Summary
このプロトコルは、クロマチン上に凝縮物を作製する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを示す。 化学二量体を用いたテロメア上の前骨髄性白血病(PML)核体の形成が実証されている。液滴の成長、溶解、局在化および組成物は、生細胞イメージング、免疫蛍光(IF)および蛍光をその蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)でモニタリングする。
Abstract
クロマチン関連凝縮物は多くの核プロセスに関与しているが、根本的なメカニズムは依然として不可解である。このプロトコルは、テロメア上に凝縮物を作成するための化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを記述する。化学二量体は、それぞれタンパク質に結合できる2つの結合リガンドで構成されています: ハローリガンドからハロエンス酵素への結合とトリメトプリム (TMP) 大 腸菌 ジヒドロホウ酸還元酵素 (eDHFR) それぞれ).Halo酵素をテロメアタンパク質に融合させ、共有化Haloリガンド-酵素結合を介して二量体をテロメアに固定します。TMPとeDHFRの結合は、eDHFR融合相分離タンパク質をテロメアに採用し、凝縮物形成を誘導する。TMP-eDHFR相互作用は非共有化であるため、過剰なフリーTMPを使用してeDHFR結合のための二量体剤と競合することにより結露を逆転させることができる。テロメア上に前骨髄性白血病(PML)核体形成を誘導し、凝縮物の成長、溶解、局在化および組成物を決定する例が示される。この方法は、局所クロマチンに直接結合するタンパク質またはガイドRNAを用いてゲノム遺伝子座に標的とされるdCas9にHaloを融合させることにより、他のゲノム位置で凝縮物を誘導するように容易に適応することができる。生化学的アッセイのための細胞集団における相分離を維持しながら、単一細胞の生画像化に必要な時間分解能を提供することにより、クロマチン関連凝縮物の形成と機能の両方を調査するのに適しています。
Introduction
多くのタンパク質および核酸は、液体-液相分離(LLPS)を受け、生体分子凝縮物に自己集合して細胞1,2の生化学を組織する。クロマチン結合タンパク質のLLPSは、特異的ゲノム遺伝子座に関連する縮合物の形成を導き、様々な局所クロマチン機能3に関与している。例えば、HP1タンパク質のLLPSは、ゲノム4、5、転写因子のLLPSが転写センターを形成して転写センターを形成し、新生mRNAのLLPSおよび多セックスコームタンパク質がヒストン軌跡体を生成してヒストンmRNAの転写および処理を調節するヘテロクロマチンドメインの形成を基礎とする。 しかし、クロマチン関連凝縮物の多くの例が発見されているにもかかわらず、凝縮物形成、調節および機能の基礎的なメカニズムは依然として十分に理解されていない。特に、LLPSを介してすべてのクロマチン関連凝縮物が形成されるわけではないが、生細胞における凝縮物形成の慎重な評価は依然として8,9が必要である。例えば、マウスにおけるHP1タンパク質は、崩壊したポリマー球体10のように生きた細胞およびヘテロクロマチン病巣に液体液滴を形成する弱い能力しか持たなかった。したがって、生細胞におけるクロマチンにデノボ凝縮物を誘導するツールが望ましく、特に、生画像化および生化学的アッセイを使用して、凝縮物の動力学、結果として得られた凝縮物の物理的および化学的特性、および凝縮物形成の細胞の影響を監視することを可能にするものである。
このプロトコルは、クロマチン11 上のタンパク質凝縮物を誘導する化学二量体化システムを報告する(図1A)。二量体は、2つの結合されたタンパク質相互作用リガンドで構成されています:トリメトプリム(TMP)とハロリガンドと、同一受容体に融合したタンパク質を二量体化することができます: エシェリヒア・コリ ・ジヒドロホドロ葉酸還元酵素(eDHFR)と細菌アルキルデハロゲン酵素(Halo酵素)、それぞれ12。HaloリガンドとHalo酵素の相互作用は共有化されており、クロマチン結合タンパク質に融合させてクロマチン結合タンパク質に融合してクロマチンに融合した相分離タンパク質をクロマチンに融合させることで、Halo酵素をアンカーとして使用することができます。初期の募集後、相分離タンパク質の局所濃度の上昇は、相分離に必要な臨界濃度を通過し、したがってアンカーで凝縮物を核とする(図1B)。蛍光タンパク質(例えばmCherryやeGFP)をeDHFRとHaloに融合させることで、蛍光顕微鏡で凝縮物の核形成と成長をリアルタイムで可視化することができます。eDHFRとTMPの相互作用は非共有であるため、過剰な遊離TMPを添加して、eDHFR結合のための二量体剤と競合させることができる。これにより、アンカーから相分離タンパク質が放出され、クロマチン関連凝縮物が溶解します。
我々は、テロメア維持のためのテロメア(ALT)経路の代替長化を用いるテロメア(ALT)経路をテロメア維持13,14に対して、テロメア上のデノボ前骨髄球性白血病(PML)核体形成を誘導するためにこのツールを用いた。 PML核体は、多くの核プロセス15、16に関与する膜のないコンパートメントであり、ALTテロメアに固有に局在してAPBを形成し、ALTテロメア関連PML体17,18に対しては、ADBを形成する。テロメアは、ADB内に集結し、おそらくALT19で相同性指向テロメアDNA合成のための修復テンプレートを提供する。実際、テロメアDNA合成は、アペブで検出されており、ADBはテロメア20,21のDNA修復因子を豊かにする上で重要な役割を果たす。しかし、APBアセンブリとテロメアクラスタリングの基礎となるメカニズムは不明でした。ALT細胞のテロメアタンパク質はユビキチン様修飾(SMO)22によって一意に修飾されるため、多くのAPB成分は相総化部位22、23、24、25および/またはSUMO-を含む 相互作用モチーフ(SIM)26、27およびSUMO-SIM相互作用は相分離を促進する28を駆動し、テロメアの相化はタンパク質およびタンパク質を含むSUMO/SIMの濃縮につながると仮定したこれらのタンパク質間のSUMO-SIM相互作用は、相分離につながります。 3つの相総化サイトと1つのSIMサイトを有するPMLタンパク質を集結したテロメアを集結させてADBを形成し、液体ABの合体がテロメアクラスタリングにつながる。この仮説を検証するために、我々は、化学二量体化システムを用いて、SIMをテロメアに採用して相相化誘導APB形成を模倣した(図2A)11。GFPは、可視化のためにハロエンザイムに融合し、テロメア結合タンパク質TRF1に融合して二量化器をテロメアに固定します。SIMはeDHFRとmCherryに融合しています。凝縮体形成および液滴融合誘発テロメアクラスタリングの動態は、生細胞イメージングに続く。 相分離は、eDHFR結合と競合するために過剰な遊離TMPを添加することによって逆転する。蛍光免疫(IF)および蛍光をその蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)で使用して、凝縮体組成およびテロメリック会合を決定する。SIMを採用すると、テロメアでSUMOが豊かになり、誘導凝縮物にはPMLが含まれているため、ADBです。SUMOと相互作用できないSIM変異体を採用しても、相素体上でのSUMOの充実や相分離の誘導は行わないため、APB結露の基本的な原動力はSUMO-SIM相互作用であることを示しています。この観察に同意すると、TRF2結合因子RAP1に融合したポリスミオポリSIMポリマーも、APB形成29を誘導し得る。相分離が十分なタンパク質が生成される限り、相分離が起こるポリSUMO-polySIM融合システムと比較して、ここで提示される化学二量化アプローチは、オンデマンドで相分離を誘導し、したがって、相分離およびテロメアクラスタリングプロセスの運動を監視するより良い時間分解能を提供する。さらに、この化学二量体化システムは、相分離およびテロメアクラスタリングを誘導する能力を評価するために他のタンパク質の採用を可能にする。例えば、テロメアに採用された無秩序なタンパク質は、APB形成を誘発することなく液滴およびクラスターテロメアを形成することもできるが、テロメアクラスタリングはAPB化学から独立しており、APB液体特性11のみに依存することを示唆している。
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Protocol
1. 過渡細胞株の製造
- 培養U2OSアクセプター細胞は、22 x 22 mmガラスカバーリップ(ライブイメージング用)または直径12mmの円形カバーリップ(IFまたはFISH用)でポリDリジンを6ウェルプレートにコーティングし、成長培地(10%のウシウシ血清およびDMEMのペニシリン・ストレプトマイシン溶液)に達するまで
- トランスフェクション前に1 mLトランスフェクション培地(ペニシリンストレプトマイシン溶液を使用しない成長培地)に置換します。
- トランスフェクションウェルごとに、4 μL のトランスフェクション試薬を 150 μL 減らされた血清培地に加え、ボルテックスを 10 秒間加え、5 分間インキュベートします。
- 各ウェルに対して、ハローコンストラクトプラスミド(Halo-GFP-TRF1またはHalo-TRF1)を加え、eDHFRコンストラクトプラスミド(mCherry-eDHFR-SIMまたはmCherry-eDHFR-SIM変異体)を1:1質量比(0.5 μgのハロー構築物プラスミドを有する0.5 μg eDHFRコンストラクトプラミド)から150μLに低下させた、滴下し、滴下し、滴下した
注:タグは比較的小さく(Halo 33 kD、eDHFR 28 kD、mCherry 30 kD、eGFP 27 kD)、相分離に影響は認められなかった。ただし、ここで使用するSIM変異体などの変異体を使用して、位相の挙動がタグではなく突然変異に敏感であることを確認することをお勧めします。SIMはPIASx28、30からです。SIM配列は、AAAACGATGTAATAatTgacttAACGATCGAATCTAGCAGCGCGAAAAGAGAAGATCCACCGGCTCTAACGTである。SIM変異体は、SIMアミノ酸VIDLをVADA28に変異させることによって生成され、そして配列はAAAAGTCGATGタグコッコッガコッカッカッカッカCGACGACGAATCGAATCTAGCAGCGCGAAGAGAGAGAAGATCCACCGGCTAAAAACGTである。私たちは、追加遺伝子に私たちのプラスミドを堆積しました: #164644 3XHalo-GFP-TRF1;#164646 mCherry-eDHFR-SIM;#164649 mCherry-eDHFR-SIM変異体。 - 150 μLのトランスフェクション試薬 -還元血清培地混合物をDNAを用いた血清培地を150 μL低減し、滴下、ピペット処理で混合し、5分間インキュベートする。
- 300 μLのトランスフェクション試薬-DNA混合物を細胞に加え、滴下してから細胞をインキュベーターに戻します。
- ライブイメージング、免疫蛍光(IF)または蛍光のハイブリダイゼーション(FISH)の24〜48時間を待ちます。
2. テロメアの二量化
- ジメライザーを10 mMでジメチルスルホキシドに溶解し、プラスチック製のマイクロ遠心分離チューブに保存して−80°Cで長期保存します。
注:TMPを直接Halo(TMP-Halo,TH)にリンクしたダイメライザーを使用する代わりに、感光リンカーを有する二量体TMP-NVOC-Halo(TNH)、6-ニトロベラトリルオキシカルボニル(NVOC)を有するTMPとハロリガンドの間に31を使用する。これは、Th(〜20分)よりもTNH(〜5分)が細胞内に拡散するのにかかる時間が短いためです。ここで示す結果はTHを用いても得られる。TNHを使用する場合は、NOVC切断を避けるためにダイメライザーを光に当てないように注意してください。薄暗い赤信号ランプ付きの暗い部屋でTNHを扱い、琥珀色のプラスチックチューブに二量体を保管し、TNHまたは処理されたセルをアルミニウム箔で包みます。DICによる画像化TNHは安全です。 - −80°Cから10 mMの二量体剤のアリコートを取り、イメージング媒体で10μMのストック濃度に希釈し、−20°Cで保管してください。
- 使用準備ができたら、10 μMストック溶液から成長培地(固定イメージング用)またはイメージング媒体中の100 nMの最終作業濃度まで、二量化器を希釈します。生画像化のステージ上で100 nMの二量体(最終濃度)を有する細胞を治療するか、免疫蛍光(IF)および蛍光をその場での蛍光(FISH)で4〜5時間インキュベートします。
注: 使用される二量化剤の濃度は二量化効率に影響を与え、したがって、相分離。最大の二量化効率を可能にする二量化濃度は、細胞の種類とアンカータンパク質濃度に依存するため、異なる実験のために決定する必要があります。1つの簡単な方法は、アンカータンパク質とmCherry-eDHFRを発現する細胞をインキュベートし(相分離タンパク質に融合せず、または非相分離変異体に融合することなく)、アンカーで最高のmCherry強度が達成される二量化剤濃度を同定することです。より体系的なアプローチは、異なる濃度の二量体でアンカーを発現する細胞をインキュベートし、ハロー結合色素強度が高原に入り始める二量体濃度を決定するのに役立つHalo結合色素を用いてインキュベートすることです(すなわち、すべてのハロー融合アンカーは二量体によって占有され、ハロー結合色素のために残っていません)。 - 二量体化を逆にするには、2〜5時間(ライブイメージングの有無にかかわらず)、または所望の液滴サイズが達成されるまで、細胞をインキュベートし、細胞にイメージング培地で希釈した100μMのフリーTMP(最終濃度)を加えます。
3. 免疫蛍光(IF)
- 6ウェルプレートにポリD-リジンでコーティングされた12ミリメートルの直径の円形カバーグラスにシード105 細胞。その後、2つのプラスミド(mCherry-eDHFR-SIMまたはmCherry-eDHFR-SIM変異体を有するHalo-GFP-TRF1)をトランスフェクトし、免疫蛍光に進む前に24〜48時間待ちます。
注: トランスフェクションがより高い表現を得られるまで、1 日以上待ちます。 - 増殖培地で希釈した二量化剤は、最終濃度100nMに達し、希釈した二量体剤を細胞に加え、37°Cで4〜5時間インキュベートする。
注:二量体剤を添加した後(<30分)、相分離が迅速に誘導されます。長いインキュベーションは、より大きなサイズにコアセンの液滴を助けます.ライブイメージングで液滴の成長に続いて、液滴が所望の状態に達するまでにかかる時間を決定するために使用できます。 - 細胞を透過させるために4%ホルムアルデヒドと0.1%トリトンX-100を室温で10分間含有するPBS溶液中の細胞を固定します。PBSで細胞を3回洗浄します。
注:このステップの後、それは一時停止することができ、細胞は最大1週間4°Cで保存することができます。
注意:ホルムアルデヒドは吸入によって有害であり、飲み込むと目、呼吸器系、皮膚を刺激し、癌の危険の可能性があります。個人的な保護具を着用する必要があります、化学発煙フードでのみ使用します。また、使用後は廃容器に入れ、流しに捨てないでください。 - カバーリップを50 μL TBS-Txで2回、50 μL抗体希釈バッファー(AbDil)で1回洗浄します。TBS-TxはTBS、0.1%トリトンX-100および0.05%Na-azideによって作られた。AbDilはTBS-Tx、2%BSAおよび0.05%のナアジドによって作られた。
- 各カバースリップを50 μL一次抗PML(AbDilで1:50希釈)/抗SUMO1(AbDilで1:200希釈)/抗SUMO2/3抗体(AbDilで1:200希釈)を加湿したチャンバーで4°Cでインキュベートする。mCherry抗体は、FISHのmCherryシグナルを検出するのに役立つ(AbDilで1:200希釈)も使用することができます。
注:FISHはmCherry蛍光シグナルをクエンチし、mCherryプラスミドにトランスフェクトされた細胞とFISH実験でトランスフェクトされていない細胞を区別することが困難です。mCherry抗体を使用することが推奨される。あるいは、タンパク質を含むeDHFRを発現する安定した細胞株を作ることができる。 - AbDilでカバーリップを3回洗浄し、非結合の一次抗体を除去します。
- 二次抗体を有するインキュベート細胞 [抗マウス IgG (H+L) PMLおよびSUMO用アレクサ Fluor 647と共役する二次抗体, 抗ウサギ IgG (H+L) 二次抗体 mCherry 用アレクサフルオール 555 と共役, 両方とも 1:1000 で暗いボックスの中で 1 時間
- TBS-Txでカバーリップを3回洗います。
- ラベルスライド、DAPIの最終濃度1 μg/mLに到達するために取り付けメディアでDAPIを希釈します。その後、スライドに2μL希釈DAPIを置きます。カバーリップをひっくり返してDAPIドロップに置き、カバースリップの端から余分な流体を熱望します。
- マニキュアで密封し、蓋の上から水で乾かしてすすいます。イメージング用の冷凍庫に保存します。
4. 蛍光の蛍光の一種化ハイブリダイゼーション(FISH)
- 6ウェルプレートにポリD-リジンでコーティングされた12ミリメートルの直径の円形カバーグラスにシード105 細胞。Halo-TRF1およびmCherry-eDHFR-SIMまたはmCherry-eDHFR-SIM変異体プラスミドを有するトランスフェクト細胞を、FISHに進む前に24-48時間待つ。二量体化ステップは3.2で説明したのと同じです。
注: ここで TRF1 は GFP と融合されないので、緑色のチャネルはテロメア DNA プローブのために解放されます。 - 4%ホルムアルデヒドを室温で10分間固定し、PBSで4回洗浄します。IF-FISHの場合は、IF(3.8)で2次抗体を洗い流した後、ここからIFプロトコルに進み、室温で10分間4%ホルムアルデヒドを有する細胞を再固定し、PBSで3回洗浄します。
- エタノールシリーズでカバーリップを脱水する(70%、80%、90%、2分ずつ)。
- インキュベートカバーリップ 488-telC PNA プローブ (1:2000 比) 5 μL ハイブリダイゼーション溶液で 75 °C で 5 分間。ハイブリダイゼーション溶液は、70%脱イオン化ホルムアミド、10 mMトリス(pH 7.4)、0.5%ブロッキング試薬を含有します。その後、室温で加湿チャンバーで一晩インキュベートします。
- 洗浄バッファー(70%ホルムアミド、10 mMトリス)で2分間室温で2分間洗浄し、1 μg/mL DAPIで取り付け用のメディアをイメージング用に取り付けます。
注: FISH プロトコルは公開プロトコル33'34です。
5. ライブイメージング
- 細胞がイメージングの準備ができたら、環境室の加熱された段階でフェノールレッドなしで細胞を1 mLイメージング媒体に維持した磁気チャンバーにカバースリップを取り付けます。
- 顕微鏡と環境制御装置を設置します。画像は、100x 1.4 NAの目的を持つ回転ディスク共焦点顕微鏡、Piezo Z-Drive、電子乗算電荷結合デバイス(EMCCD)カメラ、およびイメージングソフトウェアによって制御される455、488、561、594および647 nmレーザーを搭載したレーザーマージモジュールで取得されました。すべてのレーザーの出力力は、ファイバの端で20mW測定されます。
- テロメア上の明るいGFP信号を持つ細胞を見つけ、核内で拡散的に局在化したmCherryシグナルを見つけます。約20個のセルを見つけ、x、y、zの情報で各位置を暗記し、Zで合計8 μm、GFPチャンネルとmCherryチャンネルの両方で2〜4時間の5分間隔で0.5 μmの間隔でタイムラプスイメージングのパラメータを設定します。594 nm の 30% と 488 nm の電力強度の 50% を使用し、露出時間は 200 ミリ秒、カメラゲインは 300 です。
メモ:レーザーユニットの出力電力は20mWです。明るいGFP病巣は、凝縮物をより容易に核とすることができるより大きなアンカーサイズを示す。相分離は細胞内のSIM濃度に依存するため、mCherryシグナルの広い範囲を有する細胞を見つける。薄暗すぎる、または明るいmCherry信号を持つセルは、位相分離しない場合があります。光の消光を避けるために、あまりにも多くのレーザーパワーや長時間の露光時間を使用しないでください。 - イメージングを開始し、事前二量化として1回限りのループを取ります。一時停止イメージングは、10μMのダイメライザーの15 μLを含む0.5 mLイメージングメディアをステージ上のイメージングチャンバに加え、最終的な二量体濃度が100nMになるようにします。イメージングを再開します。
- 二量体化を逆にする準備ができたら、イメージングを一時停止し、100 mMストックTMPの2 μLを含む0.5 mLイメージングメディアをステージ上のイメージングチャンバーに追加して、100 μM TMP最終濃度を得ます。細胞のイメージングを1〜2時間継続します。
6. 固定画像
- ライブイメージングと同じ顕微鏡を設置し、ステージ加熱は必要ありません。488 nm を使用してテロメアフィッシュをイメージし、mCherry IF の場合は 561 nm、PML または SUMO IF の場合は 647 nm を使用します。
注:mCherry抗体を使用していない場合は、mCherryタンパク質を直接画像化するだけですが、FISHの消光のためにシグナルが薄暗いかもしれません。 それでも594 nmレーザーではなく561 nmを使用して、cy5からmCherryへの信号ブリードスルーを避けるためにmCherryをイメージします。 - トランスフェクトされた細胞を選択するには、赤信号(mCherryまたはmCherry IF)で約30〜50個の細胞を見つけます。
- 画像は、より多くの信号を収集するためにZで合計8 μmの0.3 μm間隔で撮影されました。647 nm の 80%、561 nm の 80%、488 nm の電力強度の 70% を使用し、露出時間は 600 ミリ秒、カメラゲインは 300 です。
7. タイムラプス画像の処理
- テロメアのバイナリを定義する
すべての時間と z スタック情報を含む 1 つのセルを選択し、GFP チャネルのみを選択し、しきい値を定義してバイナリ レイヤーを作成します。しきい値の下限値と上限値を調整し、「スムーズ」、「クリーン」、「穴埋め」などの機能を使用して、しきい値がすべての時間ポイントを通して目的のオブジェクトをどれだけうまく取り込むかを確認します。 - 背景を減算する
すべてのチャンネルを選択し、(セルの脇で)背景に四角形の関心領域(ROI)を描画します。この ROI を背景として定義し、背景の強度を減算します。 - テロメアバイナリをテロメア強度にリンク
テロメアバイナリを選択し、それをGFPチャンネルにリンクして、二項強度としてバイナリオブジェクトのGFP強度を計算します。 - テロメア数と強度を時間の経過とともに計算する
時間、オブジェクト ID、平均強度、合計強度、エクスポート データなど、エクスポートする情報を指定します。図プロットソフトウェアを使用して、エクスポートされたテーブルを読み取り、テロメア数とテロメア強度(各テロメアの体積の強度を要約し、セル内のすべてのテロメアを平均化する)の数値を時間の経過とともに生成します。
8. 固定セル画像の処理
- ADB のバイナリを定義する
561nmチャネルのシグナルを探すことで、分析用トランスフェクト細胞を選択します。7.1の手順に従って、それぞれテロメアおよびPML体またはSUMOのバイナリを生成するために、GFP(テロメアDNA FISH)およびCy5(PMLまたはSUMO IF)チャネルの両方に閾値を定義します。GFP と Cy5 バイナリ レイヤーをマージし、両方の GFP と Cy5 信号を持つパーティクルを含む新しいレイヤーを作成し、テロメア上の PML ボディの共局在化を表します。 - APB/SUMO の数と強度を計算します。
7.2の後に続く画像の背景を減算します。7.3 に続く Cy5 チャネルに APB/SUMO バイナリ レイヤーをリンクします。APB/SUMO の数と強度を計算します。7.4に続くデータをエクスポートし、プロットします。
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Representative Results
テロメアDNA FISHおよびSUMOタンパク質IFによって同定されたSUMOのテロメラ局在化の代表的な画像を 図2に示す。SIM採用を有する細胞は、SIM変異体採用を有する細胞と比較して、テロメア上のSUMO1およびSUMO 2/3を豊かにした。これは、SIM二量体化誘導によるテロメアのSUMO濃縮がSUMO-SIM相互作用に依存することを示している。
二量体化後のTRF1とSIMの代表的なタイムラプス映画を ビデオ1に示します。4 つの時点のスナップショットを 図 3Aに示します。SIMはテロメアに採用され、液滴の形成と成長が予測されるように、SIMとTRF1の両方の病巣が大きくなり、明るくなりました(図1B)。また、TRF1病巣の融合が観察された(図3B)、テロメア数の減少(図3E)に示すようにテロメアクラスタリングが行われ、経時にテロメア強度が増加した(図3D)。対照的に、SIM変異体は二量体化後にテロメアに採用されたが、テロメア強度が増加せず、テロメア数が減少しなかないように、液滴形成またはテロメアクラスタリングを誘導しなかった(図3C、D、E、ビデオ2)。これは、相分離とテロメアクラスタリングがSUMO-SIM相互作用によって駆動されることを示しています。
過剰なフリーTMPを追加した後の相分離とテロメアクラスタリングの逆転をビデオ3に示します。4 つの時点のスナップショットを図 4Aに示します。テロメアの凝縮物溶解と脱クラスタリングの予測に同意すると、テロメア数が増加し、テロメア強度が時間の経過とともに減少した(図4B、C)。
テロメアDNA FISHおよびPMLタンパク質IFによって同定されたアプブの代表的な画像を 図5に示す。SIMを募集した細胞は、SIM変異体をリクルートした細胞よりも多くのアプブを有し、二量体化誘導凝縮物が実際にADBであることを示唆している。
図は代表的な画像です。より多くのセルを使用した統計解析については、Zhang et を参照してください。al., 202011.
図1:クロマチン関連縮合物を誘導する化学二量体化(A)二量体化回路図:二量体化は、それぞれeDHFRおよびハロエンザイムと相互作用する2つの結合リガンド、TMPおよびHaloからなる。相分離タンパク質はmCherryとeDHFRに融合し、染色体アンカータンパク質はHaloとGFPに融合します。(B)二量体(左上核)を添加する前に、染色体アンカータンパク質(緑色の正方形)の大部分は染色体に局在し、少量のアンカータンパク質が核内に拡散して局在する。リクルートされる位相分離タンパク質(紫色の星)および相分離パートナー(タンパク質、赤色三角形の位相分離と凝縮するタンパク質)は、核内に拡散して局在する。二量体(右上核)を添加した後、相分離タンパク質は染色体および核細胞質のアンカータンパク質に二量化される。アンカータンパク質の相対的な濃度、相分離タンパク質および使用される二量体剤に応じて、核内タンパク質を分離する過剰な相が存在する可能性があります。二量体化(右下核)後、アンカーでの相分離タンパク質の局所濃度の増加は、クロマチン関連凝縮物の相分離および形成につながります。相分離パートナーは、eDHFR融合相分離タンパク質との共縮合のためにアンカーで濃縮されます。クロマチンに直接結合していないアンカータンパク質は、相分離タンパク質への二量体化のためにアンカーで濃縮することができます。過剰な遊離TMPを添加してeDHFR結合(左下核)の二量体と競合した後、クロマチンから分離タンパク質を分離する相分離蛋白質が溶解して分解される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:SUMOは、二量体を用いたテロメアにSIMを採用した後に豊かになり、この実験ではSIM(またはSIM変異体)がmCherryとeDHFRに融合し、TRF1がHaloとGFPに融合している。(B) SIM募集後のテロメアDNAフィッシュおよびSUMO1 IFの代表細胞。底部は、テロメア、SUMO1および共局化したSUMO1およびテロメアDNA病巣の数を識別する二項層である。スケールバー:5μm(C)SIM変異体をリクルートした後のテロメアDNA FISHおよびSUMO1 IFの代表細胞。下部には、共局化したSUMO1およびテロメアDNA病巣の数を識別するために使用される画像のバイナリ層があります。スケールバー:5μm(D)SIMを募集した後のテロメアDNA FISHおよびSUMO2/3 IFの代表細胞。下部には、テロメアを識別するバイナリ層、SUMO2/3、および共局化したSUMO2/3およびテロメアDNA病巣の数があります。スケールバー:5μm(E)SIM変異体をリクルートした後のテロメアDNA FISHおよびSUMO2/3 IFの代表細胞。下部には、共局化したSUMO2/3およびテロメアDNA病巣の数を識別するために使用される画像のバイナリ層があります。スケールバー:5 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:二量体化誘導相分離はテロメアクラスタリングを駆動する(A)100nMダイメライザーを添加する前後のTRF1-GFPおよびSIM-mCherryのスナップショット(最終濃度)。下部には、TRF1-GFP から識別されたテロメアバイナリ層があります。スケールバー:5μm(B)テロメアにSIMを募集した後の融合イベント。スケールバー:2 μm。時間間隔:5分(C)TRF1-GFPおよびSIM変異体mCherryのスナップショットを100 nMダイメライザー(最終濃度)を加える前後に。下部には、TRF1-GFP から識別されたテロメアバイナリ層があります。スケールバー: 5 μm(D) 平均テロメア強度(各テロメアの体積の強度を要約し、その後、細胞内のすべてのテロメアにわたって平均値)SIM(図3Aのセルの緑)およびSIM変異体(図3Cのセルの場合は青)。(E) SIM (図 3A のセルの緑色) および SIM 変異体 (図 3Cのセルの場合は青) を採用した後の期間の経過にとらえたテロメア数。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: 結露とテロメアクラスタリングの逆転(A)凝縮物が3時間形成された細胞に100 μM TMP(最終濃度)を加えた後のTRF1-GFPおよびSIM-mCherryのスナップショット。下部には、TRF1-GFP から識別されたテロメアバイナリ層があります。スケールバー: 5 μm(B) 平均テロメア強度 (各テロメアの体積に対する強度を要約し、次に細胞内のすべてのテロメアにわたって平均値) の時間経過に従って図 4A.図4Aの(C)テロメア数の経時の細胞数。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:二量体化誘導凝縮物は、APBである。 下部には、テロメア、PML体、共局性PMLおよびテロメアDNA病巣の数、すなわちアプブの数を識別するバイナリ層があります。スケールバー:5μm(B)SIM変異体をリクルートした後のテロメアDNA FISHおよびPML IFの代表細胞。下部には、共局型PMLおよびテロメアDNA病巣の数、すなわち、アプブの数を識別するために使用される画像のバイナリ層があります。スケールバー:5 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:テロメアに二量体を使用してSIMを募集することは、相分離とテロメアクラスタリングを促進します。 SIM-mCherry、TRF1-GFP、および100 nMダイメライザー(最終濃度)を追加する前と後の結合チャネルのライブイメージング。スケールバー:5 μm。時間間隔:5分図に示す時間。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
ビデオ2:SIM変異体を採用することは、相分離およびテロメアクラスタリングを駆動することはできません。 SIM変異体-mCherry、TRF1-GFPのライブイメージング、および100 nMダイメライザー(最終濃度)を添加する前後の結合チャネル。スケールバー:5 μm。時間間隔:5分図に示す時間。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
ビデオ3:凝縮とテロメアクラスタリングの逆転。 3時間の縮合物を形成した細胞に100 μM TMP(最終濃度)を加えた後のSIM-mCherry、TRF1-GFPおよび結合チャネルのライブイメージング。スケールバー:5 μm。時間間隔:5分図に示す時間。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
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Discussion
このプロトコルは、化学二量体化システムを用いたテロメア上の凝縮物の形成と溶解を実証した。相分離および液滴融合誘発テロメアクラスタリングのキネティクスは、ライブイメージングで監視されます。凝縮物の局在および組成は、DNA FISHおよびプロテインIFで決定される。
このプロトコルには 2 つの重要な手順があります。1つ目は、タンパク質および二量体濃度を決定することです。ゲノム遺伝子座で局所相分離を誘導することに成功することは、相分離のための重要な濃度を上回る相分離タンパク質の局所濃度の増加に依存する(図 1B).相分離タンパク質のグローバル濃度は、局所的に濃縮するのに十分なタンパク質が存在するように十分に高くする必要があります。相分離タンパク質の濃度は高すぎないので、全地球相分離が発生したり、容易に誘導されたりする可能性があります。 アンカーDNAの長さ(またはアンカータンパク質が結合する修飾クロマチンのサイズ)とHalo融合アンカータンパク質の濃度は、最大二量体化効率で核形成中心のサイズを決定します。アンカーサイズが大きいほど、凝縮物を核とすることが容易である。二量化効率は、アンカータンパク質の量に対する二量化剤の量によって影響されます。あまりにも少ないダイメライザーは、利用可能なすべてのアンカータンパク質を占有することはできませんが、あまりにも多くの二量化剤は、アンカータンパク質上のものではなく、過剰な二量体にeDHFRの非生産的な結合をもたらします。二量体濃度は、ハロー融合アンカータンパク質のアンカーDNA長および濃度とともに、局所相分離の核化に必要な臨界濃度を決定するために使用することができる。これらのパラメータを変化させる系統的アプローチ(アンカーDNA長、アンカータンパク質濃度、相分離タンパク質濃度および二量化器濃度)を使用して、多次元相図をマッピングすることができる。しかし、ここで示すようにクロマチン関連縮合物を形成することが目的ではなく、明るいHalo-GFP信号(より大きなアンカーサイズ)を持つ細胞と、mCherry-eDHFR(様々な位相分離タンパク質濃度)の明るさの広い範囲を持つ細胞を、プロトコル2.3で決定する最大の二量体濃度で画像化することは非常に簡単です。2 番目の重要なステップは、ライブイメージングでの光の消光を避けることです。液滴(位相分離タンパク質を標識する明るいmCherry病巣)が相分離後に出現する世界的な相分離とは異なり、ゲノムの位置での局所凝縮は、mCherry病巣の存在を判断することによって容易に発見することができない。これは、タンパク質を単独で募集し、相分離を伴わず、ゲノム遺伝子座に対して、mCherry局所病巣の形成をもたらすからである。相分離は採用後に起こるので、mCherry病巣は最初の採用後も大きくなり、明るくなり続けます。相分離誘導濃縮は、相分離タンパク質へのアンカータンパク質の二量体化により、GFPチャネル(アンカータンパク質)でも起こり得る。したがって、病巣の存在ではなく経時の病巣の物性(大きさおよび強度)の変化は、相分離を判断するために使用されるべきである。mCherry(捕食タンパク質)病巣の二量体化または相分離誘導濃縮を区別することは困難かもしれませんが、GFP(アンカータンパク質)病巣の濃縮は、相分離がある場合にのみ発生します(図3D).したがって、アンカータンパク質の濃縮は、容易に相分離を判断するために使用することができる。高いレーザーパワーまたはイメージング中の長時間露光時間に起因する光漂白は、ライブイメージングからの相分離を判断することがより困難であるため、イメージング条件を調整することによって可能な限り避けるべきです。経時の病巣強度とサイズの増加はLLPSの特徴ですが、LLPSの唯一の証拠として使用することはできません。ここで提示された場合、液滴融合は、より少ないアンカー数またはより少ない移動アンカーでは起こらない可能性がある液滴の形成の証拠として使用された。液滴融合を伴わない場合、凝縮物成分の拡散や低分子摂動に対する感度などの他の方法を用いて、凝縮物形成をさらに確認することができる8,9,11.
この化学二量体化システムは、生細胞の位相分離を監視するために必要な時間分解をレンダリングしますが、細胞レベルと細胞下レベルでは空間分解能が欠けます。ダイメライザーのモジュール設計により、TMPにフォトケージを取り付けることで光感受性の二量体を作り、リンカーを12、32、35の両方に感光させることが可能です。異なる用途に対して同じ設計されたセルバックグラウンド内でダイメライザーを切り替えるだけで、二量体化の高い空間的および時間的制御、二量体化の反転、またはその両方を光で実現できます。我々は、これらの光感受性二量体剤で、高い空間的および時間的な精度で相分離を制御することができると思う。光感受性タンパク質36,37を介して相分離を制御する利用可能な光遺伝学的ツールと比較して、化学的二量体化システムの欠点は、相分離を1回だけ逆転させることです。しかし、このシステムは、持続的な採用を維持し、光なしで相分離を維持することができ、液滴の成長や相分離の細胞の結果に従うなどの長期的なライブイメージングアプリケーションに適しています。また、光を使わずに細胞集団を治療する能力は、凝縮体組成やゲノム組織の変化を決定するために必要なような生化学的アッセイに便利です。
この方法は、ゲノム上の他の場所で凝縮物を誘導するように容易に適応することができる。目的のゲノム位置に結合するタンパク質を単に同定し、それをHaloに融合させてアンカーとして使用することができます(図1B)。あるいは、これをCRISPRと融合させ、dCas9をHaloに融合させ、ガイドRNAを使用してHaloを目的のゲノム座38に固定することができる。さらに、Haloを標的タンパク質(例えばLacI)に融合させることで、ゲノムに統合された異所DNAアレイ(例えばLacO)にHaloを固定することができます。その後、ボトムアップアプローチを使用して、クロマチンで局所的に分離するタンパク質の能力、タンパク質の切り捨て、突然変異または翻訳後修飾によって相分離能力がどのように影響を受けるか、または凝縮物がクロマチン修飾、複製または転写などの局所的機能にどのような影響を与えるかを評価することができます。要約すると、この化学二量体化システムは、クロマチンの様々な場所に広範囲の凝縮物を誘導するために使用することができ、クロマチン関連凝縮物の材料特性および化学組成が生化学的アッセイと長期間の生撮像を組み合わせることによってクロマチン機能にどのように寄与するかを調べるために特に適している。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、米国国立衛生研究所(1K22CA23763201からH.Z.、GM118510からD.M.C.)、チャールズ・E・カウフマン財団からH.Z.に支援されました。著者たちは、原稿を校正してくれたジェイソン・トーンズに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
References
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