार चरण अलगाव। अधिकतम डाइमराइजेशन दक्षता की अनुमति देने वाली डाइमरिज़र एकाग्रता सेल प्रकार और एंकर प्रोटीन एकाग्रता पर निर्भर करती है, इसलिए इसे विभिन्न प्रयोगों के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता होगी। एक सरल तरीका लंगर प्रोटीन और mCherry-eDHFR व्यक्त कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने के लिए है (प्रोटीन को अलग करने के चरण के लिए fusing के बिना या एक गैर चरण उत्परिवर्ती को अलग करने के लिए जुड़े) और dimerizer एकाग्रता जिस पर लंगर में उच्चतम mCherry तीव्रता हासिल की पहचान है । एक अधिक व्यवस्थित दृष्टिकोण केवल डाइमराइजर की विभिन्न सांद्रता के साथ लंगर व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को इनक्यूबेट करना है और फिर एक हेलो बाइंडिंग डाई के साथ डिमराइजर एकाग्रता निर्धारित करने में मदद करता है जिस पर हेलो बाइंडिंग डाई तीव्रता पठार तक शुरू होती है (यानी, सभी हेलो-फ्यूज्ड एंकर डिमराइजर द्वारा कब्जा कर लिए जाते हैं और हेलो बाइंडिंग डाई के लिए कोई और नहीं छोड़ा जाता है)32।
  4. डाइमराइजेशन को रिवर्स करने के लिए, 2-5 घंटे (लाइव इमेजिंग के साथ या बिना) या वांछित बूंद आकार प्राप्त होने तक डामरीकरण के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और इमेजिंग माध्यम में कोशिकाओं में पतला 100 माइक्रोन मुफ्त टीएमपी (अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ)

  1. बीज 105 कोशिकाओं पर 12 मिमी व्यास परिपत्र कवर चश्मा 6-अच्छी तरह से थाली में पाली-डी-lysine के साथ लेपित । फिर दो प्लाज्मिड्स (हेलो-जीएफपी-टीआरएफ1 को म्हेरी-ईएचडीएफआर-सिम या एमएचरी-ईएचएफआर-सिम म्यूटेंट के साथ) को ट्रांसफेक्ट करें और इम्यूनोफ्लोरेसेंस पर आगे बढ़ने से पहले 24-48 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
    नोट: ट्रांसफैक्शन उच्च अभिव्यक्ति प्राप्त कर सकते हैं के बाद एक दिन से अधिक प्रतीक्षा करें।
  2. 100 एनएम की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए विकास माध्यम के साथ पतला डाइमराइजर, कोशिकाओं में पतला डाइमराइजर जोड़ें और 4-5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: डिमराइजर (< 30 मिनट) जोड़ने के बाद चरण पृथक्करण को जल्दी से प्रेरित किया जाता है। अब इनक्यूबेशन बड़े आकार में बूंदें मोटे में मदद करता है । लाइव इमेजिंग के साथ बूंद विकास के बाद एक वांछित राज्य तक पहुंचने के लिए बूंदों के लिए समय लगता है निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. कोशिकाओं को पार करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड और 0.1% ट्राइटन एक्स-100 युक्त पीबीएस समाधान में कोशिकाओं को ठीक करें। पीबीएस के साथ 3 बार कोशिकाओं को धोएं।
    नोट: इस चरण के बाद, इसे रोका जा सकता है और कोशिकाओं को एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    सावधानी: फॉर्मलडिहाइड साँस लेने से हानिकारक है और यदि निगल लिया जाता है, तो यह आंखों, श्वसन प्रणाली और त्वचा को भी परेशान करता है और कैंसर के संभावित खतरे है। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने की जरूरत है, केवल एक रासायनिक धुएं हुड में उपयोग करें। उपयोग के बाद इसे बेकार कंटेनर में भी रखें, इसे सिंक में निस्तारित न करें।
  4. 50 माइक्रोन टीबीएस-टीएक्स के साथ दो बार और एक बार 50 माइक्रोन एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर (AbDil) के साथ कवरस्लिप धोएं। टीबीएस-टीएक्स टीबीएस, 0.1% ट्राइटन एक्स-100 और 0.05% एनए-एजाइड द्वारा बनाया गया था। अबदिल को टीबीएस-टीएक्स, 2% बीएसए और 0.05% एनए-एजाइड द्वारा बनाया गया था।
  5. प्रत्येक कवरस्लिप को 50 माइक्रोन प्राइमरी एंटी-पीएमएल (AbDil में 1:50 कमजोर पड़ने) / विरोधी सूमो 1 (AbDil में 1:200 कमजोर पड़ने) / मछली के लिए रीचेरी सिग्नल का पता लगाने में मदद करने के लिए 1:200 कमजोर पड़ने में मछली का उपयोग भी किया जा सकता है।
    नोट: मछली ने मचेरी फ्लोरोसेंट सिग्नल को क्वेंस किया, जिससे मछली प्रयोगों में संक्रमित नहीं लोगों से रीचेरी प्लाज्मिड से संक्रमित कोशिकाओं में अंतर करना मुश्किल हो जाता है। रीचेरी एंटीबॉडी का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। वैकल्पिक रूप से, कोई भी ईडीएचएफआर को प्रोटीन युक्त व्यक्त करने वाली स्थिर सेल लाइन बना सकता है।
  6. अनबाउंड प्राइमरी एंटीबॉडी को हटाने के लिए अबदिल के साथ 3 बार कवरस्लिप धोएं।
  7. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं [विरोधी माउस IgG (एच + एल) माध्यमिक एंटीबॉडी पीएमएल और सूमो के लिए एलेक्सा फ्लोर ६४७ के साथ संयुग्मित, विरोधी खरगोश IgG (एच + एल) माध्यमिक एंटीबॉडी mCherry के लिए एलेक्सा फ्लोर ५५५ के साथ संयुग्मित, दोनों पर 1:1000 पर Abdil में कमजोर पड़ने] अंधेरे कमरे में 1 घंटे के लिए ।
  8. टीबीएस-टीएक्स के साथ 3 बार कवरस्लिप धोएं।
  9. लेबल स्लाइड, बढ़ते मीडिया में तनु DAPI 1 μg/mL के DAPI अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए । फिर स्लाइड पर 2 μL पतला DAPI डाल दिया। कवरस्लिप को पलटें और उन्हें DAPI ड्रॉप पर रखें, कवरस्लिप के किनारे से अतिरिक्त तरल पदार्थ की ख्वाहिश करें।
  10. नेल पॉलिश के साथ सील करें, इसे सूखने दें और पानी के साथ कवरस्लिप के ऊपर से कुल्ला करें। इमेजिंग के लिए फ्रीजर में सहेजें।

4. सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरेसेंस

  1. बीज 105 कोशिकाओं पर 12 मिमी व्यास परिपत्र कवर चश्मा 6-अच्छी तरह से थाली में पाली-डी-lysine के साथ लेपित । हेलो-टीआरएफ1 और एमएचरी-ईडीएचएफआर-सिम या एमएचरी-ईडीएचएफआर-सिम म्यूटेंट प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफेक्ट कोशिकाएं और मछली के लिए आगे बढ़ने से पहले 24-48 घंटे की प्रतीक्षा करें। डामरीकरण कदम 3.2 में वर्णित के रूप में ही है।
    नोट: यहां TRF1 GFP के साथ जुड़े नहीं है तो हरे चैनल telomere डीएनए जांच के लिए मुक्त है ।
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और पीबीएस के साथ 4 बार धोएं। आईएफ-फिश के लिए, यहां से प्रोटोकॉल पर आगे बढ़ें और आईएफ (3.8) में माध्यमिक एंटीबॉडी को धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को पुनर्निर्गत करें और पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  3. एक इथेनॉल श्रृंखला (70%, 80%, 90%, 2 मिनट प्रत्येक) में निर्जलित कवर्लिप।
  4. 5 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर 5 माइक्रोन हाइब्रिडाइजेशन समाधान में 488-टेल्सी पीएनए जांच (1:2000 अनुपात) के साथ इनक्यूबेट कवर्लिप्स। संकरण समाधान में 70% डियोनाइज्ड फॉर्ममाइड, 10 एमएम ट्रिस (पीएच 7.4), 0.5% ब्लॉकिंग रिएजेंट होता है। फिर कमरे के तापमान पर एक आर्द्रीकृत कक्ष में रात भर इनक्यूबेट करें।
  5. वॉश बफर (70% फॉर्ममाइड, 10 एमएम ट्रिस) के साथ कवरस्लिप धोएं कमरे के तापमान पर 3 बार के लिए 2 मिनट और इमेजिंग के लिए बढ़ते मीडिया में 1 μg/mL DAPI के साथ माउंट करें।
    नोट: मछली प्रोटोकॉल एक प्रकाशित प्रोटोकॉल33'34है.

5. लाइव इमेजिंग

  1. जब कोशिकाएं इमेजिंग के लिए तैयार होती हैं, तो चुंबकीय कक्षों में माउंट कवरलिप होते हैं जिसमें कोशिकाएं पर्यावरण कक्ष में गर्म चरण पर फिनोल लाल बिना 1 एमएल इमेजिंग माध्यम में बनाए रखी जाती हैं।
  2. माइक्रोस्कोप और पर्यावरण नियंत्रण तंत्र स्थापित करें। छवियों को 100x 1.4 NA उद्देश्य, एक पीजो जेड-ड्राइव, एक इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरा, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित 455, 488, 561, 594 और 647 एनएम लेजर से लैस लेजर के साथ एक कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत किया गया था। सभी लेजर के लिए उत्पादन शक्तियां फाइबर अंत में मापा 20 मिलियनवाट हैं।
  3. न्यूक्लियोप्लाज्म में टेलोमेरेस और डिफ्यूरिली स्थानीयकृत रीचेरी सिग्नल पर उज्ज्वल जीएफपी सिग्नल वाली कोशिकाओं का पता लगाएं। लगभग 20 कोशिकाओं का पता लगाएं, एक्स, वाई, जेड जानकारी के साथ प्रत्येक स्थिति को याद करें और जेड में कुल 8 माइक्रोन के लिए 0.5 माइक्रोन स्पेसिंग के साथ समय चूक इमेजिंग के लिए पैरामीटर सेट करें और जीएफपी और एमएचरी चैनलों दोनों के लिए 2-4 घंटे के लिए 5 मिनट का समय अंतराल करें। 594 एनएम का 30% और 488 एनएम पावर तीव्रता का 50% का उपयोग करें, 200 एमएस और कैमरा गेन 300 के एक्सपोजर समय के साथ।
    नोट: लेजर इकाइयों की उत्पादन शक्ति 20 mW है। उज्ज्वल जीएफपी फोसी बड़े एंकर आकार का संकेत देता है जो संघनित को अधिक आसानी से नाभिकित कर सकता है। रीचेरी सिग्नल की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ कोशिकाओं को ढूंढें क्योंकि चरण जुदाई सेल में सिम एकाग्रता पर निर्भर करता है। बहुत मंद या बहुत उज्ज्वल mCherry संकेत के साथ कोशिकाओं को अलग चरण नहीं हो सकता है । फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए, बहुत अधिक लेजर पावर या बहुत लंबे एक्सपोजर समय का उपयोग न करें।
  4. इमेजिंग शुरू करें और प्री-डाइमराइजेशन के रूप में एक बार लूप लें। इमेजिंग को रोकें, स्टेज पर इमेजिंग चैंबर में 10 माइक्रोन डिमराइजर के 15 माइक्रोन युक्त 0.5 एमएल इमेजिंग मीडिया जोड़ें ताकि अंतिम डिमराइजर एकाग्रता 100 एनएम हो। इमेजिंग फिर से शुरू करें।
  5. जब डाइमाइजेशन को रिवर्स करने के लिए तैयार हो, इमेजिंग को रोकें, तो 100 मिलियन स्टॉक टीएमपी के 2 माइक्रोन युक्त 0.5 एमएल इमेजिंग मीडिया को 100 माइक्रोन टीएम टीएमपी अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मंच पर इमेजिंग चैंबर में जोड़ें। इमेजिंग कोशिकाओं को 1-2 घंटे तक जारी रखें।

6. फिक्स्ड इमेजिंग

  1. लाइव इमेजिंग, स्टेज हीटिंग के रूप में स्थापित एक ही माइक्रोस्कोप की आवश्यकता नहीं है। छवि टेलोमेरे मछली के लिए 488 एनएम, mCherry IF के लिए 561 एनएम, और पीएमएल या SUMO IF के लिए 647 एनएम का उपयोग करें।
    नोट: यदि एक mCherry एंटीबॉडी का उपयोग नहीं कर, बस सीधे छवि mCherry प्रोटीन लेकिन मछली में शमन की वजह से शायद मंद संकेत ।  अभी भी 561 एनएम के बजाय 594 एनएम लेजर छवि mCherry करने के लिए उपयोग करने के लिए संकेत खून से बचने के लिए Cy5 के माध्यम से mCherry।
  2. संक्रमित कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए रेड सिग्नल (रीचेरी या रीचेरी आईएफ) के साथ लगभग 30-50 कोशिकाओं का पता लगाएं।
  3. छवियों को अधिक संकेतों को इकट्ठा करने के लिए जेड में कुल 8 माइक्रोन के लिए 0.3 माइक्रोन स्पेसिंग के साथ लिया गया था। 647 एनएम का 80%, 561 एनएम का 80% और 488 एनएम पावर तीव्रता का 70%, 600 एमएस और कैमरा गेन 300 के एक्सपोजर टाइम के साथ उपयोग करें।

7. प्रक्रिया समय चूक छवियां

  1. टेलोमेरेस के लिए बाइनरी को परिभाषित करें
    सभी समय और जेड-स्टैक जानकारी के साथ एक सेल चुनें, केवल जीएफपी चैनल चुनें और सीमा को परिभाषित करके एक बाइनरी लेयर बनाएं। दहलीज के निचले और ऊपरी मूल्यों को समायोजित करें और "चिकनी", "स्वच्छ" और "फिल होल" जैसे कार्यों का उपयोग करें ताकि यह देखा जा सके कि सीमा सभी समय बिंदुओं के माध्यम से वांछित वस्तुओं को कितनी अच्छी तरह उठाती है।
  2. घटाना पृष्ठभूमि
    सभी चैनलों का चयन करें, पृष्ठभूमि (सेल से अलग) पर ब्याज के आयत क्षेत्र (आरओआई) को आकर्षित करें। इस आरओआई को पृष्ठभूमि के रूप में परिभाषित करें और फिर पृष्ठभूमि की तीव्रता को घटाएं।
  3. टेलोमेरे बाइनरी को टेलोमेरे तीव्रता से लिंक करें
    टेलोमेरे बाइनरी चुनें और बाइनरी वस्तुओं में जीएफपी तीव्रता की गणना के लिए इसे जीएफपी चैनल से टेलोमेरे तीव्रता के रूप में लिंक करें।
  4. समय के साथ टेलोमेरे संख्या और तीव्रता की गणना करें
    निर्दिष्ट करें कि कौन सी जानकारी निर्यात की जानी है, जैसे समय, ऑब्जेक्ट आईडी, मतलब तीव्रता, राशि तीव्रता, और निर्यात डेटा। निर्यात की गई तालिका को पढ़ने के लिए फिगर प्लॉटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और टेलोमेरे संख्या और टेलोमेरे तीव्रता के आंकड़े उत्पन्न करें (प्रत्येक टेलोमेरे में मात्रा पर तीव्रता को संक्षेप में प्रस्तुत करें और फिर समय के साथ एक सेल में सभी टेलोमेरेस पर औसत करें)।

8. प्रक्रिया फिक्स्ड सेल छवियां

  1. एपीबी के लिए बाइनरी को परिभाषित करें
    561nm चैनल में सिग्नल की तलाश करके विश्लेषण के लिए संक्रमित कोशिकाओं का चयन करें। 7.1 में प्रक्रिया के बाद, क्रमशः टेलोमेरेस और पीएमएल निकायों या सुमो के लिए बाइनरी उत्पन्न करने के लिए जीएफपी (टेलोमेरे डीएनए फिश) और Cy5 (पीएमएल या सुमो आईएफ) चैनल दोनों में सीमा को परिभाषित करें। जीएफपी और Cy5 बाइनरी परतों को मर्ज करें और कणों वाले एक नई परत बनाएं जिसमें टेलोमेरेस पर पीएमएल शरीर के सह-स्थानीयकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए जीएफपी और Cy5 सिग्नल दोनों हैं, इस प्रकार एपीबी।
  2. एपीबी/सुमो संख्या और तीव्रता की गणना करें
    7.2 के बाद छवि पृष्ठभूमि घटाना। 7.3 के बाद Cy5 चैनल के लिए APB/SUMO बाइनरी परत लिंक करें। एपीबी/सूमो संख्या और तीव्रता की गणना करें। निर्यात और भूखंड डेटा 7.4 के बाद।

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Representative Results

टेलोमेरे डीएनए फिश और सूमो प्रोटीन द्वारा पहचाने गए सूमो के टेलोमेरिक स्थानीयकरण की प्रतिनिधि छवियां यदि चित्र 2में दिखाई जाती हैं । सिम भर्ती के साथ कोशिकाओं को समृद्ध SUMO1 और SUMO 2/3 telomeres पर सिम उत्परिवर्ती भर्ती के साथ कोशिकाओं की तुलना में । यह इंगित करता है कि टेलोमेरेस पर सिम डिमराइजेशन-प्रेरित सूमो संवर्धन सुमो-सिम इंटरैक्शन पर निर्भर करता है।

वीडियो 1 में 1 वीडियोमें दिखाया गया है , डिमराइजेशन के बाद TRF1 और सिम की एक प्रतिनिधि समय चूक फिल्म दिखाई गई है । चार समय बिंदुओं पर स्नैपशॉट चित्रा 3Aमें दिखाए गए हैं । सिम को सफलतापूर्वक टेलोमेरेस में भर्ती किया गया था और सिम और TRF1 फोसी दोनों बड़े और उज्जवल हो गए, जैसा कि तरल बूंद गठन और विकास(चित्रा 1B)के लिए भविष्यवाणी की गई थी। इसके अलावा, टीआरएफ 1 फोसी का संलयन देखा गया(चित्रा 3 बी),जिसके कारण टेलोमेरे क्लस्टरिंग कम टेलोमेरे संख्या(चित्रा 3E)में दिखाया गया है और समय के साथ टेलोमेरे तीव्रता में वृद्धि हुई(चित्रा 3 डी)। इसके विपरीत, सिम उत्परिवर्ती को डामरीकरण के बाद टेलोमेरेस में भर्ती किया गया था, लेकिन किसी भी बूंद गठन या टेलोमेरे क्लस्टरिंग को प्रेरित नहीं किया, क्योंकि टेलोमेरे तीव्रता नहीं बढ़ी और टेलोमेरे संख्या कम नहीं हुई(चित्र 3 सी,डी, ई, वीडियो 2)। यह इंगित करता है कि चरण जुदाई और इस प्रकार टेलोमेरे क्लस्टरिंग सूमो-सिम इंटरैक्शन द्वारा संचालित है।

अतिरिक्त मुक्त टीएमपी जोड़ने के बाद चरण पृथक्करण और टेलोमेरे क्लस्टरिंग के उलट वीडियो 3में दिखाया गया है । चार समय बिंदुओं पर स्नैपशॉट चित्रा 4Aमें दिखाए गए हैं । टेलोमेरेस के अनुमानित संघनित विघटन और डी-क्लस्टरिंग से सहमत होते हुए, टेलोमेरे संख्या में वृद्धि हुई, और समय के साथ टेलोमेरे तीव्रता में कमी आई(चित्र 4 बी,सी)।

टेलोमेरे डीएनए फिश और पीएमएल प्रोटीन द्वारा पहचाने गए एपीबी की प्रतिनिधि छवियां यदि चित्र 5में दिखाई जाती हैं । सिम भर्ती के साथ कोशिकाओं सिम उत्परिवर्ती भर्ती के साथ कोशिकाओं की तुलना में अधिक APBs है, dimerization प्रेरित संघनित सुझाव वास्तव में APBs हैं ।

यहां के आंकड़े प्रतिनिधि छवियों को दिखाते हैं । अधिक कोशिकाओं के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, कृपया झांग एट का उल्लेख करें । अल. , 202011.

Figure 1
चित्र 1:क्रोमेटिन से जुड़े संघननों को प्रेरित करने के लिए रासायनिक डामरीकरण। (ए)डिमेराइजेशन योजनाबद्ध: डिमेराइजर में दो लिंक्ड लिगांड, टीएमपी और हेलो होते हैं जो क्रमशः ईएचडीएफआर और हेलोएंजाइम के साथ बातचीत करते हैं। प्रोटीन को अलग करने का चरण म्हेरी और ईडीएचएफआर से जुड़ा हुआ है, और गुणसूत्र एंकर प्रोटीन हेलो और जीएफपी से जुड़ा हुआ है। (ख)डिमराइजर (ऊपर-बाएं नाभिक) को जोड़ने से पहले, अधिकांश गुणसूत्र लंगर प्रोटीन (हरे वर्ग) गुणसूत्रों के लिए स्थानीयकृत होते हैं और न्यूकोप्लाज्म में थोड़ी मात्रा में एंकर प्रोटीन को फैलाया जाता है। चरण को अलग करने वाले प्रोटीन (बैंगनी तारे) और चरण अलग करने वाले भागीदारों (प्रोटीन जो प्रोटीन, लाल त्रिकोण को अलग करने वाले चरण के साथ गाढ़ा होगा) को न्यूकोप्लाज्म में फैलाया जाता है। डाइमाइजर (शीर्ष-दाएं नाभिक) जोड़ने के बाद, प्रोटीन को अलग करने वाले चरण को गुणसूत्रों पर और न्यूक्लियोप्लाज्म में एंकर प्रोटीन में डिमराइज्ड किया जाता है। न्यूक्लियोप्लाज्म में प्रोटीन को अलग करने वाले कुछ अतिरिक्त चरण हो सकते हैं, जो एंकर प्रोटीन की सापेक्ष एकाग्रता, प्रोटीन को अलग करने वाले चरण और उपयोग किए जाने वाले डिमराइजर पर निर्भर करता है। डाइमाइजेशन (बॉटम-राइट न्यूक्लियस) के बाद, एंकर में प्रोटीन को अलग करने वाले चरण की स्थानीय एकाग्रता में वृद्धि चरण जुदाई और क्रोमेटिन से जुड़े संघननों के गठन की ओर ले जाती है। चरण को अलग करने वाले भागीदारों को प्रोटीन को अलग करने वाले ईडीएचएफआर-फ्यूज्ड चरण के साथ सह-संघनन के कारण लंगर में समृद्ध किया जाता है। एंकर प्रोटीन जो सीधे क्रोमेटिन से बंधे नहीं होते हैं, प्रोटीन को अलग करने के चरण में डामरीकरण के कारण लंगर में समृद्ध किया जा सकता है। ईडीएचएफआर बाध्यकारी (नीचे-बाएं नाभिक) के लिए डिमराइजर के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए अतिरिक्त मुफ्त टीएमपी जोड़ने के बाद, प्रोटीन को अलग करने वाला चरण क्रोमेटिन से जारी किया जाता है और संघनन भंग हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:SUMO को सिम को डाइमेराइजर्स के साथ टेलोमेरेस में भर्ती करने के बाद समृद्ध किया जाता है।(ए)इस प्रयोग में डिमेराइजेशन योजनाबद्ध: सिम (या सिम उत्परिवर्ती) को एमसीएचरी और ईडीएचएफआर से जोड़ा जाता है, और टीआरएफ1 हेलो और जीएफपी के लिए जुड़ा हुआ है। (ख)सिम भर्ती करने के बाद टेलोमेरे डीएनए फिश और सुमो1 आईएफ के लिए एक प्रतिनिधि प्रकोष्ठ । नीचे बाइनरी लेयर है जो टेलोमेरेस, सुमो 1 और कोलोकैलाइज्ड सुमो 1 और टेलोमेरे डीएनए फोसी की संख्या की पहचान करता है। स्केल बार: 5 माइक्रोन(C)सिम उत्परिवर्ती की भर्ती के बाद टेलोमेरे डीएनए फिश और SUMO1 IF के लिए एक प्रतिनिधि सेल। नीचे कोलोकैलाइज्ड सूमो1 और टेलोमेरे डीएनए फोसी की संख्या की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली छवियों की बाइनरी परत है। स्केल बार: 5 माइक्रोन(D)सिम की भर्ती के बाद टेलोमेरे डीएनए फिश और SUMO2/3 के लिए एक प्रतिनिधि सेल । नीचे बाइनरी लेयर टेलोमेरेस, SUMO2/3 की पहचान है, और कोलोकैलाइज्ड SUMO2/3 और टेलोमेरे डीएनए फोसी की संख्या है। स्केल बार: 5 माइक्रोन (ई)सिम उत्परिवर्ती की भर्ती के बाद टेलोमेरे डीएनए फिश और SUMO2/3 के लिए एक प्रतिनिधि सेल । नीचे कोलोलाइज्ड सूमो 2/3 और टेलोमेरे डीएनए फोसी की संख्या की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली छवियों की बाइनरी परत है। स्केल बार: 5 माइक्रोन करें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3:डिमेराइजेशन-प्रेरित चरण सेपरेशन टेलोमेरे क्लस्टरिंग ड्राइव करता है। (ए)टीआरएफ1-जीएफपी और सिम-एमएचरी के स्नैपशॉट्स से पहले और बाद में 100 एनएम डिमराइजर (अंतिम एकाग्रता) जोड़ते हैं। नीचे टीआरएफ1-जीएफपी से पहचानी जाने वाली टेलोमेरे बाइनरी लेयर है। स्केल बार: 5 माइक्रोन (ख)टेलोमेरेस को सिम भर्ती करने के बाद एक फ्यूजन इवेंट। स्केल बार: 2 माइक्रोन। समय अंतराल: 5 मिनट(C)TRF1-GFP और सिम उत्परिवर्ती-mCherry के स्नैपशॉट से पहले और १०० एनएम dimerizer (अंतिम एकाग्रता) जोड़ने के बाद । नीचे टीआरएफ1-जीएफपी से पहचानी जाने वाली टेलोमेरे बाइनरी लेयर है। स्केल बार: 5 माइक्रोन(डी)औसत टेलोमेरे तीव्रता (प्रत्येक टेलोमेरे में मात्रा पर तीव्रता को संक्षेप में प्रस्तुत करें और फिर सिम की भर्ती के बाद समय के साथ एक सेल में सभी टेलोमेरेस पर औसत (ग्रीन, चित्रा 3Aमें सेल के लिए) और सिम उत्परिवर्ती (नीला, चित्रा 3 सीमें सेल के लिए)। (ई)सिम की भर्ती के बाद समय के साथ टेलोमेरे नंबर (ग्रीन, फिगर 3 एमें सेल के लिए) और सिम उत्परिवर्ती (नीला, चित्रा 3 सीमें सेल के लिए) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: संघनन और टेलोमेरे क्लस्टरिंग के उलट। (A)3 घंटे के लिए गठित संघनित के साथ कोशिकाओं में 100 माइक्रोनएम टीएमपी (अंतिम एकाग्रता) जोड़ने के बाद टीआरएफ1-जीएफपी और सिम-एमएचरी के स्नैपशॉट। नीचे टीआरएफ1-जीएफपी से पहचानी जाने वाली टेलोमेरे बाइनरी लेयर है। स्केल बार: 5 माइक्रोन(बी)औसत टेलोमेरे तीव्रता (प्रत्येक टेलोमेरे में मात्रा पर तीव्रता को संक्षेप में प्रस्तुत करें और फिर एक सेल में सभी टेलोमेरेस पर औसत) चित्रा 4 एमें सेल के लिए समय के साथ। (ग) चित्रा 4एमें सेल के लिए समय के साथ टेलोमेरे संख्या । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:डामरीकरण-प्रेरित संघनन एपीबी हैं। (A)सिम की भर्ती के बाद टेलोमेरे डीएनए फिश और पीएमएल आईएफ के लिए एक प्रतिनिधि सेल । नीचे बाइनरी लेयर टेलोमेरेस, पीएमएल निकायों और कोलोकैलाइज्ड पीएमएल और टेलोमेरे डीएनए फोसी की संख्या, यानी एपीबी की संख्या की पहचान है। स्केल बार: 5 माइक्रोन(ख)सिम उत्परिवर्ती की भर्ती के बाद टेलोमेरे डीएनए फिश और पीएमएल आईएफ के लिए एक प्रतिनिधि सेल। नीचे कोलोलाइज्ड पीएमएल और टेलोमेरे डीएनए फोसी की संख्या यानी एपीबी की संख्या की पहचान करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली छवियों की बाइनरी लेयर है । स्केल बार: 5 माइक्रोन करें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1: टेलीमेरेस के लिए डिमराइजर्स के साथ सिम की भर्ती चरण जुदाई और टेलोमेरे क्लस्टरिंग चलाता है। सिम-रीचरी, टीआरएफ1-जीएफपी की लाइव इमेजिंग, और 100 एनएम डिमराइजर (अंतिम एकाग्रता) जोड़ने से पहले और बाद में चैनलों को मर्ज करें। स्केल बार: 5 माइक्रोन। समय अंतराल: 5 मिनट। समय के रूप में दिखाया गया है । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 2: सिम उत्परिवर्ती की भर्ती चरण जुदाई और टेलोमेरे क्लस्टरिंग ड्राइव नहीं कर सकते । सिम म्यूटेंट-रीचरी, टीआरएफ1-जीएफपी की लाइव इमेजिंग और 100 एनएम डिमराइजर (अंतिम एकाग्रता) जोड़ने से पहले और बाद में चैनलों को मर्ज करें। स्केल बार: 5 माइक्रोन। समय अंतराल: 5 मिनट। समय के रूप में दिखाया गया है । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 3: संघनन और टेलोमेरे क्लस्टरिंग के उलट। सिम-एमएचरी, टीआरएफ1-जीएफपी की लाइव इमेजिंग और 3 घंटे के लिए गठित संघनित के साथ कोशिकाओं में 100 माइक्रोन टीएमपी (अंतिम एकाग्रता) जोड़ने के बाद चैनलों को मर्ज करें। स्केल बार: 5 माइक्रोन। समय अंतराल: 5 मिनट। समय के रूप में दिखाया गया है । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल ने रासायनिक डामरीकरण प्रणाली के साथ टेलोमेरेस पर संघनन के गठन और विघटन का प्रदर्शन किया। चरण जुदाई और बूंद-संलयन-प्रेरित टेलोमेरे क्लस्टरिंग के काइनेटिक्स लाइव इमेजिंग के साथ निगरानी की जाती है। संघनित स्थानीयकरण और संरचना डीएनए मछली और प्रोटीन आईएफ के साथ निर्धारित की जाती है।

इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम हैं । सबसे पहले प्रोटीन और डाइमेजर एकाग्रता का निर्धारण करना है। जीनोमिक लोकस में स्थानीय चरण पृथक्करण को प्रेरित करने में सफलता चरण पृथक्करण के लिए महत्वपूर्ण एकाग्रता से ऊपर प्रोटीन को अलग करने वाले चरण की स्थानीय एकाग्रता में वृद्धि पर निर्भर करती है (चित्रा 1B). प्रोटीन को अलग करने वाले चरण की वैश्विक एकाग्रता को काफी अधिक होना चाहिए ताकि स्थानीय स्तर पर पर्याप्त प्रोटीन केंद्रित हो सके । प्रोटीन को अलग करने वाले चरण की एकाग्रता बहुत अधिक नहीं हो सकती है ताकि वैश्विक चरण अलगाव हुआ हो या आसानी से प्रेरित हो सके।  एंकर डीएनए लंबाई (या संशोधित क्रोमेटिन का आकार जो एंकर प्रोटीन बांधता है) और हेलो-फ्यूज्ड एंकर प्रोटीन की एकाग्रता अधिकतम डाइमराइजेशन दक्षता पर नाभिक केंद्र के आकार को निर्धारित करती है। बड़ा लंगर आकार आसान यह संघनित नाभिक के लिए है। डाइमेराइजेशन एफिशिएंसी एंकर प्रोटीन की मात्रा के सापेक्ष डाइमेजराइजर की मात्रा से प्रभावित होती है। बहुत कम dimerizers सभी उपलब्ध लंगर प्रोटीन पर कब्जा नहीं कर सकते, जबकि बहुत सारे dimerizers गैर में परिणाम-अतिरिक्त dimerizers के बजाय लंगर प्रोटीन पर लोगों के लिए eDHFR के उत्पादक बाध्यकारी । Dimerizer एकाग्रता, लंगर डीएनए लंबाई और हेलो-फ्यूज्ड एंकर प्रोटीन की एकाग्रता के साथ, स्थानीय चरण जुदाई नाभिक के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण एकाग्रता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उन मापदंडों (एंकर डीएनए लंबाई, एंकर प्रोटीन एकाग्रता, चरण जुदाई प्रोटीन एकाग्रता और डिमराइजर एकाग्रता) को अलग करने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण का उपयोग बहुआयामी चरण आरेख को मैप करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यदि ब्याज मानचित्रण चरण आरेख में नहीं है, लेकिन क्रोमेटिन से जुड़े-संघननों का गठन करना जैसे कि यहां प्रदर्शित किया गया है, तो प्रोटोकॉल 2.3 में निर्धारित अधिकतम डिमेराइजेशन के लिए डिमराइजर एकाग्रता के साथ छवि के लिए उज्ज्वल हेलो-जीएफपी सिग्नल (बड़े एंकर आकार) और कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं को उज्ज्वल हेलो-जीएफपी सिग्नल (बड़े एंकर आकार) और कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं को चुनना बहुत आसान है। दूसरा महत्वपूर्ण कदम लाइव इमेजिंग में फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए है। वैश्विक चरण जुदाई से अलग जहां बूंदों (उज्ज्वल mCherry foci लेबलिंग चरण प्रोटीन को अलग) चरण जुदाई के बाद उभरने होगा, जीनोमिक स्थानों पर स्थानीय संघनन आसानी से mCherry foci की उपस्थिति को पहचानने से नहीं देखा जा सकता है । इसका कारण यह है कि अकेले प्रोटीन की भर्ती, चरण जुदाई के बिना, जीनोमिक लोकी के लिए mCherry स्थानीय foci के गठन में परिणाम होगा । चरण जुदाई भर्ती के बाद होता है, तो mCherry foci प्रारंभिक भर्ती के बाद बड़ा और उज्जवल बनने के लिए जारी है । चरण जुदाई-प्रेरित संवर्धन जीएफपी चैनल (एंकर प्रोटीन) में भी हो सकता है, जो चरण पृथक्करण प्रोटीन के लिए एंकर प्रोटीन के डामरीकरण के कारण हो सकता है। इसलिए, चरण पृथक्करण का न्याय करने के लिए फोसी की उपस्थिति के बजाय समय के साथ फोसी के भौतिक गुणों (आकार और तीव्रता) के परिवर्तन का उपयोग किया जाना चाहिए। हालांकि डाइमराइजेशन या चरण जुदाई-प्रेरित संवर्धन mCherry (शिकार प्रोटीन) foci, GFP (एंकर प्रोटीन) foci के संवर्धन में अंतर करना मुश्किल हो सकता है केवल तभी होता है जब चरण जुदाई होती है (चित्रा 3डी). इसलिए, एंकर प्रोटीन के संवर्धन का उपयोग चरण अलगाव को आसानी से जज करने के लिए किया जा सकता है। इमेजिंग के दौरान उच्च लेजर शक्ति या लंबे एक्सपोजर समय के परिणामस्वरूप फोटोब्लाचिंग से लाइव इमेजिंग से चरण पृथक्करण को जज करना अधिक कठिन हो जाता है और इसलिए इमेजिंग स्थितियों को समायोजित करके जितना संभव हो उतना बचा जाना चाहिए। ध्यान दें कि समय के साथ फोसी तीव्रता और आकार में वृद्धि एलएलपी की विशेषताएं हैं, लेकिन एलएलपी के लिए एकमात्र सबूत के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत मामले में, तरल बूंदों के गठन के लिए सबूत के रूप में बूंद संलयन का उपयोग किया गया था, जो एंकर या कम मोबाइल एंकर की छोटी संख्या के लिए नहीं हो सकता है। बूंद संलयन के बिना, संघनित घटकों के प्रसार और छोटे अणु क्षोभ के प्रति संवेदनशीलता जैसे अन्य तरीकों का उपयोग संघनित गठन की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है8,9,11.

हालांकि यह रासायनिक डिमराइजेशन सिस्टम जीवित कोशिकाओं में चरण पृथक्करण की निगरानी के लिए आवश्यक अस्थायी संकल्प प्रदान करता है, लेकिन इसमें सेलुलर और उपकोशिकीय स्तर पर स्थानिक संकल्प का अभाव है। डाइमेराइजर्स के मॉड्यूलर डिजाइन के लिए धन्यवाद, टीएमपी को फोटोकेज संलग्न करके हल्के-संवेदनशील डाइमेजर बनाना संभव है, जिससे लिंकर फोटोसेंसिटिव या12, 32,35दोनों बन जाता है। विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए एक ही इंजीनियर सेल पृष्ठभूमि के भीतर डाइमराइजर स्विच करके, डामरीकरण के उच्च स्थानिक और लौकिक नियंत्रण, डामरीकरण के उत्क्रमण, या प्रकाश के साथ दोनों प्राप्त किए जा सकते हैं। हम उन प्रकाश-संवेदनशील डिमराइज़र के साथ कल्पना करते हैं, यह उच्च स्थानिक और लौकिक परिशुद्धता के साथ चरण पृथक्करण को नियंत्रित करने में सक्षम होगा। प्रकाश संवेदनशील प्रोटीन36, 37के माध्यम से चरणपृथक्करण को नियंत्रित करने के लिए उपलब्ध ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों की तुलना में, रासायनिक डामरीकरण प्रणाली का एक नुकसान यह है कि यह केवल चरण अलगाव को एक बार रिवर्स कर सकता है। हालांकि, यह प्रणाली निरंतर भर्ती को बनाए रख सकती है और इस प्रकार प्रकाश के बिना चरण अलगाव, जो इसे दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त बनाती है जैसे कि बूंद वृद्धि या चरण अलगाव के सेलुलर परिणामों का पालन करना। इसके अलावा, प्रकाश के बिना कोशिकाओं की आबादी का इलाज करने की क्षमता यह जैव रासायनिक परख के लिए सुविधाजनक बनाता है जैसे कि संघनित संरचना या जीनोम संगठन में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं।

इस विधि को जीनोम पर अन्य स्थानों पर संघनितों को प्रेरित करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। एक बस एक प्रोटीन है कि ब्याज के जीनोमिक स्थान को बांधता है और यह एक लंगर(चित्रा 1B)के रूप में उपयोग करने के लिए हेलो को फ्यूज की पहचान कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, कोई भी इसे CRISPR के साथ जोड़ सकता है और हेलो को dCas9 फ्यूज कर सकता है और ब्याज38के जीनोमिक लोकी में हेलो को एंकर करने के लिए गाइड आरएनए का उपयोग कर सकता है। इसके अलावा, कोई भी हेलो को एक एक्टोपिक डीएनए सरणी (जैसे लैक्ओ) में लंगर कर सकता है जो हेलो को लक्षित प्रोटीन (जैसे लैक्मी) में फ्यूज करके जीनोम में एकीकृत किया गया है। एक तो एक बॉटम अप दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए एक प्रोटीन की क्षमता का आकलन करने के लिए क्रोमेटिन पर स्थानीय रूप से अलग चरण, कैसे अपने चरण जुदाई की क्षमता प्रोटीन truncations, उत्परिवर्तन या पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधनों से प्रभावित होता है, या कैसे संघनित ऐसे क्रोमेटिन संशोधन, प्रतिकृति या प्रतिलेखन के रूप में स्थानीय कार्यों को प्रभावित करता है । संक्षेप में, इस रासायनिक डामरीकरण प्रणाली का उपयोग विभिन्न क्रोमेटिन स्थानों पर संघनन की एक विस्तृत श्रृंखला को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है और यह जांच करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है कि क्रोमेटिन से जुड़े संघननों की सामग्री गुण और रासायनिक संरचना जैव रासायनिक केस के साथ दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग के संयोजन से क्रोमेटिन कार्यों में कैसे योगदान देती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (1K22CA23763201 से एच जेड, GM118510 से डी.M.C.) और चार्ल्स ई. काउफमैन फाउंडेशन द्वारा एच जेड को समर्थन दिया गया था । लेखक पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग के लिए जेसन टोन्स का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning MT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Scientific 28906 Prepare 1% in 1x PBS
6 Well Culture Plate VWR 10861-554
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-101
Anti-mCherry antibody Abcam Ab183628
Anti-PML antibody Santa Cruz sc966
Anti-SUMO1 antibody Abcam Ab32058
Anti-SUMO2/3 antibody Cytoskeleton Asm23
Blocking Reagent Roche 11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP9706100
BTX Tube micro 1.5ML  VWR 89511-258
Circle Cover Slips Thermo Scientific 3350
Confocal microscope  Nikon MQS31000
DAPI Fisher Scientific D1306
Dimethyl Sulphoxide  Sigma-Aldrich 472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10017CV
EMCCD Camera iXon Life  897
Ethanol Fisher Scientific 4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Gibco A4766801
Formamide, Deionized MilliporeSigma 46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
Laser merge module  Nikon NIIMHF47180
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 21083027
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668027
Figure plotting software, MATLAB The MathWorks
Microscope Slide Box Fisher Scientific 34487
Nail Polish Fisher Scientific 50-949-071
Imaging software, NIS-Elements  Nikon
Opti-MEM Reduced Serum Media Gibco 51985091
Parafilm Bemis 13-374-12
PBS 10x, pH 7.4 Fisher Scientific 70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100X Gibco 15140122
Piezo Z-Drive  Physik Instrumente (PI) 91985
Pipet Tips VWR 10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides Fisher Scientific 22-037-246
Poly-D-Lysine solution Sigma-Aldrich A-003-E
Sodium Azide Fisher Scientific BP922I-500
Spinning disk Yokogawa CSU-X1
Square Cover Slips Thermo Scientific 3305
TBS 10x solution Fisher Scientific BP2471500
TelC-Alexa488 PNA Bio F1004
TMP Synthesized by Chenoweth lab Available upon request
TNH Synthesized by Chenoweth lab Available upon request
Tris Solution Fisher Scientific 92-901-00ML
Triton X-100 10% Solution MilliporeSigma 64-846-350ML Prepare 0.5% in 1x PBS
U2Os cell line From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories NC9524612

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References

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जीव विज्ञान अंक 170 संघनित तरल-तरल चरण जुदाई रासायनिक डिमराइजर स्थानीय संघनन टेलोमेरेस पीएमएल परमाणु शरीर
टेलोमेरेस पर रासायनिक डामरीकरण-प्रेरित प्रोटीन संघनित
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Zhao, R., Chenoweth, D. M., Zhang, H. Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres. J. Vis. Exp. (170), e62173, doi:10.3791/62173 (2021).

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